Summary
Atleten absorberen jaarlijks enkele honderden milde traumatische hersenletsels (mTBI) / hersenschudden; Het gevolg van deze op de hersenen is echter slecht begrepen. Daarom, een diermodel van enkelvoudige en herhalende mTBI die consequent repliceren klinisch relevante symptomen, biedt de middelen om de studie van mTBI en hersenschudding te bevorderen.
Abstract
Mild Traumatic Brain Injury (mTBI) kan resulteren in het acute verlies van hersenfunctie, waaronder een periode van verwarring, een verlies van bewustzijn (LOC), focal neurologische tekorten en zelfs amnesie. Atleten die deelnemen aan contact sporten hebben een groot risico op blootstelling aan een groot aantal mTBI's. In termen van het niveau van het letsel in een sportatleet, wordt een mTBI gedefinieerd als een mild letsel dat geen grove pathologische veranderingen veroorzaakt, maar veroorzaakt kortlopende neurologische tekorten die spontaan worden opgelost. Ondanks eerdere pogingen om mTBI bij muizen en ratten te modelleren, hebben veel gemeld grote schadelijke effecten, waaronder schedelfracturen, intracerebrale bloedingen, axonale verwondingen en neuronale celdood. Hierin beschrijven we ons zeer reproduceerbare diermodel van mTBI die klinisch relevante symptomen reproduceert. Dit model maakt gebruik van een op maat gemaakte pneumatische slaginrichting om een gesloten hoofdtrauma te leveren. Deze impact wordt gemaakt onder precieze snelheids- en vervormingsparameters,Het creëren van een betrouwbaar en reproduceerbaar model om de mechanismen te onderzoeken die bijdragen aan effecten van single of repetitieve hersenschudding mTBI.
Introduction
Traumatische hersenletsel (TBI) wordt gedefinieerd als een hoofdletsel die voortvloeit uit een externe fysieke kracht, waardoor de normale hersenfunctie wordt verstoord. Het vertegenwoordigt een significante sociaal-economische en volksgezondheidsbelasting, met het rapport voor het Centrum voor Ziektecontrole en Preventie 2015 aan het Congres dat er 2,5 miljoen Amerikanen elk jaar een TBI onderhouden. Dit beïnvloedt niet alleen de kwaliteit van het leven van de patiënt, maar brengt ook een zeer hoge economische kosten voor de gemeenschap op, momenteel geschat op 76,5 miljard dollar per jaar. De hoeveelheid werkelijke hersenschade die wordt overgedragen en de acute fase symptomologieën is wat milde, matige en ernstige TBI definieert.
Mild Traumatic Brain Injury (mTBI), ook aangeduid als hersenschudding, rapporteert jaarlijks meer dan 70% van de TBI's 1 . Het is het meest voorkomend bij atleten die deelnemen aan high risk contact sporten, waaronder boksen en voetbal 2 . In tegenstelling tot matigOf ernstige vormen van TBI, zijn de directe schade en symptomen die verband houden met mTBI soms niet zo uitgesproken 3 . Daarentegen kunnen de langetermijneffecten van mTBI even even lastig zijn als die in de matige en ernstige vormen. Degenen die aan herhalende mTBI lijden hebben aangetoond dat ze chronische traumatische encefalopathie (CTE) ontwikkelen, evenals andere cognitieve en degeneratieve ziekten 4 . Daarom is het belangrijk om beter inzicht te krijgen in de mechanismen die bijdragen aan de korte termijn symptomen en de algemene langdurige schade die voortvloeit uit mTBI.
Bij mensen definieert de definitie van hersenschudding, zoals gedefinieerd door de vierde internationale conferentie over harsingskudding in sport (Zürich 2012) 5 , dat het schadeniveau voor sportharsingeling mild is, geen grove pathologische veranderingen veroorzaakt, maar veroorzaakt kortlopende neurologische tekorten Die spontaan opgelost worden. Inderdaad, een receNt studie onderzocht het effect van mTBI op cognitieve beperking bij middelbare school voetballers, met behulp van head impact telemetrie systemen. In deze studie bleek het aantal keren dat de spelers helm-effecten hebben> 20 g in een seizoen varieerde van een laag van 226 (gemiddeld, 4,7 per sessie) tot een hoogtepunt van 1855 (gemiddeld 38,6 per sessie) 6 . De meeste van deze gevolgen hebben niet geleid tot de klinische diagnose van een hersenschudding; Maar het bewijs van functionele veranderingen in de hersenfunctie kan worden waargenomen met behulp van fMRI 6 . De hersenen veranderen omdat deze functionele veranderingen onbekend zijn en daarom is er een dringende behoefte om een betrouwbaar en reproduceerbaar model te hebben om onderzoek naar de effecten van concussieve en subconcussieve mTBI te vergemakkelijken.
Ondanks eerdere pogingen om mTBI bij muizen en ratten te modelleren 7 , meldden veel negatieve effecten. In het bijzonder zijn de meeste knaagdiermodellen beperkt in hun herhalende natuur met minder thEen impact van vijf mTBI's, evenals ongunstige pathologische gebeurtenissen, waaronder intracerebrale bloedingen, schedelbreuken, ernstig axonale letsel, neuronale celsterfte en verhoogde sterfte 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Hierin beschrijven we een muismodel van mTBI dat dichter bij de echte definitie van hersenschudding bij mensen ligt. Dit model recapituleert veel van de symptomen waargenomen in menselijke mTBI, zoals de mechanische kracht die resulteert in het transiënte verlies van bewustzijn zonder openlijke brutale hersenpatologie. Bovendien is het voordelig dat het gebruikt kan worden voor zowel enkelvoudige impact als repetitieve impactparadigma's over lange perioden zoals eerder gemeld 13 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studies werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren van de National Institutes Health. Het protocol werd goedgekeurd door het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee aan de Georgetown University. Muizen werden gehuisvest in een temperatuurbeheerde dierfaciliteit en werden gehouden op een 12 uur lange / 12 uur donkere cyclus. Eten en water waren ad libitum beschikbaar.
1. Bereiding van de mTBI Apparatus
OPMERKING: Het mTBI apparaat bevat een data acquisitie (DAQ) vak om de impact parameters, een hoge snelheid pneumatische impactor te controleren om de impact te verrichten en een gegoten gel gevulde basis om de kop na slag te vertragen.
- Zet de perslucht aan en start de hoge-snelheid pneumatische slaginrichting aan op een drukinstelling van 861,85 kPa.
- Kalibreer het DAQ-controlesysteem naar de volgende parameters-zuiger snelheid van 2,35 m / s, oppervlakte dwell timE van 31,5 ms.
- Plaats de gegoten gel-gevulde basis (compressibiliteit 64 kPa / mm) zodanig dat de middellijn loodrecht is met het traject van de slagpoot.
2. mTBI Impaction
- Noteer de gewichten van alle muizen die u wilt gebruiken.
- Anesthetiseer muizen met 3% isofluraan in zuurstof gedurende 120 s in een inductiekamer.
- Overdracht muizen naar mTBI-apparaat, doorgaan met verdoving via een buigbare, niet-vaste neuskegel.
- Plaats in de neuskegel de muiskop op het geluidskussen zodat het vlakke oppervlak van de schedel loodrecht op de schroefpunt wordt gepresenteerd.
- Plaats de tape over de muiskop om een vlak oppervlak te creëren en de oren van de slagplaats af te houden.
- Laag de polytetrafluoroethyleenstootpunt om in lijn te treden met de sagittale middenlijn in het midden van het hoofd. De gebruikte tipstip is 10 mm in diameter en zal het gebied van de hoofdhuid van net achter de ogen tot aan de middellijn van de oren bedekken. Stel de slaginrichting aan zodat het juist isSt aanraking van het oppervlak van de muiskop.
- Trek de stekkerpunt terug en druk de vereiste afbuigdiepte (7.5 mm) handmatig in.
- Bevestig het DAQ-besturingssysteem en druk de trigger-knop om de muiskop te beïnvloeden, ofwel een enkelvoudige of herhalende impact. Herhaalde effecten worden achtereenvolgens geleverd tussen elke impact.
- Onmiddellijk na de laatste impact, verwijder de muis van de verdoving en het mTBI apparaat en plaats in de rugstand.
- Met behulp van een stopwatch kunt u de vertraging van het terugtrekken van de rechthoekreflex (tegenovergestelde gevoeligheid) bepalen om verlies van de bewustheidstijd te bepalen, evenals de tijd tot ambulatie (onbelemmerd lopen).
- Monitor de muis en bij herstel naar normaal gedrag, keer terug naar zijn huiskooi.
- Sham muizen krijgen dezelfde behandeling en verdoving, maar krijgen geen impact.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het gebruik van dit nieuwe mTBI-apparaat zorgt voor enkele en herhalende milde hoofdbesmettingen zonder risico op schedelbreuk of structurele hersenschade. Het model maakt gebruik van een op maat gemaakte pneumatische Teflon-slaginrichting om een mechanische energie-impact van de gesloten kop te leveren. De impact wordt gemaakt onder precieze snelheids- en vervormingsparameters, waarbij een betrouwbaar en reproduceerbaar model wordt gecreëerd om de mechanismen te onderzoeken die bijdragen aan effecten van single of repetitieve hersenschudding mTBI ( Figuur 1 ).
De aanwezigheid of afwezigheid van LOC is een handig hulpmiddel bij de ernst van de hersenschudding in dierenmodellen. De terugkeer van de correctieve reflextijd is een acute neurologische evaluatie van de ernst van het letsel dat we de LOC kwantificeren na een enkele en herhaalde mTBI (7,5 mm diepte, figuur 2 ). Tijdens de procedure krijgen muizen in totaal 3 minuten isofluraan In zuurstof, en dus alle muizen met inbegrip van shams hebben een LOC-periode na verdoving van de anesthesie. Single mTBI resulteert in significant verhoogde LOC in vergelijking met scham muizen (36,4 ± 1,6 sv 64,2 ± 7,7 s, n = 5, ** p <0,01, Figuur 2A ). Dit ook gecorreleerd met verhoogde ambulatietijden na een enkele mTBI (52,0 ± 4,5 sv 140,0 ± 21,1 s, n = 5, ** p <0,01, Figuur 2B ). Bij herhaalde verwondingsparadigma's (in totaal 30 effecten, 5 effecten per dag gedurende 6 dagen), waren er op significante hoogte LOC en ambulatietijden op alle testdagen (herhaalde maatregelen tweerichtingsanalyse van variantie schade effect F 1,14 = 22,92, P <0,0003). Tijdens de gehele studie was de gemiddelde LOC over de 6 dagen Sham: 35,5 ± 1,4 sv mTBI: 64,9 ± 1,7 s, n = 8, p <0,01, Figuur 2C , en gemiddelde ambulatietijden Sham: 64,3 ± 3,3 sv mTBI: 160,8 ± 5,3 s, n = 8, p <0,01,Lass = "xfig"> Figuur 2D. Iba1-kleuring voor microglia / macrofagen onthulde geen verandering tussen sham en single mTBI muizen, maar uitgebreide Iba1 immunoreactiviteit in het optische kanaal in herhaalde mTBI muizen ( Figuur 3 ). Repeat mTBI muizen lieten geen bewijs zien van grijze materiële ontsteking in de cortex ( Figuur 3 ) of andere hersengebieden.
Figuur 1 : Illustratieve representatie van het muismodel van mTBI. ( A ) De installatie van alle materialen die nodig zijn om mTBI uit te voeren. ( B ) Muis die gedurende 2 minuten in isofluraaninductiekamer wordt geplaatst. ( C ) Op de mTBI-apparaat wordt de muis geplaatst in een niet-vaste neuskegel om de verdoving voort te zetten. ( D ) Voorzichtig tape-muiskop om een plat oppervlak te maken en de oren terug te houden. ImpactoR punt verlaagd om alleen het oppervlak van het hoofd aan te raken. ( E ) Impactor tip teruggetrokken en de vereiste afbuigdiepte wordt verlaagd met behulp van de wijzerplaat (ingangen). MTBI uitgevoerd door de drukknop te drukken. ( F ) Verlies van het bewustzijn gemeten door de tijd die nodig is voor het terugzetten van het rechthoek (tegenovergesteld). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2 : Eenvoudige en herhaalde mTBI's verbetert het transient verlies van bewustzijn en keert terug naar ambulatietijden. Muizen die een enkele mTBI ontvangen hebben significant ( A ) verlies van bewustzijn (LOC) en ( B ) ambulatietijden vergeleken met sham control muizen (n = 5 per groep, ** p <0.01). ( C - D ) Repetitieve mTBI (5 effecten per dag gedurende 6 dagen) verhoogt de dagelijkse LOC en de ambulatietijden significant in vergelijking met sham muizen (n = 8 per groep, * p <0,05, ** p <0,01, *** p < 0.001). Data uitgedrukt als gemiddelde ± SEM, geanalyseerd door twee-weg herhaalde maatregelen ANOVA met een Bonferroni post-hoc test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3 : Herhaal mTBI induceert Microglia / Macrophages Activering in de Optic Tract. ( A ) Iba1-vlek in sham muizen onthult rustige microglia / macrofagen in de cortex (a1 - a3) en beperkte kleuring in het optische kanaal (a4-a6). ( B ) Muizen die een enkele mTBI ontvangen(7,5 mm) hebben soortgelijke Iba1-kleurprofielen als schammuizen in zowel de cortex (b1-b3) en het optische kanaal (b4-b6), 24 uur na de impact. ( C ) Repeat mTBI muizen (5 effecten per dag gedurende 6 opeenvolgende dagen) tonen een sterke ontstekingsrespons in het optische kanaal (c4-c6), maar niet in de cortex (c1-c3), 24 uur na de laatste impact ). Uitgebreide afbeeldingen die de morfologie van Iba-1 positieve microglia / macrofagen in de cortex (a3, b3, c3) en optische kanaal (a6, b6, c6) van sham, single en repetitive mTBI muizen tonen, respectievelijk. Schaalstaven = 200 μm (A, B, C); 50 μm (a1-a5, b1-b5, c1-c5); 20 μm (a3, a6, b3, b6, c3, c6, vergrote panelen). Beelden representatief voor n = 6 per groep. Cortex (cx), optisch kanaal (opt), mild traumatisch hersenletsel (mTBI). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bij mensen wordt mTBI gekenmerkt door een functionele beperking bij afwezigheid van structurele letsels. Dit kan optreden bij of zonder verlies van bewustzijn 1 . Blootstelling aan herhaling van herhaling wordt thans gedacht aan de ontwikkeling en / of progressie van neurodegeneratieve ziekten zoals CTE 4 . Het is goed gedocumenteerd dat CTE algemeen voorkomt in boksers en voetballers en hoewel blootstelling aan herhaling van herhaling (inclusief die die niet tot een verlies van bewustzijn leidt) bekend is dat het een essentieel element is bij het ontwikkelen van CTE, weten we nog niet waarom De mechanismen waarmee herhaling van hersenschudding zorgt voor de verschillende veranderingen die zich voordoen in de hersenen.
Een belangrijke hindernis om deze mechanismen te begrijpen is het moeilijk om modellen te ontwikkelen die de belangrijkste symptomologieën die worden waargenomen bij personen die een mTBI-impact hebben, nauwkeurig herhalen. Dit betekent de acute en chronische biologische patHersenbeschermende effecten zijn moeilijk te onderzoeken en nieuwe behandelingen kunnen niet worden ontwikkeld. In het bijzonder zijn bestaande diermodellen van herhaling van hersenen zeer ernstig, waarbij slechts 2-3 herhaalde effecten worden gebruikt die leiden tot uitgebreid neuronale celverlies, schedelbreuk en verlies van hersenweefsel 8 , 10 , 11 , 12 . Deze mate van letsel komt niet voor na herhaling van hersenschudding bij mensen, waarbij de behoefte aan een nieuw model van enkele en herhalende milde hoofdimpact wordt aangetoond.
Hier beschrijven we een nieuw model van mTBI, met behulp van een op maat gemaakt diffus letsel apparaat dat speciaal is ontworpen om energie door de schedel en de hersenen en weg van de muis over te dragen. Door middel van zowel enkelvoudige impact als repetitieve impactparadigma's, biedt het model een mogelijkheid om te onderzoeken hoe de hersenschudding later in het leven neurologische stoornissen bijdraagt. De enkele hHet paradigma herhaalt de kenmerkende kenmerken van milde traumatische hersenletsel waargenomen bij mensen, terwijl het herhalende paradigma het mogelijk maakt om te onderzoeken hoe deze schijnbare milde verwondingen bijdragen aan de chronische en aanhoudende degeneratie in de tijd. Het apparaat zorgt voor herhaalde mTBI-hoofdstoten zonder risico van schedelbreuk of structurele hersenschade.
Zoals bij veel technieken, zijn bepaalde aspecten van dit protocol belangrijk om op te merken voor het genereren van accurate, betrouwbare resultaten. Tijdens kamerinductie en mTBI letsel is het essentieel om een consistente narkose aan elke muis te handhaven. Aangezien de correctie- en ambulatietijd een belangrijke uitkomstmeting is van deze mTBI-procedure, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat zowel mTBI-letsels als schamdieren blootgesteld worden aan vergelijkbare narkotica. Specifiek, gedurende de gehele procedure, moeten muizen gedurende een periode van 3 minuten alleen onder verdoving zijn (2 minuten in de inDuctiekamer, 1 min met het mTBI neuskegelapparaat). Dit lage niveau en de duur van de verdoving is een groot voordeel ten opzichte van vele andere mTBI-modellen, en levert consistente corrigerende reflex respons tijden (sham muizen 20-40 s, mTBI muizen 50-100 s). Bovendien, bij het gebruik van het herhaalde mTBI-paradigma, is het belangrijk om elke dag een record van muisgewichten te houden voor de duur van de studie. Dit zorgt voor consistente monitoring voor stress en algemeen dierenwelzijn gedurende de gehele periode van de mTBI procedures. Deze procedure resulteert niet in dat muizen worden ingetrokken of geïsoleerd. Normaal verzorging, eten en drinken dienen binnen de eerste uur na de procedure te worden nageleefd.
Na-verwonding is er geen bruto morfologische pathologie voor het hersenweefsel, die voortvloeit uit een enkele of meerdere effecten gedurende een 1-week tijdschool . Na een enkele mTBI is de enige cellulaire reactie waargenomen een transiënte vermindering van excitatoire synaptes; thEre is geen ontsteking, verlies van grijze of witte stof, axonale verwonding of celdood. Met 30 herhaalde mTBI (5 per dag, meer dan 6 dagen) is er chronische ontsteking van het optische kanaal, op gelijke niveaus als eerder gekwantificeerd 1 . Chronische witte materie ontsteking is waargenomen vele jaren na een enkele mTBI 14 , en chronische ontsteking kan worden gedetecteerd bij levende atleten met een geschiedenis van herhaling van mTBI 15 . De beperkingen van dit model zijn dat het niet kan worden gebruikt om axonale schade buiten het optische kanaal of mechanismen van de cel dood te bestuderen, omdat deze afwezig zijn in ons model. Ook gebaseerd op onze eerder gepubliceerde gegevens, veroorzaakt dit model geen veranderingen in amyloïde of tau pathologie bij 1 maand na mTBI in een muismodel van de ziekte van Alzheimer 13 . Wij geloven dat dit gebrek aan amyloïde en tau pathologie verband houdt met de afwezigheid van axonale pathologie in ons model. Ons model biedt een platform om te onderzoekenAten veranderingen in neuronnetwerken, synaptische integriteit en samenstelling, en veranderingen in gedrag na herhaling van hersenschudde klachten. Op basis van deze uitkomsten produceert dit nieuwe model klinisch relevante symptomologie op een gecontroleerde, rigoureuze en efficiënte wijze. Verder gebruik van dit model zal het onderzoek mogelijk maken naar de mechanismen die de acute en chronische pathofysiologie van mTBI en hersenschudding onderbouwen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door R01 NS067417 van het National Institute for Neurological Disorders and Stroke (MPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powerlab 8SP data acquisition (DAQ) control box | (AD instruments) | ||
| VIP 3000 calibrated vaporizer | Matrx | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Oxygen | Commercially available | ||
| Compressed Air | Commercially available | ||
| Masking Tape | Commercially available | ||
| Stop Watch | Fisher Scientific | 02-261-840 | |
| C57 Bl/6 Mice | Jackson Laboratories | ||
| Digital Scale and weigh container | Fisher Scientific | 20031 | |
| anti-Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | |
| HRP labelled secondary | Jackson Immunoresearch | 111-035-003 |
References
- McMahon, P., et al. Symptomatology and functional outcome in mild traumatic brain injury: results from the prospective TRACK-TBI study. J Neurotrauma. 31 (1), 26-33 (2014).
- Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. The molecular pathophysiology of concussive brain injury. Clin Sports Med. 30 (1), 33-48 (2011).
- Blennow, K., Hardy, J., Zetterberg, H. The neuropathology and neurobiology of traumatic brain injury. Neuron. 76 (5), 886-899 (2012).
- Levin, H. S., Diaz-Arrastia, R. R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. Lancet Neurol. 14 (5), 506-517 (2015).
- McCrory, P., et al. Consensus statement on concussion in sport: the 4th International Conference on Concussion in Sport, Zurich, November 2012. J Athl Train. 48 (4), 554-575 (2012).
- Talavage, T. M., et al. Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion. J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).
- Angoa-Perez, M., et al. Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between pre-clinical research and clinical reality. J Neurochem. 129 (6), 916-931 (2014).
- Creed, J. A., et al. Concussive brain trauma in the mouse results in acute cognitive deficits and sustained impairment of axonal function. J Neurotrauma. 28 (4), 547-563 (2011).
- Hamberger, A., et al. Concussion in professional football: morphology of brain injuries in the NFL concussion model--part 16. Neurosurgery. 64 (6), 1174-1182 (2009).
- Kane, M. J., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. J Neurosci Methods. 203 (1), 41-49 (2012).
- Prins, M. L., et al. Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments. Dev Neurosci. 32 (5-6), 510-518 (2010).
- Tang, Y. P., et al. A concussive-like brain injury model in mice (II): selective neuronal loss in the cortex and hippocampus. J Neurotrauma. 14 (11), 863-873 (1997).
- Winston, C. N., et al. Dendritic Spine Loss and Chronic White Matter Inflammation in a Mouse Model of Highly Repetitive Head Trauma. Am J Pathol. 186 (3), 552-567 (2016).
- Johnson, V. E., et al. Inflammation and white matter degeneration persist for years after a single traumatic brain injury. Brain. 136, Pt 1 28-42 (2013).
- Barrio, J. R., et al. In vivo characterization of chronic traumatic encephalopathy using [F-18]FDDNP PET brain imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 2039-2047 (2015).
