Se presentan métodos para evaluar la capacidad fagocitaria de primarias macrófagos derivados de médula ósea murinas utilizando la ruina del myelin fluorescencia etiquetada y tinción de gota de lípidos intracelulares.
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Artículo de método
In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea
En este artículo
Resumen
Resumen
Macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) son los leucocitos maduros que sirven un papel fisiológico fundamental como fagocitos profesionales capaz de limpiar una gran variedad de partículas. Normalmente, BMDMs están restringidos del sistema nervioso central (SNC), pero tras una lesión, pueden infiltrarse fácilmente. Una vez dentro del tejido lesionado del CNS, BMDMs son el tipo de célula primaria responsable de la separación de desechos celulares derivadas de lesiones, incluyendo grandes cantidades de la ruina del myelin ricos lípidos. Las consecuencias neuropathological de la fagocitosis de desechos BMDM de la infiltración y la mielina dentro del CNS son complejas y no bien entendido. Los protocolos describen, permiten el estudio directo en vitro de BMDMs en el contexto de lesión del CNS. Cubrimos murino BMDM aislamiento y cultura, preparación de desechos de mielina y ensayos para evaluar la fagocitosis de desechos de mielina BMDM. Estas técnicas resultados cuantificables robusto sin necesidad de equipo especializado significativo o materiales, sin embargo pueden personalizarse fácilmente para satisfacer las necesidades de los investigadores.
Introducción
Macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) son un eslabón importante entre los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos. Como antígeno que presenta las células (APCs), pueden ponerse en contacto con los linfocitos por tanto presentación del antígeno y liberación de citocinas1,2,3. Sin embargo, como los fagocitos profesionales, su función principal es eliminar patógenos, células envejecidas y detritos celulares1,4. Después de una lesión de la médula espinal (SCI), cantidades sustanciales de la ruina del myelin se g....
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Protocolo
Los métodos aquí describen en la sección 2 han sido aprobados por el Florida estado Universidad institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) y sigue las pautas establecidas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8º edición . Todos los animales utilizados en este en este protocolo son house en un centro de animales de laboratorio dedicados hasta su uso. Ninguna experimentación en vivo fue realizado antes de su sacrificio. Número de animales se basaron en necesidad experimental usando celular media y colecciones de mielina como guía con el fin de minimizar el uso de.
Nota:
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Resultados
Tratamiento de BMDMs con CFSE etiquetado la ruina del myelin debe producir internalización transparente (figura 2). Mientras que un tiempo de 3 horas de interacción es suficiente para BMDMs fagocitar suficiente ruina del myelin añadido para robusta detección aguas abajo, se observa acumulación intracelular con tan poco como 1 hora de la interacción. Sin embargo, algunos residuos de mielina todavía pueden estar presentes en la superficie celular después del lavado. Esto puede ser debido al la.......
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Discusión
Los procedimientos aquí descritos utilizan recientemente aisladas la ruina del myelin CNS cruda y primarios macrófagos derivados de médula ósea. Para reducir los gastos de animales, se recomiendan que ambos cerebros y cosechar las células de la médula ósea de cada ratón en el momento del sacrificio. Dos investigadores trabajando juntos al mismo tiempo pueden preparar ambos materiales. Alternativamente, los cerebros pueden almacenarse a-80 ° C en PBS suplementado con antibióticos antes de aislamiento de desechos de mielin.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen ninguna revelación.
Agradecimientos
Los autores desean dar las gracias a Glenn Sanger-Hodgson, especialista en medios de comunicación en la Facultad de medicina de FSU por todo su trabajo en producción de vídeo, edición y doblaje de voz.
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01GM100474 y R01GM072611).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | Alto contenido de glucosa con L-glutamina, piruvato de sodio |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Corning | 30-002-CI | 100X Solución |
| Suero para terneros recién nacidos (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | Estados Unidos Origen |
| Clon NCTC 929 [célula L, L-929, derivado de la cepa L] | ATCC | CCL-1 | L929 Línea celular de preparación de medios acondicionados |
| Placas de cultivo celular de 24 pocillos | VWR | 10062-896 | |
| Placa de cultivo celular | Greiner Bio-One | 639960 | Poliestirina, 145/20 mm |
| CFSE Kit de proliferación celular | Thermo Fisher | C34570 | DMSO para reconstitución provisto |
| de fluorogel con tampón Tris | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 17985-11 | |
| Aceite Rojo O | Sigma Aldrich | O0625< | |
| strong>Equipo | |||
| Materiales | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Tubos de ultracentrífuga | Beckman Coulter | 326823 | Pared delgada, Polipropileno, 38,5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Rotor de ultracentrífuga Beckman | Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Cucharón basculante, titanio |
| Homogeneizador rotativo de mano | Fisher Science | 08-451-71 |
Referencias
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Unanue, E. R. Antigen-presenting function of the macrophage. Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).
- Cavaillon, J. M.
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Reimpresiones y permisos
