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Artículo de método

In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

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DOI:

10.3791/56322

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30 de diciembre de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, College of Medicine, Florida State University

En este artículo

Resumen

Se presentan métodos para evaluar la capacidad fagocitaria de primarias macrófagos derivados de médula ósea murinas utilizando la ruina del myelin fluorescencia etiquetada y tinción de gota de lípidos intracelulares.

Resumen

Macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) son los leucocitos maduros que sirven un papel fisiológico fundamental como fagocitos profesionales capaz de limpiar una gran variedad de partículas. Normalmente, BMDMs están restringidos del sistema nervioso central (SNC), pero tras una lesión, pueden infiltrarse fácilmente. Una vez dentro del tejido lesionado del CNS, BMDMs son el tipo de célula primaria responsable de la separación de desechos celulares derivadas de lesiones, incluyendo grandes cantidades de la ruina del myelin ricos lípidos. Las consecuencias neuropathological de la fagocitosis de desechos BMDM de la infiltración y la mielina dentro del CNS son complejas y no bien entendido. Los protocolos describen, permiten el estudio directo en vitro de BMDMs en el contexto de lesión del CNS. Cubrimos murino BMDM aislamiento y cultura, preparación de desechos de mielina y ensayos para evaluar la fagocitosis de desechos de mielina BMDM. Estas técnicas resultados cuantificables robusto sin necesidad de equipo especializado significativo o materiales, sin embargo pueden personalizarse fácilmente para satisfacer las necesidades de los investigadores.

Introducción

Macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) son un eslabón importante entre los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos. Como antígeno que presenta las células (APCs), pueden ponerse en contacto con los linfocitos por tanto presentación del antígeno y liberación de citocinas1,2,3. Sin embargo, como los fagocitos profesionales, su función principal es eliminar patógenos, células envejecidas y detritos celulares1,4. Después de una lesión de la médula espinal (SCI), cantidades sustanciales de la ruina del myelin se genera a partir muerte de oligodendrocitos, el tipo de célula responsable de CNS axon myelination5. Nosotros y otros hemos demostrado que la separación de la ruina del myelin es primordialmente responsabilidad de infiltración BMDMs5,6,7. Sin embargo, dentro de la lesión medular engulfment de sitios de la ruina del myelin ha sugerido cambiar estas células normalmente antiinflamatorias hacia un estado pro inflamatorio5,8,9. Como mediadores claves de la neuro-inflamación en la médula espinal lesionada, BMDMs son objetivos clínicos importantes.

Para ayudar a investigar la influencia de BMDMs en la médula espinal lesionada, hemos desarrollado un modelo en vitro para estudiar directamente cómo BMDMs responder a la ruina del myelin. Para mejorar la relevancia biológica, primarias BMDMs murinas y la ruina del myelin recién aisladas se utilizan en estas investigaciones. Como tal, los métodos presentados aquí detallan también el aislamiento y cultivo de primarias BMDMs murinos, así como una técnica de gradiente de sacarosa modificado utilizada para aislar CNS murino deriva mielina escombros10,11,12. La ruina del myelin puede etiquetarse fácilmente con un colorante fluorescente, éster de succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), vía que su internalización por BMDMs. CFSE es idóneo para esta aplicación porque es no-citotóxico, y sus permisos de estrecho espectro fluorescente multiplexado con otra fluorescente puntas de prueba de13,14. Tras la fagocitosis, lípidos de desechos de mielina son transportados a través de los lisosomas y empaquetados como lípidos neutros en las gotitas de lípido intracelular5. Para cuantificar esta acumulación de lípidos intracelulares, presentamos un aceite rojo O (ORO) tinción optimizado para análisis de imagen cuantitativo. Este método de tinción simple produce resultados reproducibles robustos y cuantificación15. Estos métodos facilitan el estudio del myelin escombros fagocitosis y lípidos retención con equipo especializado limitada.

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Protocolo

Los métodos aquí describen en la sección 2 han sido aprobados por el Florida estado Universidad institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) y sigue las pautas establecidas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8º edición . Todos los animales utilizados en este en este protocolo son house en un centro de animales de laboratorio dedicados hasta su uso. Ninguna experimentación en vivo fue realizado antes de su sacrificio. Número de animales se basaron en necesidad experimental usando celular media y colecciones de mielina como guía con el fin de minimizar el uso de.

Nota: Este protocolo describe la generación de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) (sección 1), la preparación de la ruina del myelin fluorescencia etiquetada derivado del cerebro (sección 2), el procedimiento general para el análisis de fagocitosis de desechos de mielina (sección 3), y el procedimiento general para el análisis de la acumulación de lípidos de desechos de mielina (sección 4). Preparación del reactivo, células cosecha y manipulación, colección de mielina y etiquetado y Análisis rendimiento deben completarse en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar.

1. generación de macrófagos derivados de médula ósea primarios

  1. Preparación de medio de cultivo de macrófagos completa (CMCM)
    Nota:     generación de macrófagos de la médula ósea requiere el uso de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Esta preparación utiliza medios de elución de L929 fibroblastos murinos condicionada como la fuente de M-CSF.
    1. Generar medios de elución de L929 fibroblastos murinos condicionada por las células del cultivo en platos de 145 mm con 50 mL de glucosa alta (4500 mg/L glucosa L) Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 5% de suero de ternero nacido nuevo (NCS) y penicilina/estreptomicina durante 7 días.
    2. Recoger los medios de comunicación de las culturas a tubos de centrífuga cónico de 50 mL y centrifugar durante 30 minutos a 3500 x g, 4 º C.
    3. Filtro de sobrenadantes a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Medios condicionados pueden almacenarse a-80 ° C hasta por 6 meses.
    4. A la glucosa alta DMEM, añadir 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol elución de L929 fibroblastos murinos acondicionado DMEM y 1% penicilina/estreptomicina. Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C durante 2-3 meses. Caliente a 37 ° C antes de usar.
  2. Colección de células de médula ósea primaria e inducción de macrófagos
    Nota: Mediante este protocolo una mouse generará aproximadamente 20 millones procedentes de la médula ósea macrófagos (BMDMs).
    1. Eutanasia el número deseado de 8-10 semanas viejos ratones utilizando estándar CO2 guías de asfixia seguidas por dislocación cervical.
    2. Esterilizar al animal utilizando 70% (vol/vol) de etanol: H2O, saturar la piel.
    3. Corta una pequeña abertura en el abdomen y tire cuidadosamente de la piel para revelar el tejido subyacente. Tenga cuidado de no perforar la cavidad peritoneal.
    4. Quite ambas patas traseras a partir de la cadera y terminando en el tobillo. Lugar los tejidos recogidos en un plato de Petri de 100 mm que contengan fosfato estéril de 5-10 mL tampón salino (PBS) suplementada con 1% penicilina/estreptomicina.
      Nota: Cuando procesar varios animales Asegúrese de mantener los platos en el hielo para limitar la degradación de tejido.
    5. Eliminar tejido muscular y conectivo del hueso con un bisturí. Sólo el fémur y la tibia se utilizan para la recolección de células, se puede desechar el peroné.
    6. Exponer la cavidad de la médula de los huesos recogidos por cortar una pequeña sección de cada extremo con un bisturí.
    7. Utilizando una aguja de 25g, lave las cavidades de la médula con cm en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Los huesos aparecerá blanco una vez que han sido suficientemente volcadas.
    8. Una vez que se completa la colección, talle aspira con una aguja de 18g para 30-90 s genera una suspensión unicelular.
      Nota: En este punto se puede realizar un paso de lisis opcional del glóbulo rojo (RBC). Se ha sugerido recientemente que contenido de hierro intracelular puede influir en los efectos de la ruina del myelin en macrófago polarización16. Para obtener información con respecto a la inclusión de un paso de lisis RBC consulte Trouplin et al. 17.
    9. Filtrar la suspensión a través de un tamiz de célula estéril 70 μm en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
    10. Semilla recoge células uniformemente en platos de cultivo celular 145 mm con 15-20 mL CMCM. Utilice aproximadamente tres platos de cultura por ratón sacrificados. Incubar los cultivos a 37 ° C, 5% CO2.
    11. Después de 72 horas lavar las placas una vez con PBS estéril para eliminar las células no adherentes, luego agregar 15-20mL fresco CMCM. Incubar las culturas durante 4 días adicionales a 37 ° C, 5% CO2. Después de 7 días de la cultura total, las células hematopoyéticas de la médula aisladas inicialmente será BMDMs maduros (figura 1).

2. generación de desechos de mielina fluorescencia etiquetada derivado del cerebro

Nota: Todos los reactivos pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.

  1. Preparación de los reactivos de colección de desechos de mielina
    1. Preparar Tris· Tampón de cl.
      1. 800 ml agua destilada desionizada H2O (ddiH2O) Añadir 20 mL de 1 M Tris· Cl, pH 7,45 (concentración final de 20 mM) y 20 mL de Na2EDTA (concentración final de 2 mM) de 100 mM.
      2. Ajustar el pH a 7.45. Ajustar el volumen a 1000 mL con ddiH2O. filtro solución a través de una unidad de filtración de 0.2 μm.
    2. Preparar la solución de sacarosa de 1 M.
      1. A 100 mL de Tris· CL solución tampón, añadir 68,46 g de sacarosa. Ajustar el volumen a 200 mL con Tris· Tampón de cl. Filtrar la solución a través de una unidad de filtración de 0.2 μm.
    3. Preparar 200 mL de solución de sacarosa de 0.32 M diluyendo la solución de 1 M con el Tris· CL 0.83:0.16 de solución de buffer (vol/vol).
    4. Preparar 150 mL de solución de sacarosa de 0,83 M diluyendo la solución de 1 M con el Tris· CL 0.83:0.16 de solución de buffer (vol/vol).
  2. Colección de la ruina del myelin crudo derivado del cerebro
    Nota: El método de colección descrito aquí es para el aislamiento de la ruina del myelin crudo.
    1. Eutanasia a ratones 10-12 8-10 semanas de edad con CO2 asfixia las pautas estándar seguidas por dislocación cervical.
    2. Diseccionar el cerebro y colocarlos en un plato de 100 mm que contiene 10 mL de solución de sacarosa de 0.32 M.
Mantener el plato en el hielo.
  • Usando tijeras quirúrgicas estériles cortadas el cerebro en pedazos de aproximadamente 5 mm3 en tamaño.
  • Transferir el tejido a un tubo cónico de centrífuga de 50 mL y agregar aproximadamente 30 mL de solución de 0,32 M de sacarosa.
  • Homogeneizar con un homogenizador rotativo mano estéril, hasta conseguir una solución suave.
  • Diluir el cerebro homogeneizado a un volumen final de 90 mL con solución de 0.32 M de sacarosa.
  • Para seis tubos de paredes delgadas polipropileno ultracentrífuga de 38,5 mL, añadir 20 mL de solución de sacarosa de 0,83 M.
  • Añadir suavemente la solución de homogeneizado de cerebro en la parte superior de la solución de sacarosa de 0,83 M, teniendo cuidado de no para mezclar las dos capas.
  • Balance de cada tubo con la solución de sacarosa de 0.32 M.
  • Centrifugue a 100.000 x g durante 45 min a 4° C utilizando un apropiado previamente refrigerado por rotor de ultracentrífuga. Conjunto rotor de aceleración y desaceleración a sus valores mínimos para reducir la pérdida de desechos de mielina.
  • Recoger los desechos de la mielina de la interfaz de las dos densidades de sacarosa.
    Nota: residuos deben aparecer como una banda blanca hacia el centro del tubo.
  • La ruina del myelin crudo se combinan en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y ajustar el volumen a aproximadamente 35 mL usando Tris· Tampón de cl.
  • Homogeneizar la ruina del myelin crudo con un homogeneizador rotativo mano estéril para 30-60 s.
  • Dividir uniformemente la suspensión entre 6 tubos limpios de la ultracentrífuga y equilibrio con un volumen adecuado de Tris· Tampón de cl.
  • Centrifugue a 100.000 x g durante 45 min a 4° C utilizando un apropiado previamente refrigerado por rotor de ultracentrífuga. Conjunto rotor de aceleración y desaceleración a sus valores máximos.
  • Como pellets blanco sólidos ahora será visibles, deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 10-15 mL de Tris· Tampón de cl.
  • Dividir uniformemente la suspensión entre 2 tubos limpios de la ultracentrífuga y equilibrio con un volumen adecuado de Tris· Tampón de cl.
  • Centrífuga otra vez a 100.000 x g durante 45 minutos a 4 ° C utilizando un apropiado previamente refrigerado por rotor de ultracentrífuga. Conjunto rotor de aceleración y desaceleración a sus valores máximos.
  • Deseche el sobrenadante y resuspender el pellet en 5-6 mL de PBS estéril y dividir la suspensión entre un número apropiado de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL previamente tarado.
  • Centrifugar a 22.000 x g por 10 min a 4 ° C.
  • Deseche el sobrenadante y determinar el peso de los pellets de residuos de mielina.
  • Resuspender el pellet en PBS a una concentración final de 100 mg/mL.
    Nota: los cerebros de diez a doce es suficiente para producir 10-15 mL de la ruina del myelin 100 mg/mL. La ruina del myelin se pueden conservar a-80 ° C durante 6 meses.
  • Residuos de mielina fluorescente etiquetado
    1. Preparar la solución 50 μm carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE) inmediatamente antes del uso.
      1. Con PBS estéril, diluir una solución 5 mM de CFSE elaborado con 100% dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración final de trabajo de 50 μm.
      2. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
    2. Descongele la cantidad deseada de la ruina del myelin 100 mg/mL y resuspender con una aguja estéril de 29 g.
      Nota: congelar los restos de mielina lo que provocará la gota de la solución que requiere resuspensión antes de su uso.
    3. Transferencia de desechos de mielina a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente tarado.
    4. Centrifugar a 14.800 x g por 10 min a 4° C. Deseche el sobrenadante.
    5. Resuspender la ruina del myelin en 200 μL de solución de la CFSE por ruina del myelin 100 μl peleteado.
    6. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT) protegido de la luz.
    7. Centrifugar a 14.800 x g por 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    8. Resuspender el precipitado en 600-800 μl de tampón de lavado (0,2 μm filtro esterilizado glicina 100 mM en PBS).
    9. Centrifugar a 14.800 x g por 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
    10. Repita los pasos 2.3.8-2.3.9 dos veces más.
    11. Después del último lavado, determinar el peso de la pelotilla de desechos de mielina y vuelva a suspender a 100 mg/mL con PBS estéril.
      Nota: La ruina del myelin etiquetados pueden conservar a-80 ° C hasta por 6 meses.

    • 3. ensayo de fagocitosis de desechos mielina

    Nota: El siguiente es el método básico para la observación de la fagocitosis de la ruina del myelin fluorescencia marcada. Además de otros tratamientos y condiciones experimentales deberán ser optimizados por el investigador.

    1. Preparación de placas de tratamiento
      1. De cada placa de 145 mm, recoger el BMDMs madurados en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL con 5-6 mL de ácido etilendiaminotetracético de 10 mM (EDTA) en suero salino de Dulbecco tamponada con fosfato (dPBS) (pH 7.4).
        Nota: No utilice tripsina ya que puede alterar el estado de activación de las células18.
      2. Añadir un volumen igual de CMCM precalentado a cada tubo de células colectadas.
      3. Centrifugar a 180 x g por 8 min a 20 ° C. Deseche el sobrenadante.
      4. Resuspenda las células en cm y cuenta.
      5. Añadir a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pozos, 1 x 105 células en 1 mL de cm.
      6. Incubar a 37 ° C, 5% CO2 durante 24 h.
    2. Análisis y tratamiento de desechos de mielina
      1. Añadir 10 μl de 100 mg/mL CFSE etiquetado la ruina del myelin en cada pocillo (concentración final de 1 mg/mL).
      2. Incubar durante 1-3 horas a 37 ° C, 5% CO2.
      3. Lave la placa 3 veces con PBS estéril para eliminar los restos de mielina no engullido.
      4. Añadir 400 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Incubar durante 30 min a TA.
      5. Lave la placa 2 veces con PBS estéril.
      6. Añadir 400 μL de solución de Hoechst 33258 a cada pocillo. Incubar por 5 min a TA protegido de la luz.
      7. Lavar las placas 2 veces con PBS estéril.
      8. Añadir 200 μL de Fluoro-gel con tampón Tris a cada bien para reducir el fotoblanqueo.
      9. Imagen de células usando un microscopio capaz de epi-fluorescente invertido.
        Nota: Las longitudes de onda de excitación y emisión de CFSE son 494 nm y 521 nm, respectivamente.
      10. El número de células positivas de la CFSE se dividen por el número de núcleos para determinar la absorción de desechos de mielina relativa.
      11. Antes de la proyección de imagen, mantener las placas para un máximo de 7 días a 4 ° C protegido de la luz.

    4. cuantificación de lípidos intracelulares vía aceite rojo O manchas

    Nota: El siguiente es el método básico para la observación de lípidos intracelulares derivados de desechos de mielina.La CFSE etiquetado la ruina del myelin no recomienda utilizar cuantificación fluorescente de ORO coloración debido a la superposición espectral. Además de otros tratamientos y condiciones experimentales deberán ser optimizados por el investigador.

    1. Preparación de soluciones de tinción
      1. Preparar solución de tinción de aceite rojo O (ORO) 0,5%.
        1. Lentamente, añadir 100 mL de 100% glicol de propileno (1, 2-Propanediol) a 0,5 g de ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) mientras revuelve.
        2. Solución a 95 ° C durante 15 minutos o hasta que se disuelvan todas las partículas grandes de calor.
          Nota: no calentar más de 100 ° C.
        3. Filtrar la solución a través de un pedazo de papel de filtro mientras esté aún caliente en un recipiente nuevo.
        4. Permite solución fresco durante la noche en solución de excelencia se puede conservar hasta por 1 año a TA.
      2. Preparar la solución de glicol de propileno de 85%.
        1. Añadir 85 mL de 100% propilenglicol 15 mL de ddiH2O. revolver hasta que se mezcle. Solución se puede conservar hasta por 1 año a TA.
    2. Preparación de placas de tratamiento
      1. Prepare una placa de 24 pocillos siguiendo el método descrito en la sección 3.
      2. Incubar a 37 ° C, 5% CO2 durante 24 h.
    3. Tratamiento de desechos de mielina
      1. Añadir 10 μl de la ruina del myelin 100 mg/mL a cada pozo (concentración final de 1 mg/mL).
      2. Incubar durante 1-3 h a 37 ° C, 5% CO2.
      3. Lave la placa 3 veces con PBS estéril para eliminar los restos no digeridos de la mielina.
        Nota: En este punto, las placas pueden experimentar ya sea fijación inmediata o CMCM fresco se puede Agregar y células volvieron a incubación para puntos del tiempo adicional.
      4. Añadir 400 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Incubar durante 30 min a TA.
      5. Lave la placa 2 veces con PBS estéril y luego proseguir a las manchas.
    4. ORO de tinción y análisis
      1. Lave la placa fija 3 veces con ddiH2O.
      2. Añadir 400 μL de glicol de propileno 100% a cada pocillo e incubar 5 min a TA.
        Nota: esto reducirá el arrastre de ddiH2O.
      3. Aspire el glicol de propileno y añadir 400 μL de solución de ORO a cada pocillo.
      4. Incubar durante 8 min a 60 ° C.
      5. Aspirar la solución ORO. Luego, añadir 400 μL de 85% propilenglicol a cada pozo e incubar 5 minumintes a TA.
      6. Lave la placa 3 veces con ddiH2O.
      7. Añadir 400 μL de solución de Hoechst 33258 a cada pocillo. Incubar por 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
      8. Lavar las placas 2 veces con PBS estéril.
      9. Añadir 200 μL de Fluoro-gel con tampón Tris a cada pocillo.
      10. Imagen de células usando un microscopio capaz de epi-fluorescente invertido. ORO puede ser reflejada con un conjunto estándar de filtro de Texas Red o DsRed.
      11. Cuantificar la retención relativa de lípidos determinando la zona positiva de ORO en cada campo de la imagen y dividiendo por el número de núcleos.
      12. Mantenga las placas durante 7 días a 4 ° C protección de la luz.

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    Resultados

    Tratamiento de BMDMs con CFSE etiquetado la ruina del myelin debe producir internalización transparente (figura 2). Mientras que un tiempo de 3 horas de interacción es suficiente para BMDMs fagocitar suficiente ruina del myelin añadido para robusta detección aguas abajo, se observa acumulación intracelular con tan poco como 1 hora de la interacción. Sin embargo, algunos residuos de mielina todavía pueden estar presentes en la superficie celular después del lavado. Esto puede ser debido al la...

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    Discusión

    Los procedimientos aquí descritos utilizan recientemente aisladas la ruina del myelin CNS cruda y primarios macrófagos derivados de médula ósea. Para reducir los gastos de animales, se recomiendan que ambos cerebros y cosechar las células de la médula ósea de cada ratón en el momento del sacrificio. Dos investigadores trabajando juntos al mismo tiempo pueden preparar ambos materiales. Alternativamente, los cerebros pueden almacenarse a-80 ° C en PBS suplementado con antibióticos antes de aislamiento de desechos de mielin...

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    Divulgaciones

    Los autores no tienen ninguna revelación.

    Agradecimientos

    Los autores desean dar las gracias a Glenn Sanger-Hodgson, especialista en medios de comunicación en la Facultad de medicina de FSU por todo su trabajo en producción de vídeo, edición y doblaje de voz.

    Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (R01GM100474 y R01GM072611).

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    DMEMGE Healthcare Life SciencesSH30243.01Alto contenido de glucosa con L-glutamina, piruvato de sodio
    Solución de penicilina-estreptomicinaCorning30-002-CI100X Solución
    Suero para terneros recién nacidos (NCS)Rocky Mountain BiologicsNBS-BBT-5XMEstados Unidos Origen
    Clon NCTC 929 [célula L, L-929, derivado de la cepa L] ATCCCCL-1L929 Línea celular de preparación de medios acondicionados
    Placas de cultivo celular de 24 pocillosVWR10062-896 
    Placa de cultivo celularGreiner Bio-One639960Poliestirina, 145/20 mm
    CFSE Kit de proliferación celularThermo FisherC34570DMSO para reconstitución provisto
    de fluorogel con tampón Tris Ciencias de la Microscopía Electrónica17985-11
    Aceite Rojo OSigma AldrichO0625<
    strong>Equipo
    MaterialesEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    Tubos de ultracentrífugaBeckman Coulter326823Pared delgada, Polipropileno, 38,5 mL, 25 x 89 mm
    SW 32 Ti Rotor de ultracentrífuga BeckmanCoulter369650SW 32 Ti Rotor, Cucharón basculante, titanio
    Homogeneizador rotativo de manoFisher Science08-451-71

    Referencias

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