In Vitro Fagocitosis de la ruina del Myelin por macrófagos derivados de médula ósea

Macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) son un eslabón importante entre los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos. Como antígeno que presenta las células (APCs), pueden ponerse en contacto con los linfocitos por tanto presentación del antígeno y liberación de citocinas^1,2,3. Sin embargo, como los fagocitos profesionales, su función principal es eliminar patógenos, células envejecidas y detritos celulares^1,4. Después de una lesión de la médula espinal (SCI), cantidades sustanciales de la ruina del myelin se genera a partir muerte de oligodendrocitos, el tipo de célula responsable de CNS axon myelination⁵. Nosotros y otros hemos demostrado que la separación de la ruina del myelin es primordialmente responsabilidad de infiltración BMDMs^5,6,7. Sin embargo, dentro de la lesión medular engulfment de sitios de la ruina del myelin ha sugerido cambiar estas células normalmente antiinflamatorias hacia un estado pro inflamatorio^5,8,9. Como mediadores claves de la neuro-inflamación en la médula espinal lesionada, BMDMs son objetivos clínicos importantes.

Para ayudar a investigar la influencia de BMDMs en la médula espinal lesionada, hemos desarrollado un modelo en vitro para estudiar directamente cómo BMDMs responder a la ruina del myelin. Para mejorar la relevancia biológica, primarias BMDMs murinas y la ruina del myelin recién aisladas se utilizan en estas investigaciones. Como tal, los métodos presentados aquí detallan también el aislamiento y cultivo de primarias BMDMs murinos, así como una técnica de gradiente de sacarosa modificado utilizada para aislar CNS murino deriva mielina escombros^10,11,12. La ruina del myelin puede etiquetarse fácilmente con un colorante fluorescente, éster de succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE), vía que su internalización por BMDMs. CFSE es idóneo para esta aplicación porque es no-citotóxico, y sus permisos de estrecho espectro fluorescente multiplexado con otra fluorescente puntas de prueba de^13,14. Tras la fagocitosis, lípidos de desechos de mielina son transportados a través de los lisosomas y empaquetados como lípidos neutros en las gotitas de lípido intracelular⁵. Para cuantificar esta acumulación de lípidos intracelulares, presentamos un aceite rojo O (ORO) tinción optimizado para análisis de imagen cuantitativo. Este método de tinción simple produce resultados reproducibles robustos y cuantificación¹⁵. Estos métodos facilitan el estudio del myelin escombros fagocitosis y lípidos retención con equipo especializado limitada.

Los métodos aquí describen en la sección 2 han sido aprobados por el Florida estado Universidad institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) y sigue las pautas establecidas en la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, 8^º edición . Todos los animales utilizados en este en este protocolo son house en un centro de animales de laboratorio dedicados hasta su uso. Ninguna experimentación en vivo fue realizado antes de su sacrificio. Número de animales se basaron en necesidad experimental usando celular media y colecciones de mielina como guía con el fin de minimizar el uso de.

Nota: Este protocolo describe la generación de macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) (sección 1), la preparación de la ruina del myelin fluorescencia etiquetada derivado del cerebro (sección 2), el procedimiento general para el análisis de fagocitosis de desechos de mielina (sección 3), y el procedimiento general para el análisis de la acumulación de lípidos de desechos de mielina (sección 4). Preparación del reactivo, células cosecha y manipulación, colección de mielina y etiquetado y Análisis rendimiento deben completarse en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar.

1. generación de macrófagos derivados de médula ósea primarios

1. Preparación de medio de cultivo de macrófagos completa (CMCM)
   Nota: generación de macrófagos de la médula ósea requiere el uso de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). Esta preparación utiliza medios de elución de L929 fibroblastos murinos condicionada como la fuente de M-CSF.
   1. Generar medios de elución de L929 fibroblastos murinos condicionada por las células del cultivo en platos de 145 mm con 50 mL de glucosa alta (4500 mg/L glucosa L) Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 5% de suero de ternero nacido nuevo (NCS) y penicilina/estreptomicina durante 7 días.
   2. Recoger los medios de comunicación de las culturas a tubos de centrífuga cónico de 50 mL y centrifugar durante 30 minutos a 3500 x g, 4 º C.
   3. Filtro de sobrenadantes a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Medios condicionados pueden almacenarse a-80 ° C hasta por 6 meses.
   4. A la glucosa alta DMEM, añadir 5% vol/vol NCS, 15% vol/vol elución de L929 fibroblastos murinos acondicionado DMEM y 1% penicilina/estreptomicina. Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C durante 2-3 meses. Caliente a 37 ° C antes de usar.
2. Colección de células de médula ósea primaria e inducción de macrófagos
   Nota: Mediante este protocolo una mouse generará aproximadamente 20 millones procedentes de la médula ósea macrófagos (BMDMs).
   1. Eutanasia el número deseado de 8-10 semanas viejos ratones utilizando estándar CO₂ guías de asfixia seguidas por dislocación cervical.
   2. Esterilizar al animal utilizando 70% (vol/vol) de etanol: H₂O, saturar la piel.
   3. Corta una pequeña abertura en el abdomen y tire cuidadosamente de la piel para revelar el tejido subyacente. Tenga cuidado de no perforar la cavidad peritoneal.
   4. Quite ambas patas traseras a partir de la cadera y terminando en el tobillo. Lugar los tejidos recogidos en un plato de Petri de 100 mm que contengan fosfato estéril de 5-10 mL tampón salino (PBS) suplementada con 1% penicilina/estreptomicina.
      Nota: Cuando procesar varios animales Asegúrese de mantener los platos en el hielo para limitar la degradación de tejido.
   5. Eliminar tejido muscular y conectivo del hueso con un bisturí. Sólo el fémur y la tibia se utilizan para la recolección de células, se puede desechar el peroné.
   6. Exponer la cavidad de la médula de los huesos recogidos por cortar una pequeña sección de cada extremo con un bisturí.
   7. Utilizando una aguja de 25g, lave las cavidades de la médula con cm en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Los huesos aparecerá blanco una vez que han sido suficientemente volcadas.
   8. Una vez que se completa la colección, talle aspira con una aguja de 18g para 30-90 s genera una suspensión unicelular.
      Nota: En este punto se puede realizar un paso de lisis opcional del glóbulo rojo (RBC). Se ha sugerido recientemente que contenido de hierro intracelular puede influir en los efectos de la ruina del myelin en macrófago polarización¹⁶. Para obtener información con respecto a la inclusión de un paso de lisis RBC consulte Trouplin et al. ¹⁷.
   9. Filtrar la suspensión a través de un tamiz de célula estéril 70 μm en un nuevo tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
   10. Semilla recoge células uniformemente en platos de cultivo celular 145 mm con 15-20 mL CMCM. Utilice aproximadamente tres platos de cultura por ratón sacrificados. Incubar los cultivos a 37 ° C, 5% CO₂.
   11. Después de 72 horas lavar las placas una vez con PBS estéril para eliminar las células no adherentes, luego agregar 15-20mL fresco CMCM. Incubar las culturas durante 4 días adicionales a 37 ° C, 5% CO₂. Después de 7 días de la cultura total, las células hematopoyéticas de la médula aisladas inicialmente será BMDMs maduros (figura 1).

2. generación de desechos de mielina fluorescencia etiquetada derivado del cerebro

Nota: Todos los reactivos pueden almacenarse a 4 ° C durante 1 mes.

1. Preparación de los reactivos de colección de desechos de mielina
   1. Preparar Tris· Tampón de cl.
      1. 800 ml agua destilada desionizada H₂O (ddiH₂O) Añadir 20 mL de 1 M Tris· Cl, pH 7,45 (concentración final de 20 mM) y 20 mL de Na₂EDTA (concentración final de 2 mM) de 100 mM.
      2. Ajustar el pH a 7.45. Ajustar el volumen a 1000 mL con ddiH₂O. filtro solución a través de una unidad de filtración de 0.2 μm.
   2. Preparar la solución de sacarosa de 1 M.
      1. A 100 mL de Tris· CL solución tampón, añadir 68,46 g de sacarosa. Ajustar el volumen a 200 mL con Tris· Tampón de cl. Filtrar la solución a través de una unidad de filtración de 0.2 μm.
   3. Preparar 200 mL de solución de sacarosa de 0.32 M diluyendo la solución de 1 M con el Tris· CL 0.83:0.16 de solución de buffer (vol/vol).
   4. Preparar 150 mL de solución de sacarosa de 0,83 M diluyendo la solución de 1 M con el Tris· CL 0.83:0.16 de solución de buffer (vol/vol).
2. Colección de la ruina del myelin crudo derivado del cerebro
   Nota: El método de colección descrito aquí es para el aislamiento de la ruina del myelin crudo.
   1. Eutanasia a ratones 10-12 8-10 semanas de edad con CO₂ asfixia las pautas estándar seguidas por dislocación cervical.
   2. Diseccionar el cerebro y colocarlos en un plato de 100 mm que contiene 10 mL de solución de sacarosa de 0.32 M.

3. ensayo de fagocitosis de desechos mielina

Nota: El siguiente es el método básico para la observación de la fagocitosis de la ruina del myelin fluorescencia marcada. Además de otros tratamientos y condiciones experimentales deberán ser optimizados por el investigador.

1. Preparación de placas de tratamiento
   1. De cada placa de 145 mm, recoger el BMDMs madurados en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL con 5-6 mL de ácido etilendiaminotetracético de 10 mM (EDTA) en suero salino de Dulbecco tamponada con fosfato (dPBS) (pH 7.4).
      Nota: No utilice tripsina ya que puede alterar el estado de activación de las células¹⁸.
   2. Añadir un volumen igual de CMCM precalentado a cada tubo de células colectadas.
   3. Centrifugar a 180 x g por 8 min a 20 ° C. Deseche el sobrenadante.
   4. Resuspenda las células en cm y cuenta.
   5. Añadir a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pozos, 1 x 10⁵ células en 1 mL de cm.
   6. Incubar a 37 ° C, 5% CO₂ durante 24 h.
2. Análisis y tratamiento de desechos de mielina
   1. Añadir 10 μl de 100 mg/mL CFSE etiquetado la ruina del myelin en cada pocillo (concentración final de 1 mg/mL).
   2. Incubar durante 1-3 horas a 37 ° C, 5% CO₂.
   3. Lave la placa 3 veces con PBS estéril para eliminar los restos de mielina no engullido.
   4. Añadir 400 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Incubar durante 30 min a TA.
   5. Lave la placa 2 veces con PBS estéril.
   6. Añadir 400 μL de solución de Hoechst 33258 a cada pocillo. Incubar por 5 min a TA protegido de la luz.
   7. Lavar las placas 2 veces con PBS estéril.
   8. Añadir 200 μL de Fluoro-gel con tampón Tris a cada bien para reducir el fotoblanqueo.
   9. Imagen de células usando un microscopio capaz de epi-fluorescente invertido.
      Nota: Las longitudes de onda de excitación y emisión de CFSE son 494 nm y 521 nm, respectivamente.
   10. El número de células positivas de la CFSE se dividen por el número de núcleos para determinar la absorción de desechos de mielina relativa.
   11. Antes de la proyección de imagen, mantener las placas para un máximo de 7 días a 4 ° C protegido de la luz.

4. cuantificación de lípidos intracelulares vía aceite rojo O manchas

Nota: El siguiente es el método básico para la observación de lípidos intracelulares derivados de desechos de mielina.La CFSE etiquetado la ruina del myelin no recomienda utilizar cuantificación fluorescente de ORO coloración debido a la superposición espectral. Además de otros tratamientos y condiciones experimentales deberán ser optimizados por el investigador.

1. Preparación de soluciones de tinción
   1. Preparar solución de tinción de aceite rojo O (ORO) 0,5%.
      1. Lentamente, añadir 100 mL de 100% glicol de propileno (1, 2-Propanediol) a 0,5 g de ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol) mientras revuelve.
      2. Solución a 95 ° C durante 15 minutos o hasta que se disuelvan todas las partículas grandes de calor.
         Nota: no calentar más de 100 ° C.
      3. Filtrar la solución a través de un pedazo de papel de filtro mientras esté aún caliente en un recipiente nuevo.
      4. Permite solución fresco durante la noche en solución de excelencia se puede conservar hasta por 1 año a TA.
   2. Preparar la solución de glicol de propileno de 85%.
      1. Añadir 85 mL de 100% propilenglicol 15 mL de ddiH₂O. revolver hasta que se mezcle. Solución se puede conservar hasta por 1 año a TA.
2. Preparación de placas de tratamiento
   1. Prepare una placa de 24 pocillos siguiendo el método descrito en la sección 3.
   2. Incubar a 37 ° C, 5% CO₂ durante 24 h.
3. Tratamiento de desechos de mielina
   1. Añadir 10 μl de la ruina del myelin 100 mg/mL a cada pozo (concentración final de 1 mg/mL).
   2. Incubar durante 1-3 h a 37 ° C, 5% CO₂.
   3. Lave la placa 3 veces con PBS estéril para eliminar los restos no digeridos de la mielina.
      Nota: En este punto, las placas pueden experimentar ya sea fijación inmediata o CMCM fresco se puede Agregar y células volvieron a incubación para puntos del tiempo adicional.
   4. Añadir 400 μL de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Incubar durante 30 min a TA.
   5. Lave la placa 2 veces con PBS estéril y luego proseguir a las manchas.
4. ORO de tinción y análisis
   1. Lave la placa fija 3 veces con ddiH₂O.
   2. Añadir 400 μL de glicol de propileno 100% a cada pocillo e incubar 5 min a TA.
      Nota: esto reducirá el arrastre de ddiH₂O.
   3. Aspire el glicol de propileno y añadir 400 μL de solución de ORO a cada pocillo.
   4. Incubar durante 8 min a 60 ° C.
   5. Aspirar la solución ORO. Luego, añadir 400 μL de 85% propilenglicol a cada pozo e incubar 5 minumintes a TA.
   6. Lave la placa 3 veces con ddiH₂O.
   7. Añadir 400 μL de solución de Hoechst 33258 a cada pocillo. Incubar por 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
   8. Lavar las placas 2 veces con PBS estéril.
   9. Añadir 200 μL de Fluoro-gel con tampón Tris a cada pocillo.
   10. Imagen de células usando un microscopio capaz de epi-fluorescente invertido. ORO puede ser reflejada con un conjunto estándar de filtro de Texas Red o DsRed.
   11. Cuantificar la retención relativa de lípidos determinando la zona positiva de ORO en cada campo de la imagen y dividiendo por el número de núcleos.
   12. Mantenga las placas durante 7 días a 4 ° C protección de la luz.

Tratamiento de BMDMs con CFSE etiquetado la ruina del myelin debe producir internalización transparente (figura 2). Mientras que un tiempo de 3 horas de interacción es suficiente para BMDMs fagocitar suficiente ruina del myelin añadido para robusta detección aguas abajo, se observa acumulación intracelular con tan poco como 1 hora de la interacción. Sin embargo, algunos residuos de mielina todavía pueden estar presentes en la superficie celular después del lavado. Esto puede ser debido al lavado insuficiente, o no ser totalmente internalizadas durante las primeras etapas de la fagocitosis de partículas.

Mientras que BMDMs rápidamente puede interiorizar la ruina del myelin, procesamiento lisosomal es necesaria antes de forma de gotas de lípidos puede manchar de ORO. Para demostrar, BMDMs incubados con la ruina del myelin por 90 minutos, lavadas y se cultivan para cantidades adicionales de tiempo antes de la fijación y tinción (figura 3). La figura 4 muestra que existe un retraso entre el inicio del tratamiento y el aspecto de lípido neutral. Debe señalarse también que retención de lípidos no es estable durante el cultivo. BMDMs comienza a metabolizar lípidos acumulados pronto después de la formación de gotas. Como tal, le recomendamos esperar no más de 24 horas entre la ruina del myelin no envolvió lejos de lavado y fijación.

Cuantificación de ORO manchado de área muestra la tasa de lípidos de la mielina en BMDMs (figura 5). Después de un período de 90 minutos de interacción, las células fueron devueltos a incubación en fresco CMCM. Durante el período temprano de la persecución en medio fresco, el BMDMs metabolizan el componente de lípido residuos de mielina fagocitados en lípidos puede manchar neutros de ORO. Un aumento constante en la zona positiva de ORO es típico en las horas siguientes a la interacción. Después de 24 horas sin embargo, el BMDMs tendrán effluxed o metabolizan una parte significativa de los lípidos intracelulares.

Figura 1 : Representante BMDM culturas. Algunas células adherentes se observará inicialmente. El día 3 se eliminan las células no adherentes. Día 7, se observan macrófagos derivados de médula ósea madurados. Escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Análisis de imágenes de representante de la fagocitosis de desechos de mielina BMDM. Las células fueron tratadas con 1mg/mL CFSE etiquetado la ruina del myelin por 1 hora antes del lavado y fijación con 4% PFA. La ruina del myelin internalizada puede visualizarse usando conjuntos de filtro estándar GFP en un microscopio de epi-fluorescente capaz. Escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Diagrama del diseño Experimental de aceite rojo O (ORO). BMDM se tratan con la ruina del myelin 1mg/mL (dilución 1: 100) durante 90 minutos, seguido de lavado y cultivo en medio fresco antes de la fijación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Coloración de ORO de BMDM tras la fagocitosis de restos de mielina. Fijación siguiente con el 4% PFA en los momentos indicados, BMDMs fueron manchados con ORO y Hoechst 33258. Se muestran imágenes representativas de cada momento. Escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Análisis de imagen cuantitativo de ORO tinción. Para la cuantificación de la coloración de ORO, 3 pozos fueron reflejadas a 20 X con 5 imágenes por pozo. Ajustes de adquisición de imagen todos eran idénticos. Barras de error = SEM. (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen ninguna revelación.