Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Este protocolo describe las diferentes técnicas necesarias para microscopía electrónica de transmisión como tinción negativa, seccionamiento ultrafino para estructura detallada y etiquetado para determinar las posiciones de proteínas específicas en exosomas de inmuno-oro.

Resumen

Exosomas son tamaño nanométrico vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporales y son conocidos para representar las características de las células que segregan les. El contenido y la morfología de las vesículas de secreción reflejan comportamiento celular o estado fisiológico, por ejemplo el crecimiento celular, migración, escote y la muerte. Papel de los exosomas altamente puede depender de tamaño y el tamaño de exosomas varía de 30 a 300 nm. El método más ampliamente utilizado para la proyección de imagen de exosomas es Tinción negativa, mientras que otros resultados se basan en microscopía electrónica de crio-transmisión, microscopía electrónica y microscopía de fuerza atómica. Morfología de los exosomas típico evaluado mediante tinción negativa es una forma de Copa, pero más detalles no están claros. Un exosomas bien caracterizados a través del estudio estructural es particularmente necesario en campos médicos y farmacéuticos. Por lo tanto, morfología dependiente de la función debe ser verificada mediante técnicas de microscopía electrónica como una proteína específica en la estructura detallada de exosomas de etiquetado. Para la observación detallada de la estructura, se compararon imágenes seccionados ultrafinos y negativa teñida de exosomas. En este protocolo, sugerimos microscopía electrónica de transmisión para la proyección de imagen de exosomas como tinción negativa, todo Monte inmuno-tinción, preparación de bloque, sección delgada y etiquetado inmuno-oro.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EVs) son vesículas bicapa de lípidos secretadas por las células y su tamaño oscila entre 30 y 300 nm. EVs primero fueron divulgado en 1978, con la evidencia de las vesículas de los pacientes con enfermedad de Hodgkin¹. Estas vesículas se informaron que 40 a 120 nanómetros de tamaño. En 1980, se informó que EVs están involucrado en el sistema de coagulación y trombosis, formación de un coágulo de sangre dentro de un vaso sanguíneo en los pacientes de cáncer². Después de 30 años, EVs se han divulgado para ser un factor importante para promover la invasión del tumor, escape inmune y angiogénesi....

Protocolo

1. bloque preparación, corte, coloración y proyección de imagen de los exosomas

1. Los exosomas de sobrenadante de cultivo de células HCT116 de pellets por centrifugación a 100.000 x g durante 1,5 h²³. Quite el sobrenadante del cultivo y cuidadosamente la pelotilla de exosomas purificada con 1 mL de glutaraldehído al 2.5% en solución de cacodilato de sodio de 0.1 M (pH 7.0) por 1 h a 4 ° C. De cacodilato de sodio de 0.1 M, disolver ácido cacodílico 4,28 g en 160 mL de agua destilada (DW). Ajustar el pH a 7,4 con 0.1 M HCl luego realizar hasta 200 mL con agua destilada.
2. Retirar el fijador y lavar el pellet con 1 mL de buffer d....

Resultados

En la actualidad, exosomas se clasifican en categorías de tamaño y forma por microscopía electrónica de transmisión. La figura 2 muestra negativa teñida de exosomas y etiquetada inmune exosomas en el Monte todo Estado. La figura 3 muestra los exosomas seccionado y el inmuno-etiquetado exosomas después de secciones delgadas. Tinción de inmuno-oro utilizando anticuerpos de proteínas específicas se usa positivamente un exosomas de i.......

Discusión

Este artículo presenta un protocolo para observar la estructura de los exosomas detallada y etiquetado de sus proteínas específicas. Tinción negativa ha sido considerado como el mejor método de exosomas imagen¹⁷. Esta técnica convencional ha mostrado estructura en forma de Copa de exosomas. Sin embargo, esta forma de la taza es la forma del artefacto que puede ocurrir debido al proceso de secado. Crio-TEM resultados han mostrado que los exosomas tienen una estructura perfectamente esférica en solu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Glutaraldehído	EMS	16200
Cacodilato de sodio	EMS	12300
Tetróxido de osmio 1 g cristal	EMS	19100	Uso solo en campana extractora
acetona	JUNSEI	1B2031
Medio Spurr	TED PELLA	18108
Ultra-micrótomo	Leica	UCT
Acetato de uranilo	EMS	22400	Producto químico peligroso
Citrato de plomo	EMS	17900
Microscopía electrónica de transmisión	Hitachi	H7600
rejilla de níquel	EMS	G200-Ni
Rejilla de cobre	EMS	G200-Cu
glicina	SIGMA	022K5404
Tampón de fosfato solución salina	SIGMA	P4417
Albúmina sérica bovina	Aurion	25557
1ª			en forma manual
Anticuerpo antihumano purificado CD274 (B7-H1, PD-L1)	BioLegend	329710	Immumogold de montura
entera IgG2b, κ Isotipo Ctrl	BioLegend	401202	Montura entera Immumogold (Control)
2º IgG anti-ratón conjugado 9-11 nm Partícula de oro	Sigma	G7652
Microscopía electrónica de transmisión	JEOL	JEM2200FS
Descargador de incandescencia	JEOL JFC1100E
Rejilla de carbono	EMS	121119
Paraformaldehído	EMS	19210
Rejilla de cobre recubierta de carbono Formvar (200 meh)	EMS	FCF200-CU
Formvar recubierta de carbono  Rejilla de níquel (malla 200)	EMS	FCF200-NI