Summary
ويصف هذا البروتوكول تلفيق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية تمتز مع المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة التي يمكن استخدامها لرصد الانصهار بلعم من العينات الحية وتمكن مجهرية فائقة القرار العينات الثابتة .
Abstract
وقد تم تحدي تصور تشكيل الخلايا العملاقة مولتينوكليتيد (مجكس) من العينات الحية يرجع ذلك إلى حقيقة أن يعيش أكثر من تقنيات التصوير تتطلب نشر الضوء من خلال الزجاج، ولكن على الزجاج بلعم فيوجن حدث نادر. ويقدم هذا البروتوكول تلفيق العديد من الواجهات الزجاجية الجودة البصرية حيث يتحول امتزاز المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة الزجاج في سطح فوسوجينيك. أولاً، يتم وصف إعداد الأسطح الزجاجية النظيفة كابتداء من المواد لتعديل السطح. ثانيا، ينص طريقة امتزاز المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة لتحويل الزجاج غير فوسوجينيك إلى الركازة فوسوجينيك. وثالثاً، يصف هذا البروتوكول تلفيق ميكروباتيرنس السطحية التي تشجع على درجة عالية من الرقابة الزمانية المكانية على تشكيل MGC. وأخيراً، يرد اختﻻق الأطباق أسفل الزجاج. وترد أمثلة لاستخدام هذا النظام الخلايا في المختبر كنموذج لدراسة الانصهار بلعم وتشكيل MGC.
Introduction
ويرافق تشكيل مجكس عددا من الحالات المرضية في جسم الإنسان المتميز بالتهاب مزمن1. وقد أظهرت الدراسات القليلة من المستغرب على الرغم من الاتفاق الذي مونونوكليتيد الضامة الصمامات على شكل مجكس2، الانصهار في سياق مع المعيشة العينات3،4. هذا سبب الأسطح الزجاجية النظيفة المطلوبة لمعظم تقنيات التصوير لا تعزز الانصهار بلعم عندما فعل السيتوكينات الالتهابية5. في الواقع، إذا كان الزجاج نظيفة كركيزة للانصهار بلعم، ثم منخفضة للأهداف المتوسطة التكبير (أي، 10-20 X) وأكثر من 15 ح المستمر غالباً ما مطلوبة تصوير الاحتفال بحدث واحد انصهار.
في اليد، والأسطح البلاستيكية فوسوجينيك (مثلاً، بيرمان) أو البلاستيك الصف البكتريولوجية الأخرى تعزيز الانصهار2. بيد أن التصوير من خلال البلاستيك يثير إشكالية لأن الركيزة سميكة وينثر الضوء. وهذا يزيد من تعقيد التصوير منذ فترة طويلة عامل المسافة (LWD) أهداف مطلوبة. ومع ذلك، عادة ما يكون أهداف LWD الإضاءة الخافتة جمع القدرات مقارنة بنظيرتها ساترة لتصحيح. علاوة على ذلك، تقنيات استغلال التغييرات في القطبية للضوء الذي يمر من خلال العينة مثل التدخل التفاضلية على النقيض من المستحيل نظراً للبلاستيك بيريفرينجينت. العوائق المرتبطة باستخدام البلاستيك هي أكدت حقيقة أن من المستحيل التنبؤ بحيث يحدث تشكيل الانصهار/MGC بلعم على السطح. معا، هذه القيود تحد من تصور الانصهار بلعم إلى مرحلة التباين البصريات، تمديد المدد التصوير الكلي (> 15 ساعة متواصلة)، ودقة منخفضة.
وقد حددنا مؤخرا سطح زجاج فوسوجينيك العالية أثناء إجراء الفحص المجهري جزيء واحد سوبر القرار مع الضامة الثابتة/مجكس4. هذه الملاحظة كان مفاجئاً نظراً لتنظيف زجاج الأسطح تعزيز الانصهار بمعدل منخفض جداً ~ 5% بعد 24 ساعة حضور انترلوكين-4 (إيل-4) كما تحددها الانصهار مؤشر4. لقد وجدنا أن القدرة على تعزيز الانصهار كان بسبب التلوث أوليميدي. أدلى الامتزاز أوليميدي أو مركبات أخرى وبالمثل الوارد الهيدروكربونات سلسلة طويلة فوسوجينيك الزجاج. فوسوجينيك معظم مجمع (شمع البارافين) ميكروباتيرنيد، وهو إضفاء درجة عالية من السيطرة الزمانية المكانية على الانصهار بلعم وإلى زيادة إضعاف في عدد الأحداث الانصهار لاحظ داخل نفس المقدار من الوقت مقارنة مع بيرمان. وقدمت هذه السطوح البصرية الجودة أول لمحة في الخصائص المورفولوجية والحركية التي تحكم تشكيل مجكس في العينات الحية.
في هذا البروتوكول وصف نحن تصنيع مجموعة متنوعة من الواجهات الزجاجية التي يمكن استخدامها لرصد تشكيل مجكس من العينات الحية. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن هذه الأسطح قابلة لتقنيات حل فائقة بعيدة الميدانية. تلفيق السطحية يعتمد على هدف التجربة، وهو وصف كل سطح مع الأمثلة ذات الصلة في نص الدعوى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافق الإجراءات التي تستخدم الحيوانات بالعناية بالحيوان واستخدام اللجان في عيادة مايو كلينيك ومجمع البحوث جانيليا، وجامعة ولاية أريزونا.
1. إعداد تغطية حمض تنظيف الزجاج
ملاحظة: قد لا تكون تغطية الزجاج التي تم شراؤها من العديد من الشركات المصنعة نظيفة كما هو متوقع. النظر بشكل روتيني التنظيف دفعات زجاج غطاء قبل أي إجراء وتشارك فيها الفحص المجهري.
- شراء الزجاج غطاء صرامة عالية. عناية خاصة لاختيار سمك الصحيح (0.15 أو 0.17 ملم).
ملاحظة: اختيار سمك الغطاء الزجاج اعتماداً على الهدف المجهر ويتم سرد مباشرة على برميل موضوعية. - احتضان الزجاج غطاء في حمض الهيدروكلوريك 12 مترا في غطاء الأبخرة كيميائية جيدة التهوية ح 1 مع سونيكاتيون (42 كيلو هرتز، 70 ث). كرر هذه الخطوة لمرتين إضافية مع طازجة 12 M HCl.
- ملء كوب منفصلة مع الماء عالي النقاوة وإضافة زجاج الغطاء. Sonicate زجاج الغطاء لمدة 5-10 دقيقة في غطاء كيميائية جيدة التهوية. كرر هذه الخطوة من عشر مرات.
- احتضان الزجاج غطاء في الأسيتون النقي في غطاء كيميائية جيدة التهوية لمدة 30 دقيقة مع sonication. كرر هذه الخطوة لأوقات إضافية اثنين.
- ملء كوب منفصلة مع الماء المعقم عالي النقاوة وإضافة زجاج الغطاء. Sonicate زجاج الغطاء لمدة 5-10 دقيقة في غطاء كيميائية جيدة التهوية. كرر هذه الخطوة من عشر مرات.
- احتضان الزجاج غطاء في الكحول الاثيلي 100% في غطاء كيميائية لمدة 30 دقيقة مع sonication. كرر هذه الخطوة مرتين إضافية.
ملاحظة: من المهم نقاء الكحول الاثيلي. الملوثات في شكل المواد الصلبة الذائبة سوف يجف على الزجاج، ويمكن تعزيز الانصهار بلعم. - للتخزين على المدى الطويل، مكان الزجاج غطاء تنظيف حمض في حاوية مليئة بالكحول الاثيلي النقي. وبدلاً من ذلك، جاف الزجاج غطاء مع غاز النيتروجين ومخزن في مجفف فراغ.
2-إعداد السطوح البصرية فوسوجينيك الجودة
- حل خالية من [دمس] شمع البارافين نقطة انصهار عالية في التولوين عالي النقاوة.
ملاحظة: تركيزات الأسهم مصنوعة في 10 ملغ/مل، والمخفف 1:9 في التولوين عالي النقاوة جعل 1 ملغ/مل حل عملي.
تنبيه: تولوين ينبغي التعامل معها بعناية تناسليا. التخلص من التولوين وفقا لخطة النظافة الكيميائية المؤسسية. - تطبيق البرافين يعمل حل لجفاف تنظيف حمض تغطية زجاج في وحدة تخزين التي تغطي بشكل متساو على سطح الزجاج. صب حل الزائدة والزجاج غطاء مع غاز النيتروجين أو الهواء الجاف. لإعداد الجزء الأكبر، استخدام جرة كوبلين مصممة لاستيعاب زجاج الغطاء.
- تلميع الزجاج غطاء 3 جلدات في المحور س، وبعد 3 جلدات في المحور y مع مسح خالية من الوبر (انظر الجدول للمواد).
- فورا قبل إجراء التجربة، يغسل زجاج الغطاء بالماء عالي النقاوة العقيمة، ولاحقا تعقيم لمدة 15-30 دقيقة مع الأشعة فوق البنفسجية في غطاء سلامة بيولوجية. وبدلاً من ذلك، تعقيم الزجاج غطاء تشعيع جاما أو أكسيد الإثيلين.
3-ميكروباتيرنينج الهيدروكربونية المحتوية على مركبات قصر الانصهار لمناطق محددة سلفا
- الجاف لتنظيف حمض تغطية الزجاج وشل الزجاج على سطح مستو.
- استخدام الملقط، تزج بعناية شبكة نقل الذهب مكتشف مجهر الإلكتروني في إيجاد حل عملي ل compound(s) الهيدروكربونية. اختر مركب هيدروكربون يفي بالهدف النهائي لهذه التجربة (انظر الجدول 1). فتيلة الحل الزائدة بعيداً بلطف التنصت على الشبكة على ورق الترشيح، وفورا بوضع الشبكة في مركز الزجاج غطاء. تسمح التولوين لتجف لمدة 2 دقيقة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
- تأكد من الشبكة هو الرهينة للزجاج بعكس الزجاج بلطف. إذا كانت الشبكة يفصل كرر الخطوة 3.2 استخدام زجاج غطاء جديد.
ملاحظة: إذا لم يتوفر بلازما أنظف، حذف الخطوة 3.4. - بلازما تنظيف زجاج الغطاء بالعلاج بالبلازما الغاز فراغ.
ملاحظة: الشبكة الباحث يعمل كقناع لحماية السطح الأساسي تمتز مع المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة من البلازما. يتم تقديمها في المناطق التي لا تحميها الشبكة غير فوسوجينيك بالتعرض للبلازما. وينبغي تحديد مقدار الوقت الزجاج غطاء فضح للبلازما تجريبيا. - استخدام الملقط نصيحة الجميلة، بعناية إزالة الشبكة من سطح الزجاج لفضح ميكروباتيرن.
4-اختﻻق الأطباق أسفل الزجاج
- حفر حفرة دائرية 6-10 مم في الجزء السفلي من البلاستيك 35 ملم طبق بيتري استخدام مثقاب خطوة.
ملاحظة: من الضروري استخدام مثقاب خطوة لإنشاء حواف ناعمة. إذا كانت حواف خشنة للغاية، وسوف لا السندات الزجاج غطاء شقة إلى الجزء السفلي من الطبق. الأسطح المسطحة ناقص من صعوبة الفحص المجهري. - المزيج بعناية وديغا سيليكون الاستومر وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (أي، بولي دايمثيل سيلوكسان؛ PDMS).
- تطبيق طلاء رقيقة من الاستومر فقط قريب من الحافة (أي، وقصر) الحفرة.
ملاحظة: يجب أن تظهر الاستومر فرقة مستمرة رغم رقيقة المحيطة بالحفرة. - بلطف تطبيق الزجاج غطاء فوسوجينيك (كما هو موضح في القسم 2)، أو الزجاج الجافة غطاء تنظيف حمض (كما هو موضح في القسم 1) على الطبق من أجل تغطية الحفرة محاطة الاستومر. ضمان أن الزجاج غطاء يظهر تدفق مع الجزء السفلي من الطبق ويمتد خارج قطر الحفرة حيث يكون جزء كبير من الزجاج على اتصال بالبلاستيك. علاج الاستومر واسطة الخبز عند 50 درجة مئوية ح 2-3.
- إذا كان الزجاج فوسوجينيك المفضل، الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الخلايا طبق والثقافة وفقا للبروتوكولات القياسية. ومع ذلك، إذا كان ميكروباتيرن المفضل، انتقل إلى الخطوة 3.2 لإعداد ميكروباتيرن (البلازما الغاز المستخدمة أثناء ميكروباتيرنينج يعقم الطبق والأزواج PDMS بشدة للزجاج).
5-جمع الضامة أثارت ثيوجليكولاتي
- حقن الفئران C57BL/6 8 عاماً في الأسبوع مع 0.5 مل محلول معقم من ثيوجليكولاتي 4% بروير كما هو موضح سابقا3،،من46.
- الاثنتين والسبعين ساعة في وقت لاحق، euthanize الحيوان طبقاً للرعاية الحيوانية المعتمدة واستخدام المبادئ التوجيهية، وجمع الضامة البريتوني الغسل مع المالحة المثلج مخزنة الفوسفات وتستكمل مع اتهيلينيديامينيتيتراسيتاتي 5 مم.
- الطرد المركزي الضامة في 300 غرام x لمدة 3 دقائق وريسوسبيند في 1 مل DMEM:F12 وتستكمل مع 15 ملم حبيس، 10% FBS، و 1% المضادات الحيوية (مستنبت).
ملاحظة: يتم عد الخلايا لاحقاً مع هيموسيتوميتير نويباور. الضامة المخفف بتركيز مناسب وتطبيقها على السطوح. عدد الخلايا لتطبيقه على سطح معين ينبغي ستنظر بعناية المحقق غرض مسألة تجريبية. التشاور مع المعايير المعروفة في الأدب الأساسي. - بعد 30 دقيقة تغسل السطوح بحبس وتستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1% إزالة الخلايا غير ملتصقة، واستبدال مع الطازجة الثقافة المتوسطة. العودة الثقافات للحاضنة (5% CO2 في الهواء عند 37 درجة مئوية).
- نضح المتوسطة 2 ح في وقت لاحق، واستبدل بالثقافة المتوسطة وتستكمل مع 10 نانوغرام/مل إيل-4. صورة الخلايا كما هو موضح في مكان آخر من4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
البارامترات الفيزيائية للمواد آثاراً مأساوية على مدى بلعم فيوجن7،،من89،10. وعلاوة على ذلك، من المعروف الملوثات السطحية لتعزيز الانصهار بلعم11. ولذلك، من المهم نظيفة للبدء بتغطية الزجاج كعنصر تحكم سلبية للانصهار بلعم. عند تنظيفها كما هو موضح في البروتوكول 1، الزجاج غطاء استثنائي شقة مع أي ميزات سطحية واضحة، بينما امتزاز المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة تليها التلميع السطحي يخلق درجة من نانوتوبوجرافي (الشكل 1).
على أسطح نظيفة تغطية الزجاج، الضامة الصمامات بمعدل منخفض جداً (الشكل 2). على النقيض من ذلك، يخضع الضامة تطبق على الأسطح تمتز مع المركبات المحتوية على المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة بعد 24 ساعة حضور إيل-4، الانصهار قوية (الشكل 2). علاوة على ذلك، امتزاز المذيب وحدها (مثلاً، والتولوين، الايزوبروبانول) لا تجعل الزجاج على سطح فوسوجينيك (الشكل 2).
على الرغم من أنه من غير المرجح أن طبقة 10 نانومتر من المواد الهيدروكربونية في الممتزة هائلة تؤثر على القرار، فإنه من المهم تقييم كمي الفرق المحتملة في القرار بين الأسطح المختلفة. القرار يعرف عادة بمعيار رايليغ. مقياس بديلة التي غالباً ما تستخدم لتقريب القرار العرض الكامل في نصف الحد الأقصى (فوم) هياكل أصغر من الحد حيود الضوء. الأهم من ذلك، لا يوجد أي اختلاف واضح في فوم من 100 نانومتر الخرز الفلورسنت بين السطوح المختلفة (الشكل 3A)، مما يوحي بأن تم الحفاظ على خصائص الزجاج المطلوبة للتصوير الفلورسنت بما فيه الكفاية. وعلاوة على ذلك، كنا قادرين على توليد حقل زائل وإجراء الفحص المجهري 3D التعمير البصرية العشوائية المباشرة من الضامة تطبق على الأسطح التي تحتوي على سلسلة طويلة الهيدروكربونات (الشكل 3B). مجموعة متنوعة من تقنيات التصوير العيش قابلة للتنفيذ عندما يتم تطبيق الضامة للسطوح (الشكل 4، 1 فيديو تكميلية، تكميلية الفيديو 2).
ويرد في الجدول 1الاستفادة من كل سطح. لاحظ أن معظم تقنيات التصوير المتقدمة التي تتطلب عالية نا النفط غمر أهداف لا تتفق مع معظم الأسطح البلاستيكية فوسوجينيك نظراً لأنها سميكة، وتتمتع بدرجة من أوتوفلوريسسينسي. تجدر الإشارة إلى أن الأسطح تمتز مع المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة تمكن عدد كبير من تقنيات التصوير بما في ذلك12 النخيل/دستورم/جسديم13،،من1415،16، 17، DIC، والبعض الآخر18،19،،من2021 (الجدول 1). وعلاوة على ذلك، ليس فقط بعدد كبير من تقنيات التصوير الممكنة (الجدول 1)، ولكن استخدام ميكروباتيرن يتيح درجة عالية من الرقابة الزمانية المكانية على تشكيل MGC (الشكل 4 باء؛ فيديو تكميلية 1).
الشكل 1 : الأسطح البارافين تمتز على درجة من تضاريس السطح النانو. فؤاد بالأشعة (5 × 5 ميكرومتر) من الأسطح الزجاجية إظهار أي ملامح طوبوغرافية واضحة بينما الأسطح تمتز البارافين تتضمن صفائف مواد تزيين السطح. مقياس الشدة على الجانب الأيمن من كل صورة مجهرية تبين الارتفاع على طول محور ع. أشرطة مقياس هي 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الأسطح تمتز مع المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة تعزيز الانصهار بلعم على تغطية الزجاج. (أ) في غياب إيل-4، يبدو أن هناك عدد قليل جداً من الخلايا مولتينوكليتيد على الأسطح الزجاجية النظيفة كما يحددها وصمة عار رأيت. (ب) ح 24 بعد حضور إيل-4، السطوح تمتز بالمذيبات المستخدمة لجعل سلسلة طويلة من المواد الهيدروكربونية (مثلاً، التولوين أو الأيسوبروبانول) لديها عدد قليل من الخلايا مولتينوكليتيد. (ج–ه) في المقابل، السطوح تمتز مع المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة تعزيز الانصهار وتشكيل MGC. نتائج امتزاز البارافين في أعلى درجة من إيل-4 التي يسببها الانصهار. مجكس يرد باللون الأسود. (و) يظهر الدرجة من خلال تشكيل البلاستيك بيرمان للمقارنة. في كل صورة، والضوء الأزرق يوضح الأنوية ويظهر السيتوبلازم الأرجواني. هي أشرطة مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الأسطح تمتز مع المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة لا تؤثر جذريا القرار. (أ) مقارنة بين 100 نانومتر الخرز نيون مضيئة مع الفحص المجهري مجموع الأسفار التأمل الداخلي (TIRF). اقحم في اللوحة اليسرى العليا طريقة عرض تضخيم حبة فلورسنت مفردة. وكان فرضه الخط الأحمر لإظهار صورة خط مثال المستخدمة لحساب فوم. وقد لوحظ لا اختلاف واضح في فوم من 100 نانومتر الخرز. هي أشرطة مقياس 5 ميكرومتر. (ب) مقارنة توزيع ماك-1 إنتغرين حسب تقييم TIRF والفحص المجهري 3D التعمير البصرية العشوائية المباشرة. تطبيق السطح الذي يحتوي على أوليميدي الضامة والمحتضنة مع إيل-4 ح 24. ويبرز اقحم بيضاء في ب المنطقة المصورة في ميكروجرافس اللاحقة. هي أشرطة مقياس 5 ميكرون للصور TIRF و 2 ميكرومتر ل 3D العاصفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : السطوح تمتز مع المواد الهيدروكربونية سلسلة طويلة تمكين وجهات النظر حل الوقت بلعم الانصهار وينتشر. (أ) الرسم التخطيطي يظهر الإجراء المستخدمة لتوليد ميكروباتيرن. (ب) السطوح ميكروباتيرنيد نقل التحكم الزمانية المكانية للانصهار بلعم. عدة ساعات بعد تطبيق إيل-4، تم تصويرها الضامة مع تباين المرحلة. ملاحظة هجرة الخلايا من داخل الشبكة إلى ميكروباتيرن. ولوحظ الانصهار فقط على ميكروباتيرن. شرطات أبيض مخطط التوسع في MGC. يتم عرض الوقت في الركن الأيسر العلوي من كل صورة مجهرية ك hh:mm:ss. أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. (ج) "الورقة الضوء شعرية" مجهرية20 يكشف عالية الزمانية المكانية ديناميات بلعم الانتشار على سطح تمتز البارافين. لون ترميز توزيع كثافة (الأصفر هو الأكثر كثافة) من اجفب-ليفياكت. إظهار الوقت في الركن الأيمن العلوي من كل صورة مجهرية ك mm:ss. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| السطح: | ||||||
| تقنية | برافين | أوليميدي | الفازلين | البارافين MP | بيرمان | تنظيف الزجاج |
| على النقيض من المرحلة | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| برايتفيلد | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| مدينة دبي للإنترنت | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| ابيفلوريسسينسي | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| [كنفوكل] | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| TIRF | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| النخيل/دستورم/جسديم | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| سيم | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| للسم | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| فهرس الانصهار | متوسطة | متوسطة | متوسطة | عالية | متوسطة | منخفضة |
| موقع الانصهار | عشوائية | عشوائية | عشوائية | تعريف | عشوائية | عشوائية |
| MP--ميكروباتيرن | ||||||
| DIC-تباين التدخل التفاضلية | ||||||
| TIRF-الأسفار الانعكاس الداخلي الكلي | ||||||
| النخيل-مجهرية التعريب فوتواكتيفاتيد | ||||||
| دستورم--الفحص المجهري المباشر التعمير البصرية العشوائية | ||||||
| جسديم-العودة استنزاف الدولة الأرض تليها جزيء فردية | ||||||
| سيم--منظم الإضاءة | ||||||
| STED-يحث إذاعة استنزاف | ||||||
| للسم--شعرية الورقة الخفيفة الميكروسكوب | ||||||
| √--متوافق | ||||||
| x-متوافق | ||||||
| √ *-ممكن فقط مع LWD، وتضخم منخفض، أو أهداف الغمر | ||||||
| N/T--لم يتم اختباره | ||||||
الجدول 1: الاستخدامات المحتملة لكل سطح. لاحظ أن الأسطح البلاستيكية يحول دون استخدام معظم تقنيات التصوير.
تكميلية الفيديو 1: مرحلة حل وقت عرض التباين من خلال تشكيل. ملاحظة التزامن الواضح لتشكيل MGC. يظهر الوقت في hh:mm:ss في الزاوية اليسرى العليا. هو شريط مقياس 50 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
تكميلية الفيديو 2: "ورقة الضوء شعرية" مجهرية 20 من اجفب-ليفيكت ثيوجليكولاتي-وأثارت بلعم تنتشر على سطح بارافين الممتزة. اضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الحاجة إلى تحديد ووضع بعد ذلك الأسطح الزجاجية الجودة البصرية التي تعزز الانصهار بلعم تنبع من حقيقة أن تصور بلعم الانصهار في الإطار العيش حتى لا نشرت مؤخرا دراسة مباشرة العينات3، 4. وهذا يرجع إلى أن فوسوجينيك الأسطح البلاستيكية التي تستخدم عادة تتطلب أهداف LWD وتقتصر إلى حد كبير على مرحلة التباين البصريات. تم التغلب على هذه الحواجز بالهندسة سطح زجاج الجودة البصرية التي شجعت معدلات استثنائية من الانصهار بلعم، بل وإضفاء درجة الدهشة من السيطرة المكانية على تشكيل مجكس.
على الرغم من أن هذه التكنولوجيا يمكن استخدام تقنيات التصوير المتقدمة لرصد الانصهار بلعم، فإنه لا يأتي دون قيد. على الرغم من أن إنتاج أسطح مصقول تمتز مع سلسلة طويلة من المواد الهيدروكربونية (مثلاً، أوليميدي، وشمع البارافين، إلخ) معدلات استثنائية من الانصهار بلعم مقارنة بالأسطح البلاستيكية فوسوجينيك، الانصهار يظل مكانياً العشوائية العملية (الشكل 2). هذا القيد يمنع استخدام أهداف عالية التكبير لتصور الانصهار مع العينات الحية نظراً لأنه من المستحيل التنبؤ بحيث يحدث الانصهار. للتغلب على هذا التحديد، نحن البارافين ميكروباتيرنيد حصر عملية الانصهار لمناطق محددة سلفا (الشكل 4؛ فيديو تكميلية 1). قصر مكانياً بلعم الانصهار ميكروباتيرن مكنتنا من التنبؤ بحيث سوف تحدث الانصهار والاستفادة من ذلك أهداف التكبير العالي لدراسة هذا الحدث عاليا ذوات.
ما هو المغزى من استخدام سطح الجودة البصرية التي يضفي السيطرة المكانية للانصهار بلعم؟ أولاً، منذ هذه الأسطح تعزيز معدلات عالية من الانصهار، فمن الممكن لمراقبة الانصهار من العينات الحية في إطار زمني معقول. وهذا ضروري في حالة الفحص المجهري الأسفار منذ التعرض المتزايد للخلايا للضوء يؤدي إلى فوتوبليتشينج والضيائيه. وثانيا، تمكين هذه السطوح تقنيات التصوير المتقدمة على أساس الأسفار أو الاستقطاب التي ستستخدم (الشكل 4؛ الجدول 1؛ فيديو تكميلية 1؛ فيديو تكميلية 2). أخيرا، ينبغي التعجيل بسيطرة الزمانية المكانية تتيحها السطوح ميكروباتيرنيد الموصوفة في هذا البروتوكول الدراسات الرامية إلى تحديد الآليات الخلوية وسوبسيلولار التي تحكم الانصهار بلعم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
نود أن نشكر أعضاء المختبر أوجاروفا والمحققين في المركز الأيض وبيولوجيا الأوعية الدموية لمناقشة مفيدة لهذا العمل. جيمس فاوست يود أن يعرب عن امتنانه للمدربين في دورة "مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي سوبر قرار الفحص المجهري" في عام 2015. نود أن نشكر ساتيا يذكر في جانيليا للمساعدة في إعداد نموذج للسم. أثناء استعراض وتصوير أجزاء من هذا العمل وأيد جيمس فاوست زمالة T32 (5T32DK007569-28). عنصر "الورقة الضوء شعرية" في هذا العمل أيده HHMI ومؤسسة غوردون مور وبيتي. وتمول تريبهيوفان المعاهد الوطنية للصحة منح HL63199.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S.
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
