Summary
Questo protocollo descrive la realizzazione di superfici di vetro di qualità ottica adsorbito con composti contenenti idrocarburi a catena lunga che possono essere utilizzati per monitorare la fusione del macrofago di esemplari vivi e consente la microscopia di Super-risoluzione di campioni fissati .
Abstract
Visualizzare la formazione di cellule giganti multinucleated (MGCs) da esemplari viventi è stato impegnativo per il fatto che richiedono tecniche di imaging più diretta propagazione della luce attraverso il vetro, ma il vetro fusione del macrofago è un evento raro. Questo protocollo presenta la realizzazione di diverse superfici di vetro di qualità ottica dove adsorbimento di composti contenenti idrocarburi a catena lunga trasforma il vetro in una superficie di fusogena. In primo luogo, la preparazione delle superfici di vetro pulito come materiale di partenza per modifica di superficie è descritto. In secondo luogo, viene fornito un metodo per l'adsorbimento di composti contenenti idrocarburi a catena lunga per convertire non fusogena vetro in un substrato fusogena. In terzo luogo, questo protocollo descrive la fabbricazione di superficie microfantasie che promuovono un alto grado di controllo spatiotemporal sopra formazione MGC. Infine, fabbricando piatti di vetro inferiore è descritto. Vengono illustrati esempi di utilizzo di questo sistema di cellule in vitro come un modello per studiare la fusione del macrofago e formazione MGC.
Introduction
La formazione di MGCs accompagna un numero di stati patologici del corpo umano caratterizzata da infiammazione cronica1. Nonostante l'accordo che mononucleate macrofagi si fondono per formare MGCs2, sorprendentemente pochi studi hanno dimostrato la fusione nel contesto con soggiorno esemplari3,4. Questo è perché le superfici di vetro pulito che sono necessari per la maggior parte delle tecniche di imaging non promuovono la fusione del macrofago quando indotta da citochine infiammatorie5. Infatti, se vetro pulito è usato come substrato per la fusione dei macrofagi quindi bassa e obiettivi intermedi ingrandimento (cioè, 10-20x) e più di 15 h di continuo imaging spesso sono tenuti a osservare un evento unico di fusione.
Sulla mano, fusogena superfici plastiche (ad esempio, permanox) o plastica di qualità batteriologica promuovere fusion2. Tuttavia, imaging attraverso plastica è problematica perché il substrato è spesso e disperde la luce. Questo complica di imaging poiché obiettivi di lungo lavoro distanza (LWD) sono richiesti. Tuttavia, gli obiettivi LWD hanno solitamente bassa capacità rispetto alla loro controparte vetrino coprioggetti-corretta di raccolta della luce. Inoltre, tecniche che sfruttano le modifiche nella polarità della luce che passa attraverso il campione come contrasto differenziale di interferenza sono impossibili, dato che la plastica è birifrangente. Le barriere associate all'uso di plastica sono ulteriormente sottolineate dal fatto che è impossibile prevedere dove si verificheranno formazione fusion/MGC del macrofago sulla superficie. Insieme, queste limitazioni limitano la visualizzazione di fusione dei macrofagi all'ottica di contrasto di fase, estesa totale imaging durate (> 15 ore continue) e bassa risoluzione.
Recentemente abbiamo identificato una superficie di vetro altamente fusogena durante lo svolgimento di microscopia di singola molecola super risoluzione con macrofagi fisso/MGCs4. Questa osservazione è stato sorprendente, perché pulire vetro superfici promuovono fusione al tasso molto basso di ~ 5% dopo 24 h in presenza di interleuchina-4 (IL-4) come determinato dalla fusione di indice4. Abbiamo trovato che la capacità di promuovere la fusione era dovuto contaminazione oleamide. Adsorbimento di oleamide o altri composti che similmente contenuto idrocarburi a catena lunga fatta il fusogena di vetro. La maggior parte fusogena composto (paraffina) era bioerodibili e impartito un alto grado di controllo spatiotemporal fusione del macrofago e un aumento di 2 volte del numero di eventi di fusione osservato entro la stessa quantità di tempo rispetto alla permanox. Queste superfici di qualità ottica fornito il primo assaggio nelle caratteristiche morfologiche e cinetica che presiedono alla formazione di MGCs in esemplari viventi.
In questo protocollo Descriviamo la fabbricazione di una varietà di superfici di vetro che può essere utilizzato per monitorare la formazione di MGCs da esemplari viventi. Inoltre, ci mostra che queste superfici sono favorevoli alle tecniche di Super-risoluzione campo lontano. Montaggio superficiale dipenda l'obiettivo dell'esperimento, e ogni superficie è descritta con gli esempi correlati nel testo procedere.
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Protocol
Le procedure che utilizzano gli animali sono state approvate dalle commissioni di utilizzo presso la Mayo Clinic, Campus di ricerca Janelia e Arizona State University e cura degli animali.
1. preparazione acido-puliti vetro di copertura
Nota: vetro di copertura acquistato da molti produttori non siano pulite come previsto. Considera ordinariamente pulizia lotti di vetro di copertura prima di qualsiasi procedura cui microscopia è coinvolto.
- Acquisto di vetro di copertura di alto rigore. Prestare particolare attenzione a scegliere lo spessore corretto (0.15 o 0,17 mm).
Nota: La scelta di spessore di vetro di copertura dipende l'obiettivo del microscopio ed è elencata direttamente sul barilotto dell'obiettivo. - Incubare il vetro di copertura di 12 M di acido cloridrico in una cappa chimica ben ventilato per 1 h con sonicazione (42 kHz, 70 W). Ripetere questo passaggio per altre due volte con fresco 12 M HCl.
- Riempire un becher separato con acqua ultrapura e aggiungere il vetro di copertura. Sonicare il vetro di copertura per 5-10 min in una cappa chimica ben ventilata. Ripetere questo passaggio dieci volte.
- Incubare il vetro di copertura in acetone puro in una cappa chimica ben ventilata per 30 min con sonicazione. Ripetere questo passaggio per altre due volte.
- Riempire un becher separato con acqua ultrapura sterile e aggiungere il vetro di copertura. Sonicare il vetro di copertura per 5-10 min in una cappa chimica ben ventilata. Ripetere questo passaggio dieci volte.
- Incubare il vetro di copertura in alcool etilico al 100% in una cappa chimica per 30 min con sonicazione. Ripetere questo passaggio due volte.
Nota: La purezza dell'alcole etilico è importante. Contaminanti in forma di solidi dissolti si secca sul vetro e possono promuovere la fusione dei macrofagi. - Per l'archiviazione a lungo termine, è necessario posizionare il vetro di copertura acido-puliti in un contenitore riempito con alcool etilico puro. In alternativa, asciugare il vetro di copertura con gas azoto e conservare in un essiccatore sotto vuoto.
2. preparazione delle superfici fusogena ottico-qualità
- Sciogliere privo di DMSO sovrafusione punto paraffina in toluene ultrapura.
Nota: Concentrazioni di Stock sono fatti a 10 mg/mL e sono diluiti 1:9 in toluene ultrapura per rendere un 1 mg/mL soluzione di lavoro.
Attenzione: Toluene dovrebbe essere maneggiati con cura come un teratogeno. Smaltire il toluene secondo il piano di igiene chimica istituzionale. - Applicare la paraffina soluzione per un vetro di copertura acido-puliti a secco di lavoro ad un volume che copre in modo uniforme sulla superficie del vetro. Decantare la soluzione in eccesso e asciugare il vetro di copertura con gas azoto o aria. Per la preparazione di massa, è necessario utilizzare una vaschetta di Coplin progettato per ospitare il vetro di copertura.
- Lucidare il vetro di copertura da 3 colpi nell'asse x e successiva da 3 colpi sull'asse y con un panno privo di lanugine (Vedi Tabella materiali).
- Immediatamente prima che l'esperimento è condotto, lavare il vetro di copertura con acqua ultrapura sterile e successivamente sterilizzare per 15-30 min con luce ultravioletta in una cappa di sicurezza biologica. In alternativa, è possibile sterilizzare il vetro di copertura da irradiazione di etilene ossido o gamma.
3. Micropatterning idrocarburi contenenti composti di limitare la fusione a predeterminati regioni
- Asciugare il vetro di copertura acido-puliti e immobilizzare il vetro su una superficie piana.
- Con attenzione usando il forcipe, immergere una griglia di finder oro trasmissione microscopia elettronica in una soluzione di lavoro degli idrocarburi presenti. Scegliere un idrocarburo composto che soddisfi l'obiettivo finale dell'esperimento (Vedi tabella 1). Stoppino via soluzione in eccesso battendo delicatamente la griglia su carta da filtro e immediatamente inserire la griglia al centro del coperchio vetro. Consentire il toluene ad asciugare per 2 minuti prima di procedere al passaggio successivo.
- Assicurarsi che la griglia è incollata al vetro capovolgendo delicatamente il vetro. Se la griglia si stacca ripetere il punto 3.2 utilizzando una nuova copertura in vetro.
Nota: Se un plasma cleaner non è disponibile, omettere il punto 3.4. - Al plasma pulire il vetro di copertura dal trattamento con plasma gas vuoto.
Nota: La griglia di finder agisce come una maschera per proteggere la superficie sottostante adsorbita con idrocarburi a catena lunga dal plasma. Le regioni che non sono protetto da griglia sono resi non-fusogena tramite l'esposizione al plasma. La quantità di tempo che il vetro di copertura è esporre al plasma dovrebbe essere determinata empiricamente. - Forcipe ammenda-punta, rimuovere delicatamente con la griglia dalla superficie del vetro per esporre il micropattern.
4. realizzazione di piatti di vetro inferiore
- Praticare un foro circolare di 6-10 mm nella parte inferiore di un 35 mm plastica utilizzando una punta di trivello di passaggio di Petri.
Nota: È fondamentale utilizzare un trapano passo per creare bordi lisci. Se i bordi sono troppo agitati, il vetro di copertura non legherà piatta verso il basso del piatto. Superfici non perfettamente piane rendono difficile la microscopia. - Con attenzione mescolare e degassare elastomero di silicone secondo le istruzioni del produttore (cioè, polidimetilsilossano; PDMS).
- Applicare un sottile strato di elastomero solo prossima al bordo della (vale a dire, che circoscrive) il foro.
Nota: L'elastomero dovrebbe apparire come una banda continua seppur sottile che circonda il buco. - Applicare delicatamente il vetro di copertura fusogena (descritto nella sezione 2) oppure il secco vetro di copertura acido-puliti (descritto nella sezione 1) al piatto al fine di coprire il foro circondato da elastomero. Assicurarsi che il vetro di copertura appare allineato al margine inferiore del piatto e si estende oltre il diametro del foro in modo che una parte notevole del vetro è a contatto con la plastica. Curare l'elastomero da forno a 50 ° C per 2-3 h.
- Se il vetro fusogena è comodo, UV sterilizzare le celle piatto e cultura secondo protocolli standard. Tuttavia, se un micropattern è preferito, procedere al passaggio 3.2 per la preparazione di micropattern (il plasma di gas usato durante micropatterning sterilizza il piatto e fortemente coppie PDMS al vetro).
5. raccolta tioglicolato-suscitata macrofagi
- Iniettare topi C57BL/6 8-week-old con 0,5 mL di soluzione sterile di tioglicolato di 4% Brewer come precedentemente descritto3,4,6.
- Settantadue ore dopo, eutanasia animale secondo la cura degli animali approvato e utilizzare indicazioni e raccogliere macrofagi di lavaggio peritoneale con soluzione salina tampone fosfato ghiacciata completato con acido etilendiamminotetraacetico 5 mM.
- Centrifugare i macrofagi a 300 x g per 3 min e risospendere in 1 mL di DMEM:F12 completati con 15 mM HEPES, 10% FBS e 1% antibiotici (terreno di coltura).
Nota: Le cellule sono contati successivamente con un emocitometro Neubauer. I macrofagi sono diluiti alla concentrazione appropriata e applicati alle superfici. Il numero di celle da applicare ad una determinata superficie dovrebbe essere attentamente considerato dallo sperimentatore allo scopo la questione sperimentale. Consultare standard noti nella letteratura primaria. - Dopo 30 min lavare le superfici con HBSS completati con 0.1% BSA per rimuovere cellule non aderenti e sostituire con terreno di coltura fresco. Riporre le culture nell'incubatore (5% CO2 nell'aria a 37 ° C).
- 2 ore più tardi, aspirare il mezzo e sostituire con cultura supplementato con 10 ng/mL di IL-4. Immagine le celle come descritto altrove4.
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Representative Results
Parametri fisico-chimici dei materiali hanno effetti drammatici sulla portata del macrofago fusion7,8,9,10. Inoltre, i contaminanti di superficie sono conosciuti per promuovere macrofago fusione11. Pertanto, è importante iniziare con pulito vetro di copertura come controllo negativo per la fusione del macrofago. Quando pulite come descritto nel protocollo n. 1, il vetro di copertura è eccezionalmente piatta con non evidenti caratteristiche di superficie, mentre adsorbimento degli idrocarburi a catena lunga seguita da lucidatura superficiale crea un certo grado di nanotopography (Figura 1).
Su superfici di vetro di copertura pulito, macrofagi fusibile ad un tasso molto basso (Figura 2). Al contrario, dopo 24 h in presenza di IL-4, i macrofagi applicati su superfici adsorbite con composti contenenti idrocarburi a catena lunga subiscono la robusta fusione (Figura 2). Ulteriormente, adsorbimento di solo solvente (ad es., toluene, isopropanolo) non fare vetro una superficie fusogena (Figura 2).
Anche se è improbabile che uno strato di 10 nm di idrocarburi adsorbiti colpisce drammaticamente la risoluzione, tuttavia era importante valutare quantitativamente la potenziale differenza di risoluzione tra le varie superfici. Risoluzione è in genere definito dal criterio di Rayleigh. Una metrica alternativa che viene spesso utilizzata per approssimare la risoluzione è larghezza piena a metà altezza (FWHM) delle strutture inferiore rispetto al limite di diffrazione della luce. Cosa importante, non esiste alcuna differenza apparente in FWHM di 100 perline fluorescenti nm tra le varie superfici (Figura 3A), suggerendo che le caratteristiche del vetro necessaria per l'imaging fluorescente sufficientemente sono state conservate. Inoltre, siamo stati in grado di generare un campo evanescente ed eseguire la microscopia ottica stocastica ricostruzione in 3D diretto dei macrofagi applicato su superfici contenenti idrocarburi a catena lunga (Figura 3B). Una varietà di tecniche di imaging live sono fattibile quando i macrofagi sono applicati alle superfici (Figura 4, Supplemental Video 1, Video 2 supplementare).
Il vantaggio di ogni superficie è descritto nella tabella 1. Si noti che la maggior parte delle tecniche di imaging avanzate che richiedono elevati obiettivi di immersione olio NA è compatibile con la maggior parte delle superfici di plastica fusogena poiché sono spessi e hanno un grado di autofluorescenza. Va notato che le superfici adsorbite con idrocarburi a catena lunga attiva un gran numero di tecniche di formazione immagine compreso12 PALM/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, DIC e altri18,19,20,21 (tabella 1). Inoltre, non solo sono un gran numero di tecniche di imaging possibili (tabella 1), ma l'uso di un micropattern consente un elevato grado di controllo spatiotemporal sopra formazione MGC (Figura 4B; Video supplementare 1).
Figura 1 : Paraffina adsorbito superfici hanno un grado di topografia di superficie su scala nanometrica. Scansioni AFM (5 x 5 µm) di superfici di vetro non mostrano evidenti caratteristiche topografiche mentre paraffina-adsorbito superfici contengono matrici di decorare la superficie del materiale. La scala di intensità sul lato destro di ogni microfotografia Mostra altezza lungo l'asse z. Le barre di scala sono 500 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Superfici adsorbite con idrocarburi a catena lunga promuovono macrofago fusione vetro di copertura. (A) In assenza di IL-4, ci sembra essere molto poche cellule multinucleate su superfici di vetro pulito come determinato dalla macchia del Wright. (B) dopo 24 h in presenza di IL-4, superfici adsorbite con solvente usato per solubilizzare la lunga catena di idrocarburi (ad es., toluene o isopropanolo) hanno poche cellule multinucleate. (C–E) Al contrario, superfici adsorbite con idrocarburi a catena lunga promuovono la formazione di MGC e fusione. Risultati di adsorbimento di paraffina al massimo grado di IL-4 ha indotto la fusione. MGCs sono contornate di nero. (F) il grado di formazione MGC su permanox plastica è indicato per il confronto. In ogni immagine, luce blu Mostra i nuclei e citoplasma appare viola. Le barre di scala sono 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Superfici adsorbite con idrocarburi a catena lunga non influenzano drasticamente risoluzione. (A) confronto di 100 perline fluorescenti nm illuminato con microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF). L'inserto nel pannello di sinistra superiore è una vista ingrandita una singola perlina fluorescente. La linea rossa è stata sovrapposta per mostrare un esempio di profilo di linea utilizzato per calcolare la FWHM. È stata osservata alcuna differenza apparente in FWHM di 100 perline nm. Le barre di scala sono 5 µm. (B) confronto della distribuzione di Mac-1 integrina come valutato da TIRF e microscopia ottica stocastica ricostruzione in 3D diretto. Macrofagi sono stati applicati a una superficie contenente oleamide e incubati con IL-4 per 24 h. L'inserto bianco in B gli highlights della regione imaged in micrografi successive. Le barre di scala sono 5 µm per le immagini TIRF e 2 µm per 3D STORM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Superfici adsorbite con idrocarburi a catena lunga abilitare le visualizzazioni risolta in tempo di fusione del macrofago e diffondere. (A), il diagramma mostra la procedura utilizzata per generare un micropattern. (B) superfici bioerodibili impartire spatiotemporal controllo della fusione del macrofago. Diverse ore dopo l'applicazione di IL-4, i macrofagi erano imaged con contrasto di fase. Nota la migrazione delle cellule dall'interno della griglia sulla micropattern. Fusione è stata osservata solo la micropattern. I trattini bianchi delineano l'espansione di un MGC. Ora viene mostrata nell'angolo superiore sinistro di ogni Micrografo come HH.mm.SS. Le barre di scala sono 50 µm. (C) foglio di Lattice luce microscopia20 rivela spatiotemporal dinamica elevata di un macrofago diffusione su una superficie di paraffina-adsorbito. Colore consente di codificare la distribuzione di intensità (giallo è più intenso) di eGFP-LifeAct. Ora viene visualizzata in alto a destra di ogni Micrografo come mm:ss. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Superficie: | ||||||
| Tecnica | Paraffina | Oleamide | Petrolato | Paraffina MP | Permanox | Vetro pulito |
| contrasto di fase | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| campo chiaro | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| epifluorescenza | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| confocale | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| TIRF | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| PALM/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| Indice di fusione | intermedio | intermedio | intermedio | alta | intermedio | basso |
| Posizione di fusione | casuale | casuale | casuale | definito | casuale | casuale |
| MP-micropattern | ||||||
| DIC - contrasto differenziale di interferenza | ||||||
| TIRF - fluorescenza di riflessione interna totale | ||||||
| PALM - microscopia di localizzazione di fotoattivazione | ||||||
| dSTORM - microscopia diretta ricostruzione ottica stocastica | ||||||
| GSDIM - svuotamento dello stato fondamentale seguito da singola molecola restituire | ||||||
| SIM - illuminazione strutturata | ||||||
| STED - svuotamento stimolato dell'emissione | ||||||
| LLSM - microscopia foglio leggero della grata | ||||||
| √ - compatibile | ||||||
| x - incompatibile | ||||||
| √ * - possibile solo con LWD, basso ingrandimento o obiettivi di immersione | ||||||
| N/T - non testato | ||||||
Tabella 1: usi potenziali di ciascuna superficie. Si noti che le superfici in plastica precludono l'uso della maggior parte delle tecniche di imaging.
Supplementare Video 1: vista di contrasto di fase risolta in tempo di formazione MGC. Si noti la sincronicità apparente della formazione MGC. Ora viene indicata in HH: mm: in alto a sinistra. La barra della scala è 50 µm. per favore clicca qui per scaricare questo video.
Supplementare Video 2: microscopia della grata luce foglio 20 di un macrofago tioglicolato-suscitata eGFP-LifeAct diffusione su una superficie di paraffina adsorbiti. Per favore clicca qui per scaricare questo video.
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Discussion
La necessità di identificare e successivamente sviluppare superfici di vetro di qualità ottica che promuovono la fusione del macrofago derivava dal fatto che fino a Studio non pubblicato di recente direttamente visualizzate fusione del macrofago nel contesto di vita esemplari3, 4. Questo è dovuto al fatto che fusogena superfici di plastica che sono comunemente usate richiedono obiettivi LWD e sono in gran parte limitate a ottica di contrasto di fase. Questi ostacoli sono stati superati da una superficie di vetro di qualità ottica che non solo ha promosso straordinari tassi di fusione del macrofago, ma ha impartito un sorprendente grado di controllo spaziale sopra la formazione di MGCs di ingegneria.
Anche se questa tecnologia consente di utilizzare tecniche avanzate di imaging per monitorare la fusione del macrofago, non viene senza alcuna limitazione. Anche se le superfici lucidate adsorbite con idrocarburi a catena lunga (ad es., oleamide, paraffina, ecc.) producono straordinari tassi di fusione del macrofago rispetto alle superfici in plastica fusogena, fusione rimane un spazialmente stocastico processo (Figura 2). Questa limitazione impedisce l'utilizzo di obiettivi ad alto ingrandimento per visualizzare fusione con esemplari viventi, dal momento che è impossibile prevedere dove si verificherà la fusione. Per superare questo limite, abbiamo bioerodibili paraffina per confinare il processo di fusione a regioni predeterminate (Figura 4; Video supplementare 1). Spazialmente confinare fusion del macrofago e la micropattern ci ha permesso di prevedere dove fusione sarebbe verificarsi e quindi utilizzare più alti obiettivi di ingrandimento per studiare questo evento altamente animato.
Qual è il significato di utilizzare una superficie di qualità ottica che impartisce controllo spaziale della fusione del macrofago? In primo luogo, poiché queste superfici promuovono alti tassi di fusione, è possibile monitorare la fusione da esemplari viventi entro un ragionevole lasso di tempo. Ciò è essenziale nel caso di microscopia di fluorescenza, poiché una maggiore esposizione delle cellule alla luce conduce al photobleaching e fototossicità. In secondo luogo, queste superfici consentono tecniche avanzate di imaging basate sulla fluorescenza o polarizzazione da impiegare (Figura 4; Tabella 1; Video supplementare 1; Video supplementare 2). Infine, il controllo spatiotemporal accordato dalle superfici bioerodibili descritte nel presente protocollo dovrebbe accelerare gli studi hanno progettato per identificare i meccanismi cellulari e subcellulari che governano la fusione del macrofago.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Desideriamo ringraziare i membri del laboratorio di Ugarova e gli investigatori nel centro per biologia vascolare e metabolica per utile discussione su quest'opera. James Faust desidera esprimere la sua gratitudine agli istruttori presso il corso di biologia molecolare europeo laboratorio Super risoluzione microscopia nel 2015. Desideriamo ringraziare Satya Khuon al Janelia per informazioni sulla preparazione del campione per LLSM. Durante la revisione e filmare parti di questo lavoro James Faust è stato supportato da una borsa di studio T32 (5T32DK007569-28). Il componente foglio di Lattice luce di quest'opera è stato sostenuto dal HHMI e Betty e Gordon Moore Foundation. T.U. è finanziato dal NIH concedere HL63199.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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