Summary
Dit protocol beschrijft de fabricage van optische kwaliteit glazen oppervlakken geadsorbeerde met verbindingen met lange-keten-koolwaterstoffen die kunnen worden gebruikt voor het controleren van macrofaag fusie van levende specimens en super resolutie microscopie van vaste specimens in staat stelt .
Abstract
Visualiseren van de vorming van multinucleaire reus cellen (MGCs) van levende specimens heeft zijn uitdagend wijten aan het feit dat meest levende imaging technieken voortplanting van het licht door glas vereisen, maar op glas macrofaag fusion een zeldzame gebeurtenis is. Dit protocol stelt de fabricage van verschillende optische kwaliteit glazen oppervlakken waar adsorptie van verbindingen met lange-keten koolwaterstoffen glas transformeert in een fusogenic oppervlak. Voor het eerst, voorbereiding van schone glazen oppervlakken als grondstof voor oppervlakte modificatie is beschreven. Ten tweede, een methode wordt alleen ondersteund voor de adsorptie van verbindingen met lange-keten koolwaterstoffen om te converteren van niet-fusogenic glas naar een fusogenic ondergrond. Ten derde, wordt dit protocol beschreven fabricage van oppervlakte micropatterns ter bevordering van een hoog beschermingsniveau Spatio controle over MGC vorming. Tot slot is het fabriceren van glazen bodem gerechten wordt beschreven. Voorbeelden van gebruik van deze cel in vitro stelsel als een model te bestuderen macrofaag fusion en MGC vorming zijn weergegeven.
Introduction
De vorming van MGCs begeleidt een aantal pathologische toestanden in het menselijk lichaam gekenmerkt door chronische ontsteking1. Ondanks het akkoord dat macrofagen van mononucleated fuse aan formulier MGCs2, verrassend weinig studies hebben aangetoond fusion in verband met levende specimens3,4. Dit is omdat de macrofaag fusion wanneer geïnduceerd door inflammatoire cytokines5zijn niet bevorderlijk voor schone glazen oppervlakken die vereist voor de meeste beeldvormingstechnieken zijn. Inderdaad, als schoon glas wordt gebruikt als substraat voor macrophage fusion, vervolgens laag tot vergroting van de tussentijdse doelstellingen (dat wil zeggen, 10-20 X) en meer dan 15 uur continue imaging vaak moeten observeren van een enkele fusion-gebeurtenis.
Op de andere hand, fusogenic kunststof oppervlakken (bijvoorbeeld, permanox) of bacteriologische kwaliteit kunststof fusion2te bevorderen. Beeldvorming door middel van kunststof is echter problematisch omdat het substraat dik is en licht verstrooit. Dit compliceert imaging sinds lang werkende afstand (LWD) doelstellingen nodig zijn. LWD doelstellingen hebben echter meestal weinig licht het verzamelen van de capaciteit in vergelijking met hun tegenhanger dekglaasje aan-gecorrigeerd. Verder zijn technieken die gebruik maken van de veranderingen in de polariteit van het passeren van het model zoals differentiële interferentie contrast licht niet onmogelijk omdat kunststof birefringent. De belemmeringen die zijn gekoppeld aan het gebruik van kunststof zijn verder onderstreept door het feit dat het is onmogelijk om te voorspellen waar de macrofaag fusion/MGC vorming zal plaatsvinden op het oppervlak. Samen, deze beperkingen beperken de visualisatie van macrofaag fusie aan fase contrast optica, totale imaging duur verlengd (> 15 ononderbroken uur), en lage resolutie.
We onlangs geïdentificeerd een zeer fusogenic glazen oppervlak terwijl het uitvoeren van single-molecuul super resolutie microscopie met vaste macrofagen/MGCs4. Deze observatie was verrassend omdat schoon glas oppervlakken bevorderen fusion zeer laag debiet van ~ 5% na 24 uur in aanwezigheid van Interleukine-4 (IL-4), zoals bepaald door de fusie index4. We vonden dat de capaciteit ter bevordering van kernfusie te wijten aan oleamide besmetting was. Adsorptie van oleamide of andere verbindingen die ook lange-keten koolwaterstoffen maakte de glazen fusogenic. De meeste fusogenic samengestelde (paraffine) was micropatterned, en het een hoge mate van Spatio beheersing van de macrofaag fusion en een 2-fold stijging van het aantal fusion gebeurtenissen in dezelfde hoeveelheid tijd in vergelijking met permanox waargenomen bijgebracht. Deze optische kwaliteit oppervlakken verschaft de eerste glimp in de morfologische kenmerken en kinetiek die gelden voor de vorming van MGCs in levende specimens.
In dit protocol beschrijven we de fabricage van een verscheidenheid van glazen oppervlakken die kan worden gebruikt voor het controleren van de vorming van MGCs van levende specimens. Bovendien laten we zien dat deze oppervlakken vatbaar voor ver-veld super resolutie technieken zijn. Oppervlakte fabricage is afhankelijk van het doel van het experiment, en elk oppervlak met verwante voorbeelden in de tekst van de procedure wordt beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Procedures die gebruik maken van dieren werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik comités op Mayo Clinic, Janelia Research Campus en Arizona State University.
1. voorbereiding van de zuur-gereinigd Cover glas
Opmerking: Cover glas gekocht bij veel fabrikanten wellicht niet zo schoon zoals verwacht. Overwegen regelmatig schoonmaken batches van dekking glas vóór elke procedure waar microscopie is betrokken.
- Koop hoge starheid cover glas. Zorg om te kiezen van de juiste dikte (0,15 of 0,17 mm).
Opmerking: De keuze van cover glasdikte is afhankelijk van de doelstelling van de Microscoop en staat direct op het objectieve vat. - Incubeer het glas van de cover in de 12 M zoutzuur in een goed geventileerde chemische zuurkast voor 1 h met ultrasoonapparaat (42 kHz, 70 W). Herhaal deze stap voor aanvullende tweemaal met vers 12 M HCl.
- Vul een afzonderlijk bekerglas met ultrazuiver water en voeg de glazen cover. Bewerk ultrasone trillingen ten het glas cover voor 5-10 min in een goed geventileerde chemische kap. Herhaal deze stap tien keer.
- Incubeer het glas van de cover in pure aceton in een goed geventileerde chemische kap voor 30 min met ultrasoonapparaat. Herhaal deze stap voor aanvullende tweemaal.
- Vul een afzonderlijk bekerglas met steriele ultrazuiver water en voeg de glazen cover. Bewerk ultrasone trillingen ten het glas cover voor 5-10 min in een goed geventileerde chemische kap. Herhaal deze stap tien keer.
- Incubeer het glas van de cover in 100% ethylalcohol in een chemische kap voor 30 min met ultrasoonapparaat. Herhaal deze stap twee extra keer.
Opmerking: De zuiverheid van de ethyl alcohol is belangrijk. Verontreinigende stoffen in de vorm van opgeloste vaste stoffen zal droog op het glas en macrofaag fusion kunnen bevorderen. - Voor langdurige opslag, plaatst u het glas cover zuur-gereinigd in een container gevuld met zuivere ethylalcohol. U kunt ook droog de cover glas met stikstofgas en winkel in een vacuüm exsiccator.
2. bereiding van Fusogenic optische hoogwaardige oppervlakken
- Ontbinden DMSO-gratis high-smelten van punt paraffine in ultrazuiver tolueen.
Opmerking: Voorraad concentraties zijn gemaakt bij 10 mg/mL, en zijn verdunde 1:9 in ultrazuiver tolueen te maken een 1 mg/mL werkoplossing.
Let op: Tolueen moet voorzichtig behandeld worden als een teratogen. Buitengebruikstelling van tolueen volgens de institutionele chemische hygiëneplan. - Toepassing van de paraffine werkoplossing aan een droog zuur-gereinigd cover glas op een volume dat evenredig betrekking heeft op het glasoppervlak. Decanteren overtollige oplossing en droog de cover glas met stikstofgas of lucht. Voorbereiding van de bulk, gebruiken een pot van de Coplin ontworpen voor de glazen cover.
- De cover glas Pools door 3 slagen in de x-as en volgende 3 lijnen in de y-as met een pluisvrije doekje (Zie Tabel van materialen).
- Onmiddellijk voordat het experiment wordt uitgevoerd, het glas van de cover met steriele ultrazuiver water wassen en vervolgens steriliseren gedurende 15-30 min met ultraviolet licht in een biologische veiligheid kap. Als alternatief, steriliseren het glas cover in ethyleen oxide of gamma straling.
3. Micropatterning koolwaterstoffen bevattende verbindingen beperken Fusion aan vooraf bepaalde regio 's
- Droog het glas cover zuur-gereinigd en immobiliseren van het glas op een vlakke ondergrond.
- Met behulp van Tang, onderdompelen zorgvuldig een gouden elektronenmicroscopie finder transmissienet in een werkende oplossing van de koolwaterstof verbinding(en). Kies een koolwaterstof samengestelde die voldoet aan het uiteindelijke doel van het experiment (Zie tabel 1). Pit weg overtollige oplossing door zachtjes te tikken op het raster op filterpapier, en onmiddellijk het raster te plaatsen in het midden van het glas van de cover. Laat de tolueen drogen gedurende 2 minuten voordat u verdergaat met de volgende stap.
- Controleer of dat het raster is gebonden aan het glas door zachtjes het omkeren van het glas. Als het raster Herhaal stap 3.2 met behulp van een nieuwe cover glas wordt.
Opmerking: Als een plasma reiniger niet beschikbaar is, weglaten stap 3.4. - Plasma schoon het glas cover door behandeling met vacuüm gasplasma.
Opmerking: De finder-net fungeert als een masker ter bescherming van het onderliggende oppervlak geadsorbeerde met lange-keten koolwaterstoffen uit het plasma. De regio's die zijn onbeschermd door het raster zijn niet-fusogenic door de blootstelling aan plasma geworden. De hoeveelheid tijd die het glas cover bloot aan plasma is moet empirisch worden bepaald. - Met behulp van fine-tip pincet, verwijder voorzichtig het raster van het glasoppervlak bloot van de micropattern.
4. het fabriceren van glazen bodem gerechten
- Boor een 6-10 mm ronde gat in de bodem van een 35-mm plastic petrischaal met behulp van een boor stap.
Opmerking: Het is cruciaal met een boor van de stap maken van schermlettertypen bijwerken. Als randen te ruw, zal niet het glas cover band plat aan de onderkant van de schotel. Onvolkomen vlakke oppervlakken bemoeilijken microscopie. - Zorgvuldig mixen en ontgas silicone-elastomeer volgens de instructies van de fabrikant (d.w.z., Polydimethylsiloxaan; PDMS).
- Een dunne laag van elastomeer alleen naaste aan de rand van toepassing (d.w.z., gedeelten) het gat.
Opmerking: De elastomeer moet worden weergegeven als een ononderbroken zij dunne band rond het gat. - Zachtjes toepassen of het fusogenic cover glas (beschreven in sectie 2), of het droog zuur-gereinigd cover glas (beschreven in sectie 1) de schotel ter dekking van het gat omgeven door elastomeer. Ervoor zorgen dat het glas cover uitgelijnd met de onderkant van de schotel verschijnt en de diameter van het gat overschrijdt, zodat een aanzienlijk deel van het glas in contact met de plastic is. De elastomeer genezen door het baksel bij 50 ° C gedurende 2-3 uur.
- Indien de voorkeur wordt fusogenic glas, UV steriliseren de schotel en cultuur cellen volgens standaardprotocollen. Echter als de voorkeur wordt gegeven aan een micropattern, gaat u verder met stap 3.2 voorbereiding op de micropattern (de gasplasma gebruikt tijdens micropatterning Steriliseert de schotel en sterk paren PDMS aan glas).
5. het verzamelen van macrofagen Thioglycollate-ontlokte
- Injecteren 8-week-oude C57BL/6 muizen met 0,5 mL van een steriele oplossing van 4% Brewer's thioglycollate als eerder beschreven3,4,6.
- Tweeënzeventig uur later, euthanaseren het dier volgens goedgekeurde dierenverzorgers en gebruiken van richtsnoeren en verzamelen van macrofagen door peritoneale lavage met ijskoude-fosfaatgebufferde zoutoplossing aangevuld met 5 mM ethyleendiaminetetraacetaat.
- Centrifugeer de macrofagen bij 300 x g gedurende 3 min en resuspendeer in 1 mL DMEM:F12 aangevuld met 15 mM HEPES, 10% FBS, en 1% antibiotica (kweekmedium).
Opmerking: De cellen worden vervolgens geteld met een Neubauer-hemocytometer. Macrofagen zijn naar de geschikte concentratie verdund en toegepast op de oppervlakken. Het aantal cellen toe te passen op een bepaald oppervlak moet zorgvuldig worden overwogen door de onderzoeker ten behoeve van de experimentele vraag. Bekende normen in de primaire literatuur te raadplegen. - Na 30 min was de oppervlakken met HBSS aangevuld met 0,1% BSA niet-aanhanger cellen verwijderen en vervangen door verse kweekmedium. De culturen terugkomen in de incubator (5% CO2 in lucht bij 37 ° C).
- 2 uur later, gecombineerd het medium en vervangt door cultuurmedium aangevuld met 10 ng/mL voor IL-4. Het imago van de cellen zoals elders beschreven4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fysisch-chemische parameters van materialen dramatische gevolgen hebben voor de omvang van de macrofaag fusion7,8,9,10. Oppervlakte verontreinigingen zijn bovendien bekend om macrofaag fusion11. Daarom is het belangrijk om te beginnen met schone cover glas als een negatieve controle voor macrophage fusion. Wanneer schoongemaakt zoals beschreven in protocol 1, is het glas van de cover uitzonderlijk appartement met geen voor de hand liggende oppervlaktekenmerken, terwijl adsorptie van lange-keten koolwaterstoffen, gevolgd door het oppervlakte polijsten een zekere mate van nanotopography (Figuur 1 creëert).
Op schone cover glazen oppervlakken zekering macrofagen tegen een zeer laag tarief (Figuur 2). Na 24 uur in aanwezigheid van de IL-4 ondergaan de macrofagen toegepast op oppervlakken geadsorbeerde met verbindingen met lange-keten koolwaterstoffen daarentegen robuuste fusion (Figuur 2). Verder, adsorptie van oplosmiddel alleen (b.v., tolueen, isopropanol) maakt geen glas een fusogenic oppervlak (Figuur 2).
Hoewel het onwaarschijnlijk dat een laag 10-nm geadsorbeerde koolwaterstoffen, sterk van invloed is op resolutie is, was het toch belangrijk om kwantitatief beoordelen de mogelijke verschil in resolutie tussen de verschillende oppervlakken. Resolutie wordt meestal gedefinieerd door het criterium van Rayleigh. Een alternatieve metric die vaak gebruikt wordt om de onderlinge aanpassing van de resolutie is full-breedte op halve maximum (FWHM) van structuren die kleiner is dan de limiet van de diffractie van licht. Nog belangrijker is, is er geen duidelijk verschil in FWHM van 100 nm fluorescerende kralen onder de verschillende oppervlakken (figuur 3A), wat suggereert dat de kenmerken van glas vereist voor fluorescerende imaging voldoende werden bewaard. Bovendien konden we voor het genereren van een vluchtig veld en uitvoeren van stochastische optische 3D directe reconstructie microscopie van de macrofagen toegepast op oppervlakken met lange-keten koolwaterstoffen (figuur 3B). Een verscheidenheid van live-imaging technieken zijn haalbaar wanneer macrofagen worden toegepast op de oppervlakken (Figuur 4, aanvullende Video 1, aanvullende Video 2).
Het voordeel van elk oppervlak wordt beschreven in tabel 1. Merk op dat de meerderheid van de geavanceerde beeldvormende technieken die hoge nb olie onderdompeling doelstellingen vereisen onverenigbaar met de meeste fusogenic kunststofoppervlakken zijn aangezien ze dik zijn, en een zekere mate van autofluorescence hebben. Opgemerkt moet worden dat oppervlakten geadsorbeerde met lange-keten koolwaterstoffen in staat een groot aantal beeldvormingstechnieken stellen, inclusief12 PALM/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, DIC, e.a.18,19,20,21 (tabel 1). Bovendien zijn niet alleen een groot aantal beeldvormingstechnieken mogelijk (tabel 1), maar het gebruik van een micropattern kan een hoge mate van Spatio controle over MGC vorming (figuur 4B; Aanvullende Video 1).
Figuur 1 : Paraffine geadsorbeerde oppervlakken hebben een zekere mate van nanoschaal oppervlakte topografie. AFM scans (5 x 5 µm) van glazen oppervlakken tonen geen voor de hand liggende topografische kenmerken overwegende dat paraffine-geadsorbeerde oppervlakken bevatten arrays van materiaal voor het verfraaien van het oppervlak. De schaal van de intensiteit aan de rechterkant van elke opname wordt weergegeven hoogte langs de z-as. De schaal bars zijn 500 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Oppervlakken geadsorbeerde met lange-keten koolwaterstoffen bevorderen macrofaag fusion op cover glas. (A) bij het ontbreken van IL-4, lijkt er weinig multinucleaire cellen op schone glazen oppervlakken zoals bepaald door Wrights vlek. (B) na 24 h in de aanwezigheid van IL-4, oppervlakken geadsorbeerde met oplosmiddel gebruikt om te solubilize lange keten koolwaterstoffen (bijvoorbeeld, tolueen of isopropanol) hebben enkele multinucleaire cellen. (C--E) Daarentegen bevorderen oppervlakken geadsorbeerde met lange-keten koolwaterstoffen fusion en MGC vorming. Paraffine adsorptie resultaten in de hoogste graad van IL-4 geïnduceerde fusion. MGCs worden beschreven in het zwart. (F) de mate van MGC vorming op permanox plastic weergegeven voor vergelijking. In elk beeld, lichtblauw toont kernen en het cytoplasma wordt paars weergegeven. De schaal bars zijn 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Oppervlakken geadsorbeerde met lange-keten koolwaterstoffen resolutie niet drastisch beïnvloeden. (A) vergelijking van 100 nm fluorescerende kralen verlicht met microscopie van de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF). De inzet in het bovenste linker paneel is een vergrote weergave van een enkele fluorescerende kraal. De rode lijn was bovenop om aan te tonen een voorbeeld regel profiel gebruikt voor de berekening van de FWHM. Geen duidelijk verschil in FWHM van 100 nm kralen werd waargenomen. De schaal bars zijn 5 µm. (B) vergelijking van de verdeling van Mac-1 integrine zoals beoordeeld door TIRF en stochastische optische 3D directe reconstructie microscopie. Macrofagen waren aangebracht op een oppervlak van oleamide-bevattende en geïncubeerd met IL-4 gedurende 24 uur. De witte inzet in B wijst op de regio beeld in latere microfoto. De schaal bars zijn 5 µm voor de TIRF beelden en 2 µm voor 3D STORM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Oppervlakken geadsorbeerde met lange-keten koolwaterstoffen inschakelen time-resolved uitzicht op macrophage fusion en verspreiding. (A) het diagram toont de procedure gebruikt voor het genereren van een micropattern. (B) Micropatterned oppervlakken geven Spatio controle van macrofaag fusion. Enkele uren na de toepassing van de IL-4, waren de macrofagen beeld met fase contrast. Opmerking de migratie van de cellen van de binnenkant van het raster op de micropattern. Fusion werd waargenomen alleen op de micropattern. De witte streepjes Maak een overzicht van de uitbreiding van een MGC. Tijd wordt weergegeven in de linkerbovenhoek van elke opname als uu. De schaal bars zijn 50 µm. (C) Lattice licht blad microscopie20 onthult hoge Spatio dynamiek van een macrofaag verspreiden op een oppervlak van paraffine-geadsorbeerd. Kleur codeert de distributie-intensiteit (gele is meest intense) van eGFP-LifeAct. Tijd wordt weergegeven in de rechterbovenhoek van elke opname als mm:ss. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Oppervlakte: | ||||||
| Techniek | Paraffine | Oleamide | Petrolatum | MP paraffine | Permanox | Schoon glas |
| fase contrast | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| helderveld | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| epifluorescence | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| confocale | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| TIRF | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| PALM/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| Fusion Index | tussentijdse | tussentijdse | tussentijdse | hoge | tussentijdse | lage |
| Fusion locatie | willekeurige | willekeurige | willekeurige | gedefinieerd | willekeurige | willekeurige |
| MP-micropattern | ||||||
| DIC - differential-interference-contrast | ||||||
| TIRF - totale interne reflectie fluorescentie | ||||||
| PALM - photoactivated lokalisatie microscopie | ||||||
| dSTORM - directe stochastische optische wederopbouw microscopie | ||||||
| GSDIM - uitputting van de grondtoestand gevolgd door individuele molecuul retourneren | ||||||
| SIM - gestructureerde verlichting | ||||||
| STED - gestimuleerde emissie uitputting | ||||||
| LLSM - rooster licht blad microscopie | ||||||
| √ - compatibel | ||||||
| x - niet onverenigbaar | ||||||
| √ * - alleen mogelijk met LWD, lage vergroting of onderdompeling doelstellingen | ||||||
| N/T - niet getest | ||||||
Tabel 1: potentieel gebruik van elk oppervlak. Merk op dat de kunststofoppervlakken beletsel voor het gebruik van de meeste beeldvormingstechnieken.
Aanvullende Video 1: Time-resolved fase contrast weergave van MGC formatie. Opmerking de schijnbare synchroniciteit van de MGC-formatie. Tijd wordt weergegeven in de UU in de hogere linkerhoek. De bar van de schaal is 50 µm. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende Video 2: Lattice licht blad microscopie 20 van een thioglycollate-ontlokte eGFP-LifeAct macrofaag verspreiden op een paraffine geadsorbeerde oppervlak. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De noodzaak om te identificeren en vervolgens het ontwikkelen van optische kwaliteit glazen oppervlakken die macrofaag fusion bevorderen vloeide voort uit het feit dat tot onlangs niet gepubliceerde studie direct gevisualiseerd macrofaag fusie in het kader van levende specimens3, 4. Dit is de wijten aan het feit dat fusogenic kunststofoppervlakken, die vaak worden gebruikt LWD doelstellingen vereisen en grotendeels beperkt tot de fase contrast optiek zijn. Deze hindernissen werden overwonnen door engineering een optische kwaliteit glazen oppervlak dat niet alleen bevorderd buitengewone tarieven van macrofaag fusie, maar een verrassende mate van ruimtelijke controle over de vorming van MGCs bijgebracht.
Hoewel deze technologie het gebruik van geavanceerde beeldvormende technieken maakt volgen macrofaag fusion, komt het niet zonder beperking. Hoewel de gepolijste oppervlakken geadsorbeerde met lange-keten koolwaterstoffen (bijvoorbeeld, oleamide, paraffine, etc.) buitengewone tarieven van macrofaag fusie in vergelijking met fusogenic kunststofoppervlakken produceren, blijft fusion een ruimtelijk stochastische proces (Figuur 2). Deze beperking zich verzet tegen het gebruik van hoge vergroting doelstellingen te visualiseren van fusion met levende specimens, want het is onmogelijk om te voorspellen waar de fusie zal plaatsvinden. Om deze beperking te overwinnen wij micropatterned paraffine te beperken tot het proces van de kernfusie aan vooraf bepaalde gebieden (Figuur 4; Aanvullende Video 1). Ruimtelijk beperken macrofaag fusie aan de micropattern ons in staat gesteld om te voorspellen waar de fusie zou optreden en daarom gebruik maken van hogere vergroting doelstellingen om te bestuderen van dit zeer animatie evenement.
Wat is de betekenis van het gebruik van een optische kwaliteit oppervlak dat ruimtelijke controle van macrofaag fusie worden doorgegeven? Eerst, aangezien deze oppervlakken hoge tarieven van kernfusie bevorderen, is het mogelijk om te controleren van de fusie van levende specimens binnen een redelijke termijn. Dit is essentieel in het geval van fluorescentie microscopie aangezien verhoogde blootstelling van cellen aan licht tot photobleaching en fototoxiciteit leidt. Ten tweede, deze oppervlakken kunnen geavanceerde beeldvormende technieken op basis van de fluorescentie- of polarisatie te worden gebruikt (Figuur 4; Tabel 1; Aanvullende Video 1; Extra Video 2). Tot slot moet het Spatio besturingselement die wordt geboden door de oppervlakken van de micropatterned beschreven in dit protocol studies die zijn ontworpen om te identificeren van de cellulaire en subcellular mechanismen die macrofaag fusion regeren versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Wij wensen dank aan leden van het Ugarova laboratorium en onderzoekers in het midden voor Metabolic en vasculaire biologie voor nuttige discussie van dit werk. James Faust wil zijn dank betuigen aan de instructeurs op de Europese moleculaire biologie laboratorium Super resolutie microscopie cursus in 2015. Wij willen bedanken Satya Khuon op Janelia voor hulp bij de bereiding van de monsters voor LLSM. Tijdens de beoordeling en filmen delen van dit werk werd James Faust ondersteund door een T32 Fellowship (5T32DK007569-28). De Lattice licht blad component van dit werk werd gesteund door HHMI en Betty en Gordon Moore Foundation. T.U. wordt gefinancierd door de NIH HL63199 verlenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S.
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
