Summary
Bu iletişim kuralı, makrofaj füzyon yaşam örneklerin izlemek için kullanılan ve süper çözünürlük mikroskobu sabit örneklerin sağlayan uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler ile adsorbe kaliteli optik cam yüzeyler imalatı açıklar .
Abstract
Multinucleated dev hücreler (MGCs) oluşumunu yaşam örnekler görüntülenmesi en canlı görüntüleme teknikleri cam aracılığıyla ışık yayılmasını gerektirir, ancak camına makrofaj füzyon nadir bir olaydır nedeniyle aslında bu zor oldu. Bu iletişim kuralı birkaç kaliteli optik cam yüzeyler imalatı nerede adsorpsiyon uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşiklerin fusogenic yüzey içine cam dönüşümleri sunar. İlk olarak, hazırlık temiz cam yüzeylerin yüzey modifikasyonu için malzeme başlangıç olarak tanımlanır. İkincisi, bir yöntem adsorpsiyon sigara fusogenic cam fusogenic substrat dönüştürmek için uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler için sağlanmıştır. Üçüncü olarak, bu iletişim kuralını MGC oluşumu üzerinde kronolojik zamanmekansal kontrol yüksek derecede teşvik yüzey micropatterns imalatı açıklar. Son olarak, cam alt yemekleri imalatı açıklanmıştır. Makrofaj füzyon ve MGC oluşumu için bir model olarak bu vitro hücre sisteminin kullanım örnekleri gösterilir.
Introduction
MGCs oluşumu kronik inflamasyon1tarafından seçkin insan vücudunda patolojik devletlerin bir dizi eşlik eder. İltihap makrofajlar forma MGCs2sigorta sözleşmesi rağmen şaşırtıcı birkaç çalışmalar yaşam ile bağlamda füzyon göstermiştir örnekler3,4. Bunun nedeni çoğu görüntüleme teknikleri için gerekli olan temiz cam yüzeyler inflamatuar sitokinlerin5tarafından indüklenen zaman makrofaj füzyon teşvik yok. Gerçekten de, temiz cam bir substrat makrofaj füzyon için sonra düşük orta büyütme hedefleri (Yani, 10-20 X) ve daha 15 h sürekli kullanılırsa görüntüleme kez bir tek füzyon olayı gözlemlemek için gereklidir.
Diğer el, fusogenic plastik yüzey (örneğin, permanox) veya bakteriyolojik sınıf plastik fusion2teşvik. Ancak, çünkü belgili tanımlık substrate kalın ve ışık scatters görüntüleme plastik aracılığıyla problemlidir. Bu kadar çalışma mesafesi (LWD) hedefleri gerekli olduğundan Imaging karıştırıyor. Ancak, LWD hedefler genellikle düşük ışık coverslip-düzeltilmiş karşılık gelen göre kapasite toplama var. Ayrıca, plastik birefringent bu yana değişiklikleri fark girişim kontrast gibi numune geçen ışık polarizasyonu yararlanma teknikleri imkansız. Engelleri plastik kullanımı ile ilgili daha fazla makrofaj füzyon/MGC formasyonu yüzeyde gerçekleşeceği tahmin etmek mümkün değildir aslında tarafından vurguladı. Birlikte, bu sınırlamalar faz kontrast optik, toplam görüntüleme süreleri genişletilmiş makrofaj fusion görselleştirme kısıtlamak (> 15 sürekli saat) ve düşük çözünürlüklü.
Son zamanlarda bir çok fusogenic cam yüzey tek molekül süper çözünürlük mikroskobu ile sabit makrofajlar/MGCs4yürütürken tespit. Bu gözlem yapıldı çünkü şaşırtıcı temiz cam yüzeyler füzyon de çok düşük oranda teşvik ~ %5 İnterlökin-4 (Il-4) füzyon tarafından belirlenen huzurunda 24 saat sonra dizin4. Füzyon tanıtmak için kapasite oleamide kirlilik nedeniyle olduğunu ortaya koymuştur. Adsorpsiyon oleamide veya benzer şekilde uzun zincirli hidrokarbon bulunan diğer bileşikler cam fusogenic yaptı. Çoğu fusogenic bileşik (parafin balmumu) micropatterned yapıldı ve makrofaj fusion ve permanox için karşılaştırıldığında zaman aynı miktarda içinde gözlenen füzyon olayların sayısını logosuna 2 kat artış kronolojik zamanmekansal kontrol yüksek düzeyde öğretilir. Bu optik kalitesi yüzeyler ilk bakışta Morfolojik özellikleri ve yaşam numuneler MGCs oluşumunda yöneten Kinetik tarafından sağlanan.
Bu protokol için MGCs oluşumu yaşam örnekler üzerinden izlemek için kullanılan cam yüzeyler çeşitli imalatı açıklar. Buna ek olarak, biz bu yüzeyler uzakta-tarla süper çözümleme teknikleri için mükellef olduğunu göstermektedir. Yüzey imalat denemenin amacı bağlıdır ve her yüzeyi ile ilgili örnekler devam etmeden metinde anlatılan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar kullanmak yordamları hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler Mayo Clinic, Janelia araştırma kampüs ve Arizona State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. asit temizledim cam hazırlanması
Not: birçok üretici satın cam beklendiği gibi temiz olmayabilir. Rutin temizlik cam mikroskobu nerede dahil herhangi bir yordamı önce toplu halde göz önünde bulundurun.
- Yüksek sıkılık cam satın. Doğru kalınlığı (mm) 0,15 veya 0,17 seçmek için özel dikkat.
Not: Seçtiğiniz kapak cam kalınlığı bir mikroskop amaçta bağlıdır ve doğrudan objektif varil üzerinde listelenir. - Kapak cam 12 M hidroklorik asit iyi havalandırılmış kimyasal duman başlıklı sonication (42 kHz, 70 W) ile 1 h için kuluçkaya. Taze 12 M HCl ile iki ek kez için bu adımı yineleyin.
- Ayrı bir ölçek ultrasaf su ile doldurun ve kapak cam ekleyin. 5-10dk iyi havalandırılmış bir kimyasal başlıklı kapak cam solüsyon içeren temizleyicide. Bu on kere tekrarlayın.
- 30 dk ile sonication için iyi havalandırılan bir kimyasal başlıklı saf aseton kapak cam kuluçkaya. Bu adım için iki ek kere tekrar edin.
- Ayrı bir ölçek steril ultrasaf su ile doldurun ve kapak cam ekleyin. 5-10dk iyi havalandırılmış bir kimyasal başlıklı kapak cam solüsyon içeren temizleyicide. Bu on kere tekrarlayın.
- % 100 etil alkol 30 dk ile sonication için kimyasal başlıklı kapak cam kuluçkaya. Bu iki ek kez tekrarlayın.
Not: Etil alkol saflığı önemlidir. Kirletici maddeleri çözünmüş katı şeklinde cama kuruyacak ve makrofaj füzyon yükseltebilirsiniz. - Uzun süreli depolama için saf etil alkol ile dolu bir kap içinde asit temizledim cam yerleştirin. Alternatif olarak, azot gazı ve bir vakum desiccator mağaza ile kapak cam kuru.
2. Fusogenic optik kaliteli yüzeylerin hazırlanması
- DMSO ücretsiz dağıtılması yüksek erime noktası parafin balmumu ultrasaf toluen içinde.
Not: Stok konsantrasyonları 10 mg/mL yapılır ve sulandırılmış 1:9 ultrasaf toluen çalışma çözüm 1 mg/mL yapmak vardır.
Dikkat: Toluen dikkatli bir teratogen ele alınmalıdır. Toluen kurumsal kimyasal hijyen plana uygun bir biçimde atın. - Çözüm bir kuru asit temizledim cam için cam yüzeyine eşit olarak kapsayan bir ses seviyesinde çalışıyor parafin uygulanır. Aşırı çözüm dikkatle boşaltmak ve cam ile azot gaz ya da hava kuru. Toplu hazırlık için kapak cam karşılamak için tasarlanmış bir Coplin kavanoz kullanın.
- X ekseninde 3 vuruş ve sonraki 3 vuruş y eksenindeki hav bırakmayan bir bezle Kapak cam Lehçe ( Tablo malzemelerigörmek).
- Hemen deney önce steril ultrasaf su ile kapak Cam Yıkama ve daha sonra için 15-30 dakika bir biyolojik Emanet başlıklı ultraviyole ışık ile sterilize. Alternatif olarak, kapak cam etilen oksit veya gama ışınlama tarafından sterilize.
3. Micropatterning hidrokarbon içeren bileşikler Fusion sınırlamak için önceden belirlenmiş bölgeleri
- Kuru asit temizledim cam ve cam düz bir yüzey üzerine immobilize.
- Forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde hidrokarbon compound(s) çalışan bir çözüm bir altın transmisyon elektron mikroskobu Bulucu kılavuzda bırakın. Denemenin sonu hedefi karşılayan bir hidrokarbon bileşik seçin (bkz. Tablo 1). Izgara filtre kağıdı üzerine hafifçe dokunarak uzak aşırı çözüm fitil ve hemen ızgara kapağı cam ortasına yerleştirin. Sonraki adıma geçmeden önce 2 dk kurumaya toluen izin.
- Kılavuz için cam hafifçe cam ters çevirme tarafından bağlanmış emin olun. Eğer kılavuz yeni bir cam kullanarak 3.2 adımı yineleyin ayırır.
Not: bir plazma temizleyici kullanılabilir değilse, adım 3.4 atlayın. - Plazma tarafından tedavi vakum gaz plazma ile kapak cam temiz.
Bilginize: Bulucu kılavuz ile uzun zincirli hidrokarbon plazma üzerinden adsorbe temel yüzey korumak için bir maske olarak işlem görür. Tabloya göre korumasız bölgeleri sigara fusogenic plazma maruz tarafından işlenir. Plazma için maruz kapak camdır süreyi ampirik olarak tespit edilmelidir. - İnce uçlu forseps kullanarak, micropattern ortaya çıkarmak için cam yüzeyden kılavuz dikkatli bir şekilde çıkarın.
4. cam alt yemekleri imalatı
- 35-mm plastik Petri kabına bir adım matkap kullanarak alt 6-10 mm dairesel delik matkap.
Not: Pürüzsüz kenarlar oluşturmak için adım matkap kullanmak önemlidir. Kenarları çok sert ise, cam yemek altına düz bağ değil. Imperfectly düz yüzeyler mikroskobu zorlaştırabilir. - Dikkatle karışımı ve degas silikon elastomer göre üretici yönergelerine (Yani, polydimethylsiloxane; PDMS).
- Elastomer sadece kenarına yakın ince bir kaplama uygulamak (Yani, kısıtlamaya) delik.
Not: Elastomer delik çevreleyen sürekli ince de olsa bir grup olarak görünmesi gerekir. - Yavaşça (2 bölümünde açıklanan) fusogenic cam veya kuru asit temiz kapak (1 bölümünde açıklanan) cam yemek için elastomer tarafından çevrili deliği için geçerlidir. Cam çanak alt ile aynı hizada görüntülenir ve cam önemli bir kısmını temas plastiktir delik çapi genişletir emin olun. Elastomer 50 ° c 2-3 h için pişirme tarafından tedavi.
- Fusogenic cam tercih edilirse, UV standart protokolleri göre yemek ve kültür hücreleri sterilize et. Bir micropattern tercih edilir, ancak, micropattern hazırlık için adım 3.2 devam edin (micropatterning sırasında kullanılan gaz plazma çanak sterilizes ve şiddetle PDMS loşluğa çiftler).
5. Thioglycollate elde edildi makrofajlar toplama
- 8-hafta-yaşlı C57BL/6 fare ile 0.5 mL % 4 Brewer'ın thioglycollate steril bir çözüm olarak yukarıda açıklanan3,4,6enjekte et.
- Yetmiş iki saat sonra hayvan göre onaylanmış hayvan bakımı ötenazi ve yönergeleri kullanın ve makrofajlar tarafından peritoneal lavaj buz gibi fosfat tamponlu tuz 5 mM ethylenediaminetetraacetate ile takviye ile toplamak.
- Makrofajlar vasıl 300 x g 3 dk santrifüj kapasitesi ve 15 mM, HEPES, takıma DMEM:F12 1 ml resuspend %10 FBS ve % 1 antibiyotik (kültür orta).
Not: Hücreleri daha sonra Neubauer hemasitometre ile dikkate alınır. Makrofajlar için uygun toplama seyreltilmiş ve yüzeylere uygulanır. Hücreleri belirli bir yüzeye uygulamak için dikkatle deneysel soru amacıyla araştırmacı tarafından kabul edilmelidir. Birincil edebiyatında bilinen standartlarına başvurun. - 30 dakika sonra yüzeyler yapışık olmayan hücre kaldırma ve taze kültür orta yerine % 0,1 BSA ile takıma HBSS yıkayın. Kültürler İnkübatör (%5 CO2 37 ° C'de havada) dönün.
- 2 h sonra orta Aspire edin ve kültür 10 ng/mL ile Il-4 takıma orta yerine. Hücreleri başka bir yerde4açıklandığı gibi görüntü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Malzemelerin fizikokimyasal parametreler makrofaj fusion7,8,9,10ölçüde üzerinde dramatik etkileri var. Ayrıca, yüzey kirletici makrofaj füzyon11teşvik bilinmektedir. Bu nedenle, bir negatif kontrol makrofaj fusion için önemli ile başlamak temiz cam gibi. Adsorpsiyon yüzey parlatma tarafından takip uzun zincirli hidrokarbonların nanotopography (şekil 1) bir ölçüde oluşturur, ancak protokol 1 açıklandığı gibi temizlenmiş, cam son derece düz hiçbir açık yüzey özellikleri ile olur.
Temiz cam yüzeylerde makrofajlar çok düşük bir oranda (Şekil 2) sigorta. Buna ek olarak, Il-4 huzurunda 24 saat sonra uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler ile adsorbe yüzeylere uygulanan makrofajlar sağlam füzyon (Şekil 2) tabi. Ayrıca, adsorpsiyon solvent yalnız (örneğin, toluen, isopropanol) bir fusogenic yüzey (Şekil 2) cam yapmaz.
10-nm katman adsorbe hidrokarbonların ölçüde çözünürlük etkiler olası olsa da, yine de kantitatif çözünürlük çeşitli yüzeyler arasında potansiyel farkı değerlendirmek önemliydi. Çözünürlük genellikle Rayleigh ölçüte göre tanımlanır. Çözünürlük yaklaştırmak için sıklıkla kullanılan bir alternatif ölçüsünü tam genişlikli ışığın kırınım sınırından küçük yapıların yarım maksimumda (FWHM). Önemlisi, FWHM (şekil 3A), çeşitli yüzeyler arasında 100 nm floresan boncuk cam flüoresan görüntüleme için gerekli özellikleri yeterince korunduğu görülmüştür düşündüren belirgin hiçbir fark yoktur. Ayrıca, biz fani bir alan oluşturmak ve 3D doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu uzun zincirli hidrokarbon (şekil 3B) içeren yüzeylere uygulanan makrofajlar, gerçekleştirmek başardık. Makrofajlar (şekil 4, ek Video 1, ek Video 2) yüzeylere uygulandığında çeşitli canlı görüntüleme teknikleri uygulanabilir.
Her yüzey avantajı Tablo 1' de anlatılan. Çünkü onlar kalın ve autofluorescence derecesine sahip yüksek NA yağı daldırma hedefleri gerektiren gelişmiş görüntüleme teknikleri çoğunluğu çoğu fusogenic plastik yüzeyler ile uyumsuz olduğunu unutmayın. Bu yüzeyler ile uzun zincirli hidrokarbon adsorbe görüntüleme teknikleri12 PALM/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, de dahil olmak üzere çok sayıda etkinleştirme belirtmek gerekir 17, DIC ve diğerleri18,19,20,21 (Tablo 1). Ayrıca, sadece çok sayıda görüntüleme teknikleri mümkün (Tablo 1), ama bir micropattern kullanımı yüksek derecede MGC oluşumu (4B rakam; üzerinde kronolojik zamanmekansal kontrol sağlar Tamamlayıcı Video 1).
Resim 1 : Adsorbe parafin yüzeyler sahip Nano yüzey topografyası derecesini. Parafin adsorbe yüzeylerin yüzey dekorasyon malzemesi diziler içeriyor ise AFM taranmasını cam yüzeyler (5 x 5 µm) hiçbir belirgin topografik özellikleri göster. Her test sağ tarafında yoğunluğu ölçekte yükseklik z ekseni boyunca gösterir. Ölçek çubukları çoğu 500 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Uzun zincirli hidrokarbon ile adsorbe yüzeyler makrofaj füzyon cam üzerinde teşvik. (A)Il-4 yokluğunda, orada çok az multinucleated hücreleri Wright'ın leke tarafından belirlendiği gibi temiz cam yüzeylerde gibi görünüyor. (B) sonra 24 h Il-4, uzun zincirli solubilize eskiden solvent ile adsorbe yüzeyler huzurunda hidrokarbonlar (örneğin, toluen veya isopropanol) kaç multinucleated hücre var. (C-E) Buna ek olarak, uzun zincirli hidrokarbon ile adsorbe yüzeyler fusion ve MGC oluşumu teşvik. Parafin adsorpsiyon Il-4 en üst düzeyde sonuçlarında füzyon indüklenen. MGCs siyah özetlenmiştir. (F) karşılaştırma için derece MGC oluşumu permanox plastik üzerinde gösterilir. Her görüntüde açık mavi çekirdeği gösterir ve sitoplazma mor görünür. Ölçek çubukları 100 µm. çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Uzun zincirli hidrokarbon ile adsorbe yüzeyler önemli ölçüde çözünürlüğü etkilemez. (A)karşılaştırma 100 nm floresan boncuk toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi ile aydınlatılmış. İç metin üst sol panelindeki tek bir floresan boncuk büyütülmüş bir görünümdür. Kırmızı çizgi FWHM hesaplamak için kullanılan bir örnek satır profil göstermek için üst üste. FWHM 100 nm boncuk hiçbir belirgin fark gözlendi. Ölçek çubukları 5 µm. (B) olan TIRF ve 3D doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu tarafından değerlendirildi gibi Mac-1 integrin dağıtımını karşılaştırılması. Makrofajlar oleamide içeren bir yüzeye uygulanan ve Il-4 ile 24 saat inkübe edildi. B beyaz iç metin sonraki Filmler görüntüsü bölge vurgulamaktadır. Ölçek Bar TIRF görüntüler için 5 mikron ve 3D FIRTINASI 2 µm edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Uzun zincirli hidrokarbon ile adsorbe yüzeyler etkinleştirmek zaman çözüldü görünümlerini makrofaj füzyon ve yayılıyor. Yordam bir micropattern oluşturmak için kullanılan (A) diyagram gösterir. (B) Micropatterned yüzeyler makrofaj füzyon kronolojik zamanmekansal denetim vermek. Il-4, uygulama sonrası birkaç saat makrofajlar ile faz kontrast görüntüsü. Hücre kılavuz micropattern üzerine iç göç unutmayın. Füzyon üzerinde sadece micropattern gözlendi. Beyaz tire bir MGC genişlemesi anahat. Zaman her test sol üst köşesinde snsn gösterilir. Ölçek barlar 50 µm. (C) kafes ışık sayfası mikroskobu20 ortaya yüksek kronolojik zamanmekansal dinamikleri parafin adsorbe bir yüzeye yayılan bir makrofaj vardır. Renk yoğunluğu dağıtım kodlar (sarı en yoğun olduğu), eGFP-LifeAct. Zaman her test mm:ss. olarak sağ üst köşesinde gösterilir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Yüzey: | ||||||
| Tekniği | Parafin | Oleamide | Petrolatum | MP parafin | Permanox | Temiz cam |
| faz kontrast | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| aydınlık alan | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| epifluorescence | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| confocal | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| TIRF | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| PALM/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| Füzyon dizin | ara | ara | ara | yüksek | ara | düşük |
| Füzyon konumu | rasgele | rasgele | rasgele | tanımlanan | rasgele | rasgele |
| MP-micropattern | ||||||
| DIC - diferansiyel girişim kontrast | ||||||
| TIRF - toplam iç yansıma floresan | ||||||
| PALM - photoactivated yerelleştirme mikroskobu | ||||||
| dSTORM - doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu | ||||||
| GSDIM - zemin durumu tükenmesi bireysel molekül tarafından takip dönmek | ||||||
| SIM - yapılandırılmış aydınlatma | ||||||
| STED - uyarılmış emisyonu tükenmesi | ||||||
| LLSM - kafes hafif levha mikroskobu | ||||||
| √ - uyumlu | ||||||
| x - uyumsuz | ||||||
| √ * - yalnızca LWD, düşük büyütme veya daldırma hedefleri ile mümkün | ||||||
| N/T - test | ||||||
Tablo 1: potansiyel kullanır her yüzeyi. Plastik yüzeyler çoğu görüntüleme teknikleri engel unutmayın.
Tamamlayıcı Video 1: zaman çözüldü faz kontrast görünümü MGC oluşumu. MGC oluşumu belirgin synchronicity unutmayın. Zaman snsn sol üst köşede gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm. mı Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.
Tamamlayıcı Video 2: kafes ışık sayfası mikroskopi 20 , parafin adsorbed yüzeye yayılan bir thioglycollate elde edildi eGFP-LifeAct makrofaj. Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Belirlemek ve daha sonra makrofaj füzyon teşvik kaliteli optik cam yüzeyler geliştirmek gerek kaynaklandığını son Hayır yayınlanan çalışma doğrudan kadar yaşam içinde belgili tanımlık bağlam makrofaj füzyon görselleştirildiği aslında örnekler3, 4. Yaygın olarak kullanılan fusogenic plastik yüzeyler LWD hedefleri gerektirir ve faz kontrast optik için büyük ölçüde sınırlı nedeniyle gerçeğini bu. Bu engellerin sadece makrofaj füzyon olağanüstü oranda terfi, ama şaşırtıcı bir ölçüde MGCs oluşumu üzerinde kayma kontrol öğretilir bir optik kaliteli cam yüzey mühendislik tarafından üstesinden gelmek.
Bu teknoloji makrofaj füzyon izlemek için gelişmiş görüntüleme teknikleri kullanımı sağlar, ancak, herhangi bir sınırlama olmaksızın gelmiyor. Makrofaj füzyon fusogenic plastik yüzeylere göre olağanüstü oranda uzun zincirli hidrokarbon (örneğin, oleamide, parafin, vb) adsorbe parlatılmış yüzeyler üretmek rağmen füzyon dağınık şekilde Stokastik kalır işlem (Şekil 2). Bu sınırlama füzyon gerçekleşeceği tahmin etmek mümkün değildir bu yana yaşam numuneler ile fusion görselleştirmek için yüksek büyütme hedefleri kullanımını engellemektedir. Bu sınırlamayı aşmak için biz micropatterned parafin füzyon süreci önceden belirlenmiş bölgelere (şekil 4; sınırlamak için Tamamlayıcı Video 1). Dağınık şekilde makrofaj fusion micropattern hapsetmesi nerede füzyon oluşur ve bu nedenle son derece animasyon bu olay çalışmaya daha yüksek büyütme hedefleri kullanmak tahmin sağladı.
Makrofaj füzyon kayma denetim kazandırır bir optik kalitede yüzey kullanmanın önemi nedir? İlk olarak, bu yüzeylerin füzyon yüksek oranda teşvik beri füzyon makul bir zaman çerçevesi içinde yaşayan örnekler üzerinden izlemek mümkündür. Artan hücre ışığa maruz kalma photobleaching ve fototoksisite yol açar bu Floresans mikroskobu söz konusu olduğunda gereklidir. İkinci olarak, bu yüzeylerin floresan veya istihdam edilecek polarizasyon temel alan Gelişmiş görüntüleme teknikleri (şekil 4; etkinleştir Tablo 1; Tamamlayıcı Video 1; Tamamlayıcı Video 2). Son olarak, bu protokol için açıklanan micropatterned yüzeyler tarafından tanınan kronolojik zamanmekansal denetim makrofaj füzyon yöneten hücresel ve hücre altı mekanizmaları tanımlamak için tasarlanmış çalışmaları hızlandırmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Ugarova laboratuvar ve Müfettişler Merkezi üyeleri metabolik ve vasküler Biyoloji için bu eser ilgili yararlı bilgiler için teşekkür etmek istiyorum. James Faust 2015 yılında Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı süper çözünürlük mikroskobu sahasında eğitmenler için minnettarlığını ifade istiyor. Satya Khuon LLSM için numune hazırlama konusunda yardım için Janelia teşekkür etmek istiyorum. Bir daha gözden geçirme ve bu eserin filme bölümleri sırasında James Faust T32 Bursu (5T32DK007569-28) tarafından desteklenmiştir. Bu eser kafes ışık sayfası bileşeni HHMI ve Betty ve Gordon Moore Vakfı tarafından desteklenmiştir. T.U. NIH tarafından finanse edilen HL63199 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S.
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
