Summary
Ce protocole décrit la fabrication de surfaces de verre de qualité optique adsorbé avec des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue qui peuvent être utilisés pour surveiller la fusion des macrophages de spécimens vivants et permet de microscopie de Super-résolution d’échantillons fixés .
Abstract
Visualisation de la formation de cellules géantes multinucléées (MSG) de spécimens vivants a été difficile due au fait que plus les techniques d’imagerie live nécessitent de propagation de la lumière à travers le verre, mais sur verre fusion des macrophages est un événement rare. Ce protocole présente la fabrication de plusieurs surfaces de verre de qualité optique où adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue transforme verre en une surface coniques. Tout d’abord, la préparation des surfaces de verre propre comme matériau pour la modification de la surface de départ est décrite. En second lieu, une méthode est fournie pour l’adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue pour convertir les non-coniques verre en un substrat coniques. Troisièmement, ce protocole décrit fabrication de surface micropatterns qui favorisent un degré élevé de maîtrise spatio-temporelle de formation MGC. Enfin, la fabrication de vaisselle en verre bas est décrite. Des exemples d’utilisation de ce système de cellules in vitro comme modèle pour étudier la fusion des macrophages et formation MGC sont montrés.
Introduction
La formation de MSG accompagne un certain nombre d’états pathologiques dans le corps humain se distingue par une inflammation chronique1. Malgré l’accord qui les macrophages mononucléés se fusionnent pour former MSG2, étonnamment peu d’études ont montré de fusion dans le contexte de vie des spécimens de3,4. C’est parce que les surfaces de verre propre qui sont requis pour la plupart des techniques d’imagerie ne favorisent pas la fusion des macrophages quand induit par des cytokines inflammatoires5. En effet, si le verre propre est utilisé comme substrat pour la fusion des macrophages, puis faible aux objectifs intermédiaires de grossissement (c.-à-d., X 10-20) et plus de 15 h de continu imagerie doivent souvent d’observer un événement unique fusion.
Sur l’autre main, les surfaces en plastique coniques (p. ex., permanox) ou plastique qualité bactériologique promouvoir fusion2. Toutefois, l’imagerie par le biais de plastique est problématique car le substrat est épais et disperse la lumière. Ce qui complique l’imagerie depuis longtemps des objectifs de distance (LWD) de travail sont nécessaires. Toutefois, les objectifs de GDL ont habituellement basse lumière rassemblant la capacité par rapport à leurs homologues de la lamelle couvre-objet-corrigé. En outre, techniques qui exploitent des changements dans la polarité de la lumière passant à travers l’échantillon comme le contraste interférentiel différentiel sont impossibles, car le plastique est biréfringent. Les obstacles liés à l’utilisation de plastique sont encore soulignées par le fait qu’il est impossible de prédire où formation fusion/MGC macrophage se produira sur la surface. Ensemble, ces restrictions limitent la visualisation de la fusion des macrophages à l’optique de contraste de phase, étendue des durées d’imagerie totales (> 15 heures consécutives) et en basse résolution.
Récemment, nous avons identifié une surface de verre hautement fusogène tout en menant la microscopie seule molécule Super-résolution avec macrophages fixes/MSG4. Cette observation a été surprenant parce que nettoyer le verre surfaces promouvoir fusion au très faible taux de ~ 5 % après 24 h en présence de l’interleukine-4 (IL-4), tel que déterminé par la fusion de l’index4. Nous avons constaté que la capacité à promouvoir la fusion était due à la contamination de l’olΘamide. Adsorption d’olΘamide ou d’autres composés contenant de la même façon les hydrocarbures à chaîne longue fait le verre coniques. La plupart fusogène composé (paraffine) a été MICROIMPRIMEES, et il donnait un haut degré de contrôle spatio-temporelle sur fusion des macrophages et une augmentation de 2 fois le nombre d’événements de fusion observée dans le même laps de temps par rapport à permanox. Ces surfaces de qualité optique a fourni le premier coup de œil sur les caractéristiques morphologiques et cinétique qui régissent la formation des MSG dans les spécimens vivants.
Dans ce protocole, nous décrivons la fabrication d’une variété de surfaces de verre qui peut être utilisé pour suivre la formation de MSG de spécimens vivants. En outre, nous montrons que ces surfaces soient prêtent à des techniques de champ lointain Super-résolution. Fabrication de surface dépend de l’objectif de l’expérience, et chaque surface est décrite avec des exemples dans le texte de la procédure.
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Protocol
Les procédures qui utilisent des animaux ont été approuvées par les comités d’utilisation à la Mayo Clinic, Campus de recherche Janelia et Arizona State University et animalier.
1. préparer la lamelle couvre-objet nettoyé à l’acide
Remarque : couvercle en verre acheté chez de nombreux fabricants n’est peut-être pas aussi propre comme prévu. Envisager de nettoyage régulièrement des lots de la lamelle couvre-objet avant toute procédure lorsqu’il s’agit de microscopie.
- Acheter raideur élevée lamelle couvre-objet. Prenez soin de choisir l’épaisseur appropriée (0,15 ou 0,17 mm).
Remarque : Le choix de l’épaisseur de la lamelle couvre-objet dépend de l’objectif de microscope et est inscrite directement sur le barillet de l’objectif. - Incuber le couvercle en verre à l’acide chlorhydrique 12 M dans une hotte chimique bien aéré pendant 1 h avec sonication (42 kHz, 70 W). Répétez cette étape pour deux fois supplémentaires avec frais 12 M HCl.
- Remplir un bécher distinct d’eau ultrapure et ajouter le couvercle en verre. Laisser agir pendant 5-10 min sous une hotte chimique bien aérée le couvercle en verre. Répéter l’opération dix fois.
- Incuber le couvercle en verre dans l’acétone pure dans une hotte chimique bien aérée pendant 30 min avec la sonication. Répétez cette étape pour deux fois supplémentaires.
- Remplir un bol séparé avec de l’eau ultrapure stérile et ajouter le couvercle en verre. Laisser agir pendant 5-10 min sous une hotte chimique bien aérée le couvercle en verre. Répéter l’opération dix fois.
- Incuber le couvercle en verre 100 % d’alcool éthylique dans une hotte chimique pendant 30 min avec la sonication. Répéter cette étape deux fois.
Remarque : La pureté de l’alcool éthylique est importante. Contaminants sous forme de solides dissous sécheront sur le verre et peuvent favoriser la fusion des macrophages. - Pour le stockage à long terme, placer le couvercle en verre nettoyé à l’acide dans un récipient rempli d’alcool éthylique pur. Vous pouvez également sécher le couvercle en verre avec l’azote gazeux et l’entreposer dans un dessiccateur à vide.
2. préparation des Surfaces coniques-qualité optique
- Dissoudre exempt de DMSO fusion eleve point paraffine dans le toluène ultrapure.
Remarque : Les concentrations de Stock sont faites à 10 mg/mL et sont dilué 1:9 dans le toluène ultrapure de faire un 1 mg/mL solution de travail.
ATTENTION : Toluène doit être manipulé avec soin comme un tératogène. Disposer du toluène conformément au plan institutionnel hygiène chimique. - Appliquer la paraffine solution à un verre de couverture nettoyé à l’acide sec de travail à un volume qui recouvre uniformément la surface du verre. Décanter la solution de l’excès et le couvercle en verre avec l’azote gazeux ou d’air à sec. Pour la préparation en vrac, utilisez une coloration conçue pour accueillir le couvercle en verre.
- Polir le couvercle en verre de 3 coups dans l’axe des x et ensuite en 3 coups dans l’axe des y avec un chiffon non pelucheux (voir Table des matières).
- Juste avant que l’expérience est réalisée, lavez le couvercle en verre avec de l’eau ultrapure stérile et ensuite stériliser pendant 15-30 min avec une lumière ultraviolette dans une hotte de sécurité biologique. Vous pouvez également stériliser le couvercle en verre par irradiation gamma ou de l’oxyde d’éthylène.
3. contenant des hydrocarbures microstructuration composés de confiner la Fusion à prédéterminés régions
- Sécher le couvercle en verre nettoyé à l’acide et immobiliser le verre sur une surface plane.
- Avec une pincette, plongez délicatement une grille de finder de microscopie électronique de transmission or dans une solution de travail de la composé d’hydrocarbures. Choisir un composé d’hydrocarbure qui répond à l’objectif final de l’expérience (voir tableau 1). Mèche de solution excès away en tapotant doucement la grille sur un papier filtre et immédiatement placer la grille au centre de la lamelle couvre-objet. Permettre le toluène à sécher pendant 2 min avant de passer à l’étape suivante.
- Assurez-vous que la grille est collée à la vitre en retournant doucement le verre. Si la grille détache Répétez l’étape 3.2 en utilisant un nouveau couvercle en verre.
Remarque : Si un plasma cleaner n’est pas disponible, omettre étape 3.4. - Plasma nettoyer la lamelle couvre-objet de traitement par plasma sous vide.
Remarque : La grille de recherche agit comme un masque pour protéger la surface sous-jacente adsorbée aux hydrocarbures à chaîne longue du plasma. Les régions qui sont pas protégées par la grille sont rendues non-fusogène par exposition au plasma. La durée de que la lamelle couvre-objet est exposé au plasma doit être déterminée empiriquement. - À l’aide de pinces à pointe fine, retirer délicatement la grille de la surface du verre pour exposer la composition.
4. fabrication de vaisselle en verre bas
- Percer un trou circulaire de 6 à 10 mm dans le fond d’un plastique de 35 mm boîte de Pétri avec une mèche d’étape.
Remarque : Il est essentiel d’utiliser un foret d’étape pour créer des bords lisses. Si les bords sont trop rude, le couvercle en verre adhère pas à plat sur le fond du plat. Surfaces planes imparfaitement compliquent la microscopie. - Soigneusement mélanger et dégazer élastomère de silicone selon les instructions du fabricant (p. ex., polydiméthylsiloxane ; PDMS).
- Appliquez une fine couche d’élastomère immédiate juste au bord de (c'est-à-dire, le fait de circonscrire) le trou.
Remarque : L’élastomère doit apparaître comme une bande continue quoique mince entourant le trou. - Appliquer doucement le couvercle en verre coniques (voir section 2), ou le verre couverture sèche nettoyé à l’acide (voir section 1) afin de couvrir le trou entouré d’élastomère pour le plat. Assurez-vous que le couvercle en verre apparaît à ras du fond du plat et s’étend au-delà du diamètre du trou, afin qu’une partie importante de la vitre est en contact avec le plastique. Guérir l’élastomère par cuisson à 50 ° C pendant 2-3 h.
- Si fusogène verre est préféré, UV stérilisent les cellules plat et de la culture conformément aux protocoles standards. Toutefois, si une composition est préférée, passez à l’étape 3.2 pour la préparation de la composition (le plasma de gaz utilisé lors de microstructuration stérilise le plat et fortement couples PDMS au verre).
5. collecte des Macrophages thioglycolate-induites
- Injecter des souris C57BL/6 8 semaines 0,5 ml d’une solution stérile de thioglycolate de Brewer 4 % comme décrit précédemment3,4,6.
- Soixante-douze heures plus tard, euthanasier l’animal selon animalier agréé et utiliser les lignes directrices et recueillir des macrophages par lavage péritonéal avec la solution saline tamponnée au phosphate glacee additionnée de 5 mM de tétrasodium.
- Centrifuger les macrophages à 300 g pendant 3 mn et remettre en suspension dans 1 mL de DMEM:F12 additionné de 15 mM HEPES, 10 % de SVF et 1 % antibiotiques (milieu de culture).
Remarque : Les cellules sont ensuite comptés avec un hémocytomètre Neubauer. Les macrophages sont dilués à la concentration appropriée et appliqués sur les surfaces. Le nombre de cellules à appliquer sur une surface donnée doit être examiné attentivement par le chercheur aux fins de la question expérimentale. Consulter les normes connues dans la littérature primaire. - Après 30 min Lavez les surfaces avec HBSS additionné de 0,1 % de BSA pour enlever les cellules non adhérentes et réinstaller avec milieu de culture fraîche. Remettez les cultures dans l’incubateur (5 % CO2 dans l’air à 37 ° C).
- 2 h plus tard, aspirer le milieu et remplacer par le milieu de culture enrichi de 10 ng/mL d’IL-4. Les cellules comme décrit ailleurs4de l’image.
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Representative Results
Les paramètres physico-chimiques de matériaux ont des effets dramatiques sur l’étendue des macrophages fusion7,8,9,10. En outre, contaminants de surface sont connus pour favoriser des macrophages fusion11. Par conséquent, il est important de commencer par nettoyer lamelle couvre-objet comme témoin négatif pour la fusion des macrophages. Nettoyé comme décrit dans le protocole 1, quand le couvercle en verre est exceptionnellement plat avec aucune caractéristiques évidentes de la surface, tandis que l’adsorption des hydrocarbures à chaîne longue suivie de polissage de surface crée un degré de nanotopography (Figure 1).
Sur une surface propre couvercle en verre, macrophages fusionnent à un taux très faible (Figure 2). En revanche, après 24 h en présence d’IL-4, les macrophages appliqués sur des surfaces adsorbés avec des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue subissent fusion robuste (Figure 2). En outre, adsorption de solvant seul (p. ex., toluène, isopropanol) n’a aucun verre une surface fusogène (Figure 2).
Bien qu’il soit peu probable qu’une couche de 10 nm d’hydrocarbures adsorbés affecte considérablement de résolution, il était néanmoins important d’évaluer quantitativement la différence potentielle de résolution entre les différentes surfaces. Résolution est généralement définie par le critère de Rayleigh. Une mesure alternative qui est souvent utilisé pour approximer résolution est pleine largeur à mi-hauteur (FWHM) des structures plus petites que la limite de diffraction de la lumière. Ce qui est important, il n’y a aucune différence apparente en FWHM de 100 perles fluorescentes de nm entre les différentes surfaces (Figure 3 a), ce qui suggère que les caractéristiques du verre nécessaire pour l’imagerie de fluorescence ont été suffisamment préservés. En outre, nous avons pu générer un champ évanescent et effectuer la microscopie 3D direct stochastique optique reconstruction des macrophages appliqué sur des surfaces contenant des hydrocarbures à chaîne longue (Figure 3 b). Une variété de techniques d’imagerie en direct sont possibles lorsque les macrophages sont appliquées sur les surfaces (Figure 4, la vidéo 1, vidéo supplémentaire 2).
L’avantage de chaque surface est décrit dans le tableau 1. Notez que la plupart des techniques d’imagerie avancées qui nécessitent des objectifs élevés NA huile d’immersion est incompatible avec la plupart des surfaces coniques en plastique car ils sont épais et ont un degré d’autofluorescence. Il est à noter que les surfaces adsorbés aux hydrocarbures à chaîne longue permettent un grand nombre de techniques d’imagerie, y compris12 PALM/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17, DIC et d’autres18,19,20,21 (tableau 1). En outre, non seulement un grand nombre de techniques d’imagerie possibles (tableau 1), mais l’utilisation d’une composition permet un haut degré de maîtrise spatio-temporelle de la formation MGC (Figure 4 b; Supplemental vidéo 1).
Figure 1 : Paraffine adsorbé surfaces ont un degré de topographie de surface de nanoscale. Scans AFM (5 x 5 µm) de surfaces de verre ne montrent aucune des caractéristiques topographiques évidentes tandis que paraffine-adsorbé surfaces contiennent des baies de matériel, décoration de la surface. L’échelle d’intensité sur le côté droit de chaque micrograph montre hauteur le long de l’axe z. Les barreaux de l’échelle sont de 500 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Surfaces adsorbés aux hydrocarbures à chaîne longue promouvoir la fusion des macrophages sur la lamelle couvre-objet. (A) en l’absence d’IL-4, il semble être très peu de cellules multinucléées sur des surfaces de verre propre tel que déterminé par la coloration de Wright. Hydrocarbures (B) après 24 h en présence d’IL-4, adsorbées avec du solvant utilisé pour solubiliser la longue chaîne des surfaces (p. ex., toluène ou isopropanol) ont peu de cellules multinucléées. (C–E) En revanche, surfaces adsorbés aux hydrocarbures à chaîne longue promouvoir la formation de la MGC et de fusion. Résultats d’adsorption de paraffine au plus haut degré d’IL-4 induite par fusion. MSG est présentées dans le noir. (F) le degré de formation de MGC sur matière plastique permanox est montré à titre de comparaison. Dans chaque image, bleu clair indique noyau et le cytoplasme apparaît pourpre. Les barres d’échelle sont 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Surfaces adsorbés aux hydrocarbures à chaîne longue n’affectent pas dramatiquement résolution. (A) Comparaison de 100 perles fluorescentes nm, éclairé par microscopie de Fluorescence de la réflexion interne totale (FRBR). L’encart dans le panneau supérieur gauche est une vue grossie une seule perle fluorescente. La ligne rouge a été superposée pour afficher un profil de ligne exemple permettant de calculer la FWHM. A observé aucune différence apparente en FWHM de 100 perles nm. Les barres d’échelle sont 5 µm. (B) la comparaison de la répartition des Mac-1 intégrine tel qu’évalué par FRBR et microscopie 3D direct stochastique optique reconstruction. Macrophages ont été appliquées sur une surface contenant olΘamide et incubées avec l’IL-4 pendant 24 h. L’encart blanc b met en évidence la région photographiée sur les micrographies suivantes. Les barres d’échelle sont 5 µm pour les images de la FRBR et 2 µm pour la 3D tempête. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Surfaces adsorbés aux hydrocarbures à chaîne longue activez vues résolution temporelle de la fusion des macrophages et la diffusion de. (A), le diagramme montre la procédure utilisée pour générer une composition. (B) micromotifs surfaces répandre contrôle spatio-temporelle de la fusion des macrophages. Plusieurs heures après l’application d’IL-4, les macrophages ont été projetés avec contraste de phase. Notez la migration des cellules de l’intérieur de la grille sur la composition. Fusion a été observée que sur la composition. Les tirets blancs décrivent l’expansion d’un PACS. Temps est indiquée dans le coin supérieur gauche de chaque micrograph comme hh. Les barreaux de l’échelle sont de 50 µm. (C) feuille de lumière treillis microscopie20 révèle haute dynamique spatio-temporelle d’un macrophage s’étend sur une surface de paraffine-adsorbé. Couleur Code pour la distribution d’intensité (jaune est plus intense) d’eGFP-LifeAct. Heure est affichée dans le coin supérieur droit de chaque micrograph comme mm:ss. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Superficie : | ||||||
| Technique de | Paraffine | OlΘamide | Gelée de pétrole | Paraffine MP | Permanox | Verre propre |
| contraste de phase | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| fond clair | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| DIC | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| épifluorescence | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| confocale | √ | √ | √ | √ | √ * | √ |
| FRBR | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| PALM/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| SIM | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| STED | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| Indice de fusion | intermédiaire | intermédiaire | intermédiaire | haute | intermédiaire | faible |
| Emplacement de fusion | au hasard | au hasard | au hasard | défini | au hasard | au hasard |
| MP-composition | ||||||
| DIC - contraste interférentiel différentiel | ||||||
| FRBR - fluorescence de réflexion totale interne | ||||||
| PALM - microscopie de localisation de photoactivation | ||||||
| dSTORM - microscopie directes de reconstruction stochastique optique | ||||||
| Appauvrissement de l’état fondamental suivie par molécule de GSDIM - retour | ||||||
| SIM - illumination structurée | ||||||
| STED - appauvrissement de l’émission stimulée | ||||||
| LLSM - microscopie nappe de lumière treillis | ||||||
| √ - compatible | ||||||
| x - incompatible | ||||||
| √ * - possible seulement avec GDL, faible grossissement ou objectifs à immersion | ||||||
| N/T - ne pas testé | ||||||
Tableau 1 : possibilités d’utilisation de chaque surface. Notez que les surfaces en plastique empêchent l’utilisation de la plupart des techniques d’imagerie.
La vidéo 1 : vue de contraste de phase temporelle de formation MGC. Notez la synchronicité apparente de la formation de la MGC. Temps est affiché en hh dans le coin supérieur gauche. La barre d’échelle est 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
La vidéo 2 : microscopie Lattice lumière feuille 20 de macrophage a suscité le thioglycolate eGFP-LifeAct s’étend sur une surface de paraffine adsorbée. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
La nécessité d’identifier et de développer par la suite les surfaces de verre de qualité optique qui favorisent la fusion des macrophages découlait du fait que, jusqu'à l’étude non publiée récemment directement visualisé la fusion des macrophages dans le cadre de vie des spécimens3, 4. Cela est dû au fait que fusogène surfaces plastiques qui sont couramment utilisés nécessitent objectifs GDL et sont en grande partie limitées à l’optique de contraste de phase. Ces obstacles ont été surmontés par une surface de verre de qualité optique qui non seulement promu extraordinaires taux de fusion des macrophages, mais donnait un surprenant degré de contrôle spatial sur la formation des msg d’ingénierie.
Bien que cette technologie permet d’utiliser des techniques avancées d’imagerie pour surveiller la fusion des macrophages, elle ne vient pas sans limitation. Bien que les surfaces polies adsorbés aux hydrocarbures à chaîne longue (p. ex., olΘamide, cire de paraffine, etc.) produisent un taux extraordinaire de la fusion de macrophages par rapport aux surfaces plastiques fusogène, fusion reste un spatialement stochastique processus (Figure 2). Cette limitation s’oppose à l’utilisation des objectifs fort grossissement de visualiser la fusion avec des spécimens vivants puisqu’il est impossible de prédire où la fusion se fera. Pour surmonter cette limitation, nous micromotifs paraffine de limiter le processus de fusion de régions prédéterminés (Figure 4; Supplemental vidéo 1). Dans l’espace de confinement fusion des macrophages à la composition nous a permis de prédire où la fusion serait produit et donc utiliser des objectifs grossissement supérieurs pour étudier cet événement très animé.
Quelle est l’importance de l’utilisation d’une surface de qualité optique qui confère le contrôle spatial de la fusion des macrophages ? Tout d’abord, puisque ces surfaces favoriser des taux élevés de fusion, il est possible de contrôler la fusion de spécimens vivants dans un délai raisonnable. C’est essentiel dans le cas de microscopie par fluorescence puisqu’une exposition accrue des cellules à la lumière conduit photobleaching et phototoxicité. En second lieu, ces surfaces permettre aux techniques avancées d’imagerie basées sur la fluorescence ou la polarisation devant être utilisés (Figure 4; Tableau 1; Vidéo supplémentaire 1; Supplemental vidéo 2). Enfin, le contrôle spatio-temporelle conféré par les surfaces micromotifs décrites dans le présent protocole devrait accélérer les études visant à identifier les mécanismes cellulaires et sous-cellulaires qui régissent la fusion des macrophages.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire de Ugarova et chercheurs au centre de métabolisme et de la biologie vasculaire pour une discussion utile de ce travail. Faust de James tient à exprimer sa gratitude pour les instructeurs du cours de l’European Molecular Biology Laboratory Super résolution microscopie en 2015. Nous tenons à remercier Satya Khuon Janelia pour aide à la préparation de l’échantillon pour LLSM. Au cours de l’examen et le tournage des parties de ce document, James Faust était soutenue par une bourse T32 (5T32DK007569-28). Le composant de feuille de lumière de treillis de ce travail a été soutenu par HHMI et Betty et Gordon Moore Foundation. T.U. est financé par les NIH grant HL63199.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S.
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
