Summary
该协议描述了光学质量玻璃表面的制备, 这些化合物含有长链碳氢化合物, 可用于监测活体标本的巨噬细胞融合, 并能实现固定标本的超分辨显微术。.
Abstract
从活体标本中多核巨细胞 (MGCs) 的形成可视化是一个挑战, 因为大多数活的成像技术需要通过玻璃传播光, 但在玻璃巨噬细胞融合是一个罕见的事件。该协议提供了几个光学质量玻璃表面的制造, 在这些材料中, 吸附含有长链碳氢化合物的化合物将玻璃转化为融合表面。首先, 介绍了清洁玻璃表面作为表面改性起始材料的制备方法。其次, 提出了一种吸附长链烃类化合物的方法, 将非融合玻璃转化为融合基体。第三, 该协议描述了表面 micropatterns 的制造, 促进了对 MGC 形成的高度时空控制。最后, 介绍了玻璃底菜的制作。用此体外细胞系统作为研究巨噬细胞融合和 MGC 形成模型的例子。
Introduction
MGCs 的形成伴随着人体的一些病理状态, 由慢性炎症1来区分。尽管同意 mononucleated 巨噬细胞保险丝形成 MGCs2, 惊奇地很少研究显示了融合在上下文与活体标本3,4。这是因为大多数成像技术所需的干净玻璃表面在炎症细胞因子5诱导下不会促进巨噬细胞融合。事实上, 如果用干净的玻璃作为巨噬细胞融合的基底, 那么低到中等放大目标 (即, 10-20X) 和超过 15 h 的连续成像通常需要观察一个单一的融合事件。
另一方面, 融合塑料表面 (例如, permanox) 或细菌级塑料促进融合2。然而, 通过塑料成像是有问题的, 因为基板是厚和散射光。这使得成像变得复杂, 因为需要长的工作距离 (LWD) 目标。然而, 与盖玻片校正的相对物相比, LWD 目标通常具有较低的光收集能力。此外, 由于塑料是双折射的, 利用通过试样如差动干涉对比的光线极性变化的技术是不可能的。与使用塑料有关的障碍进一步被强调的事实是, 它是不可能预测巨噬细胞融合/MGC 形成将发生在表面上。这些限制共同限制了巨噬细胞融合对相对比光学的可视化, 延长的总成像持续时间 (> 15 小时) 和低分辨率。
我们最近发现了一个高度融合的玻璃表面, 同时进行单分子超分辨率显微镜与固定巨噬细胞/MGCs4。这种观察是令人惊讶的, 因为干净的玻璃表面促进融合在极低率的5% 后24小时的存在 interleukin-4 (IL-4), 由融合指数4确定。我们发现促进聚变的能力是由于 oleamide 污染造成的。吸附 oleamide 或其他类似于长链碳氢化合物的化合物使玻璃融合。最融合化合物 (石蜡) 是 micropatterned, 它传授了高度的时空控制巨噬细胞融合和2倍增加的融合事件的数量在相同的时间内观察到与 permanox 相比。这些光学质量的表面提供了第一次一瞥的形态特征和动力学, 控制 MGCs 的形成在活体标本。
在本议定书中, 我们描述了各种玻璃表面的制造, 可用于监测从活体标本中 MGCs 的形成。此外, 我们还表明, 这些表面是适于远场超分辨率技术。表面加工依赖于实验的目标, 每个表面都用相关的例子来描述。
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Protocol
使用动物的程序是在梅奥诊所、Janelia 研究校区和亚利桑那州立大学的动物护理和使用委员会批准的。
1. 制备酸性清洗罩玻璃
注: 从许多制造商购买的盖玻璃可能不像预期的那样干净。在任何涉及显微术的程序之前, 请考虑例行清洗覆盖玻璃批次。
- 采购高紧缩盖玻璃。请特别注意选择正确的厚度 (0.15 或0.17 毫米)。
注: 覆盖玻璃厚度的选择取决于显微镜的目标, 直接列在目标筒上。 - 用超声波 (42 赫, 70 W) 在通风良好的化学油烟机罩中孵化12米盐酸中的盖玻璃 (1 小时)。重复这一步骤为两个额外的时间与新鲜的12米 HCl。
- 用超纯水填充单独的烧杯, 并添加盖玻璃。在通风良好的化学罩中油脂实验 5-10 分钟的盖子玻璃。重复此步骤十次。
- 用超声波在一个通风良好的化学罩中孵化出纯丙酮中的盖玻璃, 30 分钟。重复此步骤两次。
- 填充一个单独的烧杯与无菌的超纯水和添加盖玻璃。在通风良好的化学罩中油脂实验 5-10 分钟的盖子玻璃。重复此步骤十次。
- 用超声波在化学罩中孵化100% 乙醇中的盖玻璃, 30 分钟。重复此步骤两次。
注意: 乙醇的纯度很重要。溶解固体的污染物会在玻璃上干燥, 并能促进巨噬细胞的融合。 - 要长期贮存, 请将酸性清洁的盖子玻璃放在装满纯乙醇的容器中。或者, 用氮气将盖玻璃烘干, 并贮存在真空干燥中。
2. 融合光学质量表面的制备
- 在超纯甲苯中溶解无亚砜的高熔点石蜡。
注: 库存浓度为10毫克/毫升, 并稀释1:9 在超纯甲苯, 使1毫克/毫升工作解决方案。
注意: 应小心处理甲苯作为致畸形药。根据机构化学卫生计划处理甲苯。 - 在均匀覆盖玻璃表面的体积上, 将石蜡工作液应用于干酸清洗的盖玻璃上。醒酒过剩溶液, 用氮气或空气干燥盖玻璃。对于散装准备, 使用 Coplin 瓶设计, 以适应盖玻璃。
- 在 x 轴上抛光盖子玻璃, 在 y 轴上用3笔划, 然后用不起毛的擦除 (请参阅材料表)。
- 在实验进行之前, 先用无菌的超纯水清洗盖玻璃, 然后在生物安全罩中用紫外线杀菌 15-30 分钟。或者, 用环氧乙烷或伽玛辐照杀菌盖玻璃。
3. Micropatterning 含烃化合物, 以限制聚变到预定区域
- 把酸清洗过的盖子玻璃烘干, 将玻璃固定在平坦的表面上。
- 使用镊子, 在碳氢化合物化合物的工作溶液中仔细浸入金透射电子显微探测器网格。选择符合实验最终目标的碳氢化合物化合物 (请参见表 1)。通过在滤纸上轻轻敲击网格, 将多余的溶液吸走, 并立即将网格放在盖子玻璃的中心。在继续下一步之前, 让甲苯干燥2分钟。
- 确保网格与玻璃粘合, 轻轻地反转玻璃。如果网格分离重复步骤3.2 使用新的盖玻璃。
注: 如果等离子清洗器不可用, 请省略步骤3.4。 - 用真空气体等离子体处理等离子清洗盖玻璃。
注意: finder 网格充当掩码, 以保护从等离子体中吸附长链碳氢化合物的底层表面。由网格保护的区域通过接触等离子体而呈现非融合。应根据经验确定盖玻璃暴露在等离子体中的时间量。 - 使用细尖钳, 小心地从玻璃表面取出网格, 露出 micropattern。
4. 制作玻璃底碟
- 使用阶梯钻头在 35 mm 塑料培养皿的底部钻一个 6-10 毫米圆孔。
注意: 使用步进钻头创建平滑边缘是非常关键的。如果边缘太粗糙, 盖玻璃就不会粘在盘子的底部。不完全平坦的表面使显微学困难。 - 根据制造商的说明 (即, 烷, 仔细地混合和加德硅弹性体;)。
- 应用一个薄涂层的弹性体刚刚接近的边缘 (即, 外接) 孔。
注: 弹性体应显示为一个连续的, 虽然薄带围绕孔。 - 轻轻地应用融合盖玻璃 (在第2节中描述), 或干酸清洗盖玻璃 (在1节中描述) 到盘子, 以涵盖的洞包围的弹性体。确保盖玻璃表面与盘子的底部齐平并延伸到孔的直径之外, 使玻璃的坚固部分与塑料接触。用50摄氏度烘烤 2-3 h 来固化弹性体。
- 如果融合玻璃是首选, 紫外线杀菌的菜肴和培养细胞根据标准协议。然而, 如果 micropattern 是优选的, 继续步骤3.2 为 micropattern 准备 (气体血浆使用在 micropatterning 消毒菜和强的夫妇对玻璃)。
5. 收集培养基诱发的巨噬细胞
- 注射8周大的 C57BL/6 小鼠0.5 毫升的无菌溶液4% 布鲁尔的培养基, 如前所述3,4,6。
- 七十二小时后, 根据批准的动物护理和使用指南, 弄死动物, 并收集巨噬细胞的腹腔灌洗与冰冷的磷酸盐缓冲盐水补充5毫米 ethylenediaminetetraacetate。
- 离心机的巨噬细胞在 300 x g 3 分钟和并用重悬1毫升的 DMEM:F12 补充15毫米 HEPES, 10% 血清, 1% 抗生素 (培养基)。
注: 细胞随后用 Neubauer hemocytometer 计数。巨噬细胞被稀释到适当的浓度, 并应用于表面。要应用于给定曲面的单元格数应由调查人员仔细考虑, 以供实验问题使用。查阅主要文献中已知的标准。 - 在30分钟洗涤表面与 HBSS 补充与 0.1% BSA 去除非黏附的细胞, 并且替换以新鲜的培养基。将区域性返回到孵化器 (5% CO2在空气中37°c)。
- 2小时后, 吸入培养基并替换为培养基, 辅以 10 IL-4/毫升。像其他地方所描述的那样对单元格进行图像4。
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Representative Results
材料的物理化学参数对巨噬细胞融合的程度有戏剧性的影响7,8,9,10。此外, 已知的表面污染物促进巨噬细胞融合11。因此, 对巨噬细胞融合进行负控制, 首先要从清洁罩玻璃开始。如1号协议所述, 盖玻璃是异常平坦的, 没有明显的表面特征, 而长链碳氢化合物的吸附和表面抛光则会产生一定程度的 nanotopography (图 1)。
在干净的盖子玻璃表面, 巨噬细胞保险丝以非常低的速率 (图 2)。相比之下, 在 IL-4 存在24小时后, 应用于含有长链烃化合物的表面的巨噬细胞经历了强健的融合 (图 2)。此外, 单独吸附溶剂 (例如、甲苯、异丙醇) 不会使玻璃成为融合表面 (图 2)。
虽然一层10纳米的吸附碳氢化合物不太可能对分辨率产生显著影响, 但对不同表面之间的分辨率的潜在差异进行定量评估是很重要的。分辨率通常由瑞利准则定义。一种常用于近似分辨率的替代度量是全宽 (FWHM), 其结构小于光的衍射极限。重要的是, 在不同的表面 (图 3A) 中, 100 纳米荧光珠的 FWHM 没有明显的差别, 这表明荧光成像所需的玻璃特性得到了充分的保护。此外, 我们能够产生一个消逝的领域, 并执行3D 直接随机光学重建显微镜的巨噬细胞应用于含有长链碳氢化合物的表面 (图 3B)。当巨噬细胞应用于表面 (图 4、补充视频 1、补充视频 2) 时, 各种实时成像技术是可行的。
每个曲面的优点在表 1中进行了说明。请注意, 大多数先进的成像技术, 要求高 NA 油浸泡目标是不相容的大多数融合塑料表面, 因为它们是厚, 并有一定程度的自体荧光。应注意的是, 吸附长链碳氢化合物的表面使大量成像技术, 包括12棕榈/dSTORM/GSDIM13,14,15,16, 17、DIC 和其他18、19、20、21 (表 1)。此外, 不仅可能有大量的成像技术 (表 1), 而且使用 micropattern 可以对 MGC 形成进行高度的时空控制 (图 4B;补充视频 1)。
图 1: 石蜡吸附表面具有一定程度的纳米表面形貌.AFM 扫描 (5 x 5 µm) 的玻璃表面显示没有明显的地形特征, 而石蜡吸附表面含有阵列的材料装饰的表面。每个显微图像的右侧的强度刻度显示沿 z 轴的高度。刻度条是 500 nm。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 吸附长链碳氢化合物的表面促进巨噬细胞在盖玻璃上的融合.(A) 在没有 IL-4 的情况下, 清洁玻璃表面上的多核细胞似乎很少, 这是由赖特的污点决定的。(B) 在 IL-4 存在24小时后, 用溶剂吸附溶解长链碳氢化合物 (例如、甲苯或异丙醇) 的表面很少多核细胞。(C-E)相比之下, 吸附长链烃的表面促进了聚变和 MGC 的形成。石蜡吸附结果在 IL-4 诱导融合的最高程度。MGCs 的轮廓为黑色。(F) 显示了 permanox 塑料的 MGC 形成程度, 以进行比较。在每个图像中, 浅蓝色显示细胞核, 细胞质呈紫色。刻度条为100µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 吸附长链碳氢化合物的表面不会显著影响分辨率.(A) 用全内反射荧光 (TIRF) 显微镜照射的 100 nm 荧光珠的比较。左上板的插入是一个放大的视图一个单一的荧光珠。红线叠加, 以显示一个示例行配置文件用于计算 FWHM。观察到100纳米珠的 FWHM 无明显差异。刻度条为5µm. (B) 通过 TIRF 和3D 直接随机光学重建显微镜对 Mac-1 整合素的分布进行比较。巨噬细胞被应用于含 oleamide 的表面, 并以 IL-4 24 小时的孵化。B 中的白色插图突出了随后的显微图像中的区域。刻度条是5µm 的 TIRF 图像和2µm 的风暴。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 用长链碳氢化合物吸附的表面使巨噬细胞融合和扩散的时间分辨观点得以实现.(A) 图表显示用于生成 micropattern 的过程。(B) Micropatterned 表面传递了巨噬细胞融合的时空控制。几个小时后, IL-4 的应用, 巨噬细胞被成像的相对比。注意从网格内部到 micropattern 的单元格的迁移。只有在 micropattern 上才观察到融合。白色虚线概述了 MGC 的扩展。时间显示在每个显微图像的左上角作为 hh:mm:ss。刻度条为50µm. (C) 晶格光片显微镜20揭示了在石蜡吸附表面上扩散的巨噬细胞的高时空动力学。颜色编码的强度分布 (黄色是最强烈的) eGFP-LifeAct。时间在每个显微图像的右上角显示为 mm: ss.请单击此处查看此图的较大版本.
| 表面: | ||||||
| 技术 | 石蜡 | Oleamide | 凡士林 | MP 石蜡 | Permanox | 清洁玻璃 |
| 相衬 | √ | √ | √ | √ | √* | √ |
| brightfield | √ | √ | √ | √ | √* | √ |
| dic | √ | √ | N/T | √ | x | √ |
| 荧光 | √ | √ | √ | √ | √* | √ |
| 聚焦 | √ | √ | √ | √ | √* | √ |
| TIRF | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| 棕榈/dSTORM/GSDIM | √ | √ | N/T | x | x | √ |
| sim | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T | N/T |
| sted | N/T | √ | N/T | N/T | N/T | √ |
| LLSM | √ | N/T | N/T | √ | N/T | √ |
| 融合指数 | 中间 | 中间 | 中间 | 高 | 中间 | 低 |
| 融合位置 | 随机 | 随机 | 随机 | 定义 | 随机 | 随机 |
| MP-micropattern | ||||||
| 差分干涉对比 | ||||||
| TIRF-全内反射荧光 | ||||||
| 棕榈光活化作用定位显微镜 | ||||||
| dSTORM 直接随机光学重建显微术 | ||||||
| GSDIM-地面状态损耗其次是各自的分子回归 | ||||||
| SIM 结构照明 | ||||||
| STED 刺激的排放损耗 | ||||||
| LLSM 格子光片显微镜 | ||||||
| √兼容 | ||||||
| x 不兼容 | ||||||
| √-仅有 LWD、低放大率或浸入目标的可能 | ||||||
| N/T-未测试 | ||||||
表 1: 每个曲面的潜在用途。请注意, 塑料表面排除了大多数成像技术的使用。
补充视频 1: MGC 形成的时间分辨相对比视图。注意 MGC 形成的明显同步性。时间显示在左上角的 hh:mm:ss 中。刻度条为50µm.请单击此处下载此视频.
补充视频 2: 格子光片显微镜20培养基诱导的 eGFP LifeAct 巨噬细胞在石蜡吸附表面上扩散的.请单击此处下载此视频.
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Discussion
需要识别并随后开发出能促进巨噬细胞融合的光学质量玻璃表面, 这是因为直到最近没有发表的研究在活体标本的背景下直接可视化巨噬细胞融合3, 4。这是因为, 通常使用的融合塑料表面需要 LWD 目标, 并且主要限于相位对比光学。这些障碍是通过工程的光学质量玻璃表面, 不仅促进极高的巨噬细胞融合率, 但传授了惊人的空间控制 MGCs 的形成。
尽管这种技术能够利用先进的成像技术来监测巨噬细胞的融合, 但它并没有受到限制。虽然用长链碳氢化合物吸附的抛光表面 (例如、oleamide、石蜡、等等) 产生的巨噬细胞融合率与融合塑料表面相比较, 但融合仍然是一个空间上的随机进程 (图 2)。这一限制排除了使用高放大目标来可视化与活体标本的融合, 因为它是不可能预测融合将发生。为了克服这种限制, 我们 micropatterned 石蜡将融合过程限制在预定的区域 (图 4;补充视频 1)。空间限制巨噬细胞融合到 micropattern 使我们能够预测融合将发生在哪里, 因此利用更高的放大目标来研究这一高度动画事件。
利用光学质量表面进行巨噬细胞融合的空间控制有什么意义？首先, 由于这些表面促进了高融合率, 因此有可能在合理的时间内监测活体标本的融合。这是必要的, 在荧光显微镜的情况下, 因为增加暴露的细胞到光导致漂白和毒性。其次, 这些表面使基于荧光或极化的高级成像技术得以使用 (图 4;表 1;补充视频 1;补充视频 2)。最后, 本议定书所描述的 micropatterned 表面所提供的时空控制应加快研究目的, 以确定控制巨噬细胞融合的蜂窝和亚核机制。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的财政利益。
Acknowledgments
我们要感谢 Ugarova 实验室的成员和代谢和血管生物学中心的调查人员, 以便对这项工作进行有益的讨论。詹姆斯浮士德希望在2015年对欧洲分子生物学实验室超分辨率显微镜课程的导师表示感谢。我们感谢萨特雅·南丹 Khuon 在 Janelia 的帮助, 为 LLSM 做样品准备。在这项工作的审查和摄制部分詹姆斯浮士德由 T32 奖学金 (5T32DK007569-28) 支持。这项工作的晶格光片组件由 HHMI 和贝蒂和戈登摩尔基金会支持。歌迷由 NIH 赠款 HL63199 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
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