Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En gjær 2-Hybrid skjerm i Batch sammenligne Protein interaksjoner

Published: June 6, 2018 doi: 10.3791/57801
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

Summary

Satsvis behandling av gjær 2-hybrid-skjermer tillater direkte sammenligning av samhandling profiler av flere agn proteiner med en svært komplekse byttedyr fusion proteiner. Her beskriver vi raffinert metoder, nye reagenser og hvordan du implementerer bruken for slike skjermer.

Abstract

Screening for protein-protein interaksjoner med gjær 2-hybrid analysen har lenge vært et effektivt verktøy, men bruken har stort sett vært begrenset til oppdagelsen av høy affinitet interaktører som er høyanriket i biblioteket i samspill kandidater. I et tradisjonelt format, kan gjær 2-hybrid analysen gi mange koloniene analysere når utført ved lav stringens hvor lav affinitet interaktører kan bli funnet. Videre uten en omfattende og komplett avhør av samme biblioteket mot ulike agn plasmider, kan ikke en komparativ analyse oppnås. Selv om noen av disse problemene kan rettes bruker plassert byttedyr bibliotekene, kan kostnads- og infrastruktur behov for slike skjermer være uoverkommelige. Som et alternativ, har vi tilpasset gjær 2-hybrid analysen for å avdekke samtidig dusinvis av forbigående og statisk protein interaksjoner i et enkelt skjermbilde bruker en strategi kalt DEEPN (dynamisk berikelse for evaluering av Protein nettverk), som har høy gjennomstrømming DNA sekvensering og beregning å følge utviklingen av innbyggere plasmider som kode samspill partnere. Her beskriver vi tilpasset reagenser og protokoller som tillater en DEEPN skjerm skal utføres enkelt og kostnadseffektivt.

Introduction

En fullstendig forståelse av cellen biologiske prosesser er avhengig av å finne de protein samhandling nettverkene som ligger til grunn deres molekylære mekanismer. En tilnærming til å identifisere protein interaksjoner er gjær 2-hybrid (Y2H) analysen, som fungerer ved å sette sammen en fungerende chimeric transkripsjon faktor når to protein domener rundt binde til hverandre1. En typisk Y2H skjerm utføres ved å opprette en befolkning av gjær som huser både et bibliotek med plasmider koding samspill proteiner smeltet sammen til en transcriptional aktivator (f.eks., 'prey' fusion protein) og en gitt 'agn' plasmider består av proteinet rundt smeltet til et DNA bindende domene (f.eks, Gal4 DNA-bindende domenet binder seg til Gal4-oppstrøms aktivering sekvensen). En av de viktigste fordelene av Y2H tilnærming er at det er relativt enkelt og billig å gjennomføre i et typisk laboratorium utstyrt for molekylær biologiske rutinearbeidet2. Men når framføres, eksempler en bruker personlige kolonier som oppstår etter valg for en positiv Y2H interaksjon. Dette begrenser sterkt antall bibliotek 'prey' kloner som kan undersøkes. Dette problemet blir forsterket når overflod av en bestemt samspill byttedyr er svært høy i forhold til de andre, reduseres sjansen for å oppdage interaksjon fra lav overflod byttedyr plasmider.

En løsning for å bruke Y2H prinsippet i omfattende dekning av proteom er bruken av en matrise-formatert tilnærming der en matrise med kjent personlige bytte plasmider kan være digitalt avhørt. En slik tilnærming krever imidlertid en infrastruktur som ikke er lett tilgjengelig eller kostnadseffektiv for individuelle etterforskerne som er interessert i å definere interactome for et lite antall proteiner eller domener3. I tillegg ville svært komplekse byttedyr biblioteker som kan kode flere fragmenter av samspill proteiner utvide størrelsen på slike matrix matriser upraktisk størrelser. Et alternativ er å utføre analyser med komplekse biblioteker i grupper og vurdere tilstedeværelsen av samspill kloner bruker massivt parallelle høy gjennomstrømming sekvensering4. Dette kan brukes for å analysen tilstedeværelsen av byttedyr plasmider som oppstår i flere kolonier ved hjelp av en typisk Y2H formatert tilnærming i som gjær celler boliger et samspill par fusion proteiner er lov til å vokse på en plate5,6. Denne generelle ideen kan fremheves for å øke spørring av både flere agn og bytte komponenter på samme tid7,8.

Likevel mange undersøkelser krever en lettere ennå mer fokusert innsats på kun protein 'agn"og kan mer nytte av en uttømmende og semi kvantitative spørring av et enkelt komplekse byttedyr bibliotek. Vi har utviklet og godkjent en tilnærming for å utføre bred protein samhandling studier med en Y2H prinsipp i satsvis format4. Denne bruker frekvensen av utvidelse av en bestemt byttedyr plasmider proxy for den relative styrken av Y2H interaksjon9. Dyp sekvensering av alle plasmider innenfor en befolkningen utsatt for normal vekst eller Selektiv vekst forhold produserer et komplett kart over kloner som gir sterke og svake Y2H vekselsvirkningene. Repertoaret av interaktører kan være innhentet og direkte forhold over flere agn plasmider. Resulterende arbeidsflyten kalt DEEPN (dynamisk berikelse for evaluering av Protein nettverk) kan dermed brukes til å identifisere differensial interactomes fra samme byttedyr bibliotekene å identifisere proteiner, slik at sammenligning mellom en protein vs en annen.

Her viser vi DEEPN og innføre forbedringer i laboratorium metoder som letter bruken, som er skissert i figur 1. Betydelige forbedringer inkluderer:

Generasjonen av byttedyr gjær populasjoner. En av de viktigste kravene til DEEPN genererer bestander av gjær med forskjellige agn plasmider som har samme fordelingen av plasmider byttedyr bibliotekene. Tilsvarende planlagte bestander av byttedyr plasmider biblioteket er avgjørende for å gjøre nøyaktige sammenligninger mellom interactomes av forskjellige agn. Dette er best oppnås når en bibliotek plasmider ligger allerede i en haploid gjær befolkningen og flytte en gitt agn plasmider til at befolkningen oppnås ved parring å produsere en diploide. Her gir vi en klar veiledning i hvordan å lage slike populasjoner med kommersielle biblioteker i haploid gjær. Selv om vi fant metoder som genererer et høyt antall diploids, var parring virkningsgraden i disse kommersielle biblioteket inneholder gjær påkjenningen lav. Derfor bygget vi en ny stamme som kan huse byttedyr biblioteker som gir langt mer diploids per parring reaksjon.

Nye sett med agn plasmider. Mange nåværende plasmider som uttrykker "agn" fusion proteiner består av proteinet av interesse og DNA-bindende domene er 2µ-basert, tillater dem å forsterke deres antall kopier. Dette antall kopier kan være ganske variabel i befolkningen og føre til variasjon i Y2H transcriptional svaret. Dette kan i sin tur forskyve muligheten til å måle styrken i en gitt protein interaksjon basert på vekst svar av celler under valg. Dette kan være delvis adresse ved hjelp av en lav kopi plasmider, noen som er tidligere beskrevet som kommersielt tilgjengelig pDEST3210. Vi bygget en ny agn plasmider (pTEF-GBD) som produserer Gal4-DNA-bindende domene fusion proteiner i en TRP1 centromere-baserte lav kopi plasmider bærer Kanr motstand genet som kan også kloning av agn fragmenter både oppstrøms og nedstrøms domene Gal4 DNA-bindende.

Nye High-Density Y2H fragment biblioteket. Vi bygget en ny plasmider til huset Y2H byttedyr biblioteker og brukte den til å bygge opp et svært komplekse Y2H bibliotek laget av tilfeldig skråstilte fragmenter av genomisk DNA fra Saccharomyces cerevisiae. Sekvensen analyse viste at biblioteket hadde over 1 million ulike elementer, langt mer kompleks enn beskrevet tidligere gjær genomic Y2H plasmider biblioteker11. Med denne nye biblioteket kunne vi viser at DEEPN arbeidsflyten er robuste nok til å romme komplekse biblioteker med mange forskjellige plasmider på en måte som er pålitelig og reproduserbar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av Media og plater

Merk: Alle plater må gjøres minimal 2 dager før begynnelsen av protokollen. Media kan gjøres når som helst. Imidlertid må bufrede gjær ekstrakt pepton druesukker adenine (bYPDA) foretas dagen som det vil bli brukt. Noen medier er fremstilt med en supplement blanding som inneholder et nivå av adenine som er større enn det som vanligvis brukes. De fleste minimal media kosttilskudd angi 10 mg/L adenine. Kosttilskudd merket "+ 40Ade" Angi totalt 40 mg/L adenine.

  1. Forberede glukose løsning (50% w/v). For 1 L, oppløse 500 g D-(+)-glukose i 800 mL destillert vann i et 1000 mL beaker. Justere volumet til 1000 mL av benytter en uteksaminert sylinder og filtrere gjennom et 0,2 µm sterilt filter i et sterilt 1000 mL media lagringen flaske.
  2. Forberede gjærekstrakt pepton druesukker (YPD) plater. For 1 L, oppløse 20 g pepton og 10 g av gjærekstrakt i 800 mL destillert vann i et 1000 mL beaker. Hell i en uteksaminert sylinder, fylle opptil 960 mL med destillert vann. Hell i en 2000 mL Erlenmeyer kolbe og legge 15 g agar. Autoclave og kjølig i 37 ° C vannbad til bad temperaturen er avkjølt til ca 42-50 ° C. Bruk en pipette 40 mL av 50% glukose. Bland godt av virvlende.
    1. Hell en rekke 100 mm plater med 20 mL av media av pipette.
  3. Forberede fullstendig syntetiske minimal medier (CSM)-Trp platene. For 1 L, oppløses 6,7 g gjær Nitrogen base uten aminosyrer i 800 mL destillert vann i et 1000 mL beaker. Hell i en uteksaminert sylinder, fylle opptil 960 mL med destillert vann. Hell i en 2000 mL av Erlenmeyer kolbe og legge 0,7 g - Trp-møtte dropout blanding og 20 mg av metionin 15 g agar. Autoclave og kjølig i 37 ° C vannbad til bad temperaturen er avkjølt til ca 42-50 ° C. Bruk en pipette 40 mL av 50% glukose. Bland godt av virvlende.
    1. Hell en rekke 100 mm plater med 20 mL av media av pipette.
  4. Forberede CSM-Leu-Met plater. For 1 L, oppløses 10.05 g gjær Nitrogen base uten aminosyrer i 800 mL destillert vann i et 1000 mL beaker. Hell i en uteksaminert sylinder og fylle opptil 940 mL med destillert vann. Hell i en 2000 mL av Erlenmeyer kolbe og legge 1.005 g - Leu-møtte dropout blanding og 15 g agar. Autoclave og kjølig i 37 ° C vannbad til bad temperaturen er avkjølt til ca 42-50 ° C. Bruk en pipette til 60 mL av 50% glukose. Bland godt av virvlende.
    1. Hell en rekke 100 mm plater med 20 mL av media av pipette.
  5. Forberede CSM-Leu-Trp platene. For 1 L, oppløses 10.05 g gjær Nitrogen base uten aminosyrer i 800 mL destillert vann i et 1000 mL beaker. Hell i en uteksaminert sylinder, fylle opptil 940 mL med destillert vann. Hell i en 2000 mL av Erlenmeyer kolbe og legge 1.005 g - Trp-Leu + 40Ade frafall blanding, 240 mg av adenine og 15 g agar. Autoclave og kjølig i 37 ° C vannbad til bad temperaturen er avkjølt til ca 42-50 ° C. Bruk en pipette til 60 mL av 50% glukose. Bland godt av virvlende.
    1. Hell en rekke 100 mm plater med 20 mL av media av pipette.
  6. Forberede CSM-Leu-Trp-hans plater. For 1 L, oppløses 10.05 g gjær Nitrogen base uten aminosyrer i 800 mL destillert vann i et 1000 mL beaker. Hell i en uteksaminert sylinder, fylle opptil 940 mL med destillert vann. Hell i en 2000 mL av Erlenmeyer kolbe og legge 0.975 g - Trp-Leu-hans + 40Ade frafall blanding 240 mg av adenine og 15 g agar. Autoclave og kjølig i 37 ° C vannbad til bad temperaturen er avkjølt til ca 42-50 ° C. Bruk en pipette til 60 mL av 50% glukose. Bland godt av virvlende.
    1. Hell en rekke 100 mm plater med 20 mL av media av pipette.
  7. Forberede CSM-Leu-Trp-hans-3AT plater. For 1 L, oppløses 10.05 g gjær Nitrogen base uten aminosyrer i 800 mL destillert vann i et 1000 mL beaker. Hell i en uteksaminert sylinder, fylle opptil 940 mL med destillert vann. Hell i en 2000 mL av Erlenmeyer kolbe og legge 0.975 g - Trp-Leu-hans + 40Ade frafall blanding 240 mg av adenine og 15 g agar. Autoclave og kjølig i 37 ° C vannbad til bad temperaturen er avkjølt til ca 42-50 ° C. Bruk en pipette til 60 mL av 50% glukose. Bland i 100 µL av en 1 M sterilt lager av 3-amino-1,2,4 triazole (3AT) av virvlende.
    1. Hell en rekke 100 mm plater med 20 mL av media av pipette.
  8. Forberede LB-Kanr plater. For 1 L, oppløses 10 g av Tryptone, 5 g av gjær ekstra og 10 g av NaCl i 800 mL destillert vann i et 1000 mL beaker. Hell i en uteksaminert sylinder, fylle opp til 1000 mL med destillert vann. Hell i en 2000 mL av Erlenmeyer kolbe og legge 15 g agar. Autoclave og kjølig i 37 ° C vannbad til bad temperaturen er avkjølt til ca 42-50 ° C. Legg 50 mg Kanamycin og bland av virvlende.
    1. Hell en rekke 100 mm plater med 20 mL av media av pipette.
  9. Forberede YPD, CSM-Leu-møtte, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp og CSM-Leu-Trp-hans media. Bruk fremgangsmåten ovenfor for plater bortsett fra i stedet for pouring i en Erlenmeyer kolbe, hell i en media lagringen flaske og utelater agar.
  10. Forberede bYPDA (bufrede YPDA). Tar sterilt YPD media og legger 200 mg/L adenine i sterilt destillert vann. Justere pH til 3,7 med HCl. filtrerer gjennom et 0,2 µm sterilt filter i et sterilt flaske.
  11. Forbered transformasjon Buffer: 2 M sorbitol, 1 M litium acetate dihydrate, 10 mM Tris pH 7.6, 0,5 mM EDTA, 0.2 mM veisalt i destillert vann. Filtrere gjennom et 0,2 µm sterilt filter i et sterilt flaske.
  12. Forberede PEG løsning: 70% w/v polyetylenglykol 3350 i destillert vann. Sterilisere av autoclave.
  13. Forbered snurre: 8 M urea, 4% w/v SDS, 50 mM Tris pH 6.8, 10% v/v glyserol, 0.02% w/v bromophenol blå i sterilt destillert vann.
  14. Forberede sTE (sterk TE): 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8.0 i destillert vann. Filtrere gjennom et 0,2 µm sterilt filter i et sterilt flaske.
  15. Forberede Zymolase lagerløsning: 10 mg/mL Zymolase 100T i 50 mM kalium fosfat dibasic pH 7.5, 50% v/v glyserol buffer i sterilt destillert vann (lagret på 20 ° C).

2. kloning og verifisering av agn plasmider

Merk: Bygging av Gal4-DNA-bindende domene plasmider. Foreløpig er det en rekke kommersielt tilgjengelig og faglig tilgjengelig Y2H systemer. DEEPN rommer mange av disse forutsatt at agn plasmider uttrykke protein rundt smeltet til et DNA-bindende domene er i en TRP1-som inneholder plasmider. Andre nedstrøms krav er at sekvensen umiddelbart oppstrøms av byttedyr biblioteket sett inn er kjent og som en positiv Y2H samhandling kan være scoret av produksjonen av His3 gir for utvalg i media mangler histidin. Her vil vi beskrive bruken av en ny Y2H agn plasmider (pTEF-GBD, figur 2), men andre Y2H agn plasmider inkludert pGBKT7 kan brukes i tillegg. For bygging og evaluering av agn plasmider, vil vi beskrive bruken av pTEF-GBD. Som et generelt notat anbefaler vi gen syntese å produsere en åpne-lesing ramme som overholder gjær codon bias for å sikre god uttrykk og letthet med kloning. Kontroller at kloning ordningen tillater agn i-ramme med domene Gal4 DNA-bindende og at når kloning på 3-området, en stopp codon følger regionen agn-koding.

  1. Forberede plasmider vektoren. Plasmider pTEF-GBD gir kloning et fragment koding protein rundt 5' eller 3' i regionen koding Gal4 DNA-bindende domenet med en rask montering metode. For innsetting på 5' området, fordøye 3 µg av pTEF-GBD med NarI og EcoRI eller for innsetting på webområdet 3, fordøye med BamHI og XhoI for 2-4 h. Electrophorese prøve i 1% DNA agarose gel inneholder 0.2 - 0,5 µg/mL ethidium bromide (EtBr) på 100 V. avgiftsdirektoratet kutt 5,630 bp TEF-GBD og rense bruker en DNA gel utvinning utstyr i henhold til produsentens instruksjoner og kvantifisere DNA av absorbans ved 260 nm ved spektrofotometer12.
    Merk: Generering av agn-koding innstikk. DNA fragmenter koding proteiner eller proteinfragmenter av interesse kan være laget med Gen syntese og tilgjengelig som uncloned fragmenter. Det anbefales at kodon er optimalisert for uttrykk i Saccharomyces cerevisiae og online verktøy for codon optimalisering er inkludert i listen over materialer.
  2. For 5' innsetting, flanke DNA fragmentet koding en ATG start codon ved 5-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3 "og 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3", henholdsvis. For 3 innsetting i rammen med Gal4 DNA bindende domene, flanke koding fragmentet av 5'-ctgcatatggccatggaggccgaa-3 "og 5'-tagtaactagcataaccccttggggcc-3".
  3. Plasmider bygging, bruker du metoden rask montering som angitt i produsentens retninger for kloning fragmenter i kuttet pTEF-GBD.
    1. Platen alle forvandlet E. coli på LB-Kanr-plater og ruge 16-20 h på 37 ° C. Kolonier boliger pTEF-GBD med ønsket innsatsen kan identifiseres ved PCR forsterkning med oligonucleotides: 5'-CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG-3 "og 5'-GAGTAACGACATTCCCAGTTGTTC-3' 5' Sett inn og 5-CACCGTATTTCTGCCACCTCTTCC-3" og 5-GCAACCGCACTATTTGGAGCGCTG-3 "for 3 sett. Disse oligonucleotides kan også tjene som primere for sekvensering innsatsen.
    2. Planlegge forberede > 10 µg på pTEF-GBD derivater og pTEF-GBD alene å gi materiale for sekvensering og gjær transformasjoner.
    3. Bruk følgende PCR: 3 min på 98 ° C, etterfulgt av 25 sykluser av 30 s på 98 ° C, 30 s ved 55 ° C, og 2 min ved 72 ° C, etterfulgt av 5 min ved 72 ° C med en buffer med 2,5 MgCl2 , 0,5 U/100 µL DNA polymerase og proprietære buffer.

3. uttrykk for Gal4-DNA-bindende domene Fusion proteiner

  1. Gjøre kompetent gjær.
    1. Strek ut PJ69-4A gjær til en YPD plate ved å ta en steril tre applicator, skraping 1 mm3 en-80 ° c frosset lager og gni det forsiktig over YPD platen. Flytte tre applikatoren ned platen slik at hver pass går over en urørt del av media overflaten. Inkuber YPD platen på 30 ° C i 2 dager eller til enkelt koloniene er synlig. Gjøre frosne aksjen PJ69-4A gjær ved suspendere gjær i vann eller vekst medier, supplere med DMSO til 7% og lagring på-80 ° C.
    2. Vaksinere en enkelt koloni i 5 mL av kulturen i YPD i en 20 x 150 mm kultur rør med en bakteriefri tre applikator og vokse over natten på 30 ° C i en risting inkubator på 200 rpm.
    3. Vaksinere 50 mL av YPD i en 250 mL steril Erlenmeyer kolbe med 4 mL PJ69-4A gjær belastninger over natten kultur. Vokse i en risting inkubator på 30 ° C, 200 rpm til en optisk tetthet (OD600) ca 1.2, som bestemmes av spectrophotometry med en standard 1 cm lett bane. Veksten tar vanligvis 5-7 h.
    4. Isolere gjær ved sedimentering i en 50 mL av koniske 4,696 x g i 5 minutter ved romtemperatur i en Borstemmaskin sentrifuge. Kast nedbryting av dumping i flytende avfall. Bruker en pipette, resuspend pellet i 5 mL av transformasjon buffer og overføre til 15 mL av koniske rør. Resediment å kaste nedbryting og resuspend gjæren i 1 mL av siste bindet transformasjon buffer med en 1000 µL pipette.
    5. Inkuber gjærceller for 60 min på 30 ° C mens riste på 200 rpm og plasser på is 30-90 min.
  2. Gjær plasmider transformasjon.
    1. I 1,5 mL steril microcentrifuge rør, Legg 1 µg av pTEF-GBD-baserte plasmider og 5 µL av 10 mg/mL laks sperm DNA løsning. Inkluder også et rør som inneholder bare laks sperm bærer DNA som en negativ transformasjon. Legge til 100 µL av iskalde gjær celle suspensjon hver rør ved pipette. Legge til 100 µL av 70% PEG løsning med en 1000 µL pipette og bland forsiktig ved å sveipe røret 5 - 10 ganger (gjør ikke vortex).
    2. Ruge på 30 ° C, i en risting inkubator på 200 rpm for 45 min.
    3. Heten støt ved 42 ° C i 15 min.
    4. Sedimenter i en microcentrifuge på 845 x g for 3 min i romtemperatur, Pipetter av forkaste nedbryting, resuspend pellets i 150 µL av sterilt vann av pipettering opp og ned og spredt over overflaten av en CSM-Trp plate.
    5. Legg platene opp i 30 ° C inkubator og ruge i 2-3 dager før koloniene er synlige. Platene er slått opp ned for å unngå kondens på tallerken overflaten etter inkubasjon på 30 ° C for 6-12 h.
    6. Ta 2-3 kolonier per transformasjon og strek som en oppdatering på en CSM-Trp tallerken med en bakteriefri tannpirker. Tillat for å vokse for 24 h på 30 ° C.
  3. Kontroller lysates for protein uttrykk.
    1. Vaksinere 3 mL CSM-Trp flytende media kamp-hodet-størrelse gjær fra oppdateringen og vokse over natten på 30 ° C i en 20 x 150 mm kultur tube, mens risting 200 rpm. Gjøre to overnatting kulturer per agn og tom pTEF-GBD vektor.
    2. Legge til 1 mL av YPD hver 3 mL CSM-Trp natten kultur. Vokse 1t ved 30 ° C, mens risting 200 rpm. Kontroller OD celleområde ved spektrofotometeret.
    3. Sediment et tilsvarende antall celler, normalisere ifølge OD. Bruke bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør med en 5 min spinn på 2,348 x g ved romtemperatur i en microcentrifuge. Bruke en pipette forkaste nedbryting. Siste aksjen tilsvarer minimum 2.1 OD.
      Merk: Ved beregning av tilsvarende antall celler, det kan skje at ulike volumer kan være nødvendig fra hver natten kultur å oppnå minimal 2.1 OD.
    4. Resuspend pellet i 450 µL av 0,2 M NaOH av pipettering opp og ned. Inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Recentrifuge celler i 2 minutter på 2,348 x g ved romtemperatur, og forkaste nedbryting av pipette.
    5. Resuspend pellets med 50 µL av SNURRE buffer av pipettering opp og ned forsiktig å ikke få bobler. Varme utvalg for 5 min på 70 ° C.
  4. Sjekk for protein uttrykk SDS-side.
    1. Bruk en gradient gel på 4 til 20% å sikre en rekke molekylvekt kan løses. Last tilsvarende beløp (samme OD) prøver i en SDS-side gel og husk å ta minst ett utvalg som inneholder uendrede pTEF-GBD vektor13,14,15.
    2. Etter electrophoretic separasjon, overføre gel til nitrocellulose- og immunoblot ved hjelp av anti-myc monoklonale eller polyklonale antistoffer og ECL oppdagelsen løsning (Figur 3).

4. selv-aktivisering Test

  1. Strek ut MATalpha gjær fra-80 ° C lager tilsvarer belastningen huser byttedyr biblioteket rundt på en YPD plate ved å ta en steril tre applicator, skrape en liten mengde gjær av ampullen og striper det over YPD platen. Inkuber YPD platen på 30 ° C i 2 dager eller til enkelt koloniene er synlig. Patch et par enkelt kolonier på en YPD plate og ruge over natten på 30 ° C.
    Merk: Den nye stammen utviklet her huset byttedyr biblioteket er PLY5725 mens noen kompatibel kommersielt tilgjengelig Y2H biblioteker er plassert i Y187.
  2. Følg fremgangsmåten i 3.3.1 - 3.3.4 å transformere PLY5725 med LEU2-basert plasmider huset ønsket byttedyr biblioteket. Biblioteker utviklet her, den tilsvarende plasmider er pGal4AD (pPL6343). Gjenopprette gjær transformants, plate på CSM-Leu-Met plater. Etter kolonier oppstår, strek som flekker på en CSM-Leu-Met tallerken og Inkuber 24 h på 30 ° C.
  3. Følger protokollen i 3.4 å bekrefte uttrykk for pPL6343 tomt vektor ved hjelp av anti-HA monoklonale eller polyklonale antistoffer og ECL oppdagelsen løsning.
  4. Stripe hver av transformert PJ69-4A gjæren i en korset mønster med PLY5725 konstruerer på en YPD plate som ble bekreftet å uttrykke protein i protokollen 3.4 og 4.3 og ruge på 30 ° C over natten. Ta 1 mm3 av cellene der de to stammene har vokst sammen og patch på separate CSM-Leu-møtte, CSM-Trp og CSM-Trp-Leu plater og vokse 24 timer.
    Merk: Ønsket diploids vil vokse på CSM-Trp-Leu plater. Vekst på CSM-Leu-Met og CSM-Trp platene tjene som en positiv for gjær vekst.
  5. Vokse diploids i 1 mL av CSM-Trp-Leu media overnatting på 30 ° C. Sediment 500 µL celler i en 1,5 mL microcentrifuge rør 2,348 x g, 3 min i romtemperatur i en microcentrifuge. Kast nedbryting av pipette. Gjenta sedimentering og rørets resuspend cellene i 1 mL av sterilt vann. Sjekk OD600 celler.
  6. Gjøre en rekke 1:10 føljetong fortynninger av hver celle hjuloppheng med sterilt vann med start mest konsentrerte løsning av hver på et OD på 0,5. Spot 5 µL av hver fortynning på en CSM-Leu-Trp plate, en CSM-Leu-Trp-hans plate og en CSM-Leu-Trp-hans + 3AT plate. Ruge på 30 ° C og inspisere for vekst daglig over 3 dager (Figur 4).
    Merk: For 1:10 føljetong fortynning, Pipetter 10 µL av rør som inneholder en OD 0,5 til 90 µL av vann og bland av pipettering opp og ned. Fortsette å gjøre 1:10 føljetong fortynninger inntil det er totalt seks ulike konsentrasjoner å oppdage.

5. lag gjær populasjoner med agn og bytte bibliotek

Merk: Y187 belastningen som huser kommersielle byttedyr biblioteket plasmider ikke kompis godt. Dermed forpliktet optimalisert følgende til kompleksiteten i biblioteket. PLY5725 sil inneholder Y2H byttedyr biblioteker mates bedre og samme parring fremgangsmåte kan brukes med denne stammen (figur 5).

  1. Vaksinere en 3 mL kulturer på hver av PJ69-4A transformants bærer den ulike TRP1-som inneholder pTEF-GBD agn plasmider i CSM-Trp medier i et kultur-rør. Inkluder to separate kulturer som inneholder pTEF-GBD vektor plasmider alene for å tjene som fremgangsmåter for kontroller. Inkuber kulturer på 30 ° C, 200 rpm 6 h og deretter fortynne i en 25 mL av kulturen i et sterilt Erlenmeyer kolbe for overnatting vekst.
  2. Tine frossen (-80 ° C) ampuller med MATalpha cellene som inneholder LEU2-bærer "byttedyr" biblioteket ved romtemperatur. Vaksinere en 125 mL CSM-Leu-Met medier i et sterilt Erlenmeyer flasken hele tinte ampullen. Vokse alle kulturer overnatting på 30 ° C med skjelvende på 200 rpm.
    Merk: OD600 av natten kulturer må mellom 1.0 til 1,5 før du fortsetter til neste trinn.
  3. Sentrifuge 21 OD ekvivalenter av PJ69-4A transformant kulturer med en 5 min runde på 4,696 x g ved romtemperatur. For hver 10 parring reaksjoner ønsket, pellet 39 OD600 ekvivalenter av den MATalpha stammen bærer biblioteket plasmider i separate 50 mL av koniske rør.
    1. Resuspend celler i 10 mL av sterilt vann og re pellets i nye 50 mL av koniske rør 4,696 x g 5 min ved romtemperatur i en Borstemmaskin sentrifuge. Bruker en pipette, forsiktig fjerne nedbryting uten å forstyrre pelleted cellene.
    2. Resuspend pelleter av PJ69-4A cellene i 4 mL og PLY5725 i 10 mL av bYPDA (pH 3.7).
  4. Å sette opp Legg parring reaksjoner, 1 mL av PJ69-4A forvandlet celler, 1 mL av MATalpha bibliotek inneholder celler og 1 mL av bYPDA pH 3.7 til nye 50 mL av koniske rør. Ruge på 30 ° C med mild orbital agitasjon (100-130 rpm) i 90 minutter.
    1. Sentrifuge celler for 5 min på 4,696 x g, ved romtemperatur i en Borstemmaskin sentrifuge. Fjern nedbryting av pipette og resuspend pellet i 2 mL 1:1 bYPDA:YPD. Plate alle 2 mL på en 100 mm YPD plate av pipette og ruge på 30 ° C i ca 20 timer.
  5. Høste celler fra YPD platene med cellen skraper for å dislodge cellene i 2-3 mL CSM-Leu-Trp media. Pipetter forskyves celler i en 50 mL av koniske rør. Skyll platene 4 - 5 ganger med 2-3 mL CSM-Leu-Trp media av pipettering opp media bruker en 1000 µL Pipetter og forsiktig løser ut mediet over YPD tallerken overflaten.
    1. Sentrifuge celler for 5 min 4,696 x g ved romtemperatur i en Borstemmaskin sentrifuge. Forkast nedbryting av pipette og resuspend cellene i 40 mL CSM-Leu-Trp medier av pipettering opp og ned (gjør ikke vortex).
  6. Hvis du vil beregne antall diploide celler dannet, fortynne 4 µL av diploide blandingen i 200 µL og 2000 µL CSM-Trp-Leu media. Plate 200 µL av hver fortynning på en CSM-Leu-Trp tallerken.
    Merk: De to platene representerer en 1:10,000 og 1:100,000 brett fortynning av aksjene i diploids høstes og gir en forventet ~ 9000-27,000 kolonier på 1:10,000 fortynning platen etter inkubasjon ved 30 ° C i 36-40 h. Sjekk plater etter trinn 5.7. Et minimum antall 200 kolonier på 1:10,000 fortynning plate er nødvendig for å fortsette til trinn 5.8
  7. Umiddelbart ta resten av hver 40 mL av cellen rørets og vaksinere et 1000 mL av Erlenmeyer kolbe som inneholder 500 mL CSM-Leu-Trp media. Ta en innledende OD600. Inkuber disse flasker på 30 ° C med skjelvende på 180 rpm til de når metning (~2.0 OD/mL). Dette vanligvis tar ca 36-40 h. skjermen vekst på 24 h igjen på 36 h av OD600.
  8. Bruke en pipette, fjerne 20 mL dele fra hver av de mettede 500 mL av kulturer og innoculate 2000 mL Erlenmeyer flasker, en som inneholder 750 mL CSM-Leu-Trp medier og andre inneholder 750 mL av CSM-Leu-Trp-hans med det laveste nivået på 3AT som eliminerer bakgrunn (tidligere bestemmes i del 4.5). Bland nye kulturer (770 mL) godt av virvlende og ta en innledende OD600.
  9. Inkuber kulturer på 30 ° C mens riste på 180 rpm fram metning, som vanligvis oppstår innen 24 timer for umerkede CSM-Leu-Trp kultur og kan ta over 70 t for kulturer under valg for Y2H vekselsvirkningene.
  10. Når kulturer har nådd metning (OD ~ 2.0), fjerne 11 mL av pipette, sediment celler med en 5 min runde på 4,696 x g ved romtemperatur, forkaste nedbryting av pipette, og fryse på 20 ° C eller fortsetter på DNA utvinning. Merkede og umerkede prøvene vil begge brukes for dype sekvensering.

6. eksempel forberedelse til DEEPN dyp sekvensering

  1. DNA utvinning.
    1. Bruke en pipette for å resuspend celle pellets fra protokollen delen 5.7 i 500 µL av sTE buffer og overføre til en 1,5 mL av microcentrifuge. Legg 3 µL av betamercaptoethanol og 10 µL av Zymolase lager. Bland godt og ruge i 37 ° C inkubator 24-36 h.
    2. Ekstra prøven to ganger med 500 µL fenol/kloroform/isoamyl alkohol mens du bruker en fume hette16.
    3. Legge til 7 µL av 4 M NaCl, 900 µL av iskalde 100% etanol (ETOH), blanding av inversjon og enten fryse 20 ° C eller fortsette å sediment DNA av snurrende 21,130 x g i 10 min ved romtemperatur i en microcentrifuge.
    4. Kast nedbryting av pipette. Vask pellet thrice med 900 µL av 70% ETOH.
    5. Sediment pellets 21,130 x g i 2 minutter og fjerne gjenværende ETOH vask ved pipette. Tørr pellet i 7 min på 42 ° C.
    6. Resuspend pellets i 120 µL av 0,1 x sTE i et vannbad 37 ° C i 90 min, flick rør å blande enhver 30 min.
    7. Pipetter 60 µL av utdraget DNA i en bakteriefri 1.5 mL av microcentrifuge. Legge til 120 µL av sTE 3,5 µL av RNase A lager, flick å blande og ruge ved 37 ° C i 1 time.
    8. Etanol bunnfall som tidligere gjort i delen 6.1.3 - 6.1.5, men bruke 7 µL av 5 M ammonium acetate istedenfor 4 M NaCl.
    9. Resuspend RNase A-behandlet DNA i 55 µL av 0,1 x sTE i et vannbad 37 ° C i 90 min, flick rør for å blande alle 30 min. kvantifisere DNA av absorbans ved 260 nm på et spektrofotometer.
  2. PCR cDNA setter inn.
    1. Utføre to, 50 µL PCR reaksjoner per DNA-prøve. Hver reaksjon inneholder 25 pmol av hver forover og bakover grunning matchende byttedyr-bibliotek plasmider (se materialer). Reaksjoner også inneholder 25 µL av Hi-Fi-2 x PCR Master Mix, 5 µg av DNA-prøve, og vann opptil 50 µL. Amplify reaksjoner for 25 sykluser med filtypen tider med 3 min ved 72 ° C, en anneal temperatur på 55 ° C for 30 s og denaturing på 98 ° C i 10 s. gå foran sykling ved en 30 s rødsprit 98 ° C og følge med en 5 min incubation ved 72 ° C.
    2. Analysere 4 µL av hver PCR reaksjon av 1% DNA agarose gel geleelektroforese med DNA-agarose gel inneholder 0.2 - 0,5 µg/mL EtBr17. Visualisere DNA-prøve av UV transillumination. Eksempler viser en smear av DNA rundt 1-3 kb, hvor stripemønster kan finnes for prøver der en Y2H samspillet var valgt (figur 6).
    3. Kombinere like PCR prøver og rense bruker PCR rensing kit i henhold til produsentens instruksjoner og kvantifisere DNA av absorbans ved 260 nm på et spektrofotometer.

7. dyp sekvensering

Merk: Utvalg forberedelse og sekvensering på en dyp sekvensering plattform er vanligvis tilgjengelig i kommersielle og akademiske DNA sekvensering kjernen fasiliteter.

  1. Skjær 600 ng PCR produkt med en høy ytelse ultra-sonicator for å gi fragmenter av en gjennomsnittlig lengde på ~ 300 bp.
  2. Genererer indekserte sekvensering biblioteker bruker en forberedelse kit for dyp sekvensering som legger linkers koding strekkoder, grunning nettsteder, og ta sekvenser asymmetrisk på endene av DNA fragmenter.
  3. Utføre biblioteket forberedelse i henhold til produsentens instruksjoner. Bassenget indeksert biblioteker og sekvensen som lenge sammen-end leser på en dyp sekvensering plattform (f.eks 2 x 150 bp PE leser). Ønsket antall leser mål for hvert utvalg er mellom 10 og 40 millioner, med flere leser ønsket for de umerkede populasjonene som er vanligvis mer komplekse. Vi anbefaler minst 20 millioner eller flere leser for umerkede befolkningen.

8. Bioinformatic behandling og verifisering

  1. Prosessen DNA sekvensering data i form av fastq med et sett av frittstående programvare programmer bygd til (1) kart sekvens lese filer i et universelt SAM format (2) kvantifisere genet berikelse mellom datasett (3) utføre statistisk analyse av data i for å rangere hvilken kandidat gener er positive Y2H interaksjon () 4) gir informasjon om hva områdene og hva translasjonsforskning ramme hver av byttedyr cDNA per genet fragmenter som gir positive Y2H vekselsvirkningene består og (5) verktøy å rekonstruere ikke bare 5' men også 3 slutten av samspill fragmenter slik at deres gjenoppbygging og bekreftelse i et tradisjonelt Y2H format. Drift av disse programmene er beskrevet i tilhørende studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Y2H analysen har vært mye brukt for å finne protein: protein interaksjoner og flere tilpasninger og systemer er utviklet. For det meste, er de samme hensyn som bidra til å sikre suksess med disse tidligere tilnærminger viktig for DEEPN. Noen av de viktige milepælene inkluderer: sikre uttrykk for DNA-bindende domene fusion proteiner, sikrer lav bakgrunn av falske hans + vekst i diploids som inneholder agnet av interesse med en tom byttedyr plasmider, en høy parring effektiviteten av agn inneholder MATA gjær med det biblioteket inneholder MATalpha gjær, og til slutt, lav-stringens forhold at befolkningen å vokse vilkår velger for mange positive Y2H reaksjoner, selv de som produserer lave nivåer av His3 aktivitet og en svak Y2H transcriptional svar.

En av de viktige aspektene ved DEEPN er å innføre reproduserbar Y2H biblioteket i stammer som inneholder forskjellige agn plasmider og pålitelig velge de befolkningene de biblioteket plasmider oppretter positive Y2H vekselsvirkningene. Dette blir vanskeligere når kompleksiteten i Y2H biblioteket øker siden det er vanskeligere å sikre tilstrekkelig overføring av hele biblioteket over ulike første befolkningsgrupper. I tillegg størrelsen på populasjoner valgt å vokse under utvalg forhold og dybdeskarphet sekvensering må være stor nok til å observere reproduserbar endringer i Y2H plasmider sammensetning pålitelig identifisere ekte positiv Y2H vekselsvirkningene. I tidligere studier brukt vi kommersielt tilgjengelig Y2H cDNA biblioteker. Vi fant variasjon i Y2H bibliotek distribusjonen mellom separate populasjoner med samme agn plasmider er lav, med en overdispersion mellom de to første populasjonene før valget av < 0,01 vanligvis og 0,35 - 0,55 for egne bestander etter utvalg4. Men kompleksiteten i noen av disse kommersielt tilgjengelig Y2H bibliotekene er ganske lav (figur 7). I tillegg er mange kloner i den (~ 60%) laget av cDNA fragmenter som er 3' av koding regionen, som ytterligere begrenser deres nytte. For å demonstrere at metodene ovenfor var i stand til accomodating mer komplekse Y2H biblioteker, vi opprettet et nytt Y2H bibliotek i strømlinjeformet 'prey' plasmider vektoren (pGal4AD) som inneholder fragmenter av genomisk DNA fra Saccaromyces cerevisiae (belastning PLY5725). Genomic DNA ble fragmentert etter klipping, valgt av 600-1500 bp, modifisert med adaptere og settes inn i pGal4AD til å opprette SacCer_TAB Y2H biblioteket (Figur 8). Biblioteket ble forvandlet til PLY5725, som produserte en gjær befolkningen som ble deretter paret for å skille prøver av PJ69-4A MATA bærer pTEF-GBD plasmider alene. Dupliserte diploide bestander ble dyrket under ikke-selektive og selektiv forhold. Y2H plasmider biblioteket skivene ble analysert av dyp sekvensering. Når de tilordnes genomisk DNA omfatter 100 bp oppstrøms og nedstrøms hver protein koding regionen (84% av hele genomet), vi fant > 1,1 millioner forskjellige plasmider i biblioteket for en beregnet totalstørrelse på biblioteket i gjær av ~1.35 millioner forskjellige plasmider. Som en sammenligning, vi også forvandlet en beskrevet tidligere gjær genomic Y2H biblioteket11 (PJ_C1, C2, C3 Y2H bibliotek) i MATalpha gjær, og utsatt for den samme analysen som ovenfor. Vi fant at kompleksiteten i tilfeldig fragment gjær Y2H biblioteket var langt høyere og hadde langt mer plasmider koding i-ramme fragmenter av hver genet enn tidligere publisert biblioteket (figur 9). Viktigere, generering av første bibliotek som inneholder diploide bestander var veldig reprodusere med en overdispersion av < 0,01 (Figur 10). Videre reproduserbarhet for å ha to separate gjær befolkningen produsere lignende videredistribusjon av plasmider etter å velge for positiv Y2H vekselsvirkningene var veldig bra, gir en overdispersion på 0,3. Dermed imøtekomme metodene her større Y2H biblioteker av økt kompleksitet enn tidligere.

I form av økt brukervennlighet DEEPN, foretrekker vi bruker gen syntese å setter inn koding for agn protein av interesse. Dette tillater koding regioner for protein, chimeras og mutanter skal innlemmes lett i Y2H agn plasmider, men kan også deres kodon å optimaliseres for uttrykk i S. cerevisiae. Uttrykk for to ulike Gal4-DNA-bindende domene fusion proteiner er vist i Figur 3. To ulike gjær transformants uttrykke enten av to agn fusion proteiner var forberedt og utsatt for SDS side og immunoblotting med anti-myc antistoffer. Merk uttrykk nivåer av agn proteiner i forhold til Gal4 DNA-bindende domenet alene fra Tom vektoren. Vi fant det er viktig ikke bare å kontrollere uttrykket av agn fusion protein, men også kontrollere uttrykket i den eksakte MATA gjær transformant kolonien som skal brukes til å utvide og kompis å bytte biblioteket inneholder gjær. Når en transformant er identifisert, er det mulig å fryse den ned og lagre for senere bruk.

Figur 4 viser en test for selv-aktivisering der en seriell fortynning av diploide celler er belagt på CSM-Leu-Trp (+ hans), CSM-Trp-Leu-hans (-hans), og CSM-Trp-Leu-hans + 3AT (-hans + 3AT) plater og lov til å vokse til 30 ° C i 3 dager. Ønsket resultat er å observere vekst i nærvær, men ikke fravær av histidin uansett om det er 3AT. Dette vil tillate bruk av CSM-Trp-Leu-hans til å velge for gjær med en positiv gjær 2-hybrid interaksjon. Hvis det er vekst på CSM-Leu-Trp-hans plater, kan deretter et Y2H utvalg fortsatt fås med den laveste konsentrasjonen av 3AT som hindrer vekst. Vi finner at hvis vekst kan bli blokkert i CSM-Trp-Leu-hans + 0,1 mM 3AT, deretter DEEPN analysen kan fortsette med denne tilstanden til å velge for Y2H vekselsvirkningene. Hvis hemming av veksten av diploids som inneholder pGal4AD eller andre tomme byttedyr plasmider og pTEF-GBD-agn fusion plasmider krever imidlertid høyere konsentrasjoner av 3AT, vil det bryte DEEPN prosedyren og en annen agn plasmider bør søkes. Merk at hans + vekst er bare utvalget for en positiv Y2H interaksjon. Vi har funnet dette er tilstrekkelig til å berike for Y2H vekselsvirkningene satsvis.

En av de viktigste prosedyrene i DEEPN arbeidsflyten er å oppnå høy virkningsgrad mating av MATA gjær bærer agn plasmider med MATalpha gjær bærer Y2H byttedyr biblioteket. Vi fant at noen stammer (f.eks Y187)18, bolig kommersielt tilgjengelig cDNA biblioteker, har relativt dårlig parring effektivitet. Derfor utviklet vi en belastning å bære Y2H biblioteker. Denne belastningen er basert på BY4742, en avledning av S288c. Denne belastningen mangler GAL4, GAL80, TRP1, LEU2og HIS3. Den inneholder ingen journalister som er mottakelig for en hybrid Gal4 protein eller en annen hybrid (f.eks Meglos-VP16). I stedet ligger kilden til Y2H-indusert His3 produksjon i MATA belastningen som ville bære bestemt agn plasmider. Dette forenkler systemet og tillater større fleksibilitet i at man kan bruke samme bibliotek inneholder MATalpha cellene til pare med en belastning uttrykke et Meglos-agn fusion protein og LexA(UAS) -HIS3 reporter eller en Gal4-DBD-agn fusion protein og en Gal4 (UAS)-HIS3 reporter.

Når diploide befolkningen bærer både et agn plasmider og biblioteket genereres, de er utvannet og lov til å vokse under forhold som bare velge begge plasmider (f.eks CSM-Trp-Leu) eller både plasmider og en positiv Y2H interaksjon som produksjon av His3-stasjoner (f.eks CSM-Leu-Trp-hans). Det er viktig å starte med en stor mengde befolkningen starter å unngå en evolusjonær 'flaskehalsen' som kan forskyve befolkningen som resultater etter valg for en positiv Y2H interaksjon. Dermed angir vår prosedyre bruker 20 mL av de 500 mL diploide befolkningen kultur for å dyrkes i 750 mL frisk CSM-Leu-Trp-hans media for å unngå dette problemet. Med pTEF-GBD som agn plasmider fant vi at én enkelt runde med fortynning og vekst var tilstrekkelig til å utvikle en informativ befolkning. Bruker ulike agn plasmider tidligere, vi brukte to rundene fortynning og vekst, en første 20 mL til 750 mL, og deretter 2 mL som mettet kultur fortynnet i 75 mL. Figur 6 viser resultatene fra PCR forsterkning over biblioteket skivene for diploide befolkningen vokst under ikke-selektive forhold, samt en første og andre etterfølgende runde av fortynning og vekst i selektiv tilstand for to forskjellige agn plasmider. Merk at med ingen valg, det er en generalisert smøre PCR produkter indikativ av en kompleks og relativt godt normalisert blanding av fragmenter. Etter valg endres dette mønsteret, med noen arter sterkt berikende slik at individuelle band kan skjelnes. Noen grad av striper er typisk for vellykket eksperimentene utført hittil, men et smøre mønster i tillegg til eller i stedet for et stripemønster, antyder en kompleks blanding av byttedyr innsettinger og ønskelig hvis man ønsker å maksimere antall kandidater den DEEPN oppdager. Veldig sterk stripemønster, hvor de fleste av PCR produktet er funnet i 1-3 band, angir at mesteparten av sekvensering dataene vil bli dominert av bare 1-3 byttedyr setter. En kan kompensere for dette delvis av innvielsen mer leser fra dette eksemplet. Man kan se at hvis befolkningen er utvannet og vokst videre (se 'valgte d2"i figur 5), stripemønster er mer fremtredende, som indikerer at byttedyr plasmider overdragelse svak men autentisk Y2H vekselsvirkningene er blir redusert mens noen få byttedyr plasmider øker sin overflod. Påfølgende fortynning og vekst til denne overdreven nivå anses mot sin hensikt til målet om å fange det største antallet potensielle kandidater og dermed med protokollen her, anbefaler vi en runde med fortynning og vekst brukes.

Figure 1
Figur 1: skjematisk DEEPN arbeidsflyten. Oversikt over prosedyrer laboratoriet vises til venstre med omtrentlige tiden det tar å fullføre aktiviteten tilsvarende. Til høyre er bioinformatikk arbeidsflyten bruker programvarepakker DEEPN og Stat_Maker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk av pTEF-GBD. TRP1-som inneholder lav kopi Gal4 DNA-bindende domene fusion protein uttrykk plasmider vises. Den har en grunnleggende TEF1 promoter, myc epitope tag, Gal4 DNA bindende domene etterfulgt en T7 RNA polymerase bindende nettsted, polylinker og PRM9 terminator i en centromere (CEN)-basert plasmider. Denne plasmider også bærer Kanamycin motstand og ColE1 bakteriell opprinnelse replikering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: uttrykk for Gal4-agn fusion proteiner. Lysates fra gjær uttrykke forskjellige agn proteiner smeltet Gal4 DNA-bindende domenet i pTEF-GBD ble utsatt for SDS side og immunoblotting med anti-myc antistoffer. pTEF-GBD uttrykker bare Gal4-DNA-bindng domenet alene; pTEF-GBD-bait1 uttrykker Gal4-DNA-bindng domenet smeltet sammen til en RhoA mangler C-terminalen prenylation området og bolig en mutasjon låse den inn i en GTP-bundet konformasjon; pTEF-GBD-bait2 uttrykker Gal4-DNA-bindng domenet smeltet sammen til en RhoA mangler C-terminalen prenylation området og bolig en mutasjon låse den inn i en BNP-bundet konformasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: selv aktivisering test Diploids fra PJ69-4A cellene bærer angitt agn plasmider og PLY5725 bærer den angitte byttedyr plasmider var serielt utvannet og oppdaget på CSM-Leu-Trp platene, CSM-Leu-Trp-hans plater og CSM-Leu-Trp-hans + 3AT plater og vokst for 3 dager på 30 ° C. PJ69-4A transformants brukes for parring var første i hvert vist i Figur 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: parring effektiviteten av Y187 vs. PLY5725. Parring reaksjonen PJ69-4A som inneholder en TRP1-som inneholder agn vektor og Y187 eller PLY5725 bærer byttedyr plasmider ble utført. 1:10,000 fortynninger var belagt på CSM-Trp-Leu du velger for diploids. PLY5725 belastningen viser en høyere parring effektivitet enn Y187 belastningen med ~ 10 fold flere kolonier produsert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: PCR av byttedyr biblioteket innstikk. DNA ble isolert fra diploide gjær som inneholder et byttedyr bibliotek som ble dyrket under ikke-selektive forhold (CSM-Leu-Trp media) eller forhold valg for en positiv Y2H interaksjon (CSM-Leu-Trp-hans media). PCR over biblioteket setter inn avslører forskjeller i repertoaret av innstikk valgt. To runder med selektiv vekst ble brukt. En innledende runde av veksten gjort av fortynne 20 mL av 500 mL diploide kultur i 750 mL av ikke-selektive CSM-Leu-Trp media, og en annen 20 mL til 750 mL CSM-Leu-Trp-hans medier for en innledende runde med selektiv vekst (d1). Dette ble etterfulgt av en ekstra runde vekst (d2) tar 2 mL d1 kulturen og fortynne i 75 mL selektiv media CSM-Leu-Trp-hans. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: kompleksiteten i Y2H cDNA bibliotek. Analyse av innholdet i en kommersielt tilgjengelig mus cDNA Y2H byttedyr biblioteker: et bibliotek fra cDNA av musen hjernen og en fra flere musen vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: generering av Y2H gjær genomisk fragment bibliotek. A. skjematisk beskrive forsamlingen av gjær genomisk fragment biblioteket pGal4AD. Genomic DNA fra belastning PLY5725 var tilfeldig skåret samskrevet med angitte Y-adaptere og samskrevet til SfiI-kutt pGal4AD. Ligations ble forvandlet til bakterier til avkastning 2.2 x 106 uavhengige kolonier som ble kombinert og vokst før isolering av sine plasmider DNA til å omfatte SacCer_TAB Y2H biblioteket. B. LEU2-som inneholder plasmider (pGal4AD) boliger Gal4 transcriptional aktivisering domene vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: kompleksiteten i Y2H gjær genomisk biblioteket. SacCer_TAB genomisk biblioteket ble forvandlet til PLY5725 MATalpha belastningen og PJ_C1, C2, C3 gjær genomisk biblioteket ble forvandlet til Υ187 ΜΑΤalpha belastningen. Diploids av disse befolkningene ble gjort av mating til PJY69-4A belastning. Befolkningen ble dyrket i 10 generasjoner og byttedyr fragmenter PCR forsterket ble utsatt for høy gjennomstrømming sekvensering og analyse. A. viser rang rekkefølgen på leser per hver genet i Y2H bibliotekene delt leser per gen funnet av sekvensering gjær genomet. Gitt tilsvarende overflod av hver genet, ville hver genet har verdien 1. B. Histogram viser antall unike plasmider per genet som koder et fragment som er både i protein koding regionen (ORF) og i riktig translasjonsforskning lesing rammen. C. sammenligning av antall forskjellige plasmider i hvert bibliotek som kode gjær gener og andelen av disse som og er ikke i riktig translasjonsforskning lesing rammen eller settes bakover. D. Tomter viser posisjoner og overflod av veikryss som tilordnes til eksempel gener (VPS8 og VPS16) finnes for plasmider i hvert bibliotek. Plasmider med gene fusjoner i translasjonsforskning leses rammen er utpekt blå. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: reproduserbarhet av DEEPN med komplekse Y2H gjær genomisk bibliotek. A. fire ulike gjær diploide bestander ble opprettet av parring med SacCer_TAB Y2H biblioteket i PLY5725, vokst under ikke-selektive forhold, og sekvensielt. Leser per genet for hver befolkningen individuelt tegnes som en funksjon av gjennomsnittlig rangering order-verdien over alle populasjoner. B. viser leser per genet mellom to prøvene etter utvalg for positiv Y2H vekselsvirkningene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her gir vi en veiledning for hvordan du utfører Y2H analyser i satsvis bruker optimalisert metoder. Det er noen viktige trinn i prosedyren for å sikre at befolkningen i gjær som plasseres under valg er representant for start biblioteket og at nok av Start gjær befolkningen brukes til å gjennomgå utvalg for å begrense variasjon . Viktigere, er disse standarder relativt lett å oppnå sammen med tilpasse metoder og materialer for en tradisjonell Y2H analysen, dermed denne tilnærmingen tilgjengelig for de fleste laboratorier utstyrt for standard molekylærbiologi. DEEPN innrømmer utvalg fra samme byttedyr biblioteket populasjon mens du bruker forskjellige agn plasmider. Derfor kan settet med samspill kandidater som produserer en Y2H interaksjon med en agn vs en annen være direkte forhold. Fordi dype sekvensering brukes, kan kontrollere start biblioteket sammensetningen for hver agn-spesifikke gjær befolkningen og følge anriking av hver kandidat byttedyr genet i biblioteket uavhengig. Satsvis behandling lar spørring samme bibliotek mot ulike agn på en semi kvantitative måte som deretter gjør det mulig å beregne en statistisk rangering4.

Det er flere trinn i denne protokollen som er avgjørende for suksess. En er at et stort antall diploids må innhentes for å sikre tilstrekkelig representasjon av Y2H byttedyr biblioteket er blandet med hver agn plasmider rundt. Parring fremgangsmåten som er beskrevet her er optimalisert ved å variere flere parametere. Vi fant at noen stammer som huset kommersielle Y2H biblioteker kompis dårlig, men, parring fremgangsmåten som er beskrevet her kan generere 2 x 106- 2 x 107 diploids når fulgt, slik at tilstrekkelig og reproduserbar overføring av Y2H bibliotek i befolkningen. En annen viktig del av prosedyren er å sikre at agn plasmider rundt ikke oppretter en positiv Y2H samhandling på egen hånd eller med Tom Gal4 aktivisering domenet byttedyr plasmider. Metoden for å velge en Y2H interaksjon er krevende vekst i fravær av histidin der en positiv Y2H interaksjon forårsaker transkripsjon av HIS3 slik at cellene skal hans +. Rutinemessig de tradisjonelle Y2H-analyser kan legge til konkurransedyktige hemmer 3AT redusere bakgrunnen vekst eller bruke andre journalister3 , dette fungerer best når celler med svake Y2H vekselsvirkningene kan vokse og dermed øke stringens for vekst og velge bare for celler med sterk Y2H vekselsvirkningene grenser repertoaret av byttedyr plasmider som kan identifiseres. Et annet viktig aspekt er å sikre at mye Start diploide befolkningen brukt å vokse under selektiv og ikke-selektive forhold å unngå evolusjonære flaskehalser fra prøvetaking feil4 . Etter kultur volumer og celle tall angitt her vil hjelpe sikre reproduserbarhet og redusere støy.

En av grunnene DEEPN tilnærming er kraftig er at det omfattende kan følge alle plasmider i et gitt byttedyr bibliotek for sin evne til å samhandle med agnet av interesse. Dermed er en av begrensningene for DEEPN kompleksiteten i biblioteket brukes. For noen kommersielle biblioteker som de vi brukte her, vi fant at antall plasmider som kode bona fide fragmenter av cDNA ORF i samme lesing rammen av Gal4 aktivisering domene er mellom 3-6 x 104 med representasjon av ~ 6000 - 8,00 0 ulike gener. Vi fant at nesten 75% av disse bibliotekene inneholdt fragmenter utelukkende tilsvarer cDNA regioner som var 3' av koding DNA sekvensen (CD/ORF). Videre hadde nesten en tredjedel av gener som hadde fragmenter i biblioteket ingen som tilsvarte regioner i ORF eller over ORF.

Vi gjorde tre andre endringer i metoden DEEPN. En er en ny MATalpha stamme som kan bære 'prey' biblioteker i en TRP1 plasmider og at vennene langt bedre enn noen kommersielt tilgjengelig biblioteket inneholder belastninger Y187. Dette sikrer fullstendig overføring av befolkningen bibliotek for hver agn rundt. Vi også laget en ny 'agn' uttrykk plasmider, som skiller seg fra tidligere beskrevet plasmider som bruker en variabel kopi 2µ-baserte ryggraden10. Her beskriver vi en lav-kopi CEN plasmider (pTEF-GBD) og finner ut at én enkelt runde med selektiv vekst er tilstrekkelig til å berike for samspill byttedyr plasmider. Til slutt, vi bygger en strømlinjeformet 'prey' bibliotek vektor og brukt til å produsere en høy tetthet tilfeldig-fragment genomic Y2H bibliotek for Saccharomces cerevisiae, som bør være nyttig i fremtiden for å oppdage og karakterisere interaksjoner amonst gjær proteiner. Samlet gjør forbedringer i materialer og Bioinformatikk verktøy (beskrevet i tilhørende arbeidet) DEEPN nærmer en tilgjengelig, gjennomførbart og effektiv måte å utføre omfattende og sammenlignende Y2H skjermer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre

Acknowledgments

Vi takker ansatte i Institute of Human Genetics for NGS biblioteket forberedelse og sekvenser. Vi takker Einat Snir for sin kompetanse innen forbereder genomisk biblioteket fragmenter Y2H plasmider biblioteket gjort her. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 og NSF forskningsstipend for prosjektet: 1517110.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’		 Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Tags

Biokjemi problemet 136 Protein interaksjon neste generasjons sekvensering DNA sekvens analyse gjær 2-Hybrid
En gjær 2-Hybrid skjerm i Batch sammenligne Protein interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Peterson, T. A., Stamnes, M. A.,… More

Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter