Summary
Nous présentons un souris tibial distraction ostéogénèse modèle développé à l’aide d’un distracteur sur mesure. L’utilisation d’une souris comme une cible d’analyse est avantageuse pour faire avancer la recherche.
Abstract
Ostéogenèse distraction (DO) est une intervention chirurgicale qui consiste à la régénération des tissus squelettiques sans greffe de cellules. Un modèle comprend trois phases : la phase de latence après ostéotomie et placement du distracteur externe ; la phase de distraction, dans lequel les extrémités osseuses séparées sont progressivement et continuellement distraits ; et la phase de consolidation. Ce distracteur sur mesure utilisée pour DO se compose de deux anneaux incomplets de résine acrylique et une vis d’expansion. Le processus a été initié en faisant un moule avec le matériau d’empreinte silicone et puis en créant le distracteur sur mesure. Résine dentaire a été coulé dans le coffrage en matériau d’empreinte silicone, et il a été autorisé à se polymériser pour créer les bagues résine incomplète requis pour le distracteur sur mesure. Ces anneaux ont été fixées par une vis d’expansion à l’aide de résine transparente. Le distracteur sur mesure créé par l’intermédiaire de cette approche était attaché sur le tibia de souris. Le tibia a été fixé à l’appareil à l’aide d’une paire d’aiguilles 25 G dans la partie proximale, une paire d’aiguilles 27 G dans la partie distale et de résine acrylique. Après une période de latence de 5 jours, distraction a été initiée à un taux de 0,2 mm/12 h. L’allongement a été poursuivi pendant 8 jours, ce qui entraîne un déficit total de 3,2 mm. Les souris ont été euthanasiées 4semaines après distraction. La formation osseuse dans l’espace de distraction a été confirmée à l’aide de la radiographie et l’histologie.
Introduction
Ostéogenèse distraction (DO) est une méthode de traitement établi pour une variété de troubles squelettiques, comme les différences de longueur de branche, défauts osseux et limb difformités1. Cette stratégie de traitement unique repose sur le « principe de tension-tension » proposé par Ilizarov. La méthode nécessite plusieurs jours pour plusieurs mois pour la consolidation de latence et plusieurs semaines de distraction active jusqu'à ce que l’os mature est formé de2.
Les conditions locales hypoxiques en raison du blocage des flux de sang3,4 et une stimulation mécanique5,6 sont particulièrement importantes dans le processus de guérison de DO. Angiogenèse induite par l’hypoxie transporte l’oxygène, de nutriments, de facteurs solubles et de cellules nécessaires à la réparation des tissus localement par le biais de la circulation sanguine. Une stimulation mécanique de l’opération d’extension entraîne des réactions biologiques tels que la différenciation des cellules souches mésenchymateuses, la formation osseuse, la calcification et le remodelage. Série traitement permet la formation de non seulement les tissus durs, mais aussi les tissus mous, y compris les nerfs, les muscles, les vaisseaux sanguins et les tissus de la peau, sans la nécessité d’une greffe de cellules souches. Par conséquent, un modèle est considéré comme un excellent modèle pour l’analyse de la régénération des tissus différents.
Lapins et chiens sont les animaux les plus utilisés dans la recherche fondamentale pour DO ; Cependant, il y a quelques outils d’analyse disponibles pour ces animaux. L’utilisation d’un modèle de souris facilite une analyse plus détaillée. Il est particulièrement approprié pour les expériences utilisant des souris knock-out. Toutefois, lorsque vous utilisez une souris comme un animal expérimental, un dispositif d’extension doit être créé. Ici, nous présentons une souris tibiale modèle développé à l’aide d’un distracteur sur mesure créé à l’aide d’un outil de laboratoire dentaire et de la technique, qui a été utilisé dans une étude antérieure.
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Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l’utilisation de notre institution et animalier. Stériliser tous les instruments avant la procédure.
1. préparation d’un moule pour créer le distracteur sur mesure
- Faire deux anneaux incomplets (diamètre extérieur, 20 mm, diamètre intérieur, 10 mm), qui font partie de la distraction, avec une feuille de cire de paraffine (145 mm x 74 mm) à l’aide d’un sculpteur de cire Evans.
- Faire 4 des mêmes pièces. Utilisez une spatule cire chauffée avec un brûleur à gaz. Empiler les quatre anneaux pour une épaisseur de 5 mm. fournir l’espace pour la vis d’expansion et de l’aiguille et 8 x 2 mm 5 mm x 2 mm respectivement avec le sculpteur de cire Evans (Figures 1 a, 1 b).
- Incorporer des modèles en cire dans le matériau d’empreinte silicone et créer un moule pour les anneaux de résine (Figure 1C).
- Après durcissement du matériau d’empreinte silicone (environ 5 min à température ambiante), supprimer les modèles en cire.
2. production du distracteur sur mesure
- Appliquer la vaseline finement et uniformément au moule silicone. Mélanger 3 g de résine dentaire de polymérisation et verser immédiatement dans le moule silicone. La valeur pendant 5 min à température ambiante (RT).
- Retirer la bague résine polymérisée du moule et polir avec un bar de carbure et d’un micromoteur dentaire pour enlever la bavure (environ 1 min). Deux anneaux de résine est requises pour chaque distracteur sur mesure.
- Répétez la procédure pour créer le nombre requis de segments de résine (Figure 1D).
- Laissez un espace d’environ 2 mm, à fixer les anneaux de résine avec de la cire utilitaire et sécurisé de l’extérieur de la vis d’expansion complètement avec de la résine transparente. La valeur de la résine pendant 5 min à température ambiante. Lorsque la polymérisation est terminée, retirez le bouton à vis expansion (Figure 1E).
3. Protocole chirurgical
- Utilisez la souris mâles de 8 semaines.
- Induire l’anesthésie avec une injection intrapéritonéale de la médétomidine chlorhydrate à 0,3 mg/g, le midazolam à 4 mg/kg et butorphanol tartrate à 5 mg/kg de poids corporel.
- Rasez soigneusement et désinfecter la zone chirurgicale avec la solution d’iode 10 % ensuite administrer 0,5 % du chlorhydrate de lidocaïne à la jambe droite.
- Faire une incision longitudinale de la peau (environ 15 mm de longueur) à droite bas de la jambe avec un bistouri n ° 15. Carrément séparer les muscles sous-jacents, en prenant soin de ne pas pour enlever tous du périoste. L’approche de l’extérieur pour rejoindre facilement le péroné. Coupez le péroné avec des ciseaux.
- Saisir la cheville avec une pince stérile mince étroite et utiliser une aiguille stérile de 27 G pour faire un trou dans l’os du talon d’environ 5 mm. L’aiguille doit pénétrer la peau, des os et la peau dans cet ordre. L’aiguille pénètre, couper la pointe et la racine avec une pince afin que l’aiguille est d’environ 15 mm.
- Faire un autre trou de la même manière, environ 2 – 3 mm proximaux. Organiser autour de la cheville et passez deux aiguilles 25 G sous le genou de la même manière. Après que les aiguilles pénètrent, couper les pointes et les racines avec une pince (Figure 1F).
- Placez le distracteur sur mesure telles qu’il soit parallèle à la direction de l’extension. Fixer les aiguilles et l’appareil assez résine dentaire de polymérisation pour remplir les rainures de l’appareil. Attendre que la polymérisation à compléter (environ 5 min) (Figure 1G).
- Veillez à ne pas endommager les tissus environnants. Couper au milieu de la diaphyse du tibia à l’aide d’un disque de coupe très mince tout en appliquant une solution saline (1 à 2 mL).
- Refermer la plaie avec une suture en nylon de 4-0.
- Donner des injections sous-cutanées de la buprénorphine (0,1 mg/kg) pour l’analgésie immédiatement après l’opération. Continuer la buprénorphine chaque 12 h par jour postopératoire 7 et si nécessaire, par la suite.
4. Protocole de distraction
Remarque : Il existe différents rapports sur le taux de distraction et de la période de latence, mais ici, les protocoles représentant sont indiqués.
- Après une période de latence de 5 jours, commencez la distraction à un taux de 0,2 mm/12 h. Pour l’extension, utilisez la partie pointue attachée à la vis d’expansion rapide. Déplacer la broche dans le sens de la flèche jaune, attaché à la vis de prolongation (Figure 1E).
- L’anesthésie n’est pas nécessaire durant l’extension. Tenir la queue avec le petit doigt et de palmiers et accrocher le dispositif d’extension avec l’index et le pouce.
- Effectuer l’extension (0,2 mm pour 1/4 de tour). Continuer l’allongement pendant 8 jours, qui se traduira par un déficit total de 3,2 mm.
5. analyse
- Analyse de la radiographie : à l’issue de la prolongation, évaluer la régénération osseuse avec la tomographie par ordinateur sous anesthésie générale par l’isoflurane de 2,0 %.
Remarque : Si le soin a été apporté en ce qui concerne la position de l’appareil d’extension, il est possible de l’évaluer avec radiographie simple même lorsque le dispositif est attaché. - L’analyse histologique : soigneusement éloigner l’appareil de manière à ne pas provoquer un site de distraction de fracture lors de l’échantillonnage. Fixer l’échantillon dans 10 % de formol tamponné neutre pendant 24 h à température ambiante. Détartrer la cafetière avec une solution de Morse (citrate de sodium 10 %, 20 % d’acide formique) durant la nuit à 4 ° C.
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Representative Results
Figures 1 a et 1 b présentent des anneaux incomplets (extérieur diamètre, 20 mm intérieur diamètre, 10 mm ; épaisseur 5 mm) avec de la cire de paraffine. Deux modèles en cire ont été incorporées dans le matériau d’empreinte silicone et un moule pour les anneaux de résine (Figure 1C) a été formé. Résine polymérisée a été immédiatement coulé dans ce moule, et anneaux de résine ont été obtenus (Figure 1D). Un distracteur sur mesure a été créée en combinant deux anneaux de résine et une vis d’expansion (Figure 1E). Figure 2 A renferme des conclusions typiques de radiographie à 4 semaines après distraction dans le modèle. Les os nouvellement formé a été observée sur le site de distraction. Figure 2B présente l’hématoxyline et éosine résultats de coloration. Un pont de l’OS nouvellement formé a été observé, et l’OS nouvellement formé peut être facilement distinguée de l’OS natif. Il n’y avait aucun fracture peropératoire ou infection postopératoire chez les 5 souris utilisé dans cette expérience.
Figure 1 : Sur mesure distracteur. (A, B) Les dimensions approximatives de l’anneau sont les suivantes : diamètre extérieur, 20 mm ; diamètre intérieur, 10 mm ; épaisseur 5 mm. Les espaces de la vis d’expansion (flèche blanche) et l’aiguille (tête de flèche noire) sont sécurisés. (C) cire incorporé dans le matériau d’empreinte silicone. (D) Completed anneaux en résine. (E), les deux anneaux de résine et la vis d’expansion sont fixés avec de la résine. (F) quatre aiguilles sont insérées dans la métaphyse proximale et distale du tibia. (G) dispositif de Distraction placé dans la branche de la souris. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les résultats radiologiques et histologiques. (A) radiologiquement, l’OS nouvellement formé est observée 4 semaines après la distraction. (B) sur le plan histologique, la lacune est comblée avec nouvellement formé des os (barre d’échelle = 500 µm). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Lorsqu’il est un grand animal est utilisé comme modèle expérimental, un dispositif d’extension prêtes à l’emploi peut être utilisé, et il est facile d’obtenir la bonne fixation et évaluer le fonctionnement de l’extension elle-même et le montant de l’extension. Toutefois, lorsqu’une souris est utilisée comme modèle expérimental, il est nécessaire de développer tout ou partie de l’équipement. Isefuku et coll. et Tay et coll. fait l’appareil et créé un modèle de souris7,8. Carvahjo et coll. a adopté une méthode impliquant la fixation d’un dispositif d’expansion prêtes à l’emploi (trace distracteur : KLS Martin) par une ligature fil9. Nous pourrions également créer un modèle de souris à l’aide de produits existants pour périphériques d’extension et de mettre au point une méthode de fixation. Cette approche permettrait aisément de fabriquer le dispositif d’extension, effectuer l’extension et évaluer le montant de l’extension. En outre, il est prévu qu’un modèle de défaut segmentaire tibiale pourrait être créé en utilisant le même appareil. En outre, la longueur du défaut peut être ajustée par incréments de 0,2 mm, et ainsi, l’appareil est considéré comme polyvalent.
Dans une telle expérience, il est techniquement difficile à enfiler l’aiguille dans le tibia. En particulier, le diamètre de la partie distale du tibia est petit, et une formation est nécessaire pour passer de deux aiguilles. Si OS suffisant n’est pas remarqué, il est nécessaire de vérifier si la bonne fixation est obtenue. Afin d’obtenir la bonne fixation, il serait préférable de passer les aiguilles dans un angle et avec un écart aussi large que possible entre les aiguilles7,8. En outre, puisque le taux de guérison et l’histologie durant la cicatrisation seraient modifié selon la méthode de l’ostéotomie, il est nécessaire d’effectuer la procédure d’une certaine manière.
La taille de l’animal d’expérience peut être considérée comme un facteur limitant de cette expérience. Il n’y a pas de problèmes quand la souris est grande ; Toutefois, si elle est trop petite, chirurgie elle-même ne serait pas possible. Auparavant, nous avons utilisé des souris de 4 semaines et ont été en mesure d’effectuer des expériences sans aucun problèmes10. En ce qui concerne la période d’évaluation, périphériques d’extension peuvent être installés sans problème jusqu'à 42 jours après avoir coupé l’OS. Cependant, comme d’autres observations ont été pas faites, des recherches supplémentaires sont nécessaire à l’avenir. La survenue de complications peut être un problème lors de l’avancement des expériences. Fracture au cours de la chirurgie peut survenir chez environ 1 sur 30. De même, infection de plaie postopératoire peut survenir chez environ 1 sur 30.
En conclusion, nous avons présenté un modèle murin de la tibial développé à l’aide d’un distracteur sur mesure.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Mme Makiko Kato pour fournir des encouragements pour compléter cette étude. Nous remercions également la Division des animaux d’expérimentation et recherche médicale Engineering, Nagoya University Graduate School of Medicine, le boîtier de la souris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
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