Summary
Apresentamos um modelo de osteogênese de distração da tíbia do rato desenvolvido usando um distrator feitos sob medida. O uso de um rato como um alvo de análise é vantajoso para fazer avançar a pesquisa.
Abstract
Osteogênese de distração (DO) é um procedimento cirúrgico que envolve a regeneração do tecido esquelético sem transplante de células. Um modelo consiste em três fases: a fase de latência após a osteotomia e colocação do distrator externo; a fase de distração, em que as extremidades de ossos separados estão gradualmente e continuamente distraídas; e a fase de consolidação. Este feito por distrator usado para fazer é composto por dois anéis incompletos de resina acrílica e um parafuso de expansão. O processo foi iniciado por fazer um molde com material de impressão de silicone e em seguida, criando o Distrator feitos sob medida. Resina dental foi derramada o molde feito de material de impressão de silicone, e foi permitido a polimerizar para criar os anéis de resina incompleto exigidos para o Distrator feitos sob medida. Estes anéis foram fixados com um parafuso de expansão com resina transparente. O Distrator sob medida criado através desta abordagem foi anexado à tíbia de ratos. A tíbia foi fixada para o dispositivo usando um par de agulhas 25g proximalmente, um par de agulhas 27 G distalmente e resina acrílica. Após um período de latência de 5 dias, distração foi iniciada em uma taxa de 0,2 mm/12 h. O alongamento foi continuado por 8 dias, resultando em um espaço total de 3,2 mm. Os ratos foram sacrificados 4 semanas após a distração. Formação óssea na brecha distração foi confirmada usando radiografia e histologia.
Introduction
Osteogênese de distração (DO) é um método de tratamento estabelecida para uma variedade de distúrbios esqueléticos, tais como discrepâncias de comprimento dos membros, defeitos ósseos e membro deformidades1. Esta estratégia de tratamento original baseia-se o "princípio de tensão-estresse" proposto por Ilizarov. O método requer vários dias de latência, várias semanas para distração ativa e vários meses para consolidação até o osso maduro é formado de2.
As condições locais de hipóxicos devido ao bloqueio do fluxo de sangue3,4 e5,de estimulação mecânica6 são particularmente importantes no processo de cura de fazer. Angiogênese induzida por hipóxia transporta oxigênio, nutrientes, fatores solúveis e células necessárias para o reparo do tecido localmente através do fluxo de sangue. Estimulação mecânica pela operação de extensão provoca reações biológicas, tais como a diferenciação de células-tronco mesenquimais, formação óssea, calcificação e remodelação. Serial tratamento permite a formação de tecidos duros, não só mas também os tecidos moles, incluindo músculos, nervos, vasos sanguíneos e tecidos da pele, sem a necessidade de transplante de células-tronco. Portanto, um modelo é considerado um excelente modelo para analisar a regeneração de vários tecidos.
Coelhos e cães são os animais mais amplamente utilizados na investigação de base para fazer; no entanto, há algumas ferramentas de análise disponíveis para estes animais. O uso de um modelo de mouse facilita uma análise mais detalhada. É particularmente apropriado para experimentos utilizando ratos do KO. No entanto, ao usar um mouse como um animal experimental, um dispositivo de extensão deve ser criado. Aqui, nós apresentamos um rato da tíbia do modelo desenvolvido usando um distrator sob medida criado usando uma ferramenta de laboratório dental e técnica, que tem sido usada em um estudo anterior.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de uso de nossa instituição e cuidado Animal. Esterilize todos os instrumentos antes do procedimento.
1. preparação de um molde para a criação do distrator sob medida
- Faça dois anéis incompletos (diâmetro exterior, 20 mm, 10 mm de diâmetro interno,), que são uma parte do distrator, com uma folha de cera de parafina (145 mm x 74 mm) usando um carver de cera Evans.
- Fazer 4 das mesmas peças. Use uma espátula de cera aquecida com um queimador de gás. Empilhe os quatro anéis para uma espessura de 5 mm. fornecer espaço para o parafuso de expansão e agulha, 8 x 2 mm e 5 mm x 2 mm respectivamente com o escultor de cera Evans (Figuras 1A, 1B).
- Incorporar os padrões de cera no material de impressão de silicone e criar um molde para os anéis de resina (Figura 1C).
- Após a cura do material de impressão de silicone (aproximadamente 5 min à temperatura ambiente), remova os padrões de cera.
2. produção do distrator sob medida
- Aplica vaselina em fatias finas e uniformemente para o molde de silicone. Mix 3 g de resina dentária de polimerização e imediatamente despeje no molde de silicone. Definido por 5 min à temperatura ambiente (RT).
- Retire o anel de resina polimerizada do molde e lustrá-la com uma barra de metal duro e um micromotor odontológico para remover as rebarbas (cerca de 1 min). Dois anéis de resina são necessários para cada distrator feitos sob medida.
- Repita o procedimento para criar o número necessário de anéis de resina (Figura 1D).
- Deixa uma lacuna de cerca de 2 mm para fixar os anéis de resina com cera utilidade e seguro fora do parafuso de expansão completamente com resina transparente. Definir a resina por 5 min em RT Quando polimerização estiver concluída, retire o botão de parafuso de expansão (Figura 1E).
3. cirúrgico protocolo
- Use camundongos machos de 8 semanas de idade.
- Induzi a anestesia com a injeção intraperitoneal de cloridrato de medetomidina a 0,3 mg/g, midazolam em 4 mg/kg e tartarato de butorfanol em 5 mg/kg de peso corporal.
- Raspe cuidadosamente e desinfetar a área cirúrgica com solução de iodo 10% e em seguida, administrar cloridrato de lidocaína 0,5% no membro inferior direito.
- Fazer uma incisão longitudinal da pele (aproximadamente 15 mm de comprimento) no canto direito inferior a perna com um bisturi n º 15. Sem rodeios, separe os músculos subjacentes, tomando cuidado para não remover todo o periósteo. Aproxime-se do lado de fora para chegar facilmente a fíbula. Corte a fíbula com uma tesoura.
- Segure o tornozelo com Pinças esterilizadas finas estreitas e usar uma agulha estéril de 27 G para fazer um buraco no osso do calcanhar, com cerca de 5 mm. A agulha deve penetrar a pele, ossos e pele, nessa ordem. Quando a agulha penetra, corte a ponta e a raiz com um alicate para que a agulha é de cerca de 15 mm.
- Fazer outro buraco da mesma forma, cerca de 2 a 3 mm proximal. Segure o tornozelo e passar duas agulhas 25g sob o joelho da mesma maneira. Depois de penetram as agulhas, corte as pontas e as raízes com uma pinça (Figura 1-F).
- Coloque o Distrator sob medida tais que é paralela à direção de extensão. Corrigi as agulhas e o dispositivo com bastante resina dentária de polimerização para preencher os sulcos do dispositivo. Aguarde a polimerização completar (aproximadamente 5 min) (Figura 1G).
- Tenha cuidado para não danificar os tecidos circundantes. Corte no meio da diáfise da tíbia usando um disco de corte muito fino, aplicando uma solução salina (1-2 mL).
- Feche a ferida com uma sutura de nylon 4-0.
- Dar injecções subcutâneas de buprenorfina (0,1 mg/kg) para analgesia imediatamente depois da operação. Continue a buprenorfina cada 12h por dia pós-operatório 7 e tão necessário posteriormente.
4. distração protocolo
Nota: Existem vários relatos sobre a taxa de latência período e distração, mas aqui, o representante protocolos são mostrados.
- Após um período de latência de 5 dias, comece a distração, a uma taxa de 0,2 mm/12 h. Por extensão, usam o pino ligado ao parafuso de rápida expansão. Mova o pino na direção da seta amarela anexada ao parafuso extensão (Figura 1E).
- Anestesia não é necessária durante a extensão. Segure a cauda com o dedo mindinho e palm e fixar o dispositivo de extensão com o dedo indicador e o polegar.
- Execute a extensão (0,2 mm para 1/4 de volta). Continue o alongamento por 8 dias, o que resultará em um espaço total de 3,2 mm.
5. análise
- Análise de radiografia: após a conclusão da extensão, avaliar regeneração óssea com tomografia computadorizada sob anestesia geral com o uso de isoflurano 2,0%.
Nota: Se houve cuidado no que diz respeito a posição do dispositivo de extensão, é possível avaliá-lo com radiografia simples, mesmo com o dispositivo conectado. - A análise histológica: remover o aparelho cuidadosamente para não causar uma fratura de distração durante a amostragem. Corrigi a amostra em 10% neutro formalina tamponada por 24 horas à temperatura ambiente. Descalcificar com solução do Morse (citrato de sódio de 10%, 20% de ácido fórmico) durante a noite a 4 ° C.
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Representative Results
Figuras 1A e 1B apresentam anéis incompletos (exterior diâmetro, 20mm interna diâmetro, 10 mm; espessura, 5mm) com cera de parafina. Dois padrões de cera foram incorporados em material de impressão de silicone, e formou-se um molde para os anéis de resina (Figura 1C). Resina polimerizada foi derramada imediatamente este molde, e anéis de resina foram obtidos (Figura 1D). Um distrator sob medida foi criado pela combinação de dois anéis de resina e um parafuso de expansão (Figura 1E). Figura 2 A apresenta resultados de radiografia típica em 4 semanas após distração no modelo. Ósseo neoformado observou-se no local da distração. Figura 2B apresenta a hematoxilina e eosina, manchando os resultados. Observou-se uma ponte de osso recém-formado, e o osso recém-formado poderia ser facilmente distinguido do osso nativo. Não houve fratura intra-operatório ou infecção pós-operatória nos 5 ratos utilizados neste experimento.
Figura 1 : Feito por distrator. (A, B) As dimensões aproximadas do anel são os seguintes: diâmetro exterior, 20 mm; diâmetro interno, 10 mm; espessura, 5mm. Estão garantidos os espaços para o parafuso de expansão (seta branca) e a agulha (seta preta). (C) o padrão de cera incorporado no material de impressão de silicone. (D) Completed anéis de resina. (E) os dois anéis de resina e o parafuso de expansão são protegidos com resina. (F) quatro agulhas são inseridas em metáfise proximal e distal da tíbia. (G) distração dispositivo colocado no membro do mouse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Achados radiológicos e histológicos. (A) radiograficamente, ósseo neoformado observa-se 4 semanas após a distração. (B) histologicamente, a lacuna é preenchida com recém formado osso (barra de escala = 500 µm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Quando um animal grande é usado como um modelo experimental, pode ser usado um dispositivo de extensão de ready-made, e é fácil de obter boa fixação e avaliar a operação de extensão em si e a quantidade de extensão. No entanto, quando um rato é usado como um modelo experimental, é necessário desenvolver alguns ou todos os equipamentos. Isefuku et al e Tay et al fez o dispositivo e criou um modelo de rato7,8. Carvahjo et al adoptou um método que envolve a fixação de um dispositivo de expansão de ready-made (faixa distrator: KLS Martin) com uma ligadura fio9. Podemos também criar um modelo rato, usando produtos existentes para dispositivos de extensão e conceber um método de fixação. Esta abordagem que facilitam a fabricação do dispositivo de extensão, realizar a extensão e avaliar a quantidade de extensão. Além disso, espera-se que um modelo de defeito segmentar tibial pode ser criado usando o mesmo dispositivo. Além disso, o comprimento do defeito pode ser ajustado em passos de 0,2 mm, e assim, o dispositivo é considerado para ser versátil.
Em tal experiência, é tecnicamente difícil enfiar a linha através da tíbia. Em particular, o diâmetro da parte distal da tíbia é pequeno, e algum treinamento é necessário para passar duas agulhas. Se o osso suficiente não é observado, é necessário verificar se é obtida a boa fixação. A fim de obter boa fixação, talvez seja melhor passar as agulhas em um ângulo e com uma abertura tão grande quanto possível entre as agulhas7,8. Além disso, como a taxa de cicatrização e a histologia durante a cicatrização, mudaria de acordo com o método da osteotomia, é necessário executar o procedimento de uma certa forma.
O tamanho do animal experimental pode ser considerado como um fator limitante desta experiência. Não existem problemas quando o mouse é grande; no entanto, se for muito pequeno, cirurgia em si pode não ser possível. Anteriormente, usamos ratos de 4 semanas e foram capazes de realizar experimentos sem quaisquer problemas de10. No que se refere ao período de avaliação, dispositivos de extensão podem ser instalados sem problemas até 42 dias após o corte do osso. No entanto, como ainda não foram feitas observações, investigação adicional é necessária no futuro. A ocorrência de complicações pode ser um problema quando avançando experimentos. Fratura durante a cirurgia pode ocorrer em aproximadamente 1 de 30 ratos. Da mesma forma, infecção da ferida pós-operatória pode ocorrer em aproximadamente 1 de 30 ratos.
Em conclusão, apresentamos um modelo rato tibial desenvolvido usando um distrator feitos sob medida.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores agradecer a Sra. Makiko Kato para fornecer incentivo para completar este estudo. Agradecemos também a divisão de animais experimentais e pesquisa de engenharia médica, Nagoya University Graduate School of Medicine, para o alojamento de ratos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraffin wax | YAMAHACHI DENTAL MFG. CO. | - | For preparation a mold for resin rings |
| Labocone putty | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Utility wax | GC Corporation | - | For preparation a mold for resin rings |
| Expansion screw | Ortho Dentaurum | 600-301-30 | Component of custom-made distractor |
| Unifast III | GC Corporation | - | Immediate polymerization resin Component of custom-made distractor |
| Ortho Crystal | NISSIN | - | Transparent resin Component of custom-made distractor |
| 25 G needle | TERUMO | NN-2516R | For custom-made distractor |
| 27 G needle | TERUMO | NN-2719S | For custom-made distractor |
| ICR mouse | Chubu Kagaku Shizai Corporation | - | Experimental animal |
| Somnopentyl | Kyoritsu Seiyaku | - | Pentobarbital sodium salt |
| Isoflurane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 099-06571 | Isoflurane inhalation solution |
References
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