Analizar el tamaño, forma y direccionalidad de las redes de astrocitos acoplados

Muchos estudios han descrito cómo el diálogo astrositos neurona a nivel subcelular o sináptico puede tener implicaciones en las funciones neuronales y transmisión sináptica. Está bien establecido que los astrocitos son sensibles a los que rodean la actividad neuronal; de hecho, tienen receptores para muchos neurotransmisores como glutamato, GABA, acetilcolina y ATP (ver comentarios anteriormente publicados^2,3,4). A cambio, astrocytic procesos elementos sinápticas ensheath y actividad neuronal influencia allí y en los sitios extrasinápticos regulación de la homeostasis iónica extracelular y soltando varios factores o transmisores tales como glutamato, D-serina y ATP ^{5 , 6 , 7}.

Ha surgido la idea de que los astrocitos también pueden modular la función neuronal a nivel de red, con pruebas de que astrocytic acoplamiento espacial está regulada y corresponde a la segmentación neuronal en áreas caracterizadas por un claro anatómica compartimentalización (como zonas con representaciones sensoriales), indicando que los astrocitos se pareja otros astrocitos que sirven la misma función en lugar de sólo los que están cerca. En la oliva superior lateral, por ejemplo, redes más astrocíticos se orientan ortogonalmente al eje tonotópica⁸, mientras que en los glomérulos de corteza o olfactoty de barril, comunicación entre astrocitos es mucho más fuerte dentro de barriles o glomérulos y más débil entre los adyacentes unos^9,10. En ambos casos, las redes astrocíticos se orientan hacia el centro de la glomerule o barril^9,10.

Recientemente demostramos que actividad astrocytic modula la leña neuronal por la disminución de la concentración extracelular Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_e), presumiblemente a través de la liberación de S100β, Ca^{2 +}-binding proteína¹¹. Este efecto, que fue demostrado en una población de neuronas rhythmogenic del trigémino en la parte dorsal del sensorial principal del trigémino núcleo (NVsnpr, se cree que juegan un papel importante en la generación de movimientos de masticación), resulta del hecho de que rítmico disparo de estas neuronas depende de una persistente Na⁺ actual que es promovida por disminuciones de [Ca^{2 +}]_e^11,12. Rítmico disparo de estas neuronas puede sacaron "fisiológico" por el estímulo de sus entradas o disminución artificial de la [Ca^{2 +}]_e. Demostramos más que acoplamiento astrocytic fue requerida para leña rítmica neuronal¹. Esto levantó la posibilidad de que redes astrocytic pueden formar dominios funcionales circunscritos donde la actividad neuronal puede ser sincronizada y coordinada. Para evaluar esta hipótesis, primero teníamos que desarrollar un método para documentar rigurosamente la organización de estas redes en NVsnpr.

Estudios previos en redes astrocytic han descrito sobre todo el grado de acoplamiento en términos de número de la célula y la densidad y área cubierta. Tentativas para evaluar la forma de redes astrocytic y la dirección de acoplamiento de tinte en su mayoría fueron realizadas comparando el tamaño de las redes a lo largo de dos ejes (x e y) en el barril corteza⁹, hipocampo^{13,14, 15}, barreloid campos del tálamo¹⁶, oliva superior lateral⁸, glomérulos olfativos¹⁰y¹⁴de la corteza. Los métodos aquí descritos permiten imparciales recuentos de células marcadas en una red y una estimación del área que cubren. También hemos desarrollado herramientas para definir la orientación preferida de acoplamiento dentro de una red y evaluar si la orientación preferida es hacia el centro del núcleo o en una dirección diferente. En comparación con los métodos utilizados anteriormente, este protocolo proporciona un medio para describir la organización y orientación de astrocytic redes en estructuras como el núcleo sensorial principal del trigémino dorsal que no tienen una clara anatómica conocida compartimentalización. En los estudios mencionados, la orientación de la red se describe como una relación a la forma de la estructura que ya está documentada (por ej., la barreloid en el tálamo, barriles en la corteza, las capas en el hipocampo y corteza, glomérulos en el bulbo olfatorio, etcetera). Además, análisis vectorial permite comparaciones de orientaciones reveladas bajo diferentes condiciones de acoplamiento. Para analizar si estos parámetros cambiaron según la posición de la red dentro del núcleo, también se desarrolló un método para cada red en referencia a los límites del núcleo. Estas herramientas pueden ser fácilmente adaptadas a otras áreas para investigar redes de células acopladas.

Todos los procedimientos de morada por el Reglamento de los institutos canadienses de investigación en salud y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal de la Universidad de Montreal.

1. preparación de rodajas de cerebro de rata

1. Preparar 1 L de una solución de sacarosa (tabla 1) y 1 L de líquido cerebral espinal artificial estándar (aCSF) (tabla 2).
2. La burbuja de la solución de sacarosa con una mezcla de 95% O₂ y 5% CO₂ (carbogen) por 30 min antes de colocar de-80 ° C durante 30 minutos, hasta que la solución esté fría pero no totalmente congelado. Utilizar esta sacarosa helada como el búfer de corte para el corte del cerebro. Mantenga el hielo una vez que se retira del congelador.
3. La burbuja de la aCSF con carbogen a través de todo el experimento. Utilice esta solución para el almacenamiento de la rebanada y la perfusión buffer en el cual se realizará la sujeción de parche y de biocitina de astrocitos. Preparar una recuperación de la rebanada con cámara para depositar las rebanadas de cerebro tan pronto como se cortan.
   Nota: La cámara de retención recuperación rebanada podría ser por encargo y consiste esencialmente en un pequeño pozo con una malla en la parte inferior, suspendida en un pozo más grande que se llena con aCSF, en el cual se inserta un tubo para llevar carbogen desde la parte inferior.
4. Uso de 15 a 21 días de edad ratas Sprague-Dawley sin ningún sesgo de sexo o cepa específica. Anestesiar los animales con isoflurano (1 mL de isoflurano en una cámara de inducción de la anestesia). Verificar la profundidad de la anestesia pellizcando suavemente la pata trasera o la cola del animal.
5. Decapitar a la rata con una guillotina, corte su cráneo con unas tijeras y quitar rápidamente el cerebro del cráneo con una espátula plana.
6. Sumergir el cerebro en la helada solución de sacarosa de 30 s y transferencia que (con solución) un petri dish. Con una cuchilla de afeitar, retirar las porciones anterior y posterior a la zona para ser seccionados, si cortar rebanadas en el plano transversal.
7. El bloque restante del tejido de cerebro en su parte rostral del pegamento y proceder a cortar rebanadas de cerebro (350 μm de espesor) en el medio de sacarosa con un vibratome. Luego, se transfieren las rebanadas recogidas en una recuperación sosteniendo la cámara llenado de aCSF carbogenated a temperatura ambiente (RT) hasta que estén listos para ser usados (permiten al menos 1 hora para la recuperación).
   Nota: Los acontecimientos recientes en el campo permitan incubación prolongada hasta 24 h de rebanadas cerebrales in vitro condiciones¹⁷.

2. sulforodamina 101 (SR-101) etiquetado de astrocitos

1. Calentar previamente un baño de agua a 34 ° C y colocar dos cámaras de incubación de la rebanada en él. Una de las cámaras de incubación de la rebanada se llenan de una solución de la aCSF que contiene 1 μM SR-101 y el otro sólo aCSF.
2. Incubar las rebanadas en la cámara de incubación con el 1 μm SR-101 para 20 minutos y luego de la transferencia en la segunda incubación de cámara para enjuagar el exceso SR-101 del tejido. Dejar incubar durante 20 min o más a 34 ° C, mantenga entonces la cámara de incubación conteniendo las láminas a temperatura ambiente hasta que necesita¹⁸.

3. astrositos remendar y rellenar de biocitina

1. Seleccione un sector y colocar en la cámara de grabación del microscopio. Parche de astrocitos, usar electrodos con una resistencia de 4-6MΩ cuando se llena con una solución a base de gluconato de potasio (ver tabla 3).
2. Bajo orientación visual y con un micromanipulador, dirija el electrodo de registro hacia un SR-101-labeled astrositos como se muestra en la figura 1. Evitar células situadas en la superficie de la rodaja ya que son más propensos a dañarse o han perdido conexiones a células vecinas.
3. Para evitar fugas de biocitina en el tejido, reducir al mínimo la presión positiva a la pipeta de parche y aplicarlo sólo cuando está cerca de los astrositos que serán parcheado (0.1-0.4 mL en una jeringa de 1 mL).
4. Antes de parchear, ajuste la compensación de la pipeta y su capacitancia. Corregir para potenciales de Unión líquida, como críticos a los experimentos¹⁹comandos de voltaje preciso y exacto.
5. Mueva la pipeta lo suficientemente cerca a los astrositos observar depresión causada por la presión positiva. Luego, retirar la presión positiva y lentamente aplique algo de presión negativa. Sujete los astrositos a -70 mV cuando el sello alcanza 100 MΩ. Espere hasta que el sello alcanza 1-3 GΩ. Continúe aplicando presión negativa hasta romper en la célula. Tenga cuidado mientras aplica presión negativa, ya que los astrocitos son muy frágiles.
6. Evaluar las propiedades electrofisiológicas de la célula parcheada. En modo de pinza de voltaje, realizar un protocolo de corriente-voltaje de células completas con un comando de voltaje de la rampa de 600 ms de duración oscilan entre -120 y + 110 mV. En el modo de la abrazadera de la corriente, realizar un protocolo de paso IV en el que la inyección de 1000 ms pasos actual de 100 pA de -1 a 1 nA, la frecuencia de muestreo de las grabaciones de celulares es de 10 kHz.
   Nota: Los astrocitos muestran un perfil lineal de corriente-voltaje sin ningún tipo de rectificación (como se muestra en la figura 1B) y ningún potencial de acción, disparando sobre la despolarización de la membrana (figura 1). El potencial de membrana de reposo (RMP) debe ser estable y positivo - 60mV. En algunas áreas del cerebro, el RMP de astrocitos es hyperpolarized más que en el NVsnpr.
7. Permiten la biocitina difundir dentro de los astrositos durante 30 minutos mientras se realiza un paso Protocolo IV cada 5 min.
8. Retraer y separar la pipeta del parche con cuidado sin dañar los astrositos parcheado e inmediatamente Observe el desplazamiento de la pipeta antes de sacarlo de la sala de grabación. Reste ese valor de las grabaciones de potencial de membrana.
9. Deje la rebanada del cerebro para descansar en la sala de grabación para un mínimo de 15 minutos (además de los 30 min de la inyección) para permitir la difusión del trazalíneas de astrositos parcheado a toda la red de células acopladas.
   Nota: Para descubrir una red de células acopladas, sólo una sola celda debe ser parchada en el núcleo de interés. Si múltiples intentos se requieren para lograr un éxito parche, deseche el caso y tratar de parche en el lado contralateral o en otro segmento del cerebro.
10. Hacer una marca o una incisión en el tejido para identificar de qué lado de la rebanada es hacia arriba y transferir el segmento primero a una placa Petri conteniendo aCSF normal, luego en una solución de paraformaldehído al 4% (PFA). Incubar la rebanada a 4 ° C durante la noche.
    PRECAUCIÓN: El PFA es extremadamente dañino. Usar equipo de protección en una campana de ventilación. Asegúrese de que todos los materiales (pinceles, tubos, etc.) que han estado en contacto con la PFA no tienen contacto con la recuperación que sostiene la cámara, cámara de incubación u otros materiales utilizados para la grabación del tejido fresco.

4. biocitina revelación

1. Revelación con streptavidina fluorescente
   1. Lavado el cerebro rodajas 2 x 10 min en la salina de tampón de fosfato de 0,1 M (PBS) a TA. A continuación, revelan la biocitina por incubación de los cortes de cerebro con streptavidina conjugado con un fluoróforo en dilución 1/200 en PBS con detergente no iónico al 4% durante 4 horas a TA.
   2. Lavar las rodajas de cerebro 3 x 10 min en PBS de 0,1 M a RT y Monte las secciones sobre portaobjetos de vidrio con un medio de montaje acuoso. Coloque los lados que se inyectaron, cubreobjetos de las diapositivas y sellar con esmalte de uñas.
2. Revelación con DAB
   Nota: DAB (3,3 diaminobenzidina) revelación puede utilizarse cuando no se puede utilizar la fluorescencia. En este caso, método de solo revelación debe emplearse para hacer comparaciones.
   1. Lavar las rodajas de cerebro 3 x 10 min en PBS a RT incuban las rebanadas en PBS + H₂O₂ 0.5% durante 1 hora a TA.
   2. Enjuagar las rodajas 3 x 10 min en PBS a TA. Luego, incubar las rebanadas en una solución de tinción de complejo de avidina-biotina compuesta por PBS y 0,1% detergente no iónico + avidina-biotina peroxidasa complejo estándar tinción los reactivos del kit en 1/100 de 24 horas a TA.
   3. Enjuagar las rodajas 3 x 10 min en PBS a temperatura ambiente, incuban en una solución de PBS DAB 0.05% por 20 min a temperatura ambiente y transferencia en una solución de PBS + DAB 0.05% + H₂O₂ 0.5%.
      PRECAUCIÓN: DAB es extremadamente dañino. Usar equipo de protección en una campana de ventilación. La reacción de color se detiene cuando se transfieren las rebanadas en PBS.
   4. Enjuagar las rodajas de 5 x 10 min en PBS a temperatura ambiente, las secciones de montaje en portaobjetos (hacia los lados que fueron inyectados hacia arriba) y deje secar sobre un portaobjetos secado Banco de noche a 34 ° C.
   5. Sumerja el portaobjetos durante 1 minuto en varios baños de alcohol al 70%, 95% y 100% y al final con un baño de xileno durante 1 minuto.
   6. Montar el portaobjetos con resina sintética basado en tolueno medio de montaje. Coloque el cubreobjetos sobre el portaobjetos y sellar con barniz de uñas.

5. proyección de imagen de la red

1. Visualizar las redes astrocytic usando un microscopio de barrido confocal equipado con 20 X y 4 objetivos de X (o un objetivo apropiado para visualizar el núcleo entero donde se encuentra la red) y un láser para detectar el fluoróforo (en este caso, Alexa-594 es utilizado).
2. Utilice el aumento de X 20 para hacer una pila de z de la red de células marcadas. Utilice una resolución de 800 x 800 píxeles y exploración velocidad de 12.5 μs/pixel.
   Nota: Para toda la red de la imagen, son generalmente requiere múltiples pilas, y el número de pilas necesita ser ajustado para cada red. La resolución y exploración de la velocidad puede cambiarse, pero asegúrese de utilizar la misma configuración a todos los datos de la imagen.
3. Utilice los 4 aumentos para tomar imágenes de la red y la región de interés.
   Nota: El 4 X la proyección de imagen se utiliza para determinar la posición de la red dentro del núcleo de interés. Siempre la imagen del mismo campo en luz transmitida. Esta imagen será útil si no puede determinar la frontera del núcleo de la imagen fluorescente confocal.

6. Análisis de la imagen

1. Preparación de datos
   1. Utilizar el software ImageJFIJI (descargar en https://fiji.sc/). Abra el archivo y haga clic en aceptar en la ventana de "Opciones de importación de formatos de Bio".
   2. Para redefinir un z-stack que contiene sólo las rebanadas ópticas necesarias para la final z-pila (figura 2A), haga clic en el botón de la 'Pila' en la barra de herramientas (para encontrar, primero seleccione el stk | Z proyecto). Seleccione "Máxima intensidad" en el tipo de proyección ajuste (figura 2A). Guarde el archivo y asígnele el nombre "pila de archivo".
   3. Si el archivo de imagen contiene varios canales, dividirlo para conservar sólo el canal con la proyección de imagen de red astrocytic (imagen | Color | Dividir canales).
   4. Compruebe la configuración del pixel de la imagen [imagen | Propiedades | Pixel (con "1" para la dimensión de píxel)].
   5. Utilice la herramienta de fondo de restar (proceso | Restar el fondo) para quitar el fondo del etiquetado de biocitina. Utilice la función de vista previa para ajustar el radio de bola rodante, que generalmente está fijado en 50 píxeles (figura 2B).
   6. Utilice la herramienta de quitar outliers (proceso | Ruido | Quitar Outliers) si es necesario tras el paso del fondo restar. Seleccione a "Brillante" en el ajuste "Que afloramientos" (figura 2). Utilice la función de vista previa para ajustar el radio y umbral. Tenga cuidado con esta herramienta, ya que pueden difuminar los datos, como se muestra en la Figura 2D.
      Nota: Esta herramienta quita las pequeñas manchas causadas por depósitos inespecíficos de streptavidina (como se indica por las flechas blancas de la figura 2B y 2C antes y después del tratamiento, respectivamente).
   7. Ajuste el umbral (imagen | Ajustar | Umbral). Seleccione el modo "Default" y "B & W" (Figura 2E). Haga clic en "Aplicar".
      Nota: Ajuste automático se puede utilizar, pero ajuste manual con las dos barras de control deslizante es preferido. El objetivo de este paso es reducir el ruido al máximo sin perder las células marcadas.
   8. Convertir la imagen en una imagen binaria con la herramienta de proceso binario (proceso | Binario | Hacer el binario) como se muestra en la figura 2F. Guarde el archivo como un archivo TIFF y asígnele el nombre "binario".
2. Conteo de células
   1. Compruebe el ajuste de la función de medida (analizar | Sistema de medición). Seleccione la opción "Centroide".
   2. Utilice la herramienta de "Analizar las partículas" en el "archivo binario" (Figura 3A) producido en el paso anterior (analizar | Analizar partículas) (figura 3 a la izquierda). Seleccione "Contornos" en la configuración de "Mostrar" (figura 3). Esto genera un nuevo archivo que muestra el resultado de la detección (figura 3B).
   3. Jugar con los parámetros: tamaño (para detectar sólo células, utilizar valores entre 30 y 6000) y circularidad (para determinar un intervalo de entre 0 a 1, en el que "1" define un círculo perfecto y "0" una forma al azar) para la detección (figura 3, parte a la izquierda). Ejecutar la detección haciendo clic en "OK".
      Nota: Aparecerán dos tablas después de la detección: 1) una tabla titulada "Resumen" que proporciona el número de células detectadas y 2) una tabla titulada "Resultados" (figura 3, parte derecha) que proporciona las coordenadas x y y de cada célula.
   4. Los valores de copiar y pegar en una aplicación de hoja de cálculo. Guardar esta tabla bajo el nombre "detección tabla". Un archivo con una trama de células detectadas también aparecerá (figura 3B). Guarde este archivo como un archivo TIFF bajo el nombre "archivo de detección".
   5. Si se detecta un grupo de células de 2 o más con etiquetadas en la red como una sola celda con la herramienta de analizar partículas porque están demasiado cerca entre sí, utilice la herramienta de Cuenca (proceso | Binario | Cuencas hidrográficas) en la imagen binaria antes de aplicar el análisis de partículas de la herramienta y rehacer los pasos de las partículas de analizar.
      Nota: La herramienta cuenca crea una delimitación de 1 píxel de ancho entre células extremadamente cercanas. Una puede plug-in del contador celular se utiliza cuando es inequívoco y puede llevarse a cabo manualmente.
3. Medición de área de red astrocytic
   1. Para medir el área de las redes, utilizar el archivo de detección mediante imagen J.
   2. Utilice la herramienta de selección de Polígono (izquierda haga clic en el botón en la barra de herramientas para seleccionar) para trazar un polígono que une todas las celdas ubicado en la periferia externa de la red (Figura 4A). Haga clic para comenzar a trazar el polígono y haga clic para cerrar.
      Nota: Este polígono se definirá como una región de interés (ROI) y su superficie será medida para determinar el área superficial de la red.
   3. Abrir la ventana de sistema de medición (análisis | Sistema de medición) y seleccione la opción "Area". Abra el administrador de ROI (analizar | Herramientas | ROI Manager) (Figura 4B). A continuación, añadir el polígono trazado en el ROI Manager haciendo clic en '' agregar '' (Figura 4B) y ejecutar la medición haciendo clic en '' medida '' en el ROI Manager.
      Nota: La medida del área aparecerá en una tabla y se expresa en píxeles. No te olvides de convertir este valor con el factor de conversión para el microscopio utilizado para obtener un valor en micras².
4. Determinación del vector de dirección principal
   1. Determinación de la celda parcheada
      1. Abra el archivo de pila en ImageJFIJI e identificar la célula parcheada en el archivo de pila basada en su intensidad más fuerte de etiquetado (figura 4). A continuación, abra el archivo denominado "tabla de detección" en una aplicación de hoja de cálculo y encontrar el número asociado a la celda parcheada y sus coordenadas correspondientes.
      2. Si no es posible determinar con precisión la célula parcheada, rodean la zona donde el depósito de biocitina es más denso en la red imagen de las células acopladas, utilizando la herramienta polígono en ImageJFIJI, y se refieren a esta posición como la de la célula parcheada (figura 4).
      3. Utilice el administrador de ROI (analizar | Herramientas | ROI Manager). Luego, dibujar un ROI en la localización celular parcheado y agregarlo al ROI Manager (consulte la Figura 4B).
      4. Configurar una medición (análisis | Sistema de medición) y seleccione la opción "Centroide".
      5. En el ROI Manager, haga clic en "Medida" para obtener las coordenadas del centroide del área trazado. Utilizar estas coordenadas como punto de referencia para esta red específica.
   2. Traducción referencial
      1. Calcular las coordenadas de cada celda en referencia a los astrositos parches usando la siguiente fórmula:
          
         Con: como las coordenadas de una celda determinada; como las coordenadas de la celda parcheada o el punto referencial de la red; y como las coordenadas de una celda determinada en el nuevo referencial.
         Nota: Expresar las coordenadas de cada celda en referencia a los astrositos parcheado es un paso importante en el cálculo de vectores de los astrositos parcheado. Tenga cuidado cuando use ImageJFIJI referencial para cualquier imagen se encuentra en la esquina superior izquierda de la imagen.
   3. Determinación del vector principal de la orientación preferencial de
      1. Calcular las coordenadas del vector principal de orientación preferencial con la siguiente fórmula:
         
         Con: () como las coordenadas del vector principal de la orientación preferencial; y como las coordenadas de cada célula de la red obtenida con el parcheado de la célula como referencial.
         Nota: Para cada celda de la red, un vector se determina en relación con las coordenadas de los astrositos parcheado. El principal vector de orientación preferencial de la red es la suma de estos vectores.
      2. Dividir la longitud del vector principal (proporcionado por las coordenadas obtenidas mediante la fórmula anterior) por el número de células en la red menos uno (ya que las coordenadas de la celda parcheada no se incluyen), para normalizar los valores y poder realizar comparaciones entre redes. Una vista esquemática de este análisis se presenta en la figura 5.
5. Colocación de las redes analizadas en el núcleo de interés
   1. Alineación de 20 X y 4 X imágenes
      1. Para determinar la posición de cada red en el núcleo de interés (NVsnpr), utilice la imagen de X 4. Abre la imagen de X 4 con un editor de imágenes vectoriales.
      2. Seleccione la imagen de X 4 y modificar su tamaño, multiplicando por 5. La ventana de dimensión se encuentra en la parte derecha de la barra horizontal superior. Por ejemplo, para una imagen de 4 X que ha sido muestreada en 800 x 800 píxeles, cambiar la resolución de muestreo de 4000 x 4000 píxeles (para establecer la unidad de trabajo en píxeles, vaya a "Configuración de documento" en la pestaña de archivo: archivo | Configuración de documento). Exporte el archivo en formato TIFF y nombre "tamaño 4 X".
      3. Alinee la esquina superior izquierda de la imagen con la esquina inferior izquierda del documento de Adobe Illustrator.
         Nota: El software proporciona coordenadas de un punto referencial de la esquina inferior izquierda.
      4. Abre la imagen de X 20 de la red. Utilizar el '' archivo binario '' o '' archivo de detección '' porque son más fáciles de alinear. Entonces, jugar con la herramienta de opacidad en el '' archivo binario '' de la imagen de X 20 para alinear TI con el nuevo tamaño 4 X imagen.
         Nota: La herramienta de opacidad está en la barra de herramientas horizontal superior.
      5. Cuando la alineación es, seleccione mantener la herramienta pipeta para que aparezca la herramienta de medida y seleccione en la barra de herramientas izquierda.
      6. Uso la herramienta de medida para hacer clic en la esquina superior izquierda de la imagen de X 20 para obtener las coordenadas de los 20 X referencial del punto sobre el tamaño 4 X imagen.
         Nota: Estas coordenadas, que se denominan el 20 X referencial (20XR en la figura 5), será útil para expresar la posición de cada red en un dibujo esquemático del núcleo.
   2. Normalización del núcleo de interés
      Nota: Para resumir los datos, se utiliza una normalización del núcleo (NVsnpr) como un rectángulo. Los pasos se describen a continuación.
      1. Abierto 4 X tamaño archivo en ImageJFIJI y usar la herramienta polígono para rodear el núcleo (NVsnpr). Usar la imagen con luz transmitida, si los bordes del núcleo no son capaces de verse; en cuyo caso, no olvide cambiar primero.
      2. Abra el administrador de ROI y añadir el ROI dibujado. En"sistema", seleccione la opción '' rectángulo delimitador ''.
         Nota: La opción de "Rectángulo delimitador" calcula el rectángulo más pequeño alrededor del núcleo dibujado.
      3. Haga clic en "Medida".
         Nota: Aparecerá una tabla con BX y BY, las coordenadas de la esquina superior izquierda del rectángulo: '' rectángulo posición '' y proporciona la anchura y la altura. BX y BY son las coordenadas del rectángulo delimitador referencial que se conocen como y .
   3. Expresión de cada posición de la red en el núcleo normalizado
      1. Expresar las coordenadas de cada célula con el 4 X referencial (cuadrado negro en la figura 5) utilizando la siguiente fórmula:
         
         Dónde: son las coordenadas de la celda con el 4 X referenciales; son las coordenadas de la celda con 20 X referencial (cuadrado naranja en la figura 5); y son las coordenadas de los 20 X punto referencial en la imagen de X 4 (20XR).
      2. Expresar las coordenadas de la celda en el rectángulo de delimitación referencial (azul en la figura 5) utilizando la siguiente fórmula:
         
         Dónde: son la célula coordina en el rectángulo de delimitación referencial; son las coordenadas de celda de 4 X referenciales; y son las coordenadas del rectángulo delimitador referenciales en la imagen de X 4.
      3. Transformar las coordenadas de la celda en el rectángulo de delimitación referencial el porcentaje de la anchura y altura del rectángulo delimitador que se utiliza la siguiente fórmula:
         
         Dónde: son la célula coordina en el porcentaje de la anchura y la altura del rectángulo delimitador; son la célula coordina en el rectángulo de delimitación referencial; es el ancho del rectángulo delimitador medido por encima en el protocolo; y se mide la altura del rectángulo delimitador por encima en el protocolo.
      4. Para representar todas las redes en la misma figura, tener en cuenta la orientación de la rebanada (lado izquierdo o derecho). Para estandarizar los datos, la referencia se aplica en el lado izquierdo de la rebanada. Transferir las coordenadas de la red de la derecha a la izquierda aplicando la siguiente fórmula a coordenadas x:
         
         Dónde: es la coordenada x del lado derecho de la rodaja; y  es la nueva coordenada x expresada en el referencial en el lado izquierdo de la rebanada.
         Nota: Como alternativa, espejo de la imagen en ImageJFIJI antes del análisis (imagen | Transformar | Voltear horizontalmente).
      5. Para expresar las coordenadas del vector principal de la orientación preferencial, siga los mismos pasos con las coordenadas de la celda (6.5.3.1 a 6.5.3.4 los pasos).
         Nota: La expresión de las coordenadas en porcentajes permite una recopilación de los datos como una sola parcela en la que el núcleo (NVsnpr) está diseñado como un rectángulo.
6. Estudio de la diferencia angular del principal vector de dirección preferencial
   Nota: La diferencia angular de una red astrocítico se utiliza para determinar si su orientación preferencial es hacia el centro del núcleo de interés. Para calcular la diferencia angular (α en la figura 5), que es el ángulo entre el vector principal de la dirección preferencial de la red (línea de PD, rojo en la figura 5) y la línea que une P y C, se aplica el teorema de Al-Kashi en el triángulo PDC (véase inserción de Métodos complementariosy figura 5 ).
   1. En primer lugar, calcular las longitudes diferentes mediante la aplicación del teorema de Pitágoras en un uso referencial cartesiano la siguiente ecuación:
      
      Dónde: las coordenadas de P y C son y , respectivamente, en el rectángulo de delimitación referencial (calculado anteriormente).
   2. Determinar la diferencia angular en radianes utilizando la siguiente fórmula:
      
   3. Convertir la diferencia angular en grados (por ejemplo, con los grados de función en el software de Excel).
   4. Compilar todas las diferencias angulares mediante la representación en gráficos de barras verticales (figura 7 y 7 D) y determinar si existe una orientación preferencial de redes astrocytic.

Acoplamiento entre las células del cerebro no es estático sino más bien dinámica regulada por muchos factores. Los métodos descritos fueron desarrollados para analizar redes astrocytic reveladas bajo diferentes condiciones y entender su organización en NVsnpr. Estos resultados han sido ya publicados1. Realizamos la biocitina relleno de astrocitos individuales en la parte dorsal de la NVsnpr en tres condiciones diferentes: en reposo (en condiciones control en ausencia de cualquier estímulo), en Ca2 +-libre de condiciones y después de la estimulación eléctrica de fibras sensoriales que se proyectan al núcleo. La configuración experimental para el llenado de biocitina de astrocitos para cada condición se ilustra en los lados izquierdos de la figura 6A-C.

Redes de células biocitina etiquetados fueron observadas en condiciones de control y confirmaron un estado basal de la célula de acoplamiento entre NVsnpr astrocitos en reposo. En 11 casos probados, biocitina difusión demostró redes compuestas de 11 ± 3 células (panel central en la figura 6A, figura 6) que se extiende sobre un área de 34737 de 13254 de ± el de μm2 (figura 6E). Carbenoxolona (CBX, 20 μM), un bloqueador no específico de ensambladuras de gap, fue utilizado en un sistema independiente de experimentos para asegurar que el etiquetado observado fue un resultado de biocitina difusión a través de uniones comunicantes y no absorción por las células de biocitina, que podría escaparse en el espacio extracelular de la presión positiva aplicada a la pipeta patch antes de parchear. Aplicación de baño de CBX redujo el número de células marcadas células ± 0,5 2 (panel de la derecha en la figura 6A, figura 6; Método de Iman Conover, P = 0,016; Prueba de Holm-Sidak, P = 0.010) y la zona de biocitina 2297 ± 1726 μm2 (figura 6E; Método de Iman Conover, P = 0.0009; Prueba de Holm-Sidak, P = 0.025).

El efecto de la remoción de calcio desde el medio en el NVsnpr redes astrocytic fue probada debido a la concentración de calcio extracelular baja se sabe abrir conexinas y ensambladuras de gap20,21,22y puede ser utilizado como un estímulo masivo y uniforme para abrir el sincicio y maximizar la difusión del trazador a través de uniones comunicantes. Las redes astrocytic fueron reveladas en Ca2 +-gratuito (n = 10) mostró un mayor número de células que las redes en condiciones de control, con células ± 10 etiquetado 37 (el panel central en la figura 6, figura 6; Método de Iman Conover, P = 0,016; Prueba de Holm-Sidak, P < 0.001) cubriendo un área de 108123 ± 27450 μm2 (panel central en la figura 6, figura 6E; Método de Iman Conover, P = 0,009; Prueba de Holm-Sidak, P = 0,001).

Comparado con la completa remoción de calcio desde el medio, la estimulación eléctrica de entradas aferentes al núcleo de interés es un estímulo más fisiológico que involucra directamente a los circuitos neuronales de interés. En consecuencia, los resultados de este tipo de manipulación pueden proporcionar información significativa acerca de las implicaciones funcionales de las redes astrocytic observadas. Por ejemplo, entrada de dos distintas vías puede llevar a diferentes efectos en el estado basal de las células en un área determinada, o puede proporcionar el acoplamiento entre astrocitos en las distintas subdivisiones del núcleo. En nuestro circuito, impulsos de estimulación eléctrica de las fibras sensoriales que se proyectan a la NVsnpr con trenes de 2 segundos de 0,2 ms en 40-60 Hz (n = 11) produce un aumento del acoplamiento entre astrocitos NVsnpr, en relación con las condiciones sin estimular, con 23 ± 6 celdas (el panel central en la Figura 6B, figura 6; Método de Iman Conover, P = 0,016; Prueba de Holm-Sidak, P = 0.012) extendiéndose sobre un área de 814174 ± 15270 μm2 (panel central en la Figura 6B, figura 6E; Método de Iman Conover, P = 0,009; Prueba de Holm-Sidak, P = 0.004).

Todos los efectos de estos dos tipos de estimulación, la eliminación de calcio del medio y la estimulación eléctrica de las entradas aferentes, se interrumpen por la CBX. Las redes astrocytic en esta condición compuesta por sólo 5 ± 1 células en Ca2 +-aCSF gratis (panel de la derecha en la figura 6, figura 6; n = 4; Método de Iman Conover, P = 0,016; Prueba de Holm-Sidak, P < 0.001) y 9 ± 2 células con la estimulación de las fibras sensoriales (panel de la derecha en la Figura 6B, figura 6; n = 6; Método de Iman Conover, P = 0,016; Prueba de Holm-Sidak, P = 0.023). Las áreas superficiales de la red también se redujeron a 17987 ± 9843 μm2 con Ca2 +-aCSF libre (figura 6E; n = 4; Método de Iman Conover, P = 0,009; Prueba de Holm-Sidak, P = 0.004) y 39379 ± 11014 μm2 con estimulación de las fibras sensoriales (figura 6E; n = 6; Método de Iman Conover, P = 0,009; Prueba de Holm-Sidak, P = 0.055).

Análisis anatómico se realizó solamente en casos donde los límites de NVsnpr podrían definirse claramente en 4 X la proyección de imagen, que obtuvo el caso 9 de cada 10 redes con Ca2 +-aCSF libre y 8 de 11 redes obtienen con estimulación eléctrica. Ploteo de todas las redes astrocytic analizadas en una NVnspr teórica muestra que la mayoría de las células en las redes fueron confinada dentro de los límites del núcleo (figuras 7A y 7B, izquierdo y central). Bajo Ca2 +-libre aCSF, 4 de 9 redes astrocytic difundir fuera de la NVsnpr en la dirección del núcleo motor situado medialmente a la NVsnpr. En estos 4 casos, la mayoría de las células marcadas fueron confinada en el núcleo. Las redes de las células etiquetadas obtenidas con estimulación eléctrica de las fibras sensoriales fueron más restringidas. Sólo 2 redes extendidas sobre las fronteras del núcleo, en el cual uno separado sobre la frontera mediodorsal en el área supratrigeminal lateral (red verde oscurezca en la figura 7B, izquierdo y central). En el segundo caso, 2 astrocitos en la red roja (figura 7B, izquierdo y central) cruzaron hacia la porción ventral de la NVsnpr.

El análisis vectorial de la orientación preferencial de redes astrocytic (panel de la derecha en la Figura 7A y 7B) produce resultados diferentes según el estímulo utilizado. De hecho, para las redes astrocytic con Ca2 +-libre aCSF, todos excepto uno de los vectores de orientación preferencial fueron orientados hacia el centro de la NVsnpr. Sin embargo, para las redes astrocytic con estimulación eléctrica, los vectores de orientación preferencial fueron en su mayoría orientados hacia las fronteras del núcleo. Esto se refleja en las diferencias angulares computadas en orientación preferencial entre las redes astrocytic obtenidos con Ca2 +-gratis aCSF y los obtenidos con estimulación eléctrica de las fibras sensoriales. Bajo Ca2 +-libre aCSF, los gráficos de barras verticales de la distribución de la diferencia angular demostró que la mayoría de las redes de células marcadas tienen una diferencia angular entre 0 y 40 grados, con una media de la diferencia angular de 39.5 ± 12,7 grados ( Figura 7). Con estimulación eléctrica de las fibras sensoriales, la distribución es más uniforme, y la diferencia angular (99,5 ± 17 grados) es significativamente diferente (figura 7; prueba t de student, P = 0.012).

Estos datos demuestran que biocitina etiquetado análisis nos permite distinguir los efectos de distintos estímulos modulación acoplamiento astrocytic. Por otra parte, el mapeo de las redes astrocytic en un núcleo normalizado, seguido de análisis vectorial ofrece valiosa información sobre el tamaño y la organización anatómica de estas redes.

Figura 1: abrazadera del remiendo del celulares de astrositos. (A) astrocitos marcados con un cargamento de sulforodamina marcador 101 (SR-101) en NVsnpr. Una soma de astrositos SR-101-labeled está dirigido con la pipeta de parche (línea blanca punteada). Barra de escala = 100 μm. (B) un protocolo de rampa despolarización se realiza en la abrazadera de tensión (de -120 a 110mV) para evaluar las características pasivas de astrositos. (C) evaluación de la falta de potencial de acción de la leña en los astrositos por inyección de pulsos de corriente en modo de corriente abrazadera. Esta figura es una adaptación de Condamine et al. (2018) 1. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: tratamiento y análisis de redes astrocytic con software ImageJFIJI. (A) creación de Z-Stack de la proyección de imagen confocal de una red astrocytic. En la ventana de arriba a la izquierda, Z-stack en ImageJFIJI. (B) proceso de la resta de fondo. En la parte superior izquierda, reste la ventana en segundo plano en ImageJFIJI. El círculo punteado hace hincapié en el área en la imagen donde el efecto del comando subtract fondo es cuando más evidente en comparación con la imagen en proceso de afloramiento de A. (C) Remove. Este proceso elimina las manchitas debido a depósitos inespecíficos de streptavidina acoplado a un Alexa 594. Las flechas blancas indican el depósito antes (figura 2B) y después (figura 2) la orden ha sido procesada. En la parte superior izquierda, eliminar ventana de afloramientos en ImageJFIJI. (D) ejemplo de los efectos de desenfoque que pueden ser producido por un inadecuado ajuste de los parámetros de afloramientos de quitar. Flechas amarillas indican algunas células borrosas. (E) ajuste proceso de umbral. En la parte superior izquierda, ajustar ventana de umbral en ImageJFIJI. Las barras de desplazamiento actúan sobre el ajuste de señal de umbral. (F) hacer paso binario. La imagen se convierte en un archivo binario en ImageJFIJI. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: detección de las células en redes astrocytic con ImageJFIJI. (A) ejemplo de una imagen binaria de una red astrocytic obtenida en ImageJFIJI. Barra de escala = 100 μm. (B) ilustra el "archivo de detección" obtenido después de aplicar el proceso de analizar partículas en el archivo binario. Las formas corresponden a todas las células detectadas con su número asociado en rojo. (C) la parte izquierda: analizar ventana partículas en ImageJFIJI. Esta función detecta las células de la red en la imagen binaria. Puede ajustarse el tamaño de las células detectadas y su circularidad. Números que se utilizará deben establecerse por ensayo y error hasta que se obtenga un resultado satisfactorio. De la derecha: mesa de detección generado por el proceso de analizar partículas. Columnas X e Y las coordenadas de cada celda en la imagen de la lista. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: red de área análisis y determinación de la celda parcheada en ImageJFIJI. (A) utilizando de que la herramienta polígono en ImageJFIJI, un ROI se remonta alrededor del cluster detecta células (línea roja) que se utilizará para determinar el área superficial de la red. (B) el retorno de la inversión se añade en el ROI Manager. (C) ejemplo de una red astrocytic en el cual la célula parcheada (flecha blanca) es fácilmente identificable debido a la sorprendente intensidad de su etiqueta de biocitina. (D) ejemplo de una red astrocytic donde la célula parcheada no pudo ser identificada, pero una zona de densa etiquetado claramente indica depósitos biocitina. Un ROI es dibujado alrededor de esta área y agregado al administrador de ROI. Su centroide es computada y considerado como la posición de la celda parcheada para usar para el análisis vectorial. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Diagrama de los diferentes referenciales utilizados para análisis de redes astrocytic. El cuadrado gris es la imagen de X 4 con el 4XR punto referencial esté alineado con la esquina inferior izquierda del documento de Adobe Illustrator. El cuadrado blanco rodeado en naranja es la imagen de X 20 con el 20XR de punto referencial. Ambas imágenes están alineados uno con el otro como se describe en el protocolo. El rectángulo delimitador (azul) define NVsnpr (línea de puntos púrpura) y se escala en porcentaje con el punto referencial (BR). El centro de la teórica de la parte dorsal del NVsnpr es schematized por el punto azul oscuro (C). La red astrocytic es esquematizada por la célula parcheada (punto negro, P) y el principal vector de la dirección preferencial (línea roja). Cada línea negra discontinua es el vector de cada célula de la red astrocytic. La diferencia angular de la red astrocytic (α) es el ángulo entre la principal orientación preferencial de la red (línea roja) y la línea negra que conecta los astrositos parcheado con el centro teórico del núcleo. Recuadro es un zoom de la imagen de X 20 mostrando el triángulo PCD formado por el centro teórico de la NVsnpr (C), la célula parcheada y el principal vector de dirección preferencial (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: redes Astrocytic con biocitina en NVsnpr en diferentes condiciones mostrando tamaños. (A-C) A la izquierda, un dibujo esquemático de la condición experimental. En todas las condiciones, un solo astrositos por SR-101 fue destinados a la grabación de célula entera y llena de biocitina (0,2%). Columna media: fotomicrografías que ilustran las redes astrocytic obtenidas bajo control las condiciones (A), después de la estimulación eléctrica de la zona Vth (2 s trenes, 40-60 Hz, 10-300 mA, pulsos de 0,2 ms) (B); y después de la perfusión con una Ca2 +-aCSF gratis (C). Columna derecha: fotomicrografías que ilustran las redes astrocytic obtienen bajo las mismas condiciones pero en presencia de CBX (20 μM) en la previa del baño. Barra de escala = 100 μm. (D y E) Gráfico de barras verticales que representa el número de unida las células y la superficie, respectivamente, de las redes llenas de biocitina de astrocitos bajo las tres condiciones experimentales presentados arriba (A, B y C) en la presencia (rayitas) y ausencia (sólido) de CBX (20 ΜM). Los datos se representan como promedio ± SEM. múltiples comparaciones (prueba de Holm-Sidak): * = P < 0.05; ** = P < 0.001. Esta figura es una adaptación de Condamine et al. (2018) 1. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Caracterización de redes en NVsnpr en Ca2 +-aCSF gratis y con estimulación eléctrica de la zona Vth . (A y B) Izquierda: Todas las células en 9 redes llena bajo perfusión con Ca2 +-libre aCSF (A) o en 8 redes llenadas estimulando el tracto Vth (B) se trazan según su posición en un núcleo teórico de la NVsnpr (rectángulo gris). Cada red (y las células que lo componen) está representadas por un color diferente. Medio: límites de cada red. El punto en cada zona representa la celda parcheada. Derecha: representación del principal vector de orientación preferencial de cada red. El punto representa la célula parcheada y la flecha el vector de dirección preferencial. (C y D) Distribución de diferencias angulares entre el vector principal de la orientación preferencial y una línea recta conectando el celular parcheado al centro de la parte dorsal del NVsnpr (ubicado en 25% en el eje dorsoventral y 50% en el eje mediolateral) bajo la dos condiciones estudiadas. La diferencia angular media fue de 39.5 ± 12,7 grados en Ca2 +-libre aCSF, indicando una orientación preferente hacia el centro del núcleo y 99,5 ± 17 grados con estimulación eléctrica, indicando una orientación preferente hacia el periferia (prueba t de student, P = 0.012). Esta figura es una adaptación de Condamine et al. (2018) 1. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: composición de la solución de sacarosa utilizada para cortar el cerebro. (*) = pH y osmolaridad fueron ajustados a 7.3-7.4 y 300-320 mosmol/kg, respectivamente.

Tabla 2: composición de la solución de la aCSF utilizada para almacenaje de corte y grabación de célula entera. (*) = pH y osmolaridad fueron ajustados a 7.3-7.4 y 290-300 mosmol/kg, respectivamente.

Tabla 3: composición de la solución interna utilizada para la grabación de célula entera. (*) = pH y la osmolaridad fue ajustado a 7.2-7.3 y 280-300 mosmol/kg, respectivamente.

Los autores no tienen nada que revelar.