Summary
Этот протокол обеспечивает необходимые шаги для установления и оценки неонатального сепсиса в 7-день old мышей.
Abstract
Неонатального сепсиса остается глобального бремени. Доклинические модель для экрана эффективных профилактических или терапевтических мероприятий необходима. Полимикробная сепсис новорожденных мыши может быть вызвана внутрибрюшинно впрыскивать сенситизации навозной жижи в день жизни 7 мышей и мониторинг их на следующей неделе. Здесь представлены подробные шаги, необходимые для реализации этой модели неонатального сепсиса. Это включает в себя создание однородной суспензии сенситизации запас, разбавляя его вес и помет скорректированы дозы, наброски плана мониторинга и определение наблюдаемых здоровья категорий используется для определения гуманного конечных точек. Поколение однородной суспензии сенситизации запас от объединения доноров позволяет администрации во многих помета с течением времени, сократить различия между донорами и предотвращение использования потенциально токсичных глицерина. Стратегия мониторинга используется позволяет в ожидании результатов выживания и выявление мышей, которые позже будет развиваться до смерти, позволяя более ранней идентификации гуманного конечной точки. Две основные поведенческие особенности используются для определения исправности, а именно способность новорожденных мышей право самостоятельно при помещении их обратно и их уровень мобильности. Эти критерии могли бы потенциально применяться к гуманной адрес конечных точек в других исследованиях заболевания у новорожденных мышей, до тех пор, как экспериментальное исследование проводится для подтверждения точности. В заключение этот подход обеспечивает стандартизированный метод для новорожденных сепсиса модели мышей, обеспечивая ресурсы для оценки благополучия животных, используется для определения ранних гуманного конечных точек для оспаривается животных.
Introduction
Сепсис является основной причиной человеческих смертей новорожденных инфекционных1. Потому что плохо понимается сепсис новорожденных, был достигнут незначительный прогресс в идентификации риска новорожденных рано во время болезни и разработки эффективных методов лечения или профилактики. Это обусловливает необходимость использования животных моделей сепсиса, чтобы лучше понять процесс и тестирования возможных вмешательств. Кроме того Взрослый грызунов по-разному реагировать на сепсис, статистически значимых различий в количество бактерий, чтобы управлять для получения же летальной дозы (LD) и различия в результате ответа хоста по сравнению с новорожденным2. Таким образом неонатального сепсиса должен изучаться в новорожденных. Несколько взрослых сепсиса модели были использованы в исследованиях сепсиса. К ним относятся внутривенные вызов с конкретных организмов, причастны взрослого человека сепсис или сенситизации перевязки и прокол (CLP). CLP — это эндогенного вызов модель где слепой кишки хирургическим путем изолированных, лигируют и прокалываться допустить утечки кишечного содержимого в брюшине, в конечном итоге приводит к системных распространения микробов и их продукция3. Однако хирургической процедуры, необходимые для создания CLP является смертельным для новорожденных животных; Таким образом альтернативный метод необходимо имитировать полимикробная вызов CLP побудить неонатального сепсиса. Для удовлетворения этой потребности, whereby сенситизации содержание животных собирают, приостановлено в стерильных декстрозы, 5% в воде (D5W) и внутрибрюшинно вводили в новорожденных мышей2была разработана модель сенситизации суспензии для полимикробная неонатального сепсиса. Это, так как, стал все более популярным модель для изучения сепсиса у новорожденных и взрослых животных и существенно продвинулась механистический идеи в этой болезни процесс4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Учитывая все более широкое использование этой модели и исследователей желание непосредственно сравнивать результаты различных публикациях, существует необходимость для технических аспектов быть хорошо описаны и стандартизированных различных исследований. Стандартизация относится к трем аспектам модели, а именно, i подготовка акций сенситизации пульпы, ii) подготовка аликвоты вызов для инъекции в экспериментальных животных и iii) определение конечной гуманной которой животных считаются nonsurvivors в экспериментах вызов. В частности методы для подготовки сенситизации пульпы фондовой часто ссылки на оригинал статьи, представляя модель2. Краткое изложение этой модели является что сенситизации содержания от взрослых мышей были собирают, приостановлено в стерильные D5W к концентрации 80 мг/мл и используется в течение 2 ч для внедрения экспериментальных животных. Эта оригинальная модель использовали мышей того же возраста, из того же места поставщиков, которые были размещены в их соответствующих исследовательских учреждений для менее чем за 2 недели до уборки сенситизации содержимое. Использование собственных разводят мышей, хотя снижение стоимости от регулярной доставки и позволяющие использовать излишки мышей более широкий спектр пола и возраста, также существенно увеличил изменчивости доноров и доноров. Это побудило развитие альтернативный подход, согласно которому сенситизации содержимое из нескольких мышей были объединены вместе подготовить большой запас, который был затем aliquoted и хранятся в-80 ° C13. Этот альтернативный метод был адаптирован несколько групп14,15. Однако, что адаптация привело некоторых технических вариантов, как в средствах хранения используется (10% или 15% глицерина, или только D5W), так и в стратегию фильтрации для удаления твердых частиц (многоступенчатая фильтрация через 860 мкм и, затем, 190 мкм фильтр, или частное лицо 14,13,фильтрации через 100 мкм или 70 мкм фильтры)15. Инъекции глицерина только потенциально могло бы причинить вред, учитывая, что 25% - 50% глицерина инъекции были использованы как модель грызунов почечных травм16,,1718,19, 20. Чтобы избежать непредвиденных побочных эффектов глицерина, сенситизации пульпы массоподготовки для мышей в этом исследовании заморожен в D5W без глицерина, и испытания бактериальной жизнеспособности от хранения при температуре-80 ° C. Стратегия фильтрации, используемые в данном исследовании является один проход через 70 мкм фильтром, который непосредственно не сравнивают с другими стратегиями фильтрации перечисленных.
Смертельное вес скорректирована дозы вводят сенситизации пульпы может варьироваться от объекта до объекта и должен быть titered из желаемых летальность для отдельных групп. С различными задача доз сопровождающих томов задача изменения по необходимости. Однако эта методологическая деталь не сообщалось до. Кроме того на редко разрабатываются стратегии для стандартных процедур, таких как внутрибрюшинной инъекции, в литературе, но отдельные методы могут повлиять на ли новорожденных мышей утечки, когда вводят и влияние их окончательных результатов.
Животных, включая определение конечной гуманной точки, является центральным аспектом этой модели и в любой модели инфекции и воспаления в грызунов21. В 1998 году Канадский совет по уход животных (CCAC) опубликовал подробные руководящие принципы для конечной гуманной точки отбора, определения конечной гуманной точки, как «любых фактических или потенциальных боль, бедствия или дискомфорта следует свести к минимуму или уменьшить, выбрав ранние конечную точку, совместим с научными целями исследования»22. Другие также предостережение, что гуманные конечные точки должны создаваться на основе научного обоснования а не субъективной интерпретации животного состояния только21. Хотя есть множество ресурсов для клинических, поведенческих и состояние тела на основе знак критерии для конечной гуманной точки, даже в контексте инфекции и воспаления специально21,23,24, ни один из этих , включая CCAC руководящие принципы гуманного конечной22, упомянуть новорожденных мышей. Таким образом объективно и научно обоснованной гуманного конечные точки являются гораздо более трудно установить для новорожденных животных, учитывая их ограниченные возможности поведенческих и отсутствие доказательств от критериев, как потеря веса, который обычно используется для взрослых мышей. В настоящее время критерии для гуманной конечной точки, используемой для 5-12-дневных новорожденных мышей в литературе сенситизации пульпы, все ссылки обратно в оригинальный манускрипт, который представил модель2. В этой оригинальной бумаги определение конечной гуманной точки для новорожденных животных основано на двух критериях; а именно расположение мыши вне гнезда (россыпь) и отсутствие молоко пятна видел приведет к смерти в течение нескольких часов. Осложняющим дело в присвоении гуманного конечной точки является, что молоко пятна становятся трудно увидеть в мыши штаммы с темный мех, например, часто занятых C57BL/6J штамм, после первой недели жизни, в то время как больных животных контролируются до 14 дня жизни (DOL). Кроме того, мертвых животных можно найти postchallenge при применении этих критериев (собственные наблюдения неопубликованных); Таким образом более строгое определение конечной гуманной точки необходимо облегчить страдания для подопытных животных и избежать смертности в ситуациях, где результат может быть точно проследить ранее.
Все три методологические аспекты сенситизации пульпы модели представлены в Стандартная операционная процедура подробно подготовке акций сенситизации пульпы, метод для инъекций экспериментальных животных, что держит постоянный объем впрыска между дозами и уменьшает риск утечки и определение конечной гуманной точки для 7 - 12-дневных мышей, на основе системы поведенческого моделирования. Поведенческие информация мыши исправности из более чем 240 подопытных животных была собрана и группирование по результату Финал выживания, демонстрируя свидетельства driven определение конечной гуманной точки. Страданий подопытных животных снижается путем выявления умирающий новорожденных мышей в кратчайшие сроки точке, в то время как результаты биологически значимыми выживания может быть выведен, наблюдая ключевых переменных. Визуальное представление подготовки сенситизации навозной жижи и неонатальной мыши поведения будет служить отличным ресурсом для любой группы, изучая сепсиса или новорожденных вызов модели животных.
Protocol
Все эксперименты в настоящем протоколе были утверждены Комитетом животных ухода Университета Британской Колумбии под номером протокола A17-0110.
1. инструмент стерилизации
- В биологической безопасности кабинета (BSC) включите и Разогрейте стерилизатор горячей шарик до 250 ° C, по крайней мере 30 минут перед использованием.
- Окуните инструменты на 70% этиловом спирте.
- Погружаться инструменты в разогретой горячие шарик стерилизатор для менее 1 мин.
Примечание: Ручки инструментов будет жарко и может сгореть, если оставить в горячей шарик стерилизатор для более чем 1,5 мин. - Spray мат бумажные полотенца с 70% этанол стерилизовать его.
- Удалить инструменты из горячей шарик стерилизатор без касатьться стерилизованные частью инструмента нестерильной ручки других погруженной инструментов и разместить их на этанол распыляется бумажные полотенца.
- Подождать 30 s до 2 мин для инструментов остыть перед их использованием для рассечения.
2. сенситизации пульпы подготовка
- Preweigh 15 мл пробирок (одна трубка для каждые пять мышей быть умерщвлены).
- Усыпить доноров сенситизации шлама согласно рекомендации местных животных ухода или использовать протокол ниже.
Примечание: До 40 мышей C57BL/6J между 6 и 12 недель старые были использованы для подготовки сенситизации пульпы, с до пяти мышей умерщвлены одновременно.- Передача мышей в эвтаназии камеру и установите изофлюрановая анестезия машины до 5% с кислородом перфузии.
- Монитор мыши наблюдать потери способности двигаться и увидеть их ввода плоскости хирургического наркоза и наконец, остановка дыхания.
- Удалить мыши из камеры эвтаназии, щепотка лапой и соблюдать любые ноги опровержения или ингаляции. Если либо присутствует, вернуть мышь к палате эвтаназии; в противном случае продолжайте.
- Неизлечимо усыпить мышей с острыми шейки матки дислокации.
- Выполнения диссекции слепой кишки, используя инструменты presterilized и охлаждением (см. раздел 1) в BSC.
- Закрепите ножки мыши Совету экструдированного пенополистирола, с помощью иглы 23 G, так что мышь имеет свой живот. Безопасная и затем спрей живота с 70% этиловом спирте.
- Используя ножницы и стерильный пинцет, прорваться через кожу, ослабить кожу от перитонеальный накладки с ножницы и вырезать открыть прямоугольную область от паха до грудины и левой к правой стороне. Удалите любой мех из брюшины.
- Переключитесь на новую пару стерильных инструментов чтобы прорваться через брюшину, делая прямоугольное отверстие, как это было сделано для кожи, Переключение инструментов если те контакт кожи.
- Идентифицировать слепой кишки, которая должна быть запущена слева направо по всему телу. Нарушить соединительной ткани для выявления слепой кишки ветви из кишечника и вырезать слепой кишки от кишечника. Место слепой кишки на листе стерилизованные взвешивания бумаги.
Примечание: Либо путем распыления с 70% этанол с обеих сторон и оставляя его для просушки, или УФ-облучения можно стерилизовать весом бумаги. Кроме того слепой кишки можно расчленены на стерильные тарелке Petri.
- Сенситизации контента экструзии
- В BSC используйте стерильные инструменты для прорезать обоих концах слепой кишки.
- Держите в середине слепой кишки стерильным пинцетом и использовать плоский стерильные металлической лопаткой осторожно нажать сенситизации содержимое из разреза заканчивается, с помощью подвижного движения и избегая соскоб движения, которые могли бы разорвать эпителия. Собирать содержание и поместите их в preweighed 15 мл пластиковых пробирок.
- Бильярд сенситизации содержимое от максимум пяти мышей в же трубку. Вес трубки снова, после того, как были добавлены все содержимое.
Примечание: Ожидать в среднем по 300 мг и до 390 мг сенситизации навозной жижи на мышь, требующих 1.8 до 2,4 мл D5W для ресуспендирования на мышь; Таким образом использование более пяти мышей на этом этапе может привести к переполнять пластиковых пробирок 15мл. - Протрите инструменты чистого этанола распыляется бумажное полотенце и resterilize их, повторив шаги 1.2-1.6.
- Фильтрация пульпы сенситизации
- Весят пластиковых пробирок, наполненный сенситизации содержание и рассчитать количество D5W чтобы добавить сенситизации содержимое путем деления веса сенситизации содержимое желаемой концентрации запасов в миллиграммах на миллилитр, как уравнения ниже.
- В BSC Добавьте необходимое количество ледяной D5W пластиковых пробирок 15 мл, содержащих сенситизации содержимое.
- Вихревой 15 мл центрифуга трубки по вертикали и горизонтали для 30 s. проверки для частиц более чем 1-3 мм в диаметре и если он присутствует, продолжать vortexing до тех пор, пока все крупные частицы заметно исчезла.
- Поместите стрейнер стерильные ячейки 70 мкм в 50 мл пластиковых пробирок, который помещен на льду. Пипетка 4 мл ресуспензированы сенситизации шлама в ячейку сито, а затем в коллекции трубки. Ресуспензируйте твердых частиц, закупорить вверх и вниз 2 x-3 x. Осторожно выдавить пузыри для увеличения скорости фильтрации помешивая содержимое с кончиком пипетки, пока есть не более капельки фильтруются.
Примечание: При смешивании, могут существовать частиц достаточно большой, чтобы подключить 5 мл пипеткой. В этом случае повторите vortexing из шага 2.5.3 и если решение еще не развалится, используйте пипетку для прессы частиц к стене пластиковых пробирок. - Повторите шаг 2.5.4, изменяя ячейки сита между каждой трубы сенситизации навозной жижи и бассейн все содержимое в же 50 мл пластиковых пробирок коллекции хранится на льду, или второй Тюбик 50 мл центрифуги если объем фильтрата превышает уровень льда в ice box.
- Весят пластиковых пробирок, наполненный сенситизации содержание и рассчитать количество D5W чтобы добавить сенситизации содержимое путем деления веса сенситизации содержимое желаемой концентрации запасов в миллиграммах на миллилитр, как уравнения ниже.
- Алиготе сенситизации навозной жижи.
- Если применимо, объединить несколько 50 мл сенситизации пульпы фильтрата трубы из шага 2.5.5 в больших стерильный контейнер (например, бутылка для хранения 1000 мл). Затем вихрь для 15 s и место 20 мл в новых центрифуг Тюбик 50 мл.
- Вихрь запас сенситизации шлама, который находится в 50 мл пластиковых пробирок для 5-10 s и аликвота 500 мкл в три криогенных флакон 2 мл которые имеют резиновое уплотнение, чтобы предотвратить испарение с течением времени. Сразу же место главной фондовой и aliquoted криогенных флакона на льду.
- Повторите шаги 2.6.1 и 2.6.2, до тех пор, пока все сенситизации навозной жижи был aliquoted, vortexing мастер запас после каждые три криогенных флаконы для предотвращения, урегулирования любых твердых частиц и для поддержания однородной смеси.
- Заморозить аликвоты сенситизации пульпы при температуре-80 ° C.
Примечание: Ожидаете между три или четыре фондовых флаконов в 500 мкл от каждого взрослого мыши. Каждый флакон акций должно быть достаточно примерно вызов один помет восьми мышей на 7 дол.
3. задача сепсис новорожденных мышей 7-дневных
- Отдельные, идентифицировать и весят новорожденных мышей.
- В BSC передать новой клетке держать мышей от плотины и уменьшить стресс на дамбу новорожденных мышей.
- Удалите и руб частью гнездования материала с перчатки для передачи Кейдж запах перчатки. Затем плесень вложенности материала в меньших гнездо и поместите его в новой клетке без плотины.
- Передать вложенности материала в новой клетке новорожденных мышей.
- Передача более вложенности материал, чтобы сделать второй, пустое гнездо в новой клетке.
- Закрыть и удалить плотины Кейдж из капота, так что плотина не подчеркнул от слуха любой дистресса новорожденных мышей.
- Для отслеживания отдельных новорожденных мышей в помете со временем, используйте маркер этанола доказательство для обозначения одного до пяти точек на фронт или обратной стороне хвоста, повторное каждый 12-24 ч, при необходимости.
- Вес каждой мыши, которые будут оспариваться, размещение в средней гнездо после взвешивания и повторите это действие для всех мышей.
- Вернуть весь помет плотины до подготовки аликвота вызов сенситизации навозной жижи.
- Рассчитать индивидуальных доз вес скорректирована сенситизации навозной жижи и требует разбавления с D5W завершить этот шаг для каждого помета отдельно, используя следующие вычисления или предоставленные листа (см. Дополнительный файл).
- Рассчитайте миллиграммов сенситизации пульпы () под управлением каждой мыши, умножая вес мыши в граммах (b), требуемый вызов дозы в миллиграммах сенситизации шлама на грамм мыши (c).
- Рассчитать индивидуальный объем запасов неразбавленной навозной сенситизации требуется на мышь в микролитров (d) путем деления миллиграммов сенситизации навозной жижи, необходимые на мышь от шага 3.2.1 () путем сосредоточения запасов сенситизации пульпы, 160 мг сенситизации шлама на миллилитр D5W (e) и умножения на 1000 мкл на миллилитр для преобразования из миллилитров микролитров.
- Средний объем запасов сенситизации пульпы требуется на мышь (g) путем суммирования объем запасов сенситизации пульпы (d) на мышь в помете n мышей, деленное на количество мышей (n).
- Рассчитайте коэффициент разрежения средняя для акций сенситизации пульпы (h), разделив объем средняя впрыска (100 мкл), средний объем запасов по сенситизации навозной жижи, необходимых на мышь (g).
- Рассчитать объем конкретных впрыска каждой мыши в микролитров (j) путем умножения каждой мыши объем запасов сенситизации раствора требуется (d) коэффициент разрежения средняя (h), а затем округлить до ближайшего десятка (для соответствия 10 мкл шагом шприца инъекции).
- Рассчитайте средний объем D5W разбавлять складе сенситизации пульпы (k) путем вычитания складе средняя сенситизации пульпы (g) от среднего инъекции объем (100 мкл).
- Рассчитайте общее количество акций сенситизации навозной жижи в микролитров (l) путем умножения среднего запасов сенситизации пульпы на мышь в микролитров (g) на количество мышей в этот помет (n) и умножения на 1,4 для создания дополнительных.
- Рассчитайте общее количество D5W в микролитров (m), необходимых для разбавления фондовой сенситизации навозной жижи, умножив средний объем D5W (k) на количество мышей (n) и умножения на 1,4 для создания дополнительных.
- Рассчитайте миллиграммов сенситизации пульпы () под управлением каждой мыши, умножая вес мыши в граммах (b), требуемый вызов дозы в миллиграммах сенситизации шлама на грамм мыши (c).
- Подготовьте вызов Алиготе после расчета объема запасов сенситизации навозной жижи требуется (l от шага 3.2.7). В BSC оттепель необходимое количество акций флаконов сенситизации пульпы при комнатной температуре, закупорить его содержимое смешать.
- Когда есть не более заметными кристаллы льда в талой сенситизации пульпы, передать стерильные 1.8 мл microcentrifuge подсчитанная сумма акций сенситизации пульпы (l от шага 3.2.7).
- Разбавляют до требуемой концентрации, добавив ледяной D5W, рассчитанные на шаге 3.2.8 (m). Храните Алиготе вызов на льду.
- Перед загрузкой шприц, mix пробки microcentrifuge стряхивая его 20 x, затем 3 x составление и высылки 300-500 мкл сенситизации пульпы с 500 cc 28 G ½ дюйма инсулина шприца.
- Составить примерно 150 мкл разбавленного раствора сенситизации в же шприц.
- Флик шприц выбить пузыри от поршень, слегка отступить на шприц и затем изгнать пузыри.
- Отказаться от избыточного сенситизации пульпы обратно в пробки microcentrifuge до правильное количество сенситизации навозной жижи на одну мышь, как была рассчитана для отдельных мышей в шаге 3.2.5 (j), загружается в шприц.
- Внутрибрюшинно придать сенситизации шлама, согласно рекомендациям соответствующих местных животных ухода учреждение, или используйте шаги, описанные ниже.
- В BSC отдельные новорожденных мышей от плотины, как описано в пункте 3.1.
- Загривок мыши на задней части шеи, используя большой палец и указательный палец.
- Закрепите хвост мыши через спину Ближнего и среднего пальцев кольца, или на передней части кольцо и мизинец пальцы.
- Для сведения к минимуму утечки, наклона неонатальной мышь так, чтобы она обращена вниз и вставьте иглу скос иглы вверх, между ГЭН и гениталии, сохраняя иглы, мелкой и подкожной.
- Когда игла вводится на 1 см, нажмите вниз и вперед чувствовать иглы прокол брюшины. Медленно угнетают Плунжер, сохраняя кончик иглы как устойчивый, насколько это возможно, как боковые движения может повредить мыши органов.
- Осторожно снять иглу через 5-10 сек, следуя тем же маршрутом, как, отдыха на средний палец во время удаления для уменьшения напряженности в теле мыши.
- Чтобы проверить на наличие утечек, удерживайте кнопку мыши несколько секунд после снятия иглы дать время для укола закрыть и соблюдать любые утечки или выпуклые в месте инъекции, в какой момент мышь не должны использоваться в анализе.
Примечание: Выпуклые кожи в месте инъекции указывает неудачных внутрибрюшинной инъекции, закачиваемой в подкожной. - Поместите курсор мыши на бумажное полотенце и позволить мыши, чтобы сделать шаг. Если мышь неподвижной за 5 сек, затем слегка нажмите хвост.
- Подобрать мыши и проверьте наличие утечки сенситизации навозной жижи в месте инъекции. Если есть утечка, исключить из анализа мыши и усыпить мыши.
4. Мониторинг мышь
- Монитор мыши регулярно, чтобы проверить их для достижения гуманной конечной точки.
- Наблюдать за мышей postchallenge 2 h для любых осложнений, связанных с инъекций.
- Контролировать мышей 12 h postchallenge сепсис заболеваемости и идентификации мышей в гуманной конечной точке (см. шаги 4.2-4.3 критерии).
- Впоследствии контролировать каждые 4-6 ч для первых 2 дней, за исключением 8 h на ночь, когда новорожденных мышей без присмотра.
- За 2 дня postchallenge монитор 1 x-2 x в день. Если больной, что наблюдаются мышей или мышей, чьи исправности уменьшается, затем увеличьте мониторинга частоты каждые 4-6 ч.
- Мониторинг новорожденных мышей
- Для любой процедуры с участием новорожденных мышей, передачи постельных принадлежностей, материалов для новой клетке, как описано в шаге 3.1 (по тем же причинам там как упоминалось выше). Тщательно проверьте для новорожденных, которые тащили из гнезда во время кормления. Не следует рассматривать любые мышей, которые тащили из помета во время кормления вывезут мышей.
- При удалении верхней части гнезда, выявлять любые рассеяния новорожденных мышей, либо от гнезда или застрял в вложенности материала, но вдали от их однопометники, за исключением мышей, вытащили от мусора во время кормления. Обратитесь к гуманной конечной точки, которую критерии в шаге 4.5 Если мышь находится разбросаны.
- Измерьте мышей восстанавливающих рефлексов и мобильности.
- На бумажное полотенце, поместите мышь на его спину и следить за его способность само право в течение максимум 4 s. Когда на его спине, мышь будет падать к левой или правой стороне, что, когда начинается 4 s граф.
Примечание: Классифицируется в группе «Права», мыши должен иметь возможность получить по крайней мере три из четырех подушечки на бумажное полотенце для 1 s. Это по-прежнему сгруппированы как возможность само право, если он падает.- Если мышь может само право, затем ждать 8 s, чтобы определить его уровень мобильности.
- Классифицировать мыши как «Мобиль прав», если оно может само право и исследовать ее окружающей среды, взяв несколько шагов в строке.
- Классифицировать мыши как «Прав-вялой», если оно может само право и несколько шагов для изучения окружающей среды. Мышей в этой группе может упасть во время шага, посмотрите шаткой на их ногах и пауза между шагами.
- Классифицировать мыши как «Прав-Nonmobile», если оно может само право, но не двигаться вокруг много. Он может по-прежнему упасть, и если она не принимает какие-либо шаги в пределах 8 s, это сгруппированы как прав-Nonmobile.
- Если мышь не может само право, затем классифицировать его мобильности на основе наблюдаемых хип движения.
Примечание: Избежать повторения мониторинга или увеличения длины времени мыши тратит на их обратно, потому что это может повлиять на системы скоринга и гуманного конечной точки, как мышь, которая не само право в течение 4 s может иногда сделать если больше времени.- Классифицировать мыши как «Fail направо (ОФО)-Mobile» если он не в состоянии само право и отображает хип движения, которое превышает под углом 90° от горизонтали. Некоторые мыши может право самостоятельно, если дано более чем 4 s, но по-прежнему должны быть классифицированы как ОФО, с показателями мобильности на основе хип движения.
- Классифицировать мыши как «FTR-вялой», если он не в состоянии само право и отображает хип движения под углом 90° от горизонтали.
- Классифицировать как «ОФО-Nonmobile», если он не в состоянии само право и ноги, которые поколебать или вибрировать, но не хип движения мыши. Конечностей могут расширить или убрать, но не имеют боковое движение. Мышь явно болен и достиг гуманного конечной точки.
- На бумажное полотенце, поместите мышь на его спину и следить за его способность само право в течение максимум 4 s. Когда на его спине, мышь будет падать к левой или правой стороне, что, когда начинается 4 s граф.
- Повторите шаг 4.3 на другой стороне мыши, запись обе стороны.
Примечание: Смотрите Дополнительный файл для записи наблюдений. - Определите, является ли мышь на конечную гуманного и требует эвтаназии, изложенный в таблице 1и ниже.
- Классифицировать мышей в различных восстанавливающее и уровня мобильности на основе мониторинга наблюдения отмечено в шагах 4.3 и 4.4. Мышь мобильности измеряется для каждой стороны, и мобильные поведение используется для определения, требует ли мышь эвтаназии.
- Назначьте любой мышей с выпрямляющий рефлекс FTR-Nonmobile () или (b) FTR-вялой и нашли отделены от гнезда на гуманной конечной точки.
- В мониторинге моменты времени после 20 h postchallenge, классифицировать любой мыши с восстанавливающих рефлекс «не право» с обеих сторон как в гуманной конечной точке, потому что представленных данных с высокой точностью предсказать, что эти мышей в конце концов поддался болезни и не Восстановите.
- Отдельный мышей, которые должны быть умерщвлены, как определено в шаге 4.5. Если контроль мышь не видели, как на гуманной конечную точку, поместите его в второй пустое гнездй в новой клетке без плотины и продолжать с другими новорожденных мышей.
- После того, как был следил весь помет, переместить половину вложенности материала в клетку с плотины, реформирование гнездо с комнатой в середине для новорожденных мышей.
Примечание: Неправильном гнездо может вызвать мышей разброс и уменьшить количество доступных ухода, что плотина может предложить. - Передача новорожденных мышей обратно в клетке с плотины.
- Заключите помет в гнезде, поставив остатки раскроя материала над помет и нежно сжимая вокруг крышки для обеспечения вложенности материала в месте.
- Усыпить новорожденных мышей, разделенных на шаге 4.6 согласно требованиям местных учреждений.
5. титрование сенситизации навозной жижи
- Вызов мыши на требуемой задачи доза (раздел 3) и контролировать результаты (раздел 4).
- Наблюдать, приводит ли конечный результат в нужную LD и если нет, повторите разделы 3 и 4 с новый помет в дозе выше или ниже проблему, регулируя его на 5% - 10%.
Примечание: Вызов дозы может быть похож на рисунке 1B , но нужно быть titered в каждом объекте и штамм мышей. - Кроме того соблюдайте ли мышей достичь гуманной конечной быстрее или медленнее, чем ожидается кинетики в Рисунок 1Bи повторить разделы 3 и 4 с новый помет в дозе выше или ниже проблему, регулируя его на 5% - 10%.
Representative Results
Жизнеспособность сенситизации пульпы, температуре-80 ° C может быть проверена временем серийно разбавления и покрытие аликвоты акций сенситизации навозной жижи на 5% овец крови tryptic соевый агар следуют 24 h аэробных инкубации при температуре 37 ° C. Последующий подсчет culturable колонии формирование подразделения (CFU) содержание подготовки сенситизации пульпы был найден не будет менять в течение 6 месяцев, и жизнеспособность не пострадал от длительного хранения при температуре-80 ° C (рис. 2). Каждая мышь доноров привела, в среднем, достаточно сенситизации пульпы оспорить три-четыре помета (данные не показаны).
Мышей, оспаривается в дол 7 с сенситизации пульпы побудить полимикробная сепсиса начали достичь гуманной конечной точки в течение 12 ч вызов, и сепсиса полимикробная главным образом была решена путем 48 h postchallenge, как отмечено в сочетании с кривой выживания Каплана-Мейера данные из более чем 200 оспаривается мышей (Рисунок 1A). Летальность в зависит от дозы вызов, управлением, с 5% изменения дозы вызов, что приводит к примерно 15% различия в выживаемости (рис. 1B). Вес тела мышь была измерена на каждом мониторинга визита. Потеря веса было замечено во всех оспариваемых животных, будучи недискриминационными между мышей, которые в конечном итоге выжить и те, которые во время первоначального 24 h не postchallenge (рис. 1 c). После 24 часов наиболее сохранившихся животных начали вернуть их вес, в то время как все nonsurvivors продолжает терять вес и переехал их гуманной конечной точки. Однако небольшая доля живых животных, которые сохранили их восстанавливающих рефлекс, также продолжает терять вес или не набирать вес, до конца эксперимента, даже потерять 20% от их первоначального веса в течение 40 h вызов. Как там было с перекрытием потеря веса между мышей, которые в конечном итоге выжить и те, которые не, изменение веса или порог потеря веса не может использоваться как критерий для гуманной конечной точки при сохранении цели точно деления выживших от nonsurvivors.
Поведение мышей наблюдали, как указано в протоколе и в таблице 2. Снимки здоровья, которые являются категории отображается (Рисунок 3А-C). Эти фотографии показывают различных категорий мышей, которые не право самостоятельно после уделяется их обратно и описать разницу между ОФО-Mobile и FTR-вялой, что это важное различие. Безнаказанное здоровых мышей этого возраста не отображать FTR-вялой активности; Таким образом эта категория здравоохранения является маркером болезни и ответ на вызов. Больной мыши отображается FTR-вялой симптомы (рис. 3B) и может регрессировать к FTR-Nonmobile (рис. 3 c), где Верхняя нога по-прежнему параллельно с нижней ногой, с практически нулевой бедра, качалки движения, который является одним из критериев для гуманные конечной точки. Мышей может также восстановить, набирает более хип движения и становится FTR-Mobile (рис. 3A). Восстанавливающих рефлекс и мобильность оценки были определены для левой и правой стороне каждой мыши, и высокий балл был использован для определить, достигли ли мышь гуманного конечной точки. Поведенческая информация была собрана из более чем 240 животных, оспаривается с летальная доза 60 (60LD) сенситизации навозной жижи, и 144 гуманного конечные точки были замечены (рис. 3D-F и Таблица 1). Этот подход, ориентированный на конкретные доказательства был использован для определения и уточнения конечной гуманной через четыре стадии заболевания, категории экспериментаторов, основанный на обоих поведенческие различия между выживших и nonsurvivors и часть гуманного конечных точек достигло Каждый период времени. Во время ранних экспериментов ОФО-Nonmobile мышей, которые были не хип движения были последовательно нашли мертвым в течение 4-6 ч это поведение наблюдается. В коллекции представленной информации исправности FTR-Nonmobile был использован в качестве критерия для гуманной конечной точки. От 12-21 h postchallenge в то время как FTR-Nonmobile мышей были умерщвлены, как живых, так и nonsurviving животных отображается очень похожие поведенческих моделей и не может быть уважаемого любым другим способом (Рисунок 3D). От 21-48 h postchallenge большинство живых мышей восстановили их восстанавливающих рефлекс, хотя менее 1% ОФО поведение наблюдается у животных, которые направлялись бы на выжить эксперимент (Рисунок 3E). Таким образом мышей, которые не смогли право самостоятельно с обеих сторон стала дополнительным критерием для конечной гуманной точки в это время. Между 12 и 20 h postchallenge 12,5% от общего числа конечных точек, гуманного, против 80,5% от 20 до 48 часов и 7% были замечены после 48 ч (Таблица 1). Отличительная черта между мышей, в конечном итоге выживших и что в конечном итоге ухудшилось гуманного конечной точке была потеря восстанавливающих рефлекс, независимо от хип мобильности (Рисунок 3F). Действительно между 20 и 48 ч после вызов, в общей сложности 121 мышей не смогла право самостоятельно с обеих сторон, с 116 этих мышей, в конечном итоге прогрессирует гуманного конечную точку (которая представляет 96% точности в определении мышей, которые бы не восстановить). За 48 ч после вызов 11 мышей наблюдались не право самостоятельно от обеих сторон и 10 из этих продвинулись гуманного конечную точку (91% точность). Помимо 20 h после задачи количество мышей, которые потеряли восстанавливающих рефлекс для обеих сторон предсказывает окончательный результат с точностью более 90%; Таким образом это был добавлен в критерии гуманного конечной точки, для выявления nonrecovering мышей ранее и уменьшить страдания (Таблица 1) мыши.
Частоты, что мышей нужен мониторинг изменения с течением времени, из-за различных темпов смерти postchallenge и изложены в таблице 1. Мышь считался быть в своей гуманной конечной точке в любой момент, если он не смог само право отображаются обычные хип движения с обеих сторон, или, если мышь была найдена разбросаны из гнезда, не смог само право и вялой хип движения. Мышей с любого из этих условий не должны были иметь возможность вернуться в помете и наблюдались быть FTR-Nonmobile в течение 4-6 ч. Начиная 20 h после вызов, новой конечной точки гуманной была добавлена потому, что представленная информация показывает, что подавляющее Большинство мышей, которые ОФО с обеих сторон заканчивается изнемогать к болезни.
Видео, столы и ресурсы, представленные в этой рукописи являются ресурсом эффективного преподавания для правильного поведения назначения из оспаривается мышей. Семь экспериментаторами было предложено смотреть видео обучение и читать как протокола, так и таблицы перед присвоением поведения 60 оспаривается животных. Идентификация конечной гуманной точки назначения была точной, как отличительный FTR-Nonmobile мышей от мышей, которые отображаются другие поведения (рис. 4A) и ОФО мышей от мышей, которые смогли право самостоятельно в течение допустимого периода времени ( Рисунок 4B).
Рисунок 1 : Кривая выживания Каплана-Мейера, титрования дозы сенситизации навозной жижи и изменение веса после вызов сенситизации пульпы. (A) результаты выживания новорожденных мышей C57BL/6J оспаривается с инъекции внутрибрюшинного сенситизации пульпы в дол 7. Данные для этой фигуры были объединены из независимых экспериментов с использованием нескольких вызов, который дозах, от 0,7 до 1,3 мг сенситизации шлама на грамм массы тела был ведении этих мышей. (B) новорожденных мышей, оспаривается с 0,80 до 0,95 мг сенситизации шлама на грамм массы тела от одной сенситизации пульпы подготовки отображения дозозависимый отношения между количество сенситизации пульпы дано и процент выживания. (C) процент изменения веса по сравнению с проблемой веса, с пунктирной линии, обозначающие 20% потеря веса от времени вызов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : CFU концентрация на складе сенситизации пульпы, температуре-80 ° C не изменяется в течение 6 месяцев. Влияние возраста сенситизации навозной жижи на CFU концентрации был испытан с использованием линейной регрессии. Каждая точка представляет один Алиготе же подготовки сенситизации пульпы, серийно разбавленный и покрытием в течение 6 месяцев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Бедра категории подвижность мышей, которые не право самостоятельно и поведения животных в разное время postchallenge. Мышей, которые были оспорены с сепсисом, когда на их обратно, будет отображать знаки заболеваемости, которая может быть измерена по степени хип движения. (A) А не право (ОФО)-мобильной мыши показывает хип качалки движения их верхней части ноги, превышающий под углом 90 ° от горизонтали. (B) FTR-вялой мыши показывает хип качалки движения, но не превышает под углом 90 ° от горизонтали в любой точке во время 4 s мониторинга. (C) некоторые FTR-Nonmobile мышей продлит их ноги, сгибание на колено, но покажет очень маленький (менее углом 10 °) до нуля бедра, качалки движения и ноги по-прежнему будет параллельно друг другу. Postchallenge 12-21 h животного поведения (D) показывают, что только FTR-Nonmobile поведения отдельных пострадавших от nonsurvivors. (E) с 21 до 48 h postchallenge, только 4 из 592 наблюдаемых ОФО поведения (0,67%) принадлежат к выживших, позволяя выпрямляющий рефлекс прогнозировать окончательный результат и использоваться в качестве нового критерия для гуманной конечной точки. (F) за 48 ч postinfection, 6 из 131 мышей (4,55%), которые имели восстанавливающих рефлекс пошел на стать частью группы ОФО и были принесены к концу эксперимента, оправдывая устойчивого мониторинга в ходе восстановления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Учебных ресурсов привести точные поведенческих классификации по независимым экспериментаторов. Экспериментаторы, подготовленных смотреть видео, сопровождающих этот протокол разделить видео 60 новорожденных мышей различных оздоровительных групп. (A) способность различать гуманного конечной точки определяется и в среднем на 97% поведения был точно отнесен FTR-Nonmobile или нет, в то время как только 1% FTR-Nonmobile мышей были ошибочно. Два процента мышей были ошибочно определены как FTR-Nonmobile. (B) выявление второй конечной гуманной критерий правильно различать ОФО мышей, или тех, кто имеет возможность право самостоятельно в течение 4 s уделяется их обратно в 97% полученных баллов, в то время, как только был назначен правильно 0.96% мышей были неверно назначен выпрямляющий сами и 2% мышей были неправильно заданы как ОФО. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Стадии заболевания | Ответ: высокая заболеваемость, нет смертности | B: высокой заболеваемости, низкая смертность | C: высокой заболеваемости, высокая смертность | D: низкой заболеваемости, низкая смертность |
| Часов разместить вызов | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| Частота мониторинга | 2 h пост вызов | Каждый 4−6 h | Каждый 4−6 h, 8 ч, без присмотра на ночь | 1−2 раз ежедневно, больше, если необходимо |
| Доля всего гуманного конечных точек, наблюдается | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| Процент гуманного конечных точек, наблюдается | 0% | 12,5% | 80,5% | 7% |
| Критерии конечной гуманной точки | 1. FTR−Nonmobile на обеих сторонах | 1. FTR−Nonmobile на обеих сторонах | ||
| 2. разбросаны из гнезда и является FTR−Lethargic | 2. разбросаны из гнезда и является FTR−Lethargic | |||
| 3. ОФО левой или правой стороны (с любой мобильности Оценка) | ||||
Таблица 1: частота мониторинга и гуманного критерии конечной точки на различных стадиях болезни. Мониторинг частоты, гуманные конечные точки отметил, процент гуманного конечные точки и критерии конечной гуманной точки на разных этапах заболевания.
| Выпрямляющий рефлекс | Мобильность | Предел времени сразу после делается на спине | Предел времени для измерения количества движения (мобильный / вялой / не для мобильных устройств) | Скоринг критерии мобильности |
| Права | Мобильные | 4 s | Еще 8 s | Мышь занимает несколько шагов в ряду, поддержание продвижение вперед и исследует его окружающей среды. Щенок не будет падать. |
| Вялой | Мышь может сделать шаг, но остановит и пауза перед другой. Щенок может упасть. | |||
| Nonmobile | Мышь не предпринимать никаких шагов после выпрямляющий сам. Щенок может упасть. | |||
| Не права | Мобильные бедра | Той же 4 s используется для измерения восстанавливающих рефлекс | Имеет энергичное движение бедра с верхней части ноги вращающейся за пределами 90° от горизонтали по крайней мере один раз в течение 4 s. | |
| Вялой бедра | Хип движения до, но не за пределами 90° от горизонтали. | |||
| Для бедер | Конечностей может двигаться путем расширения и втягивания, но бедра не будет вращаться. Щенок выглядит очень болезненный. |
Таблица 2: мониторинг таблицы и критерии определения исправности мышей. Предоставленный критерии были использованы для определения категории групп здоровья для мышей и уменьшить индивидуальные различия в назначение исправности.
Discussion
Послеродовые новорожденных мышей имеют весьма ограниченной мобильности и не право самостоятельно после уделяется их обратно, даже когда никто не оспаривает. DOL 7, возраст мышей, оспаривается в этой модели, широкий спектр движение охватывающих от права-Mobile FTR-Mobile наблюдалось безнаказанное мышей, с одним важным отличием, а именно что безнаказанное мыши в этом возрасте не отображать FTR-вялой поведение. Только мыши оспаривается с сепсисом полимикробная были замечены стать FTR-вялой; Таким образом этот ответ может быть показателем тяжести заболевания. Внимательныя(ый) для отсечки под углом в 90° от горизонтали для хип движения позволяет для последовательной и точной назначения вялым или мобильных хип движения в мышей. Сроки 4 s, чтобы увидеть, если мышь может само право был выбран потому, что безнаказанное мышей были в состоянии последовательно право самостоятельно в течение этого периода времени. Неоднократные измерения же мыши удалось избежать, а время право сами и измерение хип мобильность ограничивается 4 s, чтобы избежать слишком утомительно мышь, которая иначе может повлиять на его способность получения продовольствия и тепло и может повлиять на его прогноз лучше. Выпрямляющий себя от левой и правой стороне были замечены, и выше баллов была использована для определения того, была ли мышь в гуманной конечной точке, потому что некоторые мышей были найдены для отображения FTR-Nonmobile на одной стороне еще выше мобильность на другой стороне и b e возможность восстановить в конечном итоге.
Скоринг система, используемая для оценки здоровья мыши полагались на применение категориальной предохранители на то, что спектр движения и, таким образом, могут быть склонны к отдельным предвзятости. Персонал прошел обучение вместе чтобы убедиться, что каждый человек забил мышей, то же самое; Однако скорее всего останется уровень субъективности, ведущих к вариации. Согласованность скоринга была оценена с семью исследователей, выполнявшая не ранее наблюдения неонатальной мыши узнать требования, изложенные в этом видео и протокол и, затем, самостоятельно назначить поведение и определяют гуманные Конечная точка. Точность 97% было отмечено с скоринга на 60 оспаривается мышей, предполагая, что отдельные уклон не играть существенную роль в поведенческих назначения этой модели. Представленных поведенческие наблюдения протокол основан на наблюдениях из оспаривается на дол 7 животных, но мышей моложе 6 дней бессменный здоровом состоянии не могут последовательно право самостоятельно. Таким образом критерии описанных конечной гуманной точки не может применяться непосредственно к молодых мышей. Если в этой экспериментальной модели используются молодых мышей или если применяется другой вызов модель с различных заболеваний кинетики, затем критерии подходящей конечной гуманной точки должны разрабатываться и избежать эвтаназии мышей, которые бы в противном случае, в конечном счете, на экспериментальной основе Восстановите. Скоринговая система отображает надежный метод улучшения гуманного конечной классификации, которая, с испытаний и подтверждения, потенциально могут применяться к другим моделям.
Каждый подготовка сенситизации навозной жижи или использование нового штамма мыши требуется retitration дозы сенситизации суспензии для администрирования для достижения аналогичных смертельной дозы. Каждый подготовка была стандартизирована, индикация интереса, а именно: выживание, вместо того чтобы давать же бактериальных граф. Каждый сенситизации пульпы подготовки жизнеспособных бактериальных концентратов, различаются незначительно, потенциально вследствие различий в донора синантропных бактерий или разницы в весе оставил в ячейки ситечко сенситизации пульпы акций postfiltration. В ходе титрования сенситизации навозной жижи первых двух помётов были разделены на две группы и каждая половина помета были оспорены с одним из двух доз, таким образом, чтобы каждый из дозы будут испытываться в два помета. Если результирующий коэффициент выживаемости не соответствует требуемого уровня, затем доза вызов был либо увеличился или уменьшился на 5% - 10%, и повторил эксперимент. Для учета помет помет различия, которые могут вызвать сопротивление или повышенной восприимчивости к сепсиса через помет были использованы несколько пометов. Важно, чтобы точно титр фондовой сенситизации пульпы с каждой новой подготовка для обеспечения что новый титрования сенситизации пульпы был сопоставим с предыдущей подготовки сенситизации навозной жижи. Периоды чрезмерного шума и вибрации, специально во время уплотнения асфальта и строительство близлежащие здания и дороги, были замечены увеличить стресс в плотин. Это коррелирует с повышенной частотой раскулачивание и смертности выживания экспериментов, даже затрагивающих безнаказанное мышей, указав, что посторонние воздействия на неонатальной выживаемости, что также необходимо контролировать для пострадавших.
Предыдущие методы для сенситизации пульпы массоподготовки включали использование свежих сенситизации суспензии или подготовки замороженных сенситизации шлама, с использованием различных методов, включая хранение в глицерин, который неизбежно будет передаваться во время вызова. В то время как использование свежих сенситизации пульпы обеспечивает преимущество бактериальный состав ближе к оригинальной сенситизации содержимое, существует риск расхождения между отдельными донорами мышей из-за изменения синантропных бактерий. Хотя это было сведено к минимуму с помощью сенситизации доноров от того же производителя с минимальным временем между прибытием и прогрессии эксперимента, это может стать непомерно вариант для некоторых лабораторий и другой проблемой сроков логистики в том соответствует возрасту мышей, когда начала сенситизации навозной жижи эксперимент в новорожденных мышей, которые были 7 дней. Альтернативный метод с использованием свежих сенситизации пульпы использовался, где несколько взрослых доноров сенситизации содержание были объединены, высокомобильна в D5W, Замороженные при температуре-80 ° C без глицерина и размороженным один Алиготе в то время для экспериментов. Использование сенситизации пульпы взрослых доноров изучить неонатального сепсиса потенциально могут передавать видов бактерий, присутствующих в сенситизации шлама, что новорожденных мышь не были подвержены, но она является стратегией, которая позволяет для изучения сепсиса у новорожденных мышей и был использован для изучения биологии новорожденных мыши в последних14,,1315. Сенситизации пульпы был разбавленным в D5W для обеспечения питания для бактерий, которые позволили создание активной инфекции после бактерии были введены и было сделано, чтобы имитировать доступность питательных веществ в брюшной полости во время Некротический энтероколит. Глицерин не был включен в качестве стабилизирующих агента в замораживания бактерий из-за потенциальные негативные побочные эффекты, которые могут возникнуть из глицерина инъекции только. Если глицерин был включен в подготовке сенситизации пульпы, то потенциальный ущерб только что глицерин может побудить будет нужен для проверки, включая глицерин только (не хватает сенситизации пульпы) инъекций в мышей, которые бы повысили мыши использования. Жизнеспособность бактерий сенситизации пульпы запасов был испытан после замораживания сенситизации пульпы акций без глицерина и было установлено постоянное, без изменения концентрации бактерий в отдельных аликвоты же подготовки сенситизации пульпы, температуре-80 ° C над 6 месячного периода. Это свидетельствует о том, что хранилище без глицерина осуществимо в обеспечении последовательной биологической результат. Использование массового подготовлен замороженные сенситизации пульпы фондовой также допускается для использования мышей разводят, снижая стоимость и используя мышей-самцов, которые иначе были бы избыток от разведения, поэтому уменьшение потерь мыши.
Идентификация неудачных вызовов в мышах важно избегать добавления дополнительных шумов в систему. После прохождения внутрибрюшинного введения сенситизации пульпы, мышей наблюдались на наличие выпуклость под кожу, которая указывается неудачных инъекций, что было на самом деле подкожной. Мышей наблюдались для утечек в месте инъекции, как сразу же после удаления иглой, так и после позволяя им сделать шаг после инъекции, потому что мышь иногда (редко) течь только после переезда конечности инъекции шаг. Присутствие выпуклость или утечки после инъекции привело к удаление мыши из анализа. В конце концов любой из них может привести к другой результат из-за неправильного количества сенситизации раствор вводят как 5% разницы в дозе вызов наблюдалась влияют на последующие выживания.
Сенситизации пульпы вызов эксперименты часто требуется различной цели летальных дозах с различной регулировать вес доз. Благодаря этому инъекции тома могут варьироваться от всего лишь 20 мкл и до 100 мкл. Пропорциональной экспериментальной ошибки, связанной с мертвой иглы тома также изменяется вместе с объемом впрыска, возрастающей сложности непосредственно сравнить разные дозы. С простой модификации стандартизации объем впрыска этот источник дисперсии удаляется из эксперимента.
Новорожденных мыши поведенческие системы мониторинга, используемые в настоящем Протоколе является первым в своем роде. Намерения исследователей на проведение этических исследований с новорожденных мышей часто сталкиваются с сложной нехватка ресурсов для оценки благосостояния животного в этом возрасте. Представленные интуитивно и последовательной системы мониторинга начинает решать этот пробел в знаниях. Важно отметить, что этот подход, ориентированный на конкретные доказательства не только увеличивает качество полученных экспериментальных данных, но, в то же время, также уменьшает страданий подопытных животных.
Disclosures
Д-р Джеймс Wynn получает поддержку от национальных институтов здравоохранения (НИЗ) / Национальный институт общих медицинских наук (R01GM128452) и низЮнис Кеннеди Шрайвер Национальный Институт детского здоровья и человеческого развития (NICHD) () R01HD089939).
Acknowledgments
Особая благодарность Клэр Харрисон и животных ухода объекта в Британской Колумбии Детская больница исследований института (BCCHR) за их поддержку в работе животных, а также д-р Ро-Ян Чэн за их руководство и вход на животных мониторинг и благополучия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
