Summary
Hier beschreven is een eenvoudige methode voor de zuivering van een genproduct in Streptococcus mutans. Deze techniek kan voordelig zijn bij de zuivering van eiwitten, met name membraan eiwitten en hoge moleculaire massa-eiwitten, en kan worden gebruikt met verschillende andere bacteriesoorten.
Abstract
De Elucidatie van de functie van een gen impliceert doorgaans een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild type stammen en stammen waarin het gen van belang is verstoord. Verlies van functie na genverstoring wordt vervolgens hersteld door exogene toevoeging van het product van het verstoorde gen. Dit helpt om de functie van het gen te bepalen. Een eerder beschreven methode omvat het genereren van een Gtfc gen-verstoorde Streptococcus mutans stam. Hier wordt een niet-veeleisende methode beschreven voor het zuiveren van het Gtfc -genproduct uit de nieuw gegenereerde S. mutans -stam na de verstoring van het gen. Het gaat om de toevoeging van een sequentie van polyhistidine-Coding aan het 3 ′ uiteinde van het gen van belang, waardoor eenvoudige zuivering van het genproduct met behulp van geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie mogelijk is. Voor de genetische modificatie in deze methode zijn geen andere enzymatische reacties nodig dan PCR. Het herstel van het genproduct door exogene toevoeging na gendisruptie is een efficiënte methode voor het bepalen van de genfunctie, die ook kan worden aangepast aan verschillende soorten.
Introduction
Analyse van de functie van een gen impliceert meestal een vergelijking van fenotypische eigenschappen van wild-type stammen tot stammen waarin het gen van belang is verstoord. Zodra de door het gen verstoorde stam wordt geproduceerd, maakt exogene toevoeging van het genproduct een functioneel herstel mogelijk.
De meest voorkomende methode voor het verkrijgen van gezuiverde genproducten die nodig zijn voor daaropvolgende restauratie testen is door heterologeuze expressie in Escherichia coli1uit te voeren. Echter, de expressie van membraan eiwitten of hoge moleculaire massa eiwitten is vaak moeilijk met behulp van dit systeem1. In deze gevallen wordt het doeleiwit meestal geïsoleerd van de cellen die het eiwit native synthetiseert door middel van een complexe reeks stappen, wat kan leiden tot verlies van het genproduct. Om deze problemen op te lossen, is een eenvoudige procedure ontwikkeld voor genproduct zuivering na een gendisruptie methode2, PCR-gebaseerde DNA-splicing methode3 (aangewezen twee-STELE fusie-PCR) en elektroporation voor genetische transformatie in Streptococcus mutans. Toevoeging van een polyhistidine tag (his-tag) aan het C-eindpunt van het genproduct vergemakkelijkt de zuivering ervan door geïmmobiliseerde metaal affiniteits chromatografie (IMAC).
Om de zijn-tag-uitverwoorde stam te isoleren, wordt het gehele genomische DNA van het gen van belang (in deze zijn-tag-uitverwoorde gen-verstoorde stam) vervangen door een antibioticum-resistent marker gen. De procedure voor het genereren van de his-tag-uitdrukken van strainis bijna identiek aan die voor het genereren van een genverstoorde stam zoals eerder beschreven4,5. Daarom moeten de methoden voor gendisruptie en genproduct isolatie worden uitgevoerd als seriële experimenten voor de functionele analyse.
In het huidige werk, een polyhistidine-Coding sequentie wordt gehecht aan het 3 ′ uiteinde van de Gtfc (GenBank Locus tag SMU_1005) gen, codering glucosyltransferase-si (GTF-si) in S. mutans6. Vervolgens werden expressie studies in een streptokokken soort uitgevoerd. Het bereiken van heterologe gtfc expressie door E. coli is moeilijk, waarschijnlijk vanwege de hoge moleculaire massa van GTF-si. Deze stam heeft de naam S. mutans his-gtfc. Een schematische illustratie van de organisatie van de gtfc en spectinomycine resistentie gen cassette (SPCr)7 loci in wild-type S. mutans (s. mutans WT) en derivaten daarvan wordt weergegeven in Figuur 1. De GTF-SI is een secretoire proteïne dat bijdraagt aan de ontwikkeling van de cariogene dentale biofilm6. Onder de aanwezigheid van sucrose wordt een aanhandige biofilm waargenomen op een glad glazen oppervlak in WT s. mutans stam maar niet in de S. mutans gtfc-verstoorde stam (S. mutans Δgtfc)2,5 . Biofilm vorming wordt hersteld in S. mutans Δgtfc op exogene toevoeging van de RECOMBINANT GTF-si. De stam, S. mutans zijn-gtfc, wordt vervolgens gebruikt voor de productie van de RECOMBINANT GTF-si.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Generatie van S. mutans ∆gtfc, waarin de volledige coderende regio van het gtfc -gen wordt vervangen door SPCr, moet worden voltooid voordat deze protocollen worden uitgevoerd. Raadpleeg het gepubliceerde artikel voor meer informatie over generatie5.
1. ontwerp van de primer
-
Bereid primers voor de bouw van S. mutans zijn-gtfc.
Opmerking: De in dit Protocol gebruikte primer sequenties worden weergegeven in tabel 1. Two-Step Fusion PCR-methode voor de generatie van S. mutans zijn-gtfc wordt schematisch geïllustreerd in Figuur 2.- Ontwerp primers (gtfc-reverse en SPCr-forward) voor de bevestiging van zijn-tag-Codeer volgorde, tussen het gen gtfc en SPCr (Figuur 2a).
- Omvatten GS linker en zijn-tag-coding sequentie in zowel Gtfc-reverse en SPCr-forward primers, waarbij 24 basissen in de 5 ' regio's complementair zijn aan elkaar.
Opmerking: de aminozuursequentie van de GS linker en zijn-tag (Gly-Gly-Gly-Gly-ser-his, his, his, his, his) is verbonden aan het C-eindpunt van GTF-SI via gentranslation. - Ontwerp een gtfc-forward primer om het gtfc -gen te targeten in de S. mutans WT genoome > 1 KB stroomafwaarts van het gen en de SPCr-reverse primer om het stroomafwaartse flankerende gebied van SPC r te richten in de S. mutans ∆gtfc. Stel de smelttemperatuur8 (Tm) van de gtfc-forward en SPCr-reverse primers in overeen met de smelttemperaturen van de gtfc-reverse en SPCr- respectievelijk voorwaartse primers.
- Omvatten GS linker en zijn-tag-coding sequentie in zowel Gtfc-reverse en SPCr-forward primers, waarbij 24 basissen in de 5 ' regio's complementair zijn aan elkaar.
- Ontwerp geneste primers (geneste-forward en geneste-reverse) voor de tweede PCR (Figuur 2b).
- Ontwerp primers (Gtfc-forward en Colony-reverse) specifiek voor het GENOMISCHE DNA van de Transformant (figuur 2c; de primers worden gebruikt voor kolonie PCR).
Opmerking: De amplicons Straddle de grens tussen Gtfc en SPCr. De Gtfc-forward primer kan worden aangebracht als de voorwaartse primer. - Ontwerp primers (up-forward en down-reverse) voor definitieve bevestiging van de generatie van S. mutans zijn-gtfc (figuur 2c; het door de primers versterkte PCR-product wordt gebruikt voor DNA-sequencing).
- Ontwerp primers (gtfc-reverse en SPCr-forward) voor de bevestiging van zijn-tag-Codeer volgorde, tussen het gen gtfc en SPCr (Figuur 2a).
2. genomische DNA-extractie van S. mutans
Opmerking: Elke S. mutans stam moet worden gekweekt in hersen hart infusie (BHI) medium bij 37 ° c onder anaerobe condities. De mutanten stammen van s. mutans ∆Gtfc en s. mutans zijn-gtfc worden gekweekt in BHI aangevuld met 100 μg/ml spectinomycine.
- Streak s. mutandiss WT en s. mutans ∆gtfc afzonderlijk op elk van de BHI agar platen. Incuberen ze 's nachts bij 37 °C.
- Kies enkele kolonies van s. mutandiss WT of s. mutans ∆gtfc met behulp van een gesteriliseerde tandenstoker en INOCULEREN in 1,5 ml BHI Bouillon. Incuberen ze 's nachts bij 37 °C.
Opmerking: De kolonies kunnen worden gebruikt als bron van het template-DNA voor de eerste PCR (stap 3,1). - Breng 1 mL van elke bacteriecultuur over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Centrifugeer de cultuur gedurende 1 minuut bij 15.000 x g.
- Verwijder het supernatant en voeg 1 mL tris-EDTA-buffer (pH 8,0) toe om de celpellet te hervatten.
- Centrifugeer de suspensie gedurende 1 minuut bij 15.000 x g. Verwijder het supernatant. Rebreng de celpellet in 50 μL tris-EDTA-buffer (pH 8,0).
- Verwarm de suspensie met een blok incubator gedurende 5 min bij 95 °C. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 15.000 x g.
- Breng de supernatant over naar een nieuwe micro centrifugebuis van 1,5 mL (het supernatant zal dienen als sjabloon-DNA voor de eerste PCR).
3. PCR-versterking
Opmerking: Tabel 1, tabel 2en tabel 3 vatten respectievelijk de PCR-primers, reagentia en versterkings cycli samen.
- Voer de eerste PCR uit met de s. mutandiss WT en s. mutans ∆gtfc genoom als de PCR templates. Versterk de regio's die het stroomafwaartse deel van het Gtfc -gen en de verharkoveringsspc r afboren met behulp van de in stap 1.1.1.2 beschreven primers (Figuur 2a).
- Elektroforese elk PCR-product op 1% agarose gel. De gewenste DNA-fragmenten van ongeveer 1.000 BP en 2.000 BP. Reinig de fragmenten uit de gels met behulp van op silica membraan gebaseerde gel-extractiemethode.
Opmerking: De basisprocedures voor PCR9, DNA-gel elektroforese10en DNA-zuivering11 zijn elders beschreven. - Voer een tweede PCR uit met de producten van de eerste PCR (ongeveer equimolar) als PCR-sjablonen met de geneste-forward en geneste-reverse primers (Figuur 2b).
- Elektroforese een tiende van het PCR-mengsel op de agarose-gel. Bevestig het genereren van de juiste ampliconlengte voor Temp van ongeveer 3.000 BP.
-
Het resterende PCR-product neer te slaan.
Opmerking: zuivering van het PCR-product is niet nodig, omdat niet-specifieke amplicons die door de tweede PCR worden gegenereerd, de homologe recombinatie niet verstoren.- Voeg Nuclease vrij water toe aan het PCR-mengsel en breng het totale volume naar 100 μL, gevolgd door 0,1 volume (10 μL) van 3 M Natriumacetaat (pH 5,2) en 2,5 volumes (250 μL) van absolute ethanol. Meng en bewaar het mengsel gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Centrifugeer het monster 20 min bij 15.000 x g bij 4 °c. Gooi het supernatant weg. Voeg 1 mL 70% ethanol toe om de DNA-pellet te wassen.
- Centrifugeer het monster 5 min bij 15.000 x g bij 4 °c. Gooi het supernatant weg. Lucht drogen en los de DNA-pellet op met 10 μL Nuclease vrij water.
4. Celtransformatie
- Bereid de bevoegde s. mutandiss WT voor om het tweede PCR-product te introduceren door de stappen te volgen die worden beschreven in de vorige publicatie5. Bewaar de cellen bij-80 °C.
Opmerking: Voor dit experiment zijn de bevoegde s. mutandiss WT-cellen al bewaard gebleven in-80 °C om S. mutans ∆gtfcte genereren. - Meng 5 μL van het geconcentreerde tweede PCR-product tot de 50 μL aliquot van de ijskoude bevoegde cellen die eerder zijn bevroren. Voeg het mengsel toe aan electroporatie cuvettes. Geef een enkele elektrische puls (1,8 kV, 2,5 MS, 600 Ω, 10 μF) aan de cellen met behulp van het elektroporation apparaat.
- Respendeer de cellen in 500 μL BHI-Bouillon. Verdeel onmiddellijk 10 – 100 μL van de suspensie op BHI-agar-platen met spectinomycine. Inbroed de platen gedurende 2 – 6 dagen bij 37 °C tot de kolonies voldoende zijn opgekwekt om te worden opgepakt.
5. verificatie van GEnome recombinatie en opslag
- Voer kolonie PCR uit, met behulp van gtfC-forward en Colony-reverse primers om te schermen voor de recombinatie. Elektroforese elke kolonie PCR-product op een agarose gel. Bevestig het DNA-fragment van ongeveer 1.500 BP.
- Kies een van de positieve kolonies met behulp van een gesteriliseerde tandenstoker en subcultuur de cellen overnachten in 2 mL BHI bouillon met spectinomycine.
- Meng 0,8 mL bacteriële cultuur met 0,8 mL steriele 50% glycerol en kolf bij-80 °C of-20 °C.
- Breng de resterende 1 mL celsuspensie over in een micro centrifugebuis van 1,5 mL. Herhaal stap 2.3 – 2.7 om het genomische DNA uit de cellen te halen.
- Voer PCR uit met behulp van de up-forward en down-reverse primers en genomisch DNA als sjabloon. Herhaal stap 3,2 om het versterkte DNA-product uit de gels te zuiveren.
- Bepaal de DNA-sequentie van de gezuiverde ampliconlengte voor temp door DNA-sequencing.
Opmerking: Zorg ervoor dat u de generatie van S. mutans zijn-gtfc bevestigt door DNA-sequencing.
6. zuivering van Polyhistidine-Tagged GTF-SI
- Streak S. mutans zijn-gtfc op een spectinomycine-bevattende BHI agar plaat. Incuberen ze 's nachts bij 37 °C.
- Pak een enkele kolonie met behulp van een gesteriliseerde tandenstoker en subcultuur cellen in 3 mL BHI Bouillon. Inincuberen 's nachts bij 37 °C.
- Bereid twee conische kolven met 1 L BHI Bouillon zonder spectinomycine. Inoculeren 1 mL van de nachtelijke kweek suspensie in 1 L van de BHI-Bouillon. Inincuberen 's nachts bij 37 °C.
- Concentraat eiwitten uit de kweek supernatant door ammoniumsulfaat neerslag.
Opmerking: uittreksel uit cellichamen als een doel proteïne intracellulaire is. De basisprocedures voor de precipitatie van ammoniumsulfaat zijn elders12beschreven.- Centrifugeer de bacteriële kweek suspensie gedurende 20 minuten bij 10.000 x g bij 4 °c. Herstel de kweek supernatant in een glazen beker van 3 liter.
- Voeg 1.122 g ammoniumsulfaat toe aan 2 L van het supernatant (80% verzadiging) met krachtig roeren met behulp van een magnetische roerder. Laat het neerslag gedurende 4 uur of meer bij 4 °C samen roeren.
NB: de precipitaatformatie kan 's nachts worden voortgezet. - Centrifugeer de ammoniumsulfaat-geprecipiteerde oplossing bij 15.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c. Decanterende het supernatant.
- Verzamel het precipitaat met een spatel en breng over in een glazen beker van 200 mL. Respendeer de pellets in 35 mL bindings buffer (50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 5 mm imidazol, pH 8,0).
- Dialyseer de suspensie tegen 2.500 mL van de bindings buffer met behulp van een geregenereerde cellulose dialyse slang, bij 4 °C, met roeren. Vervang de dialyse oplossing na 2 uur en ga 's nachts verder met dialyse.
- Vervang de dialyse-oplossing opnieuw. Doorgaan naar dialyze voor een extra 2 h.
- Centrifugeer de gedialyseerde suspensie bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °c. Filtreer de supernatant door een membraanfilter met behulp van afzuig filtratie apparatuur. Breng het filtraat over in een kolf van 75 cm2 .
- Fractioneren van de polyhistidine-Tagged GTF-SI van de gefiltreerde suspensie door geïmmobiliseerde metaal affinity chromatografie (IMAC).
- Breng 2 mL van de ni-geladen IMAC-hars slurry (ongeveer 1 mL hars) over in een chromatografische kolom waarvan de uitlaat is aangebracht op een siliconenbuis. Verwijder de opslagoplossing door de zwaartekracht stroom.
Let op: Laat de hars niet uitdrogen in de IMAC. - Voeg 3 mL gedistilleerd water toe aan de kolom om de hars te wassen. Voeg 5 mL van de bindings buffer toe om de hars te equilibreren.
- Sluit de stroom af met een Hoffmann-knijp haan. Voeg 5 mL van de gefilterde suspensie uit stap 6,5 toe om de slurry te maken.
- Voeg alle slurry toe aan de resterende gefilterde suspensie. Zwenk het mengsel gedurende 30 minuten zachtjes bij 4 °C.
- Laad het mengsel terug op de kolom. Verwijder de suspensie door de zwaartekracht stroom. Was de IMAC Resin met 20 mL binding buffer.
Opmerking: Stel de stroomsnelheid in op ongeveer 2 mL/min met een Hoffmann-knijp haan in de daaropvolgende IMAC. - Elute de recombinant GTF-SI met 20 mL van de elutie buffer (50 mM NaH2po4, 300 mM NaCl, 500 mm imidazol, pH 8,0).
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken. Het eluaat moet bij 4 °C worden bewaard. IMAC Resin kan worden hergebruikt. Raadpleeg de instructies voor de IMAC Resin.
- Breng 2 mL van de ni-geladen IMAC-hars slurry (ongeveer 1 mL hars) over in een chromatografische kolom waarvan de uitlaat is aangebracht op een siliconenbuis. Verwijder de opslagoplossing door de zwaartekracht stroom.
- Vervang de elutie buffer door de opslag buffer (50 mM fosfaatbuffer, pH 6,5) en concentreer de recombinant GTF-SI oplossing tot ongeveer 1 mL met behulp van een centrifugale ultrafiltratie unit. Bewaar de recombinant GTF-SI-oplossing bij 4 °C.
Opmerking: Bevestig met behulp van SDS-PAGE13 en Western blotting14 de polyhistidine-Tagged GTF-si-zuivering met een mierikswortel, met peroxidase-geconjugeerd anti-polyhistidine monoklonaal antilichaam. Toevoeging van CHAPS (eindconcentratie, 0,1%) het eluens kan nodig zijn om niet-specifieke adsorptie aan de eenheid te voorkomen, afhankelijk van het doeleiwit.
7. functionele restauratie door recombinant GTF-SI
- Streak elke s. mutandiss stam op een BHI agar plaat afzonderlijk. Incuberen de platen 's nachts op 37 °C.
- Gebruik een gesteriliseerde tandenstoker en neem een enkele kolonie op om te inoculeren in 2 mL BHI-Bouillon. Inincuberen 's nachts bij 37 °C.
- Gebruik 20 μL van de nachtelijke cultuur van S. mutans ∆gtfc om 2 ml BHI bouillon met 1% sucrose zonder antibiotica in een glazen reageerbuis te inoculeren. Voeg de GTF-SI of een equivalent volume van het voertuig toe aan de S. mutans ∆gtfc cultuur, en cultuur de cellen met de buis geplaatst in een schuine positie 's nachts.
Opmerking: Steriliseer de GTF-SI-oplossing met een steriel spuit filter en bepaal vóór gebruik de eiwitconcentratie met behulp van een bicinchoninic acid Protein assay15 . - Roer de cultuur suspensies met een Vortex mixer voor 10 sec. de schorsingen af. Was de reageerbuisjes met een voldoende hoeveelheid gedistilleerd water.
- Beits de biofilms op de buiswand met 1 mL 0,25% Coomassie Brilliant Blue (CBB).
- Decaner de kleurings oplossing na 1 min. was de reageerbuisjes met een voldoende hoeveelheid gedistilleerd water. Lucht drogen van de reageerbuisjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 3 toont de grootte van elke ampliconlengte voor Temp van de eerste PCR (Figuur 3a) en de tweede PCR (Figuur 3b). De grootte van elke ampliconlengte voor temp correspondeerde met de voorspelde grootte, zoals beschreven in tabel 1. Fig. 4a toont S. mutans kolonies getransformeerd met het tweede PCR product en verguld op de BHI agar platen met spectinomycine. Kolonie PCR-producten werden vervolgens uitgevoerd op de agarose-gel (figuur 4b). Elke ampliconlengte voor temp was van de voorspelde grootte, zoals beschreven in tabel 1. Afbeelding 5 toont de afbeeldingen van SDS-page en Western Blot. Eiwit gezuiverd met IMAC werd gezien als een enkele band door SDS-PAGE (figuur 5a). Western Blot werd uitgevoerd met behulp van het anti-polyhistidine antilichaam om te bevestigen dat de waargenomen band de verwachte polyhistidine-Tagged proteïne (Figuur 5b) van 160 kDa was. Figuur 6 toont de met sacharose afgeleide biofilmvormende capaciteit van elke S. mutans stam. Alleen s. mutans WT en s. mutans zijn-gtfc kunnen een aanhandige biofilm op de buiswand vormen in de aanwezigheid van 1% sucrose. Dit werd niet waargenomen bij S. mutans Δgtfc (Figuur 6a). Echter, de toevoeging van de recombinant GTF-SI herstelde de aanhanger vermogen biofilm vorming in S. mutans Δgtfc (Figuur 6b).
Figuur 1: organisatie van Gtfc en SPCr loci in de S. mutans UA159 genoome en derivaten daarvan. Een schematische illustratie van de his-tag tussen Gtfc en SPCr. De lengtes van de genen en gaten zijn niet te schalen. In de schaduw van het Pentagon: SMU_1004; solide Pentagon: SMU_1006. Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: strategie voor tweestapsfusie-PCR. Een schematische illustratie van S. mutans Zijn-Gtfc bouw. De lengtes van de genen en gaten zijn niet te schalen. De grondgebonden sites in de sjabloon worden aangegeven door patronen. A) de regio's die een deel van het gen van de Gtfc in de s. mutans WT genoom en harkotteren SPCr in de s. mutans Δgtfc genoom werden versterkt met de eerste PCR-remmer. B) de tweede PCR werd uitgevoerd met geneste primers met behulp van de twee fragmenten die werden versterkt door de eerste PCR-modellen, en een DNA-constructie voor homologe recombinatie werd verkregen. C) de Mutante stam werd opgewekt bij homologe recombinatie in de bacteriën. Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: agarose-gel elektroforese van eerste en tweede PCR-producten. A) producten van de eerste PCR van een deel van de gtfc (gtfc; linker afbeelding) en de regio harkotteren SPCR-(SPCR-; rechter afbeelding) worden weergegeven. Het enkelvoudige elektroforetisch beeld is verdeeld om de markerings banden te labelen. B) de tweede PCR-producten die met de geneste primers worden versterkt, worden weergegeven. Elke pijlpunt geeft de voorspelde grootte van elk PCR-product aan. M = moleculaire marker. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: kolonie PCR tot scherm generatie van S. mutans zijn-gtfc. A) S. mutans KOLONIES die door het tweede PCR-product worden getransformeerd, worden weergegeven. Kolonie-ID wordt aangegeven door omcirkelde getallen. (B) agarose-gel elektroforese van de kolonie PCR-producten wordt getoond. Omcirkeld Lane-nummer correspondeert met de kolonie-ID in figuur 4a. M = moleculaire marker. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: bevestiging van de polyhistidine-Tagged GTF-si-zuivering. (A) representatief SDS-page beeld wordt getoond. B) de afbeelding van de representatieve Western Blot wordt weergegeven. Een nitrocellulose membraan waarop GTF-SI werd overgebracht, werd gepropageerd met een mierikswortelperoxidase-geconjugeerde anti-polyhistidine monoklonaal antilichaam. Immunoreactieve bands werden gevisualiseerd met behulp van een chemiluminescentie reactie. De pijlpunten geven de voorspelde grootte van de recombinant GTF-SI aan. M: moleculaire marker; 1 = monster vóór IMAC; 2 = monster verkregen door IMAC. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: functionele restauratie door toevoeging van de recombinant GTF-si. A) voor elke stam van S. mutans is het vermogen van aan de basis van sacharose afgeleide biofilm vorming aangetoond. B) de mogelijkheid van het vormen van hechtende biofilms werd hersteld in S. mutans Δgtfc door toevoeging van recombinant GTF-si (25 μg). WT = S. mutans WT; Δgtfc = S. mutans Δgtfc; Zijn-gtfc = S. mutans zijn-gtfc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Primer paren | Sequentie (5 ′ tot 3 ′) | Verwachte band grootte (BP) | ||
| 1ste PCR | ||||
|
Gtfc-forward Gtfc-omgekeerde A, B |
TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC de Atgatgatgatgatgactaccaccacctcc AAATCTAAAGAAATTGTCAA |
1.090 | ||
|
SPCr-forward A, C SPCr-reverse |
De kat van de Kaspop Kat TAAATCGATTTTCGTTCGTGAAT TTAAGAGCAAGTTTAAGATAGAACATGTTACTCAC |
2.232 | ||
| 2de PCR | ||||
| Genest-voorwaarts Genest-reverse |
TGGTATTATTTCGATAATAACGGTTATATGGTCAC GCCATACTTAGAGAAATTTCTTTGCTAAATTCTTG |
3.179 | ||
| Verificatie van recombinatie | ||||
| Kolonie PCR | ||||
|
Gtfc-forward Kolonie-reverse |
TAAAGGTTATGTTTATTATTCAACGAGTGGTAACC CCACTCTCAACTCCTGATCCAAACATGTAAGTACC |
1.482 | ||
| Definitieve verificatie | ||||
| Up-forward Omlaag-achteruit |
TACGGCCGTATCAGTTATTACGATGCTAACTCTGG TGTCCACTTTGAAGTSCAACGTCTTGCAAGGCATG |
6.173 | ||
Tabel 1: primers die in het protocol worden gebruikt. Een heel De onderstreepte sequenties "gtfC-reverse en SPCr-Forward" zijn complementair en de vetgedrukte sequencescode voor de his-tag (gtfc-reverse; ATGATGATGATGATG, SPCr-forward; CATCATCATCATCAT) en GS linker (Gtfc-reverse; ACTACCACCACCTCC, SPCr-forward; GGTGGTAGT). B De DNA-stop codon van Gtfc is verwijderd. C Direct na de polyhistidine-Coding-sequenties is een DNA-stop codon (TAA) toegevoegd.
| Reagens | Concentratie van de stamoplossing | Volume | Eindconcentratie |
| DNA polymerase premix | 2x | 25 μL | 1x |
| Voorwaartse primer | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Omgekeerde primer | 5 μM | 2 μL | 0,2 μM |
| Template DNA | Variabele | Variabele | Variabele |
| Gedeïoniseerd water | - | Tot 50 μL | - |
Tabel 2: PCR-Reagentia: Voor de eerste PCR werd 2 μL van de DNA-template toegevoegd. Voor de tweede PCR werd 0,5-2 μL van de eerste PCR-ampliconlengte voor temp toegevoegd aan het reactiemengsel. Voor kolonie PCR werden bacteriële cellen direct toegevoegd aan het reactiemengsel.
| Stap | Temperatuur | Tijd | Aantal cycli |
| Initiële denaturatie | 98 °C | 2 min. | 1 |
| Denaturatie Annealing Extensie |
98 °C 50 °C 72 °C |
10 s 5 s Amplicon-afhankelijke (1 min/1 KBP) |
35 |
| Final extensie | 72 °C | Amplicon-afhankelijke (1 min/1 KBP) |
1 |
Tabel 3: PCR-versterkings cycli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het ontwerp van primers is de meest kritieke stap in het protocol. De sequenties van de gtfc-reverse en SPCr-forward primers werden automatisch bepaald op basis van de sequenties van zowel het 3 ′ eindgebied van gtfc als het 5 ′ eindgebied van SPCr. Elke primer bevat 24 complementaire basissen die coderen een GS linker en een zijn-tag-coding sequentie in hun 5 ' regio's. Verstoring van de inheemse regelgevings sequenties gelegen in de upstream flankerende regio's kan worden vermeden door de toevoeging van zijn-tag-codering sequenties aan de 3 ′ einde. De DNA-aanslag codon moet worden verwijderd uit de Gtfc-reverse primer en toegevoegd aan de SPCr-forward primer. Bovendien moeten de Gtfc-forward en SPCr-reverse worden ontworpen om flankerende regio's van ongeveer 1 KB stroomopwaarts en stroomafwaarts van de doelregio van Homologeuze recombinatie in de S. mutans WT genoome, te versterken, Respectievelijk. Toevoeging van lange flankerende sequenties verbetert de efficiëntie van homologeuze recombinatie. De geneste primers zijn ontworpen voor gebruik in plaats van het buitenste primer paar (Gtfc-forward en SPCr-reverse) in dit protocol. Het opnemen van geneste primers is vereist voor de tweede PCR, zoals elders beschreven5.
Transformatie door elektroporation is efficiënt1 en procedures voor competente celvoorbereiding voorafgaand aan elektroporation zijn ook veel eenvoudiger in vergelijking met de alternatieve methoden16,17,18, Hoewel een elektroporation apparaat vereist is. Het wordt sterk aanbevolen om de bevoegde s. mutandiss WT opnieuw te bereiden in geval van ontbrekende kolonies op de plaat na elektroporation. Hoewel de incubatie een paar uur na elektroporation de efficiëntie van de transformatie kan verbeteren, heeft de extra incubatie geen invloed op het succes van de transformatie. Cellen in de log groeifase moeten worden gebruikt voor de bevoegde cel preparaat, zoals eerder beschreven5.
Aangezien de hoeveelheid recombinant eiwit afhangt van de inheemse uitdrukking van het gen, kan opschalingscultuur nodig zijn in gevallen van eiwitten met een lagere expressie. De hier gepresenteerde methode wordt beperkt door de toepassing van de functionele restauratie test. De toevoeging van gen van belang kan niet worden toegepast op intracellulaire eiwitten exogenously. De ontwikkelde methode biedt echter aanzienlijke voordelen op het gebied van faciliteit, efficiëntie en kosten (bijv. geen enzymatische reacties anders dan PCR) bij het werken met het extracellulaire doeleiwit. Bovendien kan de zuivering van het recombinant eiwit en de bevestiging van de werkelijke genexpressie worden uitgevoerd met behulp van veelgebruikte his-tag-toepassingen, zoals weergegeven in Figuur 5.
De huidige methode, met inbegrip van gendisruptie en genproduct isolatie, kan worden aangepast voor toekomstig gebruik in andere soorten als seriële experimenten voor de functionele analyse van een gen van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (subsidie nummers 16K15860 en 19K10471 tot T. M., 17K12032 tot M. I., en 18K09926 tot N. H.) en de SECOM Science and Technology Foundation (subsidie nummer 2018.09.10 nr. 1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
References
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Wingfield, P. T.
- Database, J. S. E.
- Database, J. S. E.
- Smith, P. K., et al.
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
