Summary
Hier beschrijven we de uitvoering en interpretatie van de resultaten van een in vitro mammosphere zelf vernieuwing kwantitatieve assay.
Abstract
De borstklier wordt gekenmerkt door uitgebreide regeneratiecapaciteit, omdat het door massale hormonale veranderingen doorheen de levenscyclus van een vrouwtje gaat. De rol van borst stamcellen (MASCS) wordt breed bestudeerd zowel in de fysiologische/ontwikkelings context en met betrekking tot borst carcinogenese. In dit aspect zijn ex vivo-studies gericht op de eigenschappen van MaSC zeer gewild. Mammosphere culturen vormen een surrogaat van orgaan vorming en zijn een waardevol hulpmiddel geworden voor zowel fundamenteel als translationeel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het opwekken van primaire mammosphere culturen en de kwantatie van de MaSC groei eigenschappen. Het protocol omvat de verzameling en spijsvertering van de borstklier, isolatie van primaire zoogdieren epitheelcellen (MECs), de oprichting van primaire mammosphere culturen, seriële passage, kwantatie van mammosphere groei parameters en interpretatie van de resultaten. Als voorbeeld presenteren we het effect van de constitutieve Myc-uitdrukking op een laag niveau op normale MECs die leiden tot meer zelf vernieuwing en proliferatie.
Introduction
Isolatie en in vitro cultuur van borstklier epitheel stam en voorlopercellen zijn essentieel geworden voor het begrijpen van hun eigenschappen in de borst Cell biologie. Elegante Lineage tracing en seriële transplantatie testen hebben de studie van stamcellen (SCs) en andere weefsel subgroepen in de context van hun in vivo niche mogelijk gemaakt. Deze aanpak is echter tijdrovend en vereist het genereren van Reporter Muismodellen1,2,3,4,5. Daarom is in vitro cultuur en voortplanting van borst cellen (MaSCs), terwijl het sparen van belangrijke stemness kenmerken, namelijk zelf vernieuwing en differentiatie vermogen, een van de grootste uitdagingen in het veld. In de afgelopen jaren is de mammosphere assay op grote schaal gebruikt om zowel normale borstweefsel-als borstkanker groei te modelleren, om normale of kanker SCs (CSCS) te kwantificeren en hun zelfvernieuwings vermogen te beoordelen als surrogaat reporter van hun activiteit in hun respectievelijke in vivo context6,7,8,9,10,11.
De mammosphere assay is een efficiënte en kosteneffectieve aanpak, waarbij vers geïsoleerde borst cellen (MECs) worden gekweekt in niet-aanhandige omstandigheden, met de veronderstelling dat alleen MaSCs zullen overleven en bollen in suspensie vormen, terwijl alle andere celtypen zullen sterven door anoikis. Bovendien is het vermogen om meerdere generaties mammosferen te vormen in seriële niet-aanhandige passages gerelateerd aan het zelfvernieuwings vermogen van de MASCS6,9,11. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol van een kwantitatieve mammosphere Assay, die oorspronkelijk werd ontwikkeld door dontu en collega's7 als een wijziging van de baanbrekende neurosphere assay12, waardoor de groei van vermoedelijke SCs in niet-aanhangende, serum vrije omstandigheden met de toevoeging van passende groeifactoren7,12.
Protocol
In vivo werden procedures uitgevoerd in overeenstemming met EU-richtlijn 2010/63 en na goedkeuring door ons institutioneel ethisch comité (organisme voor dierlijk welzijn--OPBA) en het Italiaanse ministerie van volksgezondheid (IACUC-nummers 762/2015 en 537/2017).
1. Murine borstklier verzameling en spijsvertering
- Voor een typisch experiment, offeren 8-10 weken-oude Maagd vrouwelijke muizen door CO2 inademing. Afhankelijk van de doelstellingen van het experiment, gebruik 5-30 muizen. Plaats de muizen op dissectie planken onder een capuchon. Gebruik naalden om de voorpoten te strekken en de vacht van het dier met ethanol af te spoelen.
- Til de huid met een tang en voer een verticale incisie beginnen op het niveau van het bekkengebied en verplaatsen helemaal naar de baarmoederhals, waardoor het peritoneum intact. Gebruik een schaar met ronde randen om te voorkomen dat de huid of het peritoneum wordt gescheurd.
- Maak de huid voorzichtig los van het lichaam met zachte bewegingen van de schaar over de laterale as van het lichaam.
- Zodra de huid volledig is losgemaakt van het thoracale en abdominale gebied, voert u vier incisies uit over de vier ledematen van het dier en speld u de huid met naalden. Gebruik de schaar en de tang om het lichaam van het dier volledig los te maken van de verlengde huid.
- Gebruik de tang om de borst Fat pads die nu volledig blootgelegd zijn voorzichtig op te tillen en voorzichtig los te maken van de huid met behulp van de schaar. Verzamel de onderste thoracale en abdominale borstklieren van elke muis en dompel ze onder in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS), in een conische buis van 50 mL. Verzamel tot 20 klieren per buis. Houd de weefsels op ijs.
Opmerking: Indien nodig kunnen de klieren 's nachts op ijs blijven. Dit is een veilig stoppunt. De volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. - Bereiden en filteren van het spijsverterings medium: Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) aangevuld met 2 mM glutamine, 100 U/mL penicillaire, 100 μg/mL streptomycine, 200 U/mL Collagenase en 100 μg/mL hyaluronidase (Zie tabel van de materialen).
- Breng tot 20 klieren naar een 100 mm Petri schaaltje en gehakt het weefsel met behulp van een scalpel of gebogen schaar. Vermijd het overbrengen van grote hoeveelheden DPBS naar het gerecht.
- Voeg 10 mL verterings medium toe aan elke Petri schaal en breng het fijngehakte weefsel over in een conische buis van 50 mL met een serologische Pipet van 25 mL.
- Sluit de buisjes af met Parafilm en plaats ze op een rotator. Stel de Rotator op een lage snelheid (0,03 x g) en inincuberen voor 2,5 h bij 37 °c in een vochtige atmosfeer met 5% Co2.
- Inspecteer de suspensie visueel voordat u doorgaat met de volgende stappen. Als grote stukjes weefsel onverteerd blijven, verlengt u de incubatie bij 37 °C nog eens 30 minuten.
Opmerking: Als alternatief kan de spijsvertering 's nachts worden uitgevoerd bij 37 °C, 5% CO2, met behulp van een zachte Collagenase/hyaluronidase enzym mix13.
2. isolatie van primaire Murine MECs
- Stop de Rotator en verwijder de buisjes uit de incubator. Pas een P1000 tip aan bij de opening van een serologische Pipet van 5 mL. Als de suspensie door de P1000-tip gaat, gaat u verder met de volgende stappen. Zo niet, dan verlengt u de incubatie bij 37 °C nog eens 30 minuten.
- Centrifugeer bij 100 x g, gedurende 5 minuten bij 4 °c. Decanteren zorgvuldig het supernatant en respendeer de pellet van elke buis in 3 mL DPBS.
Opmerking: De lage centrifugeersnelheid maakt het verwijderen van lymfocyten en vetweefsel cellen mogelijk. Voorzichtige manipulatie is vereist om te voorkomen dat de pellet in deze stap wordt ontloand. - Filter de celsuspensie in elke buis afzonderlijk, met behulp van 100, 70 en 40 μm celstrainers. Bij elke filter stap de zeven met 2 mL DPBS wassen voordat de Pass-Through wordt verzameld.
Opmerking: Vanaf dit punt kunnen de celsuspensies samen worden samengevoegd en verwerkt. - Centrifugeer bij 300 x g, gedurende 5 minuten bij 4 °c. Decanteren zorgvuldig de supernatant en resteert de cellen in het resterende volume van DPBS.
- Ga naar de rode bloedcel (RBC) lysis door een gelijk volume ammonium-chloride-kalium (ACK) lysisbuffer toe te voegen (Zie tabel met materialen). Meng door Pipetteer en inincuberen op ijs tot 5 min.
- Voeg 10 mL DPBS toe en centrifugeer bij 300 x g, gedurende 5 minuten bij 4 °c. Decanteer het supernatant zorgvuldig en inspecteert de pellet visueel. Als de pellet wit is, gaat u verder met de volgende stap. Anders herhaalt u de stap RBC Lysis (stap 2,5).
- Reproduceert de celpellet in 1-5 mL mammosphere media: borstklier epitheel celgroei Basaal medium (MEBM), aangevuld met 2 mM glutamine, 100 U/mL penicillaire, 100 μg/mL streptomycine, 5 μg/mL insuline, 0,5 μg/mL hydrocortison, 2% B27, 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 20 ng/mL basis fibroblast groeifactor (bFGF) en 0,4 IE/mL heparine (Zie tabel van de materialen).
3. seriële Mammosphere re-plating
- Voor de oprichting van mammosphere culturen, plaat de cellen op niet-weefselcultuur behandeld (ultra-lage hechting) 6-well platen met een dichtheid van 200.000 levensvatbare cellen/mL in mammosphere medium. Inincuberen de cellen voor 7-10 dagen bij 37 °C, 5% CO2.
- Bereid en filtreer 1% poly-HEMA oplossing in 95% ethanol (Zie tabel met materialen). Jas ultra-lage hechting 6-put platen voor de volgende passages, door toevoeging van 400 μL van 1% poly-HEMA oplossing per goed en waardoor de ethanol volledig drogen. Voor betere resultaten herhaalt u de coating tweemaal.
Opmerking: Het gebruik van niet-gecoate platen tijdens de eerste passage maakt het selectief verwijderen van fibroblasten uit de cultuur mogelijk. - Aan het einde van de 7-10 dagen cultuur, verzamel de primaire mammosferen van alle putten en centrifugeer bij 300 x g, gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Decanteer het supernatant zorgvuldig en ga naar de mechanische dissociatie van de mammospheres met behulp van een P200 pipet met gefilterde tips. Pipetteer ongeveer 100 keer en Inspecteer de suspensie visueel op de aanwezigheid van grote spheroïden.
Opmerking: Een korte incubatie (2-5 min) van de bolpellet in een laag volume (0,2-0,5 mL) trypsine of Accutase bij 37 °C, 5% CO2, kan worden gebruikt om mechanische dissociatie te vergemakkelijken. Bereid verse mammosphere medium (stap 2,7) voor de plating van elke passage. - Respendeer in 1-5 mL vers mammosphere medium en Tel de levensvatbare cellen. Indien van toepassing, de cellen in behandelingsgroepen of kweek condities splitsen.
- Plaat 20.000 levensvatbare cellen/mL op poly-HEMA-gecoate ultra-lage hechting 6-well platen en inincuberen bij 37 °C, 5% CO2.
Opmerking: Mammobollen bereiken hun maximale grootte binnen 5-7 dagen na celplating. Verdeel, indien mogelijk, de cellen van elk monster of elke voorwaarde naar meerdere putjes om technische replicaten te verkrijgen. De dichtheid van de plating moet laag worden gehouden om celaggregatie te voorkomen. Een maximum van 20.000 cellen/mL wordt aanbevolen voor 6-well platen en 5.000 cellen/mL voor 24-Well platen. - Tel na 5-7 dagen het aantal bollen per put. Dit kan handmatig worden gedaan, met behulp van een Microscoop uitgerust met een 10x vergroting lens, of met behulp van digitale beeldanalyse (zie stap 4).
- Verzamel de mammosferen van elk goed afzonderlijk en centrifugeer bij 300 x g, gedurende 5 minuten bij 4 °c.
- Decanteer het supernatant zorgvuldig en ga naar de mechanische dissociatie van de mammospheres met behulp van een P200 pipet met gefilterde tips. Pipetteer ongeveer 100 keer en Inspecteer de suspensie visueel op de aanwezigheid van grote spheroïden.
- Respendeer in 1 mL vers mammosphere medium en Tel de levensvatbare cellen. Pool de cellen van elk voorbeeld of elke voorwaarde en herhaal stap 3.6-3.10. Noteer het aantal cellen verguld en het aantal bollen en cellen per goed geteld voor elke passage. Ga verder met stap 5 voor de berekening van de cumulatieve groei.
4. Sphere-opsomming met behulp van digitale beeldanalyse (DIA)
- Aan het einde van elke passage scant u het gehele oppervlak van alle putjes en verkrijgt u beelden van de bollen met behulp van een digitale camera die op een stereoscoop is gemonteerd. Sla de afbeeldingen op als. TIF-bestanden.
- Importeer de stereoscoop-afbeeldingen als een Afbeeldingsvolgorde met imagej14. Stel de schaal en het type afbeelding in op 8-bits.
- Dupliceer de stapel afbeeldingen en selecteer achtergrond aftrekken van het tabblad proces op de menubalk. Controleer de opties licht achtergrond en glijdende paraboloïde en klik op de knop OK. Alle afbeeldingen van de stapel verwerken.
- Selecteer aanpassen en vervolgens drempelwaarde van de tabafbeelding van de menubalk. Door op toepassente klikken, verschijnt een dialoogvenster met de titel Converteer stapel naar binair . Selecteer standaard als methode en licht als achtergrond. Vink het vakje aan drempel berekenen voor elke afbeelding en klik op de knop OK.
- Selecteer achtereenvolgens de commando's watershed, Open en Erode uit de binaire lijst onder het tabblad proces van de menubalk. Verwerk alle afbeeldingen van de stapel door te klikken op de knop Ja van het dialoogvenster dat verschijnt.
Opmerking: Deze processen zorgen voor visuele segmentatie van objecten die aanraken, object vloeiend maken en verwijderen van pixels van de rand van de objecten. - Selecteer de functie Analyseer deeltjes uit het menu analyseren. Stel de minimumgrootte drempel in op 10.000 μm2 en circulariteit tussen 0,50 en 1,00. Selecteer de optie ellipsen in het dropdownmenu weergeven . Check samenvatten, uitsluiten op randen en in situ tonen en klik op de knop OK. Alle afbeeldingen van de stapel verwerken.
- Inspecteer de correspondentie van de ellipsen visueel met bollen en corrigeer indien nodig het aantal deeltjes dienovereenkomstig. Som de tellingen uit alle frames van elk goed om de totale telling van mammospheres per put te verkrijgen.
5. berekening van de cumulatieve groei curve
Opmerking: Het aantal mammobollen dat in elke put aan het einde van elke passage wordt geteld (Pn) geeft het aantal cellen aan dat aan het begin van Pnis gesekt.
- Registreer voor elke passage (PN) het aantal vergulde cellen en het aantal cellen en bollen dat per put wordt geteld. Bereken de bol grootte aan het einde van elke passage:
bol grootte Pn (cellen/bol) = cellen geteld pn /bollen geteld pn
Opmerking: De grootte van de bol bij Pn is een maat voor het proliferatieve potentieel van elke mammosphere-initiërende cel op pn. - Leid het aantal geplateerde bollen door het aantal cellen dat is geplateerd voor Pn te delen door de bol grootte, berekend aan het einde van de vorige passage (Pn-1):
bollen verguld Pn = cellen verguld pn /bol grootte pn-1
Opmerking: Volgens de Conventie wordt de grootte van de bol tijdens de eerste passage van de cultuur stabiel (d.w.z. Sphere grootte P0 = Sphere size p1). Als meerdere putten worden gebruikt als technische replicaten, gebruik dan de gemiddelde bol grootte op PN-1 als noemer. - Bereken de cumulatieve cel en het bol-nummer voor elke put per passage:
cumulatief getal Pn = ( aantal pn /plated pn) X cumulatief getal pn-1.
Opmerking: Per Conventie, cumulatief getal P0 = verguld p1. Als er meerdere putten als technische replicaten worden gebruikt, berekent u voor elke passage het gemiddelde cumulatieve aantal per monster of voorwaarde. - Plot de gegevenspunten op een semi-logaritmische schaal. Toon het passage nummer (P0 tot pN) op de x-as (lineaire schaal) en het cumulatieve cel-of Sphere-nummer op de y-as (logaritmische schaal).
- Plaats een exponentiële trendlijn op de gegevenspunten en bereken de determinatiecoëfficiënt (R2) om de goedheid van de pasvorm te meten.
Opmerking: De trendlijn die op de gegevenspunten is aangebracht, moet een exponentiële curve benaderen, zoals verwacht voor een celpopulatie die met een constante snelheid groeit of sterft. R2 neemt waarden tussen 0 en 1, met waarden die het dichtst bij 1 wijzen op een betere pasvorm. - Verbeelden de vergelijking van de trendlijn als een natuurlijke exponentiële functie om de groeisnelheid (GR) van de cultuur af te leiden:
y = y0 e(GR) x, waarbij y0 de waarde y is wanneer x = 0.
Representative Results
Myc overexpressie in normale MECs, leidt tot een verhoogde frequentie van het initiëren van mammosphere cellen. Dit wordt bereikt door middel van een dubbel mechanisme: Myc verhoogt de snelheid van MASC symmetrische divisies en de frequentie van voorlopercellen herprogrammering in nieuwe MASCS11. Om het effect van een lage constitutieve Myc-uitdrukking te testen, gebruikten we het transgene muismodel Rosa26-MycER, waarin Myc-activiteit kan worden geïnduceerd door 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)15. We hebben de MECs eerst geplateerd op ultra-low adhesie 6-well platen om fibroblasten te verwijderen, bij afwezigheid van 4-OHT. Na de eerste passage splitsen we de cultuur in tweeën: twee putten werden onbehandeld gehouden (controle) en twee putten werden behandeld met 200 nM 4-OHT (MycER). We telden de bol-en celaantallen van 5 opeenvolgende passages voor drie onafhankelijke experimenten (tabel 1). De cumulatieve cel-en Sphere-nummers per passage worden weergegeven in tabel 2. Inductie met 4-OHT leidt tot verhoogde bol-en celgroei percentages, zoals weergegeven in Figuur 1.
Figuur 1: representatieve resultaten. Cumulatieve bol (a) en cel (B) groeicurves van de controle-en mycer-mammosferen. De gemiddelde en standaarddeviatie van 3 onafhankelijke experimenten worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| 1ste plating | 2de plating | 3e plating | 4e plating | 5e plating | ||||||||||||
| Cellen verguld | Aantal cellen | Aantal bol | Cellen verguld | Aantal cellen | Aantal bol | Cellen verguld | Aantal cellen | Aantal bol | Cellen verguld | Aantal cellen | Aantal bol | Cellen verguld | Aantal cellen | Aantal bol | ||
| Exp1 | Controle | 77.000 | 50.000 | 31 | 65.000 | 58.500 | 41 | 57.000 | 30.000 | 32 | 30.000 | 22.000 | 5 | 22.000 | 0 | 0 |
| 77.000 | 81.000 | 41 | 65.000 | 55.000 | 23 | |||||||||||
| MycER | 77.000 | 31, 0000 | 193 | 80.000 | 375.000 | 323 | 80.000 | 380.000 | 217 | 80.000 | 220.000 | 223 | 80.000 | 170.000 | 155 | |
| 77.000 | 110.000 | 142 | 80.000 | 505.000 | 396 | 80.000 | 270.000 | 149 | 80.000 | 290.000 | 194 | 80.000 | 250.000 | 160 | ||
| Exp2 | Controle | 75.000 | 75.000 | 71 | 60.000 | 17.000 | 34 | 28.000 | 45.000 | 29 | 45.000 | 13.000 | 2 | 13.000 | 0 | 0 |
| 75.000 | 47.000 | 45 | 60.000 | 11.000 | 47 | |||||||||||
| MycER | 75.000 | 200.000 | 188 | 80.000 | 225.000 | 277 | 80.000 | 230.000 | 155 | 80.000 | 210.000 | 211 | 80.000 | 100.000 | 95 | |
| 75.000 | 250.000 | 192 | 80.000 | 202.500 | 283 | 80.000 | 305.000 | 185 | 80.000 | 160.000 | 237 | 80.000 | 100.000 | 133 | ||
| Exp3 | Controle | 82.500 | 130.000 | 121 | 80.000 | 45.000 | 105 | 80.000 | 110.000 | 86 | 80.000 | 58.500 | 75 | 58.500 | 58.500 | 78 |
| 82.500 | 125.000 | 177 | 80.000 | 71.250 | 42 | |||||||||||
| MycER | 82.500 | 325.000 | 457 | 80.000 | 610.000 | 327 | 80.000 | 367.000 | 309 | 80.000 | 500.000 | 260 | 80.000 | 115.000 | 146 | |
| 82.500 | 475.000 | 463 | 80.000 | 455.000 | 392 | 80.000 | 415.000 | 204 | 80.000 | 470.000 | 295 | 80.000 | 185.000 | 161 | ||
Tabel 1: aantal bollen geteld en aantallen cellen verguld en geteld bij elke passage.
Tabel 2: berekening van vergulde bol-nummers en cumulatieve bol-en celnummers. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Discussion
Hier beschrijven we een protocol voor de kwantitatieve beschrijving van de MaSC-groei-eigenschappen in vitro. Als voorbeeld presenteren we het effect van de constitutieve Myc-uitdrukking op een laag niveau op normale Murine-MaSCs. Deze benadering kan echter ook op verschillende contexten worden toegepast. Menselijke of murene primaire cellen, evenals gevestigde cellijnen, kunnen worden gekweekt in verankerings onafhankelijke voorwaarden om mammosphere culturen te vestigen die kunnen worden doorgangen. Gen-overexpressie en RNA-interferentie kunnen eenvoudig in het protocol worden geïntroduceerd met de toevoeging van een virale transductie stap aan het einde van de eerste passage (na stap 3,5). Als alternatief kunnen cellen worden geïnfecteerd in adhesie en vervolgens geplateerd als mammobollen.
Een kritisch aspect van de bepaling die hier wordt gepresenteerd, is de celdichtheid zaaien, die laag genoeg moet zijn om te voorkomen dat de opwekking van aggregaten de interpretatie van de resultaten16,17verstoort. De morfologie van de mammobollen kan informatief zijn om deze onduidelijkheid op te lossen. Alleen compacte, ronde bollen moeten worden geïnventariseerd aan het einde van elke passage. Zowel de circulariteit van de sferoïden als de grootte moet in aanmerking worden genomen. Met gebruikmaking van het geautomatiseerd proces van de DIA wordt deze stap op objectieve en absolute wijze verzekerd met de juiste drempels. Vaak, voor ouders zullen acinaire structuren of kleinere clusters van cellen die moeten worden uitgesloten van de mammosphere graven vormen. Als vuistregel gebruiken we een drempelwaarde van 100 μm diameter. Ten slotte moet worden gezorgd om te voorkomen dat de overdracht van ongeschonden of niet-volledig gescheiden mammopsherzen van de ene passage naar de volgende wordt vermeden. Aan de andere kant, overtollige Pipetteer zal leiden tot een verhoogde celdood. Dus, als dergelijke moeilijkheden worden ondervonden, raden we aan milde trypsinoisatie of accutase behandeling te gebruiken en de gezien bollen door een 40 μm zeef te passeren om de aanmaak van eencellige suspensies te garanderen.
Sphere forming efficiency (SFE) is als alternatief gebruikt, als surrogaat voor SC of CSC kwantatie ex vivo in mammosphere culturen. SFE is inderdaad een maat voor stam-achtige cellen in een bepaalde celpopulatie. Het vertegenwoordigt echter een minder gewetensvolle aanpak, aangezien het alleen op verschillende tijdstippen informatie verschaft. De berekening van de cumulatieve bol-getallen en het genereren van cumulatieve groeicurven, in plaats daarvan, maakt het mogelijk dat de groeisnelheid van de cultuur van de initiële cel zaaien stap tot de cultuur Uitlaten uitstoten of, in het geval van vereeuwigd culturen, voor het gewenste aantal passages. De beoordeling van de groei-eigenschappen maakt de evaluatie mogelijk van de afwijking van de exponentiële groei door de coëfficiënt R2 en, bij een tweede stap, de beoordeling van de GR-waarde zelf.
Belangrijk is dat cumulatieve mammosphere groeicurven kunnen worden gebruikt om het effect van kleine molecuul remmers of andere chemotherapeutische geneesmiddelen selectief te evalueren op de CSC-niveau6,11. In tegenstelling tot de normale primaire mammospheres, die functioneel uitlaat in 5-7 passages, hebben tumor mammospheres de neiging om oneindig uit te breiden. Deze functie is gekoppeld aan de onbeperkte CSC-mogelijkheid voor zelf verlenging. De effecten op proliferatie en CSC-zelf vernieuwing kunnen worden losgekoppeld door respectievelijk het genereren van tumorcellen en mammosphere groeicurves. Er wordt verwacht dat een CSC-specifiek effect resulteert in een afname van de cumulatieve mammosphere groeisnelheid, met of zonder effect op de cumulatieve celgroei snelheid6,11.
Tot slot, een ander gebied van belang is het een van Adult weefsel SC herprogrammering. Volgroeide mammosferen bestaan uit een fenotypisch heterogene celpopulatie, waarin slechts een kleine fractie stam achtige kenmerken behoudt, waaronder het initiëren van mammosphere en het starten van de borstklier bij transplantatie in vivo6,9,11,18,19. Mammary voorlopercellen kunnen dus worden geïsoleerd hetzij met behulp van in vitro label-behoud van de assays6,9,11 of, ex vivo, met behulp van gevestigde oppervlakte markeringen2,3. Met name, borst voor ouders overleven anoikis niet en zijn niet in staat om mammosferen te vormen. Afgedwongen Myc-uitdrukking is aangetoond dat het mammosphere initiatie potentieel verleent aan borst voorlopercellen die zijn geïsoleerd als pkhneg11, resulterend in de generatie van een cultuur die voor onbepaalde tijd kan worden doorgegeven. Evenzo kan interferentie van negatieve regulatoren van fysiologische herprogrammering worden getest met dezelfde test. In deze context is een veelvoorkomend probleem dat zich kan voordoen het beperkte aantal celinvoer. Als de celinvoer lager is dan 10.000 cellen, raden we aan te zaaien in 24-Well platen (maximaal 5.000 levensvatbare cellen/mL). Niettemin kan worden aangetoond dat de onafhankelijke cultuur voorwaarden van de verankering te streng zijn voor het scoren van herprogrammering, met name in gevallen waarin het herprogrammeeringeffect niet onmiddellijk is. In dergelijke gevallen zou het gebruik van een ondersteunende matrix en 3-dimensionale organoïde culturen geschikter kunnen zijn20.
Over het algemeen is de mammosphere assay een kosteneffectieve optie die gemakkelijk kan worden gebruikt voor het scoren van stam achtige eigenschappen in normale en tumorele MEC-populaties. De kwantitatieve benadering in dit protocol vergemakkelijkt de vergelijkingen tussen culturen die in verschillende omstandigheden worden uitgevoerd of aan uiteenlopende stimuli worden blootgesteld. Wanneer nauwgezet gevolgd, biedt het een relatief eenvoudig ex vivo modelsysteem dat het mogelijk maakt om de meerdere spelers die stam eigenschappen definiëren in vivo te ontkoppelen, en biedt de mogelijkheid van gedetailleerdere mechanistische studies.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Bruno Amati voor het vriendelijke cadeau van het Rosa26-MycER transgene muismodel. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van WWCR, AIRC, ERC en het Italiaanse ministerie van volksgezondheid aan P.G.P. T.V. en X.A. werden ondersteund door FIRC en A.S. door een FUV-subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor - basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
| Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
| DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
| DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
| EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
| Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
| Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
| Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
| Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
| Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |
References
- Kordon, E. C., Smith, G. H. An entire functional mammary gland may comprise the progeny from a single cell. Development. 125 (10), 1921-1930 (1998).
- Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
- Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
- van Amerongen, R., Bowman, A. N., Nusse, R. Developmental stage and time dictate the fate of Wnt/beta-catenin-responsive stem cells in the mammary gland. Cell Stem Cell. 11 (3), 387-400 (2012).
- Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479 (7372), 189-193 (2011).
- Cicalese, A., et al. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell. 138 (6), 1083-1095 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Research. 10 (3), R52 (2008).
- Pece, S., et al. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140 (1), 62-73 (2010).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Research. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Santoro, A., et al. p53 Loss in Breast Cancer Leads to Myc Activation, Increased Cell Plasticity, and Expression of a Mitotic Signature with Prognostic Value. Cell Reports. 26 (3), 624-638 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gao, H., et al. Murine mammary stem/progenitor cell isolation: Different method matters? Springerplus. 5, 140 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Murphy, D. J., et al. Distinct thresholds govern Myc's biological output in vivo. Cancer Cell. 14 (6), 447-457 (2008).
- Bailey, P. C., et al. Single-Cell Tracking of Breast Cancer Cells Enables Prediction of Sphere Formation from Early Cell Divisions. iScience. 8, 29-39 (2018).
- Lombardo, Y., de Giorgio, A., Coombes, C. R., Stebbing, J., Castellano, L. Mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines. Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).
- Peng, T., Qinghua, M., Zhenning, T., Kaifa, W., Jun, J. Long-term sphere culture cannot maintain a high ratio of cancer stem cells: a mathematical model and experiment. PLoS One. 6 (11), (2011).
- Smart, C. E., et al. In vitro analysis of breast cancer cell line tumourspheres and primary human breast epithelia mammospheres demonstrates inter- and intrasphere heterogeneity. PLoS One. 8 (6), (2013).
- Panciera, T., et al. De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
