Summary
Her beskriver vi en prosedyre for genomomfattende analyse av DNA-metylering i gastrointestinale kreftformer. Prosedyren er av relevans for studier som undersøker sammenhenger mellom metyleringsmønstre av gener og faktorer som bidrar til karsinogenese ved gastrointestinal kreft.
Abstract
DNA metylering er en viktig epigenetisk endring som er biologisk meningsfylt og et hyppig fokus på kreftforskning. Genome-wide DNA metylering er et nyttig tiltak for å gi en nøyaktig analyse av metylering status for gastrointestinale (GI) maligniteter. Gitt flere potensielle translasjonelle bruk av DNA-metyleringsanalyse, må praktiserende klinikere og andre nye dna-metyleringsstudier kunne forstå trinnvis hvordan disse genomomfattende analysene utføres. Målet med denne protokollen er å gi en detaljert beskrivelse av hvordan denne metoden brukes til biomarkøridentifikasjon i GI maligniteter. Viktigere, vi beskriver tre kritiske trinn som er nødvendige for å oppnå nøyaktige resultater under genom-omfattende analyse. Klart og konsis skrevet, disse tre metodene mangler ofte og ikke merkbare for de nye til epigenetiske studier. Vi brukte 48 prøver av en GI malignitet (magekreft) for å markere praktisk talt hvordan genom-wide DNA metylering analyse kan utføres for GI maligniteter.
Introduction
Epigenetikk refererer til arvelige endringer i genfunksjonen uten endring av sekvensen av DNA1. Slike endringer kan skyldes DNA-metylering, der metylgrupper på en DNA-base kan endre genuttrykket gjennom endringer i kromatinpakning. Kreftutvikling og progresjon kan oppstå hvis denne effekten resulterer i endret uttrykk for tumorsuppressorgener2. Aldring og kronisk betennelse er begge årsaker til kreft og hovedårsakene til endringer i DNA-metylering hos mennesker3,4,5. Følgelig tillater dette utnyttelse av DNA metylering som biomarkør i kreftdiagnose, og som et mål for behandling og forebygging. For tidlig påvisning og kreftprognose måles DNA-metylering i tumor-, blod-, urin- ogavføringsprøver 6, mens demetyleringsmidler nå brukes til å behandle leukemier som myelodysplastisk syndrom7.
Genome-wide DNA metylering analyse ved hjelp av en array plattform for kompleks evaluering av DNA metylering på en individuell CpG locus i det menneskelige genomet kan benyttes til å undersøke metylering status på mer enn 450.000 CpG nettsteder i genomisk DNA8,9, som tillater utforskning av kreft epigenetikk (se Materialovertredende). Hele genom bisulfite sekvensering (WGBS) teknologier har endret våre tilnærminger innen epigenetikk10,11. Det er imidlertid noen ulemper med teknologiene når det gjelder en betydelig kostnads- og behandlingstid for epigenetisk analyse av et stort antallprøver 10,11. Derfor er arrayplattformen mer mulig for kompleks evaluering av DNA-metylering i det menneskelige genomet. Tilgjengeligheten av tilnærminger til genomomfattende metyleringsanalyser har blitt bedre de siste årene og gjør det mulig for oss å utvide vår kunnskap om hvordan DNA-metylering bidrar til kreftutvikling ogprogresjon 12. Nylige fremskritt i mikroarray-plattform tilnærminger gir oss begrunnelsen for genom-wide metylering analyse for å identifisere en ny epigenetisk signatur i gastrointestinalekreftformer 13. Målet med denne protokollen er å gi en detaljert beskrivelse av hvordan denne metoden brukes til biomarkøridentifikasjon i GI-maligniteter.
Protocol
Alle prosedyrene som fulgte var i samsvar med de etiske standardene til institusjonenes etiske forskningsetikkkomité. Studien ble godkjent av Institutional Review Board ved Juntendo University Shizuoka Hospital, og skriftlig informert samtykke ble frafalt på grunn av retrospektiv design.
1. Vaske lysbildene
- Forbered 10 μm av uoppnåde formalin-faste parafin-innebygde (FFPE) seksjoner.
- Plasser lysbildene i en glidebryter i glass: Bruk ca. 3–5 største tverrsnittslyser med mindre vevet er minimalt, og det er behov for flere lysbilder.
- Fyll glideholderen med xylen, og kontroller at alt vev på lysbildet er nedsenket. La det sitte i 15 min.
- Etter 15 min, hell ut xylenen med lysbildene holdt med en pipettespiss slik at lysbildene ikke faller ut.
- Hell i mer xylen til samme nivå som før. La det sitte i ytterligere 15 min.
- Etter 15 min, hell ut xylen igjen.
- Fyll glideholderen med 100% etanol (EtOH), og sørg for at alt vev på lysbildet er helt nedsenket. La det sitte i 3 min.
- Hell av EtOH mens du holder lysbildene forsiktig. Påfyll til samme nivå med mer EtOH. La det sitte i 2 min.
- Hell av EtOH igjen og fjern lysbildet. Plasser dem forsiktig med forsiden opp på et rent papirhåndkle for å tørke. La det sitte i 10 min.
2. Skraping av lysbildene
- Forbered fordøyelsen/lysisbufferen med 650 ml dietylpyrokarbonat (DEPC)-behandlet vann, 100 ml etylendiamintestersyre (EDTA), 50 ml Trishydroklorid (Tris-HCL) 2 M pH 8,8 og 200 ml 10 % natriumveldecylsulfat (SDS) (se materialtabell).
- Fyll et 1,5 ml engangspolypropylenrør med 80 μL fordøyelses-/lysisbuffer (se Materialovertred).
- Sett en ren pipettespiss inn i bufferen.
- Identifiser kreftvev i tumorområdet som er mest egnet for makrodisseksjon i henhold til riktig H&E-farget seksjon.
MERK: Tumorområdet for makrodisseksjon bør identifiseres av fortrinnsvis to kvalifiserte patologer. - Macrodissect kreftvev basert på den markerte H&E farget delen.
- Ta et rent barberblad og skrap forsiktig kreftvevet av lysbildet, og prøver å holde det i ett stykke slik at det er lettere å jobbe med.
- Ta pipettespissen ut av engangspolypropylenrøret som inneholder buffer, og bruk det til å overføre det skrapte vevet til bufferhettet (se Materialtabell).
MERK: Den våte spissen skal tiltrekke seg vevet, noe som gjør overføringen enklere.
- Gjenta trinn 2.5 med resten av lysbildene.
- Etter at alt vevet er i engangspolypropylenrør, bruk spissen for å sikre at vevet er helt nedsenket og ikke sitter fast på veggen av røret.
- Tilsett 20 μL av en subtilisinrelatert serinprotease i hetteglasset og knips forsiktig for å blande (se Materialtabell).
- Plasser hetteglasset i en varmeblokk på 55 °C i minst 4 timer eller over natten. Pass på å litt vortex etter 2 timer.
3. Bisulfittbehandling
- Bruk 45 μL av den fordøyde vevsoppløsningen som prøve.
- Utfør bisulfittbehandlingen ved hjelp av reagenser i et bisulfittkonverteringssett i henhold til produsentens instruksjoner (se Materialse tabell).
- Tilsett 5 μL fortynningsbuffer til DNA-prøven og inkuber ved 37 °C i 15 min (se Materialtabell).
- Mens prøvene inkuberer, klargjør bisulfittkonverteringsreagensen ved å tilsette 750 μL dH2O og 210 μL fortynningsbuffer til ett rør med CT-konverteringsreagens (se Materialtabell). Bland rørene ved å virvle i 10 min.
- Etter 15 min inkubasjon, tilsett 100 μL av den tilberedte CT-konverteringsreagensen til hver prøve og bland ved inversjon.
- Inkuber prøvene i mørket ved 50 °C i 12 til 16 timer.
- Etter inkubasjonen, fjern prøvene og legg på is i 10 min.
- Tilsett 400 μL bindingsbuffer og bland hver prøve ved å pipettere opp og ned (se Materialtabell). Legg hver prøve i en spin-kolonne, og plasser kolonnen i et 2 ml oppsamlingsrør (se Materialse tabell).
- Sentrifuger hver prøve med full hastighet (10 000 x g)i 1 min og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 200 μL vaskebuffer i hver kolonne og spinn med full hastighet i 1 min, kast gjennomstrømningen (se Materialtabell).
- Tilsett 200 μL av desulfonasjonsbuffer i hver kolonne og la kolonnen stå ved romtemperatur i 15 min (se Materialtabell). Etter inkubasjonen, spinn kolonnene med full hastighet i 1 min og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 200 μL vaskebuffer i hver kolonne og spinn med full hastighet i 1 min (se Materialtabell).
- Gjenta dette trinnet en gang til.
- Tilsett 46 μL dH2O i hver kolonne og plasser hver kolonne i et nytt sterilt 1,5 ml engangspolypropylenrør (se Materialtabell). Spinn hvert rør i 2 min for å elute DNA.
- Fjern hver spinnkolonne fra engangspolypropylenrøret og kast (se Materialsegraf). DNA-et er nå klart for analysen.
4. Array plattform for evaluering av DNA metylering ved en CpG locus i det menneskelige genomet
- Vurder kvaliteten på DNA (kvalitetskontroll: QC) ved hjelp av FFPE QC-analyse på et PCR-forsterknings- og deteksjonsinstrument i sanntid, med påfølgende dataanalyse utført i henhold til produsentens instruksjoner (se Materials tabell).
MERK: Eksempler med ∆Cq-verdier som er mindre enn de anbefalte 5.0, behandles videre14. - Analyser prøver med en arrayplattform for kompleks evaluering av DNA-metylering for å vurdere metyleringsstatusen til >450 000 CpG-områder i genomet (se Materialtabell). Produktinformasjonsark, dataark og produktfiler for matriseplattformen er tilgjengelige15.
MERK: Analysen utføres i henhold til produsentens instruksjoner for FFPE-materiale14. - Beregn høy og lav locus metylering i et dataanalyseverktøy for en matriseplattform som en β-verdi, med et område fra henholdsvis 0 til 1 (se Materialtabell). Bruk kommersielt tilgjengelig programvare (se Materials tabell) til å beregne β verdi.
- Importer data generert på array-plattformen for kompleks evaluering av DNA-metyleringsplattform til R-programvaremiljøet (R v.2.15.1) og behandle dem ved hjelp av et verktøy for å analysere metyleringsarrayer16,17.
MERK: På varmekartet, som genereres ved hjelp av et dataanalyseverktøy, bestilles kolonner av klynger uten tilsyn, mens rekkefølgen på radene er basert på den avtagende betydningen av t-statistikken for differensialmetylering fra topp til bunn. - Del varmekartet i høy og lav metyleringsgrupper ved hjelp av den første differensieren i klyngene uten tilsyn.
MERK: For validering med kvantitativ metyleringsspesifikk PCR (qMSP), velg gener basert på en større β-verdi i forhold til CpG-øyene i promotorregionen, og på grunn av deres egnethet for primer og sondedesign for qMSP.
5. Kvantitativ metyleringsspesifikk PCR (qMSP)
- Bruk bisulfittmodifisert DNA fra trinn 3.3 som en mal for fluorescensbasert sanntids-PCR i qMSP for å evaluere metylering av promotorområdet i hver genanalyse.
- Utfør qMSP ved hjelp av et PCR-instrument i sanntid (se Materialsekk).
- Se etter promotormetyleringsstatusen til målgenet på det bisulfittmodifiserte DNA-et ved hjelp av 200 nM fremover primer, 200 nM omvendt primer og 80 nM sonder. Forbered mastermiksen med 16,6 mM (NH4)2SO4,67 mM Tris pH 8,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10 nM fluorescein, 0,166 mM av hver deoksynukletidtrifosfat og 0,04 U/μl DNA polymerase (se Materialtabell). Det endelige reaksjonsvolumet i hver brønn for alle analyser er 25 μL.
- Utfør sykling av qMSP slik: 95 °C i 5 minutter, etterfulgt av 55 sykluser på 95 °C i 15 s, 60 °C i 1 min og 72 °C i 1 min.
MERK: Målgenet bør velges basert på kriteriene for å ha større betaverdier, være relatert til CpG-øyer i promotorregionen, og være egnet for primer- og sondedesign for qMSP.
- Bruk human genom behandlet med CpG Methylase (M.SssI) som en positiv metyleringskontroll (se Materialtabell).
MERK: Den endelige kvantifiseringen av metylering er definert som den relative metyleringsverdien (RMV), og beregnes som 2–ΔΔCt for hver metyleringsdeteksjons replikering sammenlignet med gjennomsnittlig Ct for β-Actin (ACTB)18. Primer- og probesekvenser vises i tabell 1. En Ct på 100 brukes til uoppdagede repliker, noe som gir en verdi på 2–ΔΔCt nær null. Følgende formel brukes: gjennomsnitt 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.
Representative Results
Egenskapene til 48 pasienter med magekreft i treningskohorten er som følger (tabell 2): median alder for pasienter var 74 år (52–89 år), og kohorten inkluderte 38 menn (79,2 %) og 10 kvinner (20,8 %). Det var 35 pasienter (72,9 %) med primær magekreft og hos 13 pasienter (27,1 %) med rest magekreft (primær magekreft: første forekomst av en ikke-metastatisk malignitet i magen; rest magekreft: kreft i rest magen som utviklet seg mer enn 5 år etter distal gastrektomi, uavhengig av årsaken til den opprinnelige reseksjon19). Det var 23 pasienter (47,9 %) med lymfeknutemetastase og 25 pasienter (52,1 %) Uten. For det første ble alle 48 prøvene (treningskohorten) lastet for identifisering av outliers (figur 1A). To prøver ga topper som var større enn to standardavvik forskjøvet fra de andre, og disse prøvene ble fjernet (figur 1B). Derfor ble 46 prøver gruppert av DNA-promotor hypermetylering. Det resulterende varmekartet ble delt inn i to grupper basert på høy og lav metylering (figur 2). Dette varmekartet tillater visualisering av de 50 beste sondene innen 1500 bp fra transkripsjonsstartstedet (TSS) i differensialmetyleringsanalysen. De høye og lave metyleringsgruppene var forskjellige i klinikkopatologiske faktorer knyttet til en aggressiv ondartet fenotype. Det vil si typen kreft (primær magekreft: PGC) (p = 0,01, oddsratio = 9,09 (1,67–50,00)) og tilstedeværelse av lymfeknutemetastase (positiv) (p = 0,03, oddsratio = 6,82 (1,16–40,08)) dukket opp som betydelige uavhengige prediktive faktorer når de patologiske faktorene ble brukt som kovariater i multivariatanalyse (tabell 3). Til slutt identifiserte vi EPB41L3-genet20,21 (primer- og sondesekvenser vist i tabell 1) for å være sterkt forbundet med kodifisering av treningskohorten til høye og lave metyleringsgrupper i mikroarrayanalysen. Ved hjelp av qMSP ble resultatene av mikroarrayanalysen for EPB41L3 i testkohorten (126 prøver) validert. Egenskapene til pasientene i testkohorten er vist i tabell 4. RMVs av EPB41L3 i PGC vev var signifikant høyere enn de i rest magekreft (RGC) i univariate analyse (p = 0,01) (figur 3A). På samme måte var RMVs i prøver med lymfeknutemetastase signifikant høyere enn de uten lymfeknutemetastase (p = 0,03) (figur 3B). På denne måten kan DNA-metyleringsanalyse for hele landet hjelpe oss med å identifisere spesifikke gener for å karakterisere visse kliniske status hos pasienter med GI-maligniteter.
Figur 1: Betaverdier i 48 prøver (treningskohort). Alle 48 prøvene (treningskohorten) ble lastet og outliers ble undersøkt (A). To prøver hadde topper som var outliers, og disse ble fjernet (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Det resulterende varmekartet. De resterende 46 prøvene ble gruppert av DNA-promotor hypermetylering. Varmekartet ble delt inn i høye og lave metyleringsgrupper. Dette varmekartet tillater visualisering av de 50 beste sondene innen 1500 bp fra transkripsjonsstartstedet (TSS) i differensialmetyleringsanalysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Relative metyleringsverdier (RMVs) for EPB41L3 i primær magekreft (PGC) vs. rest magekreft (RGC), og i tilfeller med og uten lymfeknutemetastase. Resultatene av mikroarrayanalyse for EPB41L3 i testkohorten (126 prøver) ble validert ved hjelp av qMSP. (A)I enspistanalyse var RMVs av EPB41L3 i PGC vev signifikant høyere enn de i RGC (p = 0,01). (B)På samme måte var RMVs i prøver med lymfeknutemetastase signifikant høyere enn hos de uten lymfeknutemetastase (p = 0,03). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Genet | Forover 5' - 3' | Omvendt 5' - 3' | Sonde |
| B-ACTIN | MERKE GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT | AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC | \56-VANLIGE SPØRSMÅL\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \3IABkFQ\ |
| Epb41L3 Leilighet | GGG ATA GTG GGG TTG ACG C | ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA | AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GCC GAA ACC A |
Tabell 1: Primer- og sondesekvenser.
| Klinikkopatologiske faktorer | Variabler | |
| Alder | 74 (52 - 89) * | |
| Kjønn | Mann / Kvinne | 38 (79.2%) / 10 (20.8%) |
| Type | PGC / RGC | 35 (72.9%) / 13 (27.1%) |
| Lymfeknutemetastase | (+) / (-) | 23 (47.9%) / 25 (52.1%) |
| PGC: Primær magekreft, RGC: Rest magekreft | ||
| * Median (minimum maksimum) | ||
Tabell 2: Egenskapene hos 48 pasienter med magekreft i treningskohorten.
| P-verdi | Oddsforhold | 95 % konfidensintervall | |
| Type (PGC) | 0.01 | 9.09 | 1.67 – 50.00 |
| Lymfeknutemetastase (+) | 0.03 | 6.82 | 1.16 – 40.08 |
| PGC: Primær magekreft | |||
Tabell 3: Prediktive faktorer for den høye metyleringsgruppen (klynge B).
| Klinikkopatologiske faktorer | Variabler | |
| Alder | 71 (33 - 86) * | |
| Kjønn | Mann / Kvinne | 96 (76.2%) / 30 (23.8%) |
| Type | PGC / RGC | 87 (69.0%) / 39 (31.0%) |
| Lymfeknutemetastase | (+) / (-) | 50 (39.7%) / 76 (60.3%) |
| PGC: Primær magekreft, RGC: Rest magekreft | ||
| * Median (minimum maksimum) | ||
Tabell 4: Egenskapene hos 126 pasienter med magekreft i testkohorten.
Discussion
Det er tre kritiske skritt for å oppnå nøyaktige resultater fra DNA metylering genom-wide analyse. Den første er makrodisseksjon av et tumorområde ved å helst to kvalifiserte patologer basert på representative H&E-fargede seksjoner. Unøyaktig makrodisseksjon kan forårsake forurensning med tilstøtende ikke-kreftvev, noe som gir upålitelige resultater; Dermed er det nødvendig med nøye makrodisseksjon. Den andre er vurdering av DNA-kvaliteten (kvalitetskontroll: QC). Eksempler som mislykkes QC (∆Cq > 5.0) kan gi data av dårlig kvalitet. Derfor bør prøver med ∆Cq > 5.0 fjernes og andre brukes. Det tredje trinnet er beregning av β-verdien, som bestemmes av et dataanalyseverktøy for arrayplattformprogramvaren som det metylererte signalet / det totale (metylert + umetylert) signal17. Verdien β fra 0–1 (eller 0 %–100 %), noe som er enkelt å tolke biologisk17. Hovedproblemet med denne verdien er dens dårlige statistiske egenskaper, siden den høye heteroscedasticity innebærer at varians på tvers av prøver ved metyleringsområde ekstreme (β = 0 eller β = 1) er sterkt redusert17. I tillegg, på grunn av dårlig utvalgskvalitet, kan β-verdier ikke vise reproduserbare bifasiske topper22, og prøver uten slike topper bør utelukkes fra videre studier. I tillegg bør målgen velges basert på kriteriene for å ha større betaverdier, være relatert til CpG-øyer i promotorregionen, og være egnet for primer og sondedesign for qMSP.
Evaluering av DNA-metylering ved cpg-locus i det menneskelige genomet utføres ved hjelp av mikroarraybasert teknologi med et fast antall sonder for å kartlegge spesifikke genomiske loci. Det er den mest brukte metoden i epigenome-wide association studier (EWAS) på grunn av sin lave kostnad, liten mengde DNA kreves, og markert kortere prøvebehandlingstid, noe som tillater høy gjennomstrømning behandling av mange kliniske prøver23. En arrayplattform for kompleks evaluering av DNA-metylering ved en individuell CpG-locus er imidlertid begrenset av antall og spesifisitet av sonder for epigenetisk endret loci, noe som forhindrer utforskning av noen genomiske regioner. WGBS er generelt sett på som gullstandardmetoden på grunn av sitt bredere spekter av genomiskdekning 10,11. Denne metoden har imidlertid en betydelig kostnad og en relativt lang behandlingstid for analyse av et stort antall prøver10,11. Dermed er det ikke alltid mulig. Til sammenligning er arrayplattformen for kompleks evaluering av DNA-metylering ved en individuell CpG-locus i det menneskelige genomet rimelig for bruk når det gjelder kostnader og genomisk dekning. Nylig har de nyeste oppgraderte perlechipsene blitt klar til bruk24. Disse analysene kan hjelpe oss med å analysere nesten doblet målte CpG-nettsteder, som kan oppnå ideell genomomfattende foreningsstudie (GWAS) for store utvalgspopulasjoner.
Oppsummert kan DNA-metyleringsgenomomfattende analyse med arrayplattformen for kompleks evaluering av DNA-metylering ved en individuell CpG-locus i det menneskelige genomet gi viktig informasjon om epigenetiske biomarkører i gastrointestinal kreft. Sammenlignet med WGBS er denne metoden kostnadseffektiv og reduserer prøvebehandlingstiden. Derfor er denne metoden for påvisning av DNA-metylering ved en CpG-locus sannsynligvis mye brukt i epigenetisk biomarkørforskning.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er spesielt takknemlige til alle medlemmer av Institutt for kirurgi, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center ved Johns Hopkins University School of Medicine for nyttige diskusjoner og teknisk støtte. Vi takker også Kristen Rodgers for sjenerøs teknisk veiledning om prosedyrene for bisulfittbehandling og qMSP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
| 10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
| 100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
| ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
| CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
| DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
| Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
| GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
| Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
| Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
| Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
| LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
| M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
| M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
| M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
| Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
| M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
| Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
| Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
| Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
| Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |
References
- Qiu, J.
- Okugawa, Y., Grady, W. M., Goel, A. Epigenetic alterations in colorectal cancer: emerging biomarkers. Gastroenterology. 149 (5), 1204-1225 (2015).
- Ahuja, N., Li, Q., Mohan, A. L., Baylin, S. B., Issa, J. P. Aging and DNA methylation in colorectal mucosa and cancer. Cancer Research. 58 (23), 5489-5494 (1998).
- Hsieh, C. J., et al. Hypermethylation of the p16INK4a promoter in colectomy specimens of patients with long-standing and extensive ulcerative colitis. Cancer Research. 58, 3942-3945 (1998).
- Ushijima, T., Okochi-Takada, E. Aberrant methylations in cancer cells: where do they come from. Cancer Science. 96 (4), 206-211 (2005).
- Coppedè, F. Epigenetic biomarkers of colorectal cancer: Focus on DNA methylation. Cancer Letters. 342 (2), 238-247 (2014).
- Vasilatou, D., Papageorgiou, S. G., Dimitriadis, G., Pappa, V. Epigenetic alterations and microRNAs: new players in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes. Epigenetics. 8 (6), 561-570 (2013).
- Ma, X., Wang, Y. W., Zhang, M. Q., Gazdar, A. F. DNA methylation data analysis and its application to cancer research. Epigenomics. 5 (3), 301-316 (2013).
- Morris, T. J., Beck, S. Analysis pipelines and packages for Infinium HumanMethylation450 BeadChip (450k) data. Methods. 72, San Deigo, California. 3-8 (2015).
- Rauluseviciute, I., Drabløs, F., Rye, M. B. DNA methylation data by sequencing: experimental approaches and recommendations for tools and pipelines for data analysis. Clinical Epigenetics. 11 (1), 193 (2019).
- Cazaly, E. Making sense of the epigenome using data integration approaches. Frontiers in Pharmacology. 10, 126 (2019).
- Leal, A., Sidransky, D., Brait, M. Tissue and cell-free DNA-based epigenomic approaches for cancer detection. Clinical Chemistry. 66 (1), 105-116 (2020).
- Song, W., Ren, J., Wang, W. J., Wang, C. T., Fu, T. Genome-wide methylation and expression profiling identify a novel epigenetic signature in gastrointestinal pan-adenocarcinomas. Epigenomics. 12 (11), (2020).
- Wong, E. M., et al. Tools for translational epigenetic studies involving formalin-fixed paraffin-embedded human tissue: applying the Infinium HumanMethyation450 Beadchip assay to large population-based studies. BMC Research Notes. 8, 543 (2015).
- Illumina. , Available from: https://jp.support.illumina.com/downloads/infinium_humanmethylation450_product_files.html (2020).
- Fackler, M. J., et al. Genome-wide methylation analysis identifies genes specific to breast cancer hormone receptor status and risk of recurrence. Cancer Research. 71 (19), 6195-6207 (2011).
- Dedeurwaerder, S., et al. A comprehensive overview of Infinium HumanMethylation450 data processing. Briefings in Bioinformatics. 15 (6), 929-941 (2014).
- Hulbert, A., et al. Early detection of lung cancer using DNA promoter hypermethylation in plasma and sputum. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (8), 1998-2005 (2017).
- Shimada, H., Fukagawa, T., Haga, Y., Oba, K. Does remnant gastric cancer really differ from primary gastric cancer? A systematic review of the literature by the Task Force of Japanese Gastric Cancer Association. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 19 (2), 339-349 (2016).
- Eijsink, J. J., et al. Detection of cervical neoplasia by DNA methylation analysis in cervico-vaginal lavages, a feasibility study. Gynecologic Oncology. 120 (2), 280-283 (2011).
- Sugimoto, K., et al. DNA methylation genome-wide analysis in remnant and primary gastric cancers. Gastric Cancer: Official Journal of the International Gastric Cancer Association and the Japanese Gastric Cancer Association. 22 (6), 1109-1120 (2019).
- Wang, Z., Wu, X., Wang, Y. A framework for analyzing DNA methylation data from Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip. BMC Bioinformatics. 19, Suppl 5 115 (2018).
- Teh, A. L., et al. Comparison of methyl-capture sequencing vs. Infinium 450K methylation array for methylome analysis in clinical samples. Epigenetics. 11 (1), 36-48 (2016).
- Zhou, W., Laird, P. W., Shen, H. Comprehensive characterization, annotation and innovative use of Infinium DNA methylation BeadChip probes. Nucleic Acids Research. 45 (4), 22 (2017).
