Summary
Nous présentons une méthode (GM-free) génétiquement modifiée pour obtenir des cellules avec un phénotype neuronal des cellules sanguines périphériques reprogrammées. L’activation d’une voie de signalisation liée à une nouvelle protéine humaine liée au GPI révèle une méthode efficace sans OGM pour obtenir des cellules souches pluripotentes humaines.
Abstract
De nombreux troubles neurologiques humains sont causés par la dégénérescence des neurones et des cellules gliales dans le cerveau. En raison des limites des stratégies pharmacologiques et autres stratégies thérapeutiques, il n’y a actuellement aucun remède disponible pour le cerveau blessé ou malade. Le remplacement cellulaire apparaît comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour des conditions neurodegenerative. À ce jour, des cellules souches neurales (CSCN) ont été générées avec succès à partir de tissus fœtaux, de cellules embryonnaires humaines (SE) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Un processus de dédifférenciatation a été initié par l’activation de la glycoprotéine GPI-liée humaine nouvelle, qui mène à la génération des cellules souches pluripotentes. Ces cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs) différencient in vitro en cellules avec un phénotype neural comme montré par brightfield et microscopie d’immunofluorescence. L’analyse d’ultrastructure de ces cellules au moyen de la microscopie électronique confirme leur structure primitive aussi bien que neuronal-comme la morphologie et les caractéristiques subcellulaires.
Introduction
Le développement de méthodes de recherche fondamentale et préclinique sur les cellules souches encourage l’application clinique de thérapies à base de cellules souches pour les maladies neurologiques. Une telle thérapie potentielle dépend de manière critique de la méthode de génération de cellules neurales humaines conduisant à la récupération fonctionnelle1.
Les cellules souches neurales (CNS) s’auto-renouvellent et se différencient en nouveaux neurones tout au long de la vie dans un processus appelé neurogenèse adulte. Seules les zones cérébrales très restreintes abritent des NSC compétents pour générer des neurones nouveau-nés à l’âge adulte. Ces NSCs peuvent donner naissance à des neurones matures, qui sont impliqués dans l’apprentissage et la mémoire, remplaçant ainsi les neurones perdus ou endommagés. Malheureusement, ces NSC sont présents en quantités restreintes et cette neurogenèse limitée diminue rapidement au cours du développement juvénile2. Par conséquent, d’autres sources de cellules neurales doivent être considérées dans un objectif de thérapie cellulaire.
Les maladies neurologiques dégénératives sont difficiles à guérir en utilisant des approches pharmacologiques standard. De nouvelles stratégies thérapeutiques pour embrasser de nombreux troubles neurologiques immédicables sont basées sur des thérapies de remplacement cellulaire de tissus malades et blessés. La transplantation de NSC pourrait remplacer les cellules endommagées et fournir des bienfaits. D’autres sources de remplacement des cellules neurales comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (ESC), qui sont dérivées de la masse cellulaire interne des blastocystes mammifères3, ainsi que les cspi4, qui ont une grande capacité d’auto-renouvellement comme les CSE et sont capables de se différencier en diverses lignées cellulaires. Les NSC peuvent également être générés par reprogrammation directe à partir de fibroblastes humains évitant l’état pluripotent5.
La thérapie de remplacement cellulaire est toujours un problème difficile. Bien que l’ESC, le fœtus ou l’iPS puissent être une source de génération de cellules neuronales pour traiter de nombreuses maladies neurologiques incurables, le remplacement autologue des cellules de SC adultes des tissus endommagés est une meilleure alternative qui contourne les préoccupations immunologiques, éthiques et de sécurité.
L’activation de la protéine humaine liée au GPI par réticulation d’anticorps via la phosphorylation de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN déclenche une dédifférenciatation des cellules progénitrices sanguines et la génération de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs)6. Ces cellules différencient in vitro vers les cellules neuronales comme confirmé au moyen de brightfield, d’immunofluorescence et d’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM).
Dans ce travail nous décrivons la génération GM-libre de BD-PSCs et leur re-différenciation réussie en cellules avec le phénotype neuronal.
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Protocol
Des approbations éthiques ont été obtenues lors de la réalisation des expériences.
1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMNCs)
- S’assurer que tous les donneurs ont signé un consentement éclairé avant le prélèvement sanguin conformément aux lignes directrices de l’établissement.
- Prendre 30 ml de sang de donneurs sains par un personnel médical qualifié selon le protocole standard.
- Isolez les PBMNCs par support de gradient de densité. Utiliser 10 mL de milieux avec 25 mL de sang 1:1 dilué avec une solution saline tampon phosphate (PBS) et centrifuger à 300 x g pendant 30 min.
- Isoler la couche interphase entre le plasma et le gradient de densité par pipetage. Laver les cellules isolées avec 5 mL de PBS stérile et centrifuger à 300 x g pendant 10 min. Répéter deux fois.
- Comptez le nombre de cellules par des méthodes standard à l’aide d’une chambre de comptage.
2. Activation de la glycoprotéine humaine ancrée dans le GPI par réticulation d’anticorps à la surface des PBMNCs
- Placer les cellules mononucléaires (MNCs) de 6 x10 6 dans des tubes de 15 mL et effectuer la réticulation des anticorps en incubant les cellules avec de l’anticorps spécifique à la protéine membranaire lié au GPI humain (30 μg/mL) pendant 30 min dans du PBS avec 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) à 37 °C.
- Remplacer le milieu d’incubation par le milieu modifié de Dulbecco d’Iscove complété par 10 % de sérum fœtal bovin (SBF).
- Cultiver les cellules dans des tubes de polystyrène de 15 mL, mettre les tubes dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pendant 8-10 jours (sans secouer). Sur D5, ajoutez 1 à 2 mL supplémentaires de milieu d’Iscove complété par 10 % de FBS à chaque tube de 15 mL.
3. Tri des cellules dédifférenciées nouvellement générées
- Comptez les cellules avec un compteur cellulaire automatisé (suspension cellulaire de 18 μL + colorant de fluorescence de 2 μL) ou dans une chambre de comptage.
- Suspension cellulaire cultivée en centrifugeuse (5-7 x10 6)à 300 x g pendant 10 min et aspirer le surnageant résultant avec une pipette Pasteur stérile.
- Re-suspendre la pastille cellulaire dans 90 μL de PBS pré-refroidi pH 7,2, 0,5% BSA et 2 mM EDTA.
- Ajouter des billes magnétiques cd45 positives de taille nanométrique (80 μL) à la suspension cellulaire et incuber sur de la glace pendant 15 min.
- Laver les cellules en ajoutant 2 mL de tampon PBS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
- Suspendre à nouveau les cellules dans 500 μL de tampon PBS.
- Laver la colonne avec 500 μL de tampon PBS pré-refroidi et la placer dans le champ magnétique.
- Placez la suspension cellulaire sur la colonne et lavez-la avec 500 μL de tampon PBS (deux fois) et le flux de centrifugeuse contenant des cellules CD45 négatives. Collectez-les dans le support d’Iscove complété par 1% BSA.
- Comptez les cellules dans la chambre de comptage.
4. Préparation de plats de culture cellulaire pour la différenciation neuronale des cellules souches nouvellement générées
- Enrober les vaisseaux de culture de poly-L-ornithine et de laminine pour la croissance des cellules neuronales.
- Placer les lamelles de verre dans des plaques à 4 puits et les recouvrir de poly-L-ornithine diluée à 1:5 (0,1 mg/mL dans duddH2O)dans du ddH2O.Placer les lamelles dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h. Puis laver avecddH2O.
- Décongeler lentement la laminine (0,5-2,0 mg/mL) et ajouter au sommet des lamaux de couverture. Incuber à 37 °C pendant 2 h.
- Préparer le milieu d’induction neuronale N2 composé de 49 mL de D-MEM/F12, de 500 μL de supplément de N2, de 400 μL d’acides aminés non essentiels (NEAA), de solution de FGF de base à une concentration finale de 20 ng/mL (préparée à partir d’une solution mère de 100 μg/mL) et d’héparine à une concentration finale de 2 ng/mL.
- Éliminer l’excès de laminine par pipetage et ajouter le milieu neuronal N2 aux plats de culture.
5. Culture de cellules sanguines dédifférenciées neuronales
- Culture de cellules CD45 négatives dérivées de BD sur des lamives de verre recouvertes de laminine/ornithine pendant 2 jours dans un incubateur à 37 °C et 5 % deCO2 dans le milieu N2 pour initier une différenciation neuronale des cellules nouvellement générées par BD.
- Cellules de culture supplémentaires dans un milieu de différenciation neuronale composé de 48 mL de milieu neurobasal, 500 μL de L-glutamine, 1 mL de supplément de B27, 500 μL de NEAA, 50 μL de facteur neurotrophique (GDNF) humain recombinant dérivé de glial (GDNF) à 5 μg/250 μL dans PBS/0,1% BSA, et 50 μL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau humain recombinant (BDNF) à 5 μg/200 μL dans PBS/0,1% BSA et 50 μL de solution d’acide ascorbique 2,9 g/50 mL dans PBS. Placer les plaques dans un incubateur à 37 °C et 5 % deCO2.
6. Analyse par microscopie à immunofluorescence de cellules neurales dérivées du sang
- Culturez les cellules comme décrit ci-dessus pendant 16 jours et retirez le milieu.
- Incuber avec un fixateur préchauffé composé de 75 mL d’eau stérile, 4 g de paraformaldéhyde. Ajouter 10 N NaOH au besoin et remuer jusqu’à ce que la solution se dégage. Ajouter ensuite 10 mL de PBS 10x, 0,5 mL deMgCl2, 2 mL d’EGTA 0,5 M et 4 g de saccharose. Titrer à pH 7,4 avec 6 N HCl, et porter à 100 mL d’eau stérile pendant 15 min, selon Marchenko et al.7.
- Jetez le fixateur et lavez les cellules 3 fois pendant 5 min à chaque fois. Ajoutez immédiatement une solution X de Triton à 0,3% fraîchement faite et perméabilisez les cellules pendant 5 min. Laver 3 fois avec du PBS et ajouter une solution de blocage faite par PBS et BSA à 5%.
- Bloquer les cellules à température ambiante sur une plaque à bascule pendant 1 heure.
- Préparer une dilution appropriée des anticorps dans 1 % de BSA/PBS et incuber les cellules avec des dilutions d’anticorps sur la plaque bascule pendant 1,5 h à température ambiante. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS pendant 5 min chacune, incuber les cellules avec du DAPI et montez les lamures avec un support de montage pour la visualisation au microscope.
REMARQUE : Les anticorps directement marqués utilisés dans cette expérience sont énumérés dans la table des matériaux.
7. Analyse par microscopie électronique à transmission de cellules nouvellement générées
- Ensemencez les cellules pour TEM dans des lames de chambre à 8 puits.
- Fixer les cellules dans du glutaraldéhyde à 3,5 % pendant 1 h à 37 °C, post-fixer dans 2 %OsO4 pendant une heure supplémentaire à température ambiante et colorer dans 2 % d’acétate d’uranyle dans l’obscurité à 4 °C pendant 2 h 30 min.
- Enfin, rincez les cellules dans de l’eau distillée, déshydratez-les dans de l’éthanol et incorporez-les dans de la résine époxy pendant la nuit. Le lendemain, transférer les échantillons dans une étuve à 70 °C pendant 72 h pour le durcissement de la résine.
- Détachez les cultures cellulaires incorporées de la lame de chambre et de la colle vers des blocs d’araldite.
- Couper des sections semi-minces en série (1,5 μm) avec une machine, les monter sur des lames de verre et colorer légèrement avec 1% de bleu de toluidine.
- Collez les sections semi-minces sélectionnées en blocs d’araldite et détachez-les de la lame de verre par congélation répétée (dans de l’azote liquide) et décongélation.
- Préparer des sections ultramin inthes (0,06-0,08 μm) avec une machine et contraster davantage avec le citrate de plomb.
- Obtenez des micrographies à l’aide d’un microscope à balayage électronique avec appareil photo numérique.
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Representative Results
Les résultats fournissent la preuve que cette nouvelle méthode sans OGM est capable de rétablir les cellules progénitrices du sang à leur état le plus primitif sans agir directement sur le génome humain.
Nous avons précédemment montré que la réticulation des anticorps spécifiques aux protéines liées au GPI initie via la régulation à la hausse PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN de gènes hautement conservés pertinents pour le développement tels que WNT, NOTCH et C-Kit, initiant ainsi un processus de dédifférenciatation qui conduit à la première étape de la génération de CSH et à une deuxième et dernière à une génération de BD-PSCs6,8.
Des cultures activées de MNC ont été soumises au tri immunomagnétique utilisant les microbilles CD45. Les cellules sanguines matures qui ne peuvent pas être reprogrammées avec cette méthode (p. ex. cellules CD45 positives) ont été conservées sur la colonne, tandis que la fraction négative contenant des cellules reprogrammées (cellules CD45 négatives) a été utilisée pour la génération de diverses cellules de lignée neuronale.
Nous avons d’abord étudié les aspects morphologiques des cellules BD-dedifferentiated périphériques au moyen de lumière et de TEM. Comme le montre la figure 1, laréticulation spécifique d’anticorps glycoprotéiques ancrés dans le GPI des multinationales humaines génère une nouvelle population croissante de cellules(figure 1A). Nous avons analysé ces cellules au moyen de TEM. Les cellules BD-dédifférenciées sont de petite taille et présentent les caractéristiques des cellules agranulaires immatures, avec progressivement moins d’organites et de grands noyaux avec de la chromatine condensée, similaires aux CSE (Figure 1B). Les cultures non traitées ont montré une tendance à la disparition progressive.
Des cellules négatives BD-CD45 ont été soumises à la différentiation neuronale en deux étapes. Nous avons initié la différenciation vers les lignées neuronales en semant les cellules CD45 négatives sur des plaques de culture enrobées de poly-L-ornithine/laminine pendant 2 jours dans le milieu N2 après culture dans le milieu de différenciation neuronal. Des images de Brightfield ont été acquises aux jours 4, 8, 10, 14 et 30 respectivement en commençant la différenciation neuronale des cellules souches BD-générées.
Dès 4 jours après le début de la différenciation ciblée des cellules nouvellement générées, les premières cellules neuronales avec de longues structures de ramification ont pu être détectées. Nous observons les changements morphologiques de D2 à D30 avec une structure plus complexe comprenant la ramification, impliquant un processus actif vers la différenciation vers les lignées neuronales tout au long de la période de culture (Figure 2). Pour confirmer les dispositifs neuronaux des cellules re-différenciées après les avoir cultivées dans le milieu neuronal pendant 16 jours, des cellules ont été fixées selon un protocole précédent7,et immunocytochemistry (ICC) a été exécuté utilisant la détection d’anticorps au nestin, à la protéine acide fibrillaire glial (GFAP), à la protéine microtubule-associée 2 (MAP2) et à la bêta-tubuline neurone-spécifique de la classe III (Tuj1).
GFAP est la protéine qui constitue une partie du cytosquelette dans les astrocytes représentant le filament intermédiaire principal des astrocytes matures. Comme le montre la figure 3,l’anticorps dirigé contre le GFAP reconnaît ces structures dans les cellules neuronales nouvellement générées, confirmant que les BD-PSCs sont capables de se différencier vers les astrocytes humains9.
MAP2 est une protéine du cytosquelette qui se lie aux tubuli et stabilise les microtubules. Il est exprimé dans les axones, les dendrites et les corps cellulaires et cette expression est spécifique aux tissus et au développement. Les résultats de la microscopie à immunofluorescence confirment l’expression de cette protéine dans les cellules re-différenciées10.
Tuj1 est un marqueur cellulaire neuronal typique. Sa fonction est de stabiliser les microtubili dans le corps cellulaire neuronal et les axones. Il est également impliqué dans le transport axonal11. Les cellules nouvellement re-différenciées ont clairement confirmé l’expression de cette protéine à D16 en commençant la différenciation neuronale dans la condition décrite ici.
Nestin a été caractérisé pour la première fois dans les NSC et représente une protéine de cellules souches neuro-épithéliales, qui appartient à la protéine12 du filament intermédiaire (IF) distinguant les cellules progénitrices neuronales des cellules neuronales plus différenciées. Ces protéines IF sont exprimées principalement dans les cellules nerveuses où elles sont impliquées dans la croissance radiale de l’axone, mais elles sont également présentes dans un certain nombre de tissus supplémentaires. Nestin en tant que marqueur de NSCs principalement est faiblement exprimé dans les cellules déjà sur le chemin pour se différencier en lignées neuronales spécifiques comme c’est le cas avec les cellules BD-re-différenciées à D16.
Figure 1: Génération de cellules souches dédifférenciées (pluripotentes). (A) des cellules mononucléaires Ficoll-isolées ont été cultivées dans Le milieu d’Iscove complété avec 10% FBS. Des micrographies des cellules cultivées activées ont été prises aux jours 1, 5 et 10, respectivement. Des multinationales non activées ont été étudiées comme contrôle. Barre d’échelle: 50 μm. (B) L’analyse TEM des cellules nouvellement générées tout au long de la période de culture montre que les organites des cellules matures (D1) disparaissent progressivement (D8), conduisant à la génération de cellules complètement dédifférenciées ressemblant à des CSE. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Re-différenciation neurologique des BD-CSP. (A) des cellules BD-dédifférenciées ont été placées dans des plats de culture enduits d’ornithine/laminin et cultivées pendant 30 jours comme décrit dans le protocole. Les micrographies sont prises aux jours 4, 8, 10, 14 et 30 respectivement, après avoir grandi dans des conditions de différenciation neuronale. La plupart des cellules de la culture ont changé leur morphologie de petites formes sphériques à des formes plus grandes et allongées et, dans certains cas, à des cellules ramifiées. Barre d’échelle: 100 μm. (B) Les cellules dédifférenciées par BD ont été cultivées pendant 16 jours dans un milieu neuronal, fixées dans une analyse au glutaraldéhyde et à l’EM effectuée comme décrit dans la section protocole. Le corps cellulaire et les processus de ces cellules ont montré une complexité plus élevée que ceux de la cellule indifférenciée en termes d’organites et de cytosquelette présentant une haute densité de cisternae empilés de réticulum endoplasmique rugueux et de faisceaux abondants de filaments d’actine (a, b). À la différence des BD-cellules indifférenciées, les cellules se développant dans les milieux de différenciation ont fréquemment établi des contacts de cellule à cellule. Certains de ces contacts spécialisés impliquaient le corps cellulaire (c) tandis que d’autres impliquaient des processus cellulaires de type neurite (d). Barres d’échelle: a) 20 μm; (b-d), 500 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Immunophénotypage de cellules neuronales nouvellement générées. des cellules BD-dédifférenciées ont été cultivées comme décrit dans le protocole pendant 16 jours et l’analyse immunocytochemistry a été exécutée utilisant des anticorps aux marqueurs neuronaux nestin, GFAP, MAP2 et Tuj1. On voit des micrographies brightfield de cellules re-différenciées accompagnées d’images d’immunofluorescence avec DAPI comme coloration nucléaire, aussi bien que la souillure avec des anticorps pertinents. Les champs montrant une population particulière qui exprime l’une des caractéristiques du marqueur neuronal spécifique pour des lignes spécifiques sont représentés. Barre d’échelle: 100 μm. Le contrôle est présenté à la figure supplémentaire 1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Contrôle des cellules dédifférenciées par BD. des cellules indifférenciées BD-dérivées ont été cultivées dans le milieu modifié de Dulbecco d’Iscove complété avec 10% FBS pendant 16 jours comme décrit dans le protocole et souillé avec de l’anticorps à la nestine GFAP, Tuj1 et MAP2. DAPI a été employé pour la souillure nucléaire. Barre d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
La méthode non-GM de reprogrammation des cellules humaines décrite dans ce travail est basée sur l’activation de membrane à noyau de la ou des machines de signalisation derrière la glycoprotéine de membrane humaine liée au GPI qui initie le processus de dédifférenciatation menant à la génération ex vivo et à l’expansion de PSCs autorenouvants obtenus à partir de sang périphérique humain non manipulé. Ces cellules, lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux appropriés, sont capables de se re-différencier en cellules appartenant à différentes couches germinales6.
Les données présentées dans ce travail montrent que les cellules BD-PSCs générées sans GM lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu de différenciation neuronale ont acquis un phénotype complètement différent, avec des formes allongées, un développement plus élevé de leurs organites et ont établi des interactions plus complexes entre les cellules. De plus, la re-différenciation utilisant la condition décrite ici, implique la différenciation neuronale vers diverses lignées neuronales.
Pour obtenir le nombre optimal et la meilleure qualité de cellules reprogrammées pour leur utilisation dans les études de re-différenciation, les préparations fraîches de MNC pourraient être avantageuses par rapport aux préparations congelées de MNC. La méthode de tri immunomagnétique qui a séparé BD-PSCs des cellules terminalement différenciées qui ne peuvent pas être reprogrammées par cette méthode a pu être incomplète exigeant que le procédé soit répété, ce qui est très stressant pour des cellules et a comme conséquence leurs décès prématurés.
L’étape critique du protocole concerne le nombre et la qualité des emn qui pourraient être obtenues par la méthode décrite. La modification des milieux de différenciation neuronale ainsi que le temps de culture peuvent améliorer le potentiel de différenciation des BD-PSCs, conduisant ainsi à la génération de types spécifiques de cellules neuronales.
Une limitation de cette méthode est la nature non tératogène de ces cellules reprogrammées car il n’est pas possible de générer les lignées cellulaires avec cette méthode. Une fois que les cellules dédifférenciées ont atteint le stade final, celui de la pluripotence, elles deviennent la plupart du temps tranquilles et une nouvelle partie de MNCs doit être dédifférenciée à nouveau pour obtenir un plus grand nombre de BD-PSCs.
La reprogrammation décrite ici repose sur l’activation de la réticulation des anticorps à la surface des cellules progénitrices sanguines. Ce paradigme offre de nombreux avantages potentiels en ce qui concerne la sécurité clinique par rapport aux méthodes GM. L’objectif de réaliser des cellules souches autologues pour la génération de tissus neuronaux peut être atteint par une manipulation minimale ex vivo; suggérant donc fortement que cette thérapie cellulaire pourrait être un candidat prometteur pour l’approche clinique efficace et sûre en neurologie.
La maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer et l’ischémie cérébrale sont parmi les maladies qui pèsent le plus lourdement sur le plan social et économique pour la société en Europe et dans le monde. On s’attend à ce que le fardeau des maladies neurodégénératives augmente avec le vieillissement de la population, devenant un problème socio-économique important et créant un besoin désespéré d’une réponse au problème. La méthode présentée ouvre une nouvelle voie pour les stratégies thérapeutiques non invasives en utilisant une procédure simple et rentable pour générer des populations appropriées de cellules souches autologues ayant l’espoir de guérir des maladies neurologiques actuellement insolubles.
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Disclosures
L’auteure correspondante déclare qu’elle est titulaire d’un brevet lié à Novel Human GPI-linked Protein et qu’elle a cofondé et travaille pour ACA CELL Biotech. Les autres auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Dédié à la mémoire du Dr Rainer Saffrich.
Les auteurs sont particulièrement reconnaissants à José Manuel García-Verdugo et Vicente Herranz-Pérez d’avoir effectué des expériences et des analyses em au Laboratoire de neurobiologie comparative, Institut de biodiversité et de biologie évolutive de Cavanilles, Université de Valence, CIBERNED, Valence, Espagne, qui a été soutenu par un financement de recherche de la subvention Prometeo pour les groupes de recherche d’excellence PROMETEO/2019/075. Le reste de ces travaux a été soutenu par ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Allemagne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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