Summary
ここでは、CGRPおよびファロイジンを用いた免疫蛍光および蛍光組織化学を用いて、頭蓋デュラマー中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性神経線維および血管の空間相関を可視化するプロトコルを提示する。また、これらの神経線維の起源は、蛍光神経トレーサーで逆行トレースした。
Abstract
本研究の目的は、免疫蛍光、三次元(3D)再構成および逆行トレーシング技術を用いた頭蓋硬膜のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性感覚神経線維の分布と起源を調べることであった。ここで、神経線維と血管は、それぞれCGRPおよび蛍光ファロイジンを用いた免疫蛍光および組織化学技術を用いて染色した。硬膜CGRP-インミュール活性神経線維と血管の空間的相関を3D再構成によって実証した。一方、CGRP免疫反応神経線維の起源は、頭蓋頭膜神経節(TG)および子宮頸部側神経節(DrGs)の中髄膜動脈(MMA)周辺領域からフルオロゴールド(FG)を用いた神経学的追跡技術によって検出された。また、TGおよびDRGにおけるFG標識ニューロンの化学的特徴も、二重免疫蛍光を用いたCGRPと併せて調べた。透明な全実装サンプルと3D再構成を利用して、CGRP免疫反応性神経線維とファロイジン標識動脈が一緒に動くか、または別々に3Dビューで神経血管網を形成することを示した、 一方、FG標識ニューロンは、TGの眼、上顎、下顎の枝、およびFG標識ニューロンの一部がCGRP-免疫反応性を示すトレーサー適用の側にC2-3 DRGのイプシララルで発見された。これらのアプローチにより、頭蓋硬膜の血管周囲のCGRP免疫反応性神経線維の分布特性、ならびにTGおよびDRGからのこれらの神経線維の起源を実証した。方法論の観点から、生理学的または病理学的状態下での頭蓋硬膜の複雑な神経血管構造を理解するための貴重な参考文献を提供し得る。
Introduction
頭蓋硬膜は、脳を保護するための髄膜の最外層であり、豊富な血管と神経線維の異なる種類1、2が含まれています。多くの研究は、感作頭蓋硬膜が異常な血管拡張およびインナーベーション3、4、5を含む頭痛の発生につながる重要な要因である可能性があることを示している。したがって、頭蓋硬膜における神経血管構造の知識は、特に片頭痛の発病を理解するために重要である。
硬膜の内膜は従来の免疫検査で以前に研究されてきたが、頭蓋硬膜における神経線維と血管の空間的相関は6、7、8、9より少なかった。より詳細に神経血管構造を明らかにするために、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)およびファロイジンを、免疫蛍光および蛍光組織化学10を有する全実装頭蓋デュラ・マテルにおける硬膜神経線維および血管をそれぞれ染色するためのマーカーとして選択した。神経血管構造の三次元(3D)ビューを得るのに最適な選択であり得る。さらに、 フルオロゴールド(FG)は、脳神経筋の中髄膜動脈(MMA)周辺領域に適用され、CGRP免疫反応性神経線維の起源を決定し、3叉神経節(TG)および子宮頸部(C)後頭根神経節(DRG)に追跡され、FG標識ニューロンは免疫伝達を用いてさらに一緒に検査した。
本研究の目的は、CGRP免疫反応性の内挿とその起源に対する頭蓋硬膜の神経血管構造を調査するための有効なツールを提供することであった。透明な全実装型DURa materを利用し、免疫蛍光、逆行トレーシング、共焦点技術、および3D再構成を組み合わせることで、頭蓋デュラマーターにおける神経血管構造の新しい3Dビューを提示することが期待された。これらの方法論的アプローチは、異なる頭痛の病因を探索するためにさらに役立つ可能性がある。
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Protocol
この研究は、中国医学アカデミー鍼灸研究所の倫理委員会(参考番号D2018-09-29-1)によって承認されました。すべての手順は、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイド(国立アカデミー出版局、ワシントンD.C、1996)に従って行われました。この研究では、12匹の成人スプレイグ・ドーリー雄ラット(体重220±20g)を使用した。動物[ライセンス番号SCXK(JING)2017-0005]は、国立食品医薬品管理研究所によって提供されました。
1. ラット頭蓋硬膜のインナーブ
-
灌流
- 腹腔内にトリブロモエタノール溶液(250mg/kg)の過剰摂取をラットに注入し、安楽死を誘発する。
- 呼吸が止まると、100mLの通常の生理食塩基が0.9%、0.1Mのリン酸緩衝液(PB、pH 7.4)に250〜300mLの4%パラホルムアルデヒドが続きます。
- 灌流した後、頭の皮膚を取り除き、頭蓋骨を開いて脳の硬膜と後側を露出させる。次に、脳幹に沿って頭蓋硬膜を全マウントパターンの嗅球に解剖する(図1)。4%パラホルムアルデヒドで2時間後に固定後を行い、4°Cで24時間以上0.1M PBで25%スクロースで凍結保護を行います。
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CGRPおよびファロイジン標識のための蛍光免疫組織化学
注:CGRPとファロイジンの蛍光染色の組み合わせを適用し、全マウントパターンにおけるラット頭蓋硬膜の硬膜神経線維と血管の空間的相関を明らかにしました。- 頭蓋デュラマーターを0.1 M PBで約1分間リンスします。
- デュラマーターを、3%正常ロバ血清を含むブロッキング溶液にインキュベートし、0.5%トリトンX-100を0.1 M PBで30分間インキュベートします。
- デュラマーターをマウス抗CGRP抗体(1:1000)に移し、1%正常ロバ血清を含む0.1M PBおよび0.5%トリトンX-100を4°C11で一晩含有させる。
- 翌日0.1M PBで硬膜を3回洗います。
- 1%正常ロバ血清と0.5%トリトンX-100を室温(26°C)で1.5時間含む0.1M PBにロバ抗マウスアレクサフルオール488二次抗体(1:500)とファロイドン568(1:1000)の混合溶液で硬膜をインキュベートする。
- 硬膜を0.1M PBで3回洗います。
- エッジをトリムし、顕微鏡スライドに取り付けます( 材料表を参照)。
- 観察前に50%グリセリンでカバースリップを置きます。
-
観察と記録
- 蛍光顕微鏡または共焦点イメージングシステムで蛍光サンプルを観察します。
- デジタルカメラ(4x、NA:0.13)を搭載した蛍光顕微鏡で全体実装デュラマーの画像を撮影し、500 msの露光時間を使用します。硬膜の画像モザイクは、蛍光顕微鏡のソフトウェアで完成しました( 材料表を参照)。
- 共焦点顕微鏡を用いて、硬膜中のCGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識血管の画像を撮ります。励起波長と発光波長は488nm(緑色)、594nm(赤)であった。コンフォーカルピンホールは110(20x)と105 μm(40x)です。画像キャプチャの解像度は 640 x 640 ピクセルです。
- 各40 μmの厚さセクションから2μmフレームの20枚の画像をキャプチャし、3D解析用の共焦点画像処理関連ソフトウェアシステムとの単一の焦点内画像統合を実行 |します。 エンドフォーカルプレーン|を設定するステップ サイズ |を設定する深度パターン|を選択イメージ キャプチャ|Zシリーズ。
- 写真編集ソフトウェアを使用して、画像の明るさとコントラストを調整して、ビジュアライゼーションを最適化します。画像からデータを削除しないように注意してください。
2. FGによる逆行トレース研究
- 手術
- ラット頭蓋硬膜の対象となる座標領域を決定します。
- 10 μL マイクロシリンジを準備し、液体パラフィンでテストします。
- ラットを腹腔内注射でトリブロモエタノール溶液(150mg/kg)で麻酔します。つま先ピンチへの応答の欠如によって麻酔の深さを確認してください。
- 電気カミソリでネズミの頭を剃ります。
- ラットに鈍い耳の棒を置き、ステレオタックスデバイス上に置きます。その後、口ホルダーを入れ、眼科軟膏を目に当てる。
- 10%ポビドネヨウ素を使用して、ヘッドスキンの手術部位を洗浄し、その後75%エタノールを使用します。
- 頭皮の正中線に沿って切開を行います。
- 無菌綿先端アプリケーターを使用して頭蓋骨から骨膜組織と筋肉組織を鈍く取り除く(図1A)。
- MMA12の上の左頭頂部と側頭骨に丸い先端ビット(#106)を持つバリドリルを使用して小さな穴(約5〜7mm)を掘削し、頭蓋硬膜がそのまま保持されていることを確認します(図1B)。
- トレーサーの広がりを制限するために、歯科ケイ酸塩セメントで穴の周りにバンクを構築します(図1C)。
- 2%FGの2μLを10μLマイクロシリンジでMMAの周りの穴に加えます(図1D)。
- 小さな止血スポンジで穴を覆います。
- 穴にパラフィンフィルムを置き、トレーサーの漏れを防ぎ、周囲の組織への汚染を避けるために骨ワックスで縁を密封します。
- 傷口を無菌糸で縫合する。
- ラットが完全に回復するまで、暖かい場所に保管してください。
- ラットをケージに戻し、抗生物質と鎮痛剤を飲料水に加えます。
- 灌流とセクション
- 7日間生存後、セクション1.1の手順で上述したようにこれらのラットを浸透する。
- TGおよびC1-4 DRGを解剖し、後修正し、セクション1.1.3(図1F)で前述したようにそれらを凍結保護する。
- TGとDRGを、矢状方向のクライオスタットミクロトームシステムで30μmの厚さで切り、シランコーティングされたガラススライドに取り付けます。
- TGおよびDRGにおけるFGおよびCGRP標識のための二重免疫蛍光
注:FG標識は、追加の染色なしで水銀ランプ下のUV照明で直接観察することができますが、FGを有する標識ニューロンは、TGおよびDRGにおける硬直CGRP免疫神経線維の起源を明らかにするためにFGおよびCGRPを用いた二重免疫蛍光を使用してTGおよび子宮頸部DRGでさらに検査された。- セクションを、その部分を、その中のヒストケミカルペンで囲みます。
- 3%正常ロバ血清を含むブロッキング溶液に30分間、0.1M PBで0.5%トリトンX-100をインキュベートします。
- サンプルをウサギの抗フルオロゴールド(1:1000)およびマウス抗CGRP抗体(1:1000)の溶液に、通常のロバ血清1%、トリトンX-100を一晩4°Cで含む0.1M PBに移します。
- 次の日に0.1M PBで3回洗浄してください。
- ロバ抗ウサギアレクサFluor 594(1:500)とロバ抗マウスアレクサフルオール488(1:500)の2次抗体を1%正常ロバ血清と0.5%トリトンX-100を室温で1.5時間含む0.1M PBの混合溶液でインキュベートする。
- 手順 1.2.6 および 1.2.8 の手順として、セクションにカバーリップを洗浄して適用します。
- 観察と記録
- デジタルカメラを搭載した蛍光顕微鏡で、TGおよびDRGのTGおよびDRGのニューロンをUV照明で撮影します。
- デジタルカメラを搭載した蛍光顕微鏡下で、TGおよびDRGのFGおよびCGRP標識ニューロンの画像をキャプチャします。
- 編集ソフトウェアを使用して、画像の明るさとコントラストを調整し、画像にラベルを追加します。
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Representative Results
頭蓋硬膜の神経血管構造
CGRPおよびファロイジンによる免疫蛍光および蛍光組織化学的染色の後、CGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識された硬動脈および結合組織は、3Dパターンで全身に明示された(図2C、D、E、F)。厚くて薄いCGRP免疫反応神経線維は、両方とも、血管壁の周り、または血管間の硬膜動脈に平行に走ることを示した(図2D、E、F)。3D再構成を活用することで、硬直細動脈の形態と硬膜CGRP免疫反応性神経線維および細動脈の空間的相関が、異なる視点から明らかに実証された。
TGおよびDRGにおける逆行標識ニューロン
ラット頭蓋硬膜中のMMA領域にFG印を適用してから7日後(図3A)、FG標識ニューロンは、蛍光顕微鏡のUV照射下で直接観察されたトレーサーアプリケーションのイプシラテラ側側のTGおよび頸部DRGで検出された(図3B、C)。FG標識ニューロンは、眼科(V1)および上顎(V2)分裂に高濃度のTGの3つの枝すべてで発見され、下顎除管(V3)の少ない(図3B)。一方、FG標識ニューロンの一部は、C2-3 DRGでも観察された(図3C)。
さらに、TGおよび頸部DRGのセクションにFGおよびCGRPを用いて二重免疫蛍光も行った。TGおよびDRGにおけるCGRP免疫反応性ニューロンの直径によると、それらの大部分は主に小径および中径の感覚ニューロン(<50 μm)に見られた。これらのタイプのCGRP免疫反応性ニューロンの一部は、TGおよびC2-3 DRGにおいてFGで標識され、頭蓋硬膜中のCGRP免疫反応性神経線維がTGおよびDRGにおける感覚ニューロンのこれらの亜集団から生じたことを示す(図4)。
図1: 本研究における主な実験図の写真( A) 頭皮の正中線に沿った切開法(B) 頭蓋頭蓋の上に穴が開き、中髄動脈(MMA)を示す。(C)頭蓋骨の硬膜にトレーサーを塗布するための歯科ケイ酸塩セメントで囲まれた穴の周りの小さな銀行。(D) マイクロシリンジを用いた穴へのフッ素金(FG)の適用(E) 透明な全マウントデュラマーター。(F) 三叉神経節(TG)の外見。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性神経線維とファロイジン(Pha)標識細動脈との相関(A)透明な全実装デュラマーター(B)全体マウントのデュラマーを平らにしてスライドに取り付けた。(C) 中髄膜動脈(MMA)に沿ったCGRP免疫反応性神経線維およびPha標識血管の分布。(D,E)パネルCのdとeの同じ領域からの拡大写真(F) 3Dパターンのフレームを持つパネルEからの拡大および調整された画像。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:3叉神経節(TG)および子宮頸部(C)の頸部根神経節(DRG)における蛍光金(FG)標識ニューロンのUV照射下における分布(A)FG応用による硬膜の領域。(B)眼科(V1)、上顎(V2)、およびTGの下顎(V3)枝におけるFG標識ニューロンの分布。(C) C2 DRGに分布するFG標識ニューロンの分布この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:蛍光基底(FG)とカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)を用いた二重免疫蛍光を用いた三叉神経節(TG)および頸部底根神経節(DRG)における標識された感覚ニューロンを示す代表的な写真(A、B)FGを有する標識ニューロン、 また、FGとCGRPの両方をそれぞれ赤、緑、黄色で示し、それぞれTG(A)およびDRG(B)で実証した。(A1-B1)、(A2-B2):パネルA及びBは、FG標識(A1、B1)およびCGRP標識(A2、B2)とを別々に示した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究では、免疫蛍光、3D再構成、および神経トレーサーによる神経トレーサによる脳神経障害におけるCGRP免疫反応性神経線維の分布と起源を実証し、神経血管網の理解を深める組織学的および化学的証拠を提供した。
それが知られていたように、CGRPは片頭痛4、17の病因において重要な役割を果たしている。増加したCGRPは、3叉経路4,18に沿って末梢および中枢感作を引き起こす血管拡張および神経原性炎症を引き起こす可能性があることを示した。CGRP免疫反応性神経線維は、切欠性信号の輸送を担う非髄形成ペプチド作動性感覚軸索19に属する。これまでの研究と一致しており、ここでは頭蓋硬膜中のCGRP-免疫反応性神経線維の分布を明確に実証し、TGおよびDRGの中径および中径の感覚ニューロンからその起源を追跡した。これらの細胞構造は、CGRPを合成および放出するためのソースとなり得る。一方、ファロイジンは、平滑筋細胞や内皮細胞に豊富な糸状アクチン(F-アクチン)に対する特異的プローブです。適切な候補として、ファロイジンは血管構造および結合組織10,20,21に標識するために使用された。我々の最近の研究は、アルファ平滑筋アクチンおよびCD31とは対照的に、ファロイジンは、硬膜動脈を染色するためのより信頼性が高く、感受性であり、脳神経血管ネットワークを詳細に示すためにCGRPと組み合わせるのに最適であることを示している。
ニューラルトラクトトレース技術は、神経の起源と終了を調査するための重要なツールです。本研究では、FGを、頭蓋硬膜中のCGRP免疫反応性神経線維の起源を逆行トレースするために用いた。頭蓋デュラの合膜は薄膜であるため、注射方法ではトレーサーを簡便に塗布することはできません。その代わり、FGは、以前に導入された方法に従って頭蓋硬膜のMMA周辺領域に直接追加されましたが、硬膜をそのまま維持するために注意する必要があります。また、隣接組織へのFGの漏出を防ぐための努力がなされました。FG標識は水銀灯24のUV照明下で直接観察することができるので、このアプローチにより、我々はFGアプリケーションの部位をチェックした。神経伝播以外にも、FGは周囲の組織を汚染することなく歯科ケイ酸塩セメントで囲まれた領域で制限されていたことが分かった。もう一つの利点は、FG標識ニューロンがFG抗体と共に免疫蛍光を用いて期待される色で染色することもできるということで、他のバイオマーカー14、15、16と併用することがより便利になる。この研究を通じて、FGは、硬膜内膜を逆行トレースするのに適しているだけでなく、FG標識ニューロンの化学的特性を決定するためのCGRPと結合する適切な候補でもあることを証明した。
ここで注目すべきは、この方法は、若い動物に好適に用いられる。ラットの初期段階では、頭蓋硬膜は全体のマウントスタイルでより透明です。この特徴は、さらに透明な治療をせずに3Dパターンで頭蓋硬膜の神経血管構造を視覚化することをより便利にする。
要約すると、本研究は、TGおよび頸部DRGの感覚ニューロン、特にCGRP免疫反応性発現を有する小径および中径感覚ニューロンのサブタイプからの頭蓋硬膜の内インナーブを効果的に探求するための貴重なアプローチを提供する。方法論の観点から、それはさらに頭蓋硬膜の神経線維の他の種類、ならびにそれらの起源を調査するための貴重な参考文献を提供するかもしれない。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国家キーR&Dプログラム(プロジェクトコード番号2019YFC1709103;No.2018YFC1707804)と中国国立自然科学財団(プロジェクトコード番号81774211;no.81774432;no.818015611)のプロジェクトによって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
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