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Biochemistry

लिपिड-बाउंड प्रोटीन और एलर्जेंस से एंडोजेनस लिगांड को हटाना और प्रतिस्थापन

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/61780
Automatic Translation
1, 1, 1
1Nuclear Magnetic Resonance Group, National Institute of Environmental Health Sciences

Summary

यह प्रोटोकॉल एलर्जी से अंतर्जात लिपिड को हटाने और रिवर्स-फेज एचपीएलसी के माध्यम से उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट लिगामेंट्स के साथ उनके प्रतिस्थापन का वर्णन करता है। 31 पी-एनएमआर और परिपत्र डिक्रोमिज़्म लिगांड हटाने/लोडिंग की तेजी से पुष्टि और देशी एलर्जी संरचना की वसूली के लिए अनुमति देते हैं।

Abstract

कई प्रमुख एलर्जी हाइड्रोफोबिक लिपिड जैसे अणुओं से बांधते हैं, जिनमें मस एम 1, बेट वी 1, डेर पी 2 और फेल डी 1 शामिल हैं। इन लिगामेंट्स को दृढ़ता से बनाए रखा जाता है और संवेदीकरण प्रक्रिया को सीधे प्रतिरक्षा प्रणाली को उत्तेजित करने या एलर्जिक प्रोटीन के जैव भौतिक गुणों में फेरबदल करने की क्षमता होती है। इन चरों को नियंत्रित करने के लिए, अंतर्जात रूप से बंधे लिगामेंट्स को हटाने के लिए तकनीकों की आवश्यकता होती है और यदि आवश्यक हो, तो ज्ञात संरचना के लिपिड के साथ प्रतिस्थापन। तिलचट्टा एलर्जेन बला जी 1 एक बड़ी हाइड्रोफोबिक गुहा को संलग्न करता है जो पारंपरिक तकनीकों का उपयोग करते हुए शुद्ध होने पर अंतर्जात लिपिड के विषम मिश्रण को बांधता है। यहां, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जिसके माध्यम से इन लिपिड को रिवर्स-फेज एचपीएलसी का उपयोग करके हटा दिया जाता है जिसके बाद थर्मल एनीलिंग द्वारा अपने एपो-फॉर्म में बला जी 1 उपज या फैटी एसिड या फॉस्फोलिपिड कार्गो के उपयोगकर्ता-परिभाषित मिश्रण के साथ फिर से लोड किया जाता है। जैव रासायनिक परख के साथ इस प्रोटोकॉल युग्मन से पता चलता है कि फैटी एसिड कार्गो काफी टी सेल epitope पीढ़ी और एलर्जी की दर के लिए डाउनस्ट्रीम निहितार्थ के साथ, बीएलए जी 1 के थर्मोसिटी और प्रोटियोलिटिक प्रतिरोध को बदल देते हैं। ये परिणाम लिपिड हटाने/रीलोडिंग प्रोटोकॉल के महत्व को उजागर करते हैं जैसे कि यहां वर्णित जब दोनों पुनः संयोजन और प्राकृतिक स्रोतों से एलर्जी का अध्ययन करते हैं । प्रोटोकॉल लिपोकलिन (मस एम 1), पीआर-10 (बेट वी 1), एमडी-2 (डेर पी 2) और यूट्रोग्लोबिन (फेल डी 1) सहित अन्य एलर्जी परिवारों के लिए सामान्य रूप से महत्वपूर्ण है, जो एलर्जी प्रतिक्रिया में लिपिड की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

एलर्जेन डेटाबेस के एक सर्वेक्षण से पता चलता है कि एलर्जी सभी ज्ञात प्रोटीन परिवारों के केवल 2% में पाई जाती है, आम कार्यात्मक और जैव भौतिक गुणों का सुझाव देता है जो एलर्जी1में योगदान देते हैं। इन गुणों में से, लिपिड कार्गो को बांधने की क्षमता एलर्जी के बीच दृढ़ता से अधिक प्रतिनिधित्व करती प्रतीत होती है, यह सुझाव देते हुए कि ये कार्गो संवेदीकरण प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं1। दरअसल, यह दिखाया गया है कि ब्राजील अखरोट एलर्जी Ber ई 1 अपने अंतर्जात लिपिड के साथ सह प्रशासन की आवश्यकता को अपनी पूरी संवेदनशील क्षमता2 काएहसास । ये लिपिड संभवतः प्रतिरक्षा प्रणाली को सीधे उत्तेजित कर सकते हैं जैसा कि पतंग एलर्जी डेर पी 2 और डेर पी 7 द्वारा दर्शाया गया है, जिनमें से दोनों एलपीएस-बाध्यकारीप्रोटीन3,4,5के साथ एक मजबूत संरचनात्मक होमोलॉजी साझा करते हैं। इस अवलोकन के आधार पर यह प्रस्ताव किया गया था कि डर्प 2 और डेर पी 7 बैक्टीरियल लिपिड को बांध सकते हैं और सीधे टीएलआर 4-मध्यस्थता सिग्नलिंग के माध्यम से मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रोत्साहित कर सकते हैं, जिससे संवेदीकरण प्रक्रिया5,6को सुविधाजनक बनाया जा सकता है। यह भी संभव है कि अंतर्जात रूप से बंधे लिपिड एलर्जी प्रोटीन के जैव भौतिक गुणों को बदल सकते हैं। उदाहरण के लिए, फॉस्फोलिपिड वेसिकल्स के साथ बातचीत करने के लिए पाप ए 2 (सरसों) और आरा एच 1 (मूंगफली) की क्षमता ने गैस्ट्रिक और एंडोसोमल क्षरण7के प्रति उनके प्रतिरोध को काफी बढ़ाया, जबकि प्रमुख बर्च पराग एलर्जेन बेट वी 1 के लिए बाध्यकारी लिगांड ने एंडोसोमल प्रसंस्करण की दर और परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स8की विविधता दोनों को बदल दिया। यह विशेष रूप से स्थिरता, टी-सेल एपिटोप जनरेशन और बेट वी 1 और बीएलए जी 1 जैसे प्रोटीन के लिए एलर्जी के बीच मनाया गया सहसंबंध को देखते हुए एलर्जी के लिए प्रासंगिक है; जिनमें से बाद इस काम का विषय होगा9,10.

बला जी 1 कीट मेजर एलर्जेन (एमए) प्रोटीन परिवार के प्रोटोटाइप सदस्य का प्रतिनिधित्व करता है, और 12 एम्फीपैथिक अल्फा हेलीस से बना एक अद्वितीय संरचना है जो असामान्य रूप से बड़े हाइड्रोफोबिक गुहा9,11को संलग्न करता है। बीएलए जी 1 की उपलब्ध एक्स-रे क्रिस्टल संरचना इस गुहा के भीतर इलेक्ट्रॉन घनत्व दिखाती है जो बाउंड फॉस्फोलिपिड या फैटी एसिड लिगामेंट्स के अनुरूप है; 31पी-एनएमआर और मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पुष्टि की गई अनुमान। ये कार्गो प्रकृति में विषम थे और उनकी संरचना एलर्जी स्रोत पर भारी निर्भर थी, जिसमें ई कोलाई और पी पादरीमें व्यक्त किए गए पुनर्संयोजन ब्ला जी 1 के लिए विभिन्न लिपिड प्रोफाइल मनाए गए थे। मजे की बात है, बला जी 1 अपने प्राकृतिक एलर्जी स्रोत (तिलचट्टा फ्रास) से शुद्ध होता है, जिसमें मुख्य रूप से फैटी एसिड होते हैं, जिसमें पामिट, ओलेट और स्टीरेट के मिश्रण को इसके "प्राकृतिक" लिगांड9,11के रूप में पहचाना जाता है। कई शुद्धिकरण चरणों के बाद लिपिड और फैटी एसिड को बनाए रखने के लिए बला जी 1 की क्षमता अलगाव में प्रोटीन का अध्ययन करने के प्रयासों में बाधा डालती है। इसके विपरीत, यह सुझाव दिया गया है कि बीएलए जी 1 (अब से एनएमआईएक्स के रूप में संदर्भित) के प्राकृतिक पल्मिटेट, स्टेरेट, और ओलेट लिगांड अपनी एलर्जी और देशी जैविक समारोह9दोनों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, ये लिगामेंट्स रीकॉम्बिनेंट स्रोतों से प्राप्त बीएलए जी 1 में मौजूद नहीं हैं, जिससे इस परिकल्पना का आकलन करना मुश्किल हो जाता है। इसी तरह के मुद्दे अन्य लिपिड बाइंडिंग एलर्जी जैसे बेट वी1 12,13के लिए देखे गए हैं । लिपिड-एलर्जेन इंटरैक्शन के व्यवस्थित अध्ययन को सुगम बनाने के लिए हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसके माध्यम से एलर्जी को मात्रात्मक रूप से उनके अंतर्जात लिपिड से छीन लिया जा सकता है और या तो एपो-फॉर्म में पुनर्गठित किया जा सकता है या विशिष्ट लिगांड से भरा हुआ है।

एलर्जेंस को आमतौर पर आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी और/या आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके उनके प्राकृतिक या पुनर्संयोजन स्रोतों से शुद्ध किया जाता है । यहां, हम उच्च प्रदर्शन वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) के रूप में एक अतिरिक्त शुद्धिकरण कदम पेश करते हैं, जिसमें रिवर्स-फेज C18 कॉलम को नियोजित किया गया है, जिसमें से एलर्जी को फैटी एसिड बाइंडिंग प्रोटीन14के लिए विकसित प्रोटोकॉल के समान एक कार्बनिक विलायक में शामिल किया गया है। परिणामस्वरूप प्रोटीन तो फैटी एसिड और/या फॉस्फोलिपिड की अनुपस्थिति या उपस्थिति में एक थर्मल एनीलिंग कदम के अधीन है । देशी बला जी 1 गुना ठीक करने के अलावा, ऊंचा तापमान लिपिड कार्गो की घुलनशीलता और पहुंच में वृद्धि करता है, या तो एपो-फॉर्म में बला जी 1 उपज या वांछित हाइड्रोफोबिक लिगामेंट से समान रूप से भरा हुआ है। 31 इस तरह से शुद्ध बीएलए जी 1 के पी-एनएमआर स्पेक्ट्रा ने वांछित यौगिकों के साथ अंतर्जात रूप से बंधे लिगामेंट्स और समान प्रतिस्थापन को पूरी तरह से हटाने की पुष्टि की, जबकि परिपत्र डिक्रोवाद ने बला जी 1 गुना की सफल वसूली की पुष्टि की। इस विधि की उपयोगिता को हाल के एक काम में रेखांकित किया गया है जिसमें कार्गो बाइंडिंग को बला जी 1 थर्मोस्थेबिलिटी और प्रोटियोलिटिक प्रतिरोध को बढ़ाने के लिए पाया गया था, जो संवेदीकरण और एलर्जी9के संभावित प्रभावों के साथ टी-सेल एपिटोप उत्पादन की गतिज में फेरबदल करता था।

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Protocol

1. बला जी 1 क्लोनिंग

  1. तिलचट्टा एलर्जेन बला जी 1.0101 (अवशेष 34-216) के लिए जीन प्राप्त करें, जो एमए डोमेन के एक दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है। सादगी के लिए, बला जी 1 पूरे बला जी 1.0101 प्रतिलिपि के बजाय, इस एकल दोहराने का प्रतिनिधित्व करने के लिए पूरे काम में इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. वांछित वेक्टर में बला जी 1 जीन को उपक्लोन करें। इस अध्ययन में, एक एन-टर्मिनल ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेज (जीएसटी) टैग युक्त जीन को तंबाकू वक़्तूस वायरस (तेवी) प्रोटीज क्लीवेज साइट को अभिव्यक्ति के लिए एक पीजीईएक्स वेक्टर में डाला गया था जैसा कि पहले11वर्णित है ।
  3. बीएलए जी 1 पीजीईएक्स वेक्टर को BL21 DE3 ई. कोलाई कोशिकाओं में बदलें।
    1. वांछित वेक्टर का 10 एनजी/माइक्रोन स्टॉक तैयार करें।
    2. निर्माता द्वारा प्रदान की गई BL21 DE3 कोशिकाओं के 50 माइक्रोन के साथ 10 एनजी/μL डीएनए स्टॉक के 1 μL गठबंधन करें।
    3. बर्फ पर 30 मिनट के लिए Incubate BL21 DE3-डीएनए मिश्रण । 1 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान करने के लिए स्थानांतरित करें, फिर तुरंत अतिरिक्त 1 मिनट इनक्यूबेशन के लिए बर्फ पर वापस स्थानांतरित करें।
    4. कोशिकाओं में एलबी मीडिया के 200 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    5. प्लेट एलबी-एगर प्लेटों पर 100 मिलीग्राम/एल एम्पीसिलिन वाली बदली हुई कोशिकाएं रात भर 37 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि होती हैं।

2. प्रारंभिक अभिव्यक्ति और शुद्धि

  1. एलबी मीडिया के 1 एल 1.3 में वर्णित बीएल जी 1 वेक्टर के साथ बदल BL21 DE3 कोशिकाओं की एक कॉलोनी के साथ 100 मिलीग्राम/ रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें।
  2. अगले दिन, फसल कोशिकाओं (OD600 ~ 1.5) अपकेंद्रित्र के माध्यम से 10 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर और 2x YT मीडिया के 2 एल में resuspend 100 मिलीग्राम/ कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 1 घंटे के लिए एक ओडी600 > 0.6 तक बढ़ने दें।
  3. 0.5 mM आईपीटीजी के अलावा के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करें। कोशिकाओं को 18 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें और रात भर इनक्यूबेट करें।
  4. अगले दिन, फसल कोशिकाओं के रूप में २.२ में वर्णित है । परिणामस्वरूप सेल गोली को -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. लाइसिस बफर (50 m Tris-HCl पीएच 8.5, 100 mm NaCl) के 50 मिलीएल में संस्कृति के 1 एल से प्राप्त Resuspend गोली जिसमें 1 प्रोटीज अवरोधक गोली (या समकक्ष) और बेंजोनासे नाभिक के 1 माइक्रोन युक्त।
  6. 50% शुल्क चक्र के साथ 4 मिनट के लिए 30-50% बिजली के लिए सेट जांच सोनिकेटर (500 डब्ल्यू, 20 kHz) का उपयोग करके Lyse कोशिकाएं। सोनीफिकेशन के दौरान आइस बाथ में lysate रखें
  7. 20 मिनट के लिए 45,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज lysate। अघुलनशील अंश (गोली) को त्यागें।
    1. घुलनशील प्रोटीन के 28 माइक्रोन निकालें। 5x SDS-पेज बफर के 7 माइक्रोन के साथ गठबंधन और SDS-पेज विश्लेषण के लिए स्टोर । टीईवी के साथ इनक्यूबेशन से पहले और बाद में जीएसटी कॉलम फ्लो-थ्रिव, वॉश और एल्यूशन अंशों के लिए इस कदम को दोहराएं।
  8. पीबीएस पीएच 7.4 में घुलनशील प्रोटीन (सुपरनिट) को ग्लूटाथिएक राल कॉलम (~ 10 एमएल कुल बिस्तर की मात्रा) पर लागू करें।
  9. पीबीएस के 50 एमएल का उपयोग करके किसी भी अनबाउंड प्रोटीन को धो लें।
  10. एल्यूट जीएसटी-बला जी 1 पीबीएस के 50 एमएल का उपयोग करके जिसमें 10 एमएम कम ग्लूटाथिएक होता है।
  11. जीएसटी टैग को हटाने के लिए रात 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 किलोवाट तेव प्रोटीज के साथ इनक्यूबेट प्रोटीन या 6 घंटे के लिए कमरे का तापमान।

3. रिवर्स चरण एचपीएलसी के माध्यम से अंतर्जात लिपिड हटाने

  1. क्लीवेड बला जी 1 को इकट्ठा करें और <10 केडीए आणविक वजन कट-ऑफ के साथ एक अपकेंद्रित्र फिल्टर इकाई का उपयोग करके इसे ~ 2 एमएल पर केंद्रित करें।
    1. <12 एमएल का नमूना एक स्विंग-बकेट रोटर में 10-15 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर ध्यान केंद्रित और स्पिन के शीर्ष पर जोड़ें।
      नोट: नमूना मात्रा और स्पिन गति विशिष्ट फ़िल्टर और नियोजित रोटर के प्रकार के आधार पर भिन्न होगी। उपयोग करने से पहले निर्माता दस्तावेज से परामर्श करें।
  2. 97% बफर ए (पानी, 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड) और 3% बफर बी (एसीटोनिट्रिल, 0.1% ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड) के साथ बराबर सी 18 रिवर्स-फेज क्रोमेटोग्राफी कॉलम से लैस 250 x 10 मिमी एचपीएलसी सिस्टम पर ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: छोटे स्तंभों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन प्रोटीन को कम बाध्यकारी क्षमता को समायोजित करने के लिए कई चक्रों का उपयोग करके लोड और eluted किया जा सकता है । कॉलम का चयन करते समय यह सुनिश्चित करें कि राल के मोतियों में प्रोटीन आकार के अणुओं के प्रभावी पृथक्करण की अनुमति देने के लिए >200 Å के < 5 माइक्रोन और ताकना आकार का कण आकार है
    सावधानी: ट्राइफ्लोरोएकेटिक एसिड अत्यधिक संक्षारक है और उचित पीपीई (यानी, नाइट्राइल दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और चश्मे) का उपयोग करके एक धुएं हुड के भीतर तिरस्कृत किया जाना चाहिए। एसीटोनीट्रिल दोनों मामूली विषाक्त, अस्थिर, और अत्यधिक ज्वलनशील है, उचित पीपीई (यानी, नाइट्राइल दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और चश्मे) का उपयोग करके एक धुएं हुड के भीतर उपयोग किया और तिरस्कृत किया जाना चाहिए।
  3. एल्यूट बला जी 1.5-4.0 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर तालिका 1 में दिखाए गए प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए। 280 एनएम पर फ्लोरेसेंस अवशोषण का उपयोग करके एल्यूशन प्रक्रिया की निगरानी करें।
    1. इकट्ठा करें और पूल बला जी 1 अंश। बला जी 1 सामान्य रूप से >74% बफर बी, या ~ 34-40 मिनट पर elutes।
      नोट: एलयूशन समय प्रवाह दर या कॉलम आकार के आधार पर थोड़ा भिन्न होगा। सर्वश्रेष्ठ परिणामों के लिए ए280 के आधार पर अंश एकत्र करें।
समय (न्यूनतम) बफर ए (%) बफर बी (%)
0 97 3
10 97 3
25 35 65
55 5 95
65 5 95
70 97 3

तालिका 1: बला जी 1 के लिए एल्यूशन प्रोटोकॉल। सी 18 एचपीएलसी कॉलम का उपयोग करके बला जी 1 के अलगाव में नियोजित एल्यूशन ढाल को दर्शाती तालिका।

  1. नमूना को ग्लास टेस्ट ट्यूब में अलीकोट करें, आधे रास्ते (~ 4 एमएल) से अधिक टेस्ट ट्यूब नहीं भरें। पैराफिन फिल्म के साथ ट्यूबों को कवर करें और वेंटिंग की अनुमति देने के लिए दो छेद के साथ कवर को छिद्रित करें।
    1. एक अलग 1 एमएल एलिकोट (टेस्ट एलिकोट) तैयार करें। इसका उपयोग अपेक्षित उपज निर्धारित करने के लिए किया जाएगा।
  2. नमूनों को फ्रीज करें और 1 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखकर, या तरल नाइट्रोजन में विसर्जन करके अलीकोट का परीक्षण करें। बाद के मामले में, ठंड पर तरल चरण के विस्तार के कारण टेस्ट ट्यूब टूटने से बचने के लिए ट्यूब को लगातार घुमाया जाना चाहिए।
  3. एक लियोफिलाइजर का उपयोग करके परिणामी डिलीपिड प्रोटीन नमूनों को सुखाएं। सूखे प्रोटीन को सीलबंद कंटेनर में कई महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

4. एपीओ और कार्गो से भरे बला जी 1 का पुनर्गठन

  1. प्रत्याशित बला जी 1 उपज का निर्धारण करें।
    1. रीस्पेंड ल्योफिलाइज्ड, डेलीपिप्टेड (पोस्ट-एचपीएलसी) टेस्ट एलिकोट में 5 एमएल में रिफोल्डिंग बफर, (50 एमएम एचईपीईपीएच 7.4, 100 एमएम एनएसीएल, 2% डीएमएसओ)।
    2. एक पानी स्नान में मिश्रण गर्म (500 मिली बीकर 250 मिलीएल पानी के साथ और एक गर्म थाली पर बार हलचल) 95 डिग्री सेल्सियस करने के लिए। भंवर समाधान रुक-रुककर और 0.5-1 घंटे के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    3. गर्मी निकालें और धीरे-धीरे पानी स्नान कमरे के तापमान (~ 1 घंटे) के लिए बराबर कर देते हैं। जरूरत पड़ने पर एनील्ड प्रोटीन को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इस रूप में संग्रहित किया जा सकता है।
    4. पार्टिकुलेट मैटर को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से एनील्ड बला जी 1-लिपिड मिश्रण पास करें।
    5. बफर अवशिष्ट मुक्त फैटी एसिड और कार्बनिक विलायक को हटाने के लिए 3.1 में चर्चा के रूप में 10 केडीए कटऑफ के साथ एक अपकेंद्रित्र फिल्टर का उपयोग कर पीबीएस पीएच 7.4 में फ़िल्टर प्रोटीन 3x विनिमय।
    6. बीसीए परख या यूवी अवशोषण जैसे अन्य पसंदीदा विधि का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करें। शेष बला जी 1 aliquots के लिए प्रत्याशित उपज निर्धारित करने के लिए इसका उपयोग करें।
  2. पुनर्गठन एपीओ- या कार्गो-लोडेड बला जी 1
    1. 4.1.1 में वर्णित बफर को फिर से बनाने में 1 एलिकोट्स को फिर से खर्च करें।
    2. एपो-बला जी 1 का उत्पादन करने के लिए, वांछित उपज प्राप्त करने के लिए 4.1.2-4.1.6 कदम दोहराएं।
    3. फैटी एसिड के साथ बीएलए जी 1 लोड करने के लिए, मेथनॉल या डीएमएसओ में वांछित फैटी एसिड कार्गो के 20 एमएमएम स्टॉक समाधान तैयार करें।  फिर, 4.2.5 कदम करने के लिए छोड़ दें।
    4. फास्फोलिपिड्स के साथ बला जी 1 लोड करने के लिए, एक ग्लास टेस्ट ट्यूब के अंदर क्लोरोफॉर्म में वांछित कार्गो का 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक तैयार करें।
      1. लिपिड फिल्म का निर्माण करने के लिए क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करें। 20 mm की अंतिम फॉस्फोलिपिड एकाग्रता का उत्पादन करने के लिए परीक्षण ट्यूब में पीबीएस जोड़ें।
        सावधानी: अगर साँस लिया जाता है या निगल लिया जाता है तो क्लोरोफॉर्म हानिकारक है। एक रासायनिक धुएं हुड में उपयोग करें या यदि अपर्याप्त वेंटिलेशन उपलब्ध है तो श्वसन यंत्र। हैंडलिंग करते समय नाइट्रिल दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और चश्मे को नियोजित करें। उपयोग करने से पहले एमएसडीएस से परामर्श करें।
      2. लिपिड कार्गो के चरण संक्रमण तापमान से ऊपर गर्म करके लिपिड फिल्म को फिर से हाइड्रेट करें और जब तक समाधान बादल नहीं हो जाता है तब तक भंवर। ध्यान दें कि कुछ कार्गो को पूरी तरह से पुन: रीसुस्पेंड और रीहाइड्रेट करने के लिए सोनीशन की आवश्यकता हो सकती है।
      3. यदि सोनीशन की आवश्यकता है, तो टेस्ट ट्यूब को बाथ सोनिकेटर (100 डब्ल्यू, 42 किलोहर्ट्ज) में रखें और कार्गो को पुनः निलंबित होने तक अधिकतम शक्ति पर सोनिकेट करें। वैकल्पिक रूप से, एक जांच सोनिकेटर (2.6 में वर्णित) का उपयोग 50% शुल्क चक्र के साथ 10-20% बिजली का किया जा सकता है।
        चेतावनी: सोनीशन उच्च आवृत्ति ध्वनि तरंगों को रोजगार देता है जो सुनवाई को नुकसान पहुंचा सकता है। शोर दबाने वाले पीपीई (इयरप्लग या मफलर) को नियोजित करें। यदि संभव हो, तो ध्वनि-गीला कैबिनेट या कक्ष के अंदर सोनिकेटर रखें।
    5. 4.1 में निर्धारित प्रत्याशित उपज के आधार पर बला जी 1 के सापेक्ष लिगांड की 20x मोलर अतिरिक्त उत्पादन करने के लिए वांछित फैटी एसिड या फॉस्फोलिपिड कार्गो जोड़ें। इस चरण में जोड़े गए ऑर्गेनिक सॉल्वेंट की कुल मात्रा 2% से अधिक नहीं होनी चाहिए। भंवर मिश्रण करने के लिए।
      नोट: बीएल 21 डीई 3 कोशिकाओं के 1 एल आम तौर पर ~ 0.25-0.4 nmol प्रोटीन, प्रति ट्यूब ~ 400 μM ligand के अनुरूप पैदावार।
    6. 4.1 में वर्णित प्रोटीन एनील।

5. 31पी-एनएमआर के माध्यम से फॉस्फोलिपिड कार्गो हटाने/लोडिंग की पुष्टि

  1. 3.1 में वर्णित अपकेंद्रित्र फिल्टर यूनिट का उपयोग करके एपीओ-या कार्गो-लोडेड बला जी 1 से >100 माइक्रोनएम के नमूनों को केंद्रित करें।
  2. पीबीएस बफर में 2, 1.5, 1, 0.5, और 0.25 m M की अंतिम सांद्रता के लिए रिहाइड्रेट संदर्भ फॉस्फोलिपिड।
  3. पतला नमूने 1:1 कोलेट बफर (100 m Tris पीएच 8.0, 100 mm NaCl, 10% w/v cholate) के साथ ~ 600 μL की कुल मात्रा के लिए।
    नोट: Cholate इस कदम में पूरी तरह से निकालने और बला जी 1 हाइड्रोफोबिक गुहा से लिपिड को घुलनशील करने के लिए कार्यरत है । यह सुनिश्चित करता है कि फॉस्फोलिपिड हेडग्रुप के आसपास का रासायनिक वातावरण विभिन्न नमूनों के बीच सुसंगत है, जो 31पी-एनएमआर का उपयोग करके इसके मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है। कोलेट के उपयोग को क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है जैसा कि पहले15वर्णित है ।
  4. ब्रॉडबैंड जांच का उपयोग करके कोलेट-घुलोबिलाइज्ड बला जी 1 नमूनों और संदर्भ फॉस्फोलिपिड मानकों के 1D 31पी-एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त करें।
    नोट: इस काम में प्रस्तुत 31पी-एनएमआर स्पेक्ट्रा को 600 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। हालांकि, इसी तरह की तकनीकों को नियोजित करने वाले पिछले अध्ययनों से पता चलताहै कि 150-200 मेगाहर्ट्ज 15 के रूप में कम क्षेत्रों की ताकत पर स्वीकार्य संवेदनशीलता हासिल की जा सकती है ।
  5. उपयुक्त सॉफ्टवेयर16का उपयोग करके परिणामी डेटा को संसाधित करें ।
  6. पसंदीदा एनएमआर देखने के सॉफ्टवेयर17का उपयोग करके अधिकतम तीव्रता प्राप्त करें ।
  7. बला जी 1 31पी-एनएमआर स्पेक्ट्रा की तुलना फॉस्फोलिपिड संदर्भ नमूनों के लिए प्राप्त करने वालों से करें ताकि दृश्यमान चोटियों (या उसके अभाव) के रासायनिक बदलावों के आधार पर अंतर्जात रूप से बंधे लिगांड और/या वांछित लिगांड को हटाने की पुष्टि की जा सके ।
    1. फास्फोलिपिड संदर्भ मानकों के लिए बला जी 1 स्पेक्ट्रम की चोटी की तीव्रता की तुलना करके पूर्ण बाध्यकारी stoichiometry की पुष्टि करें।

6. बला जी 1 तह की पुष्टि

  1. सीडी बफर में बीएलए जी 1 के 0.5 माइक्रोनएम नमूने तैयार करें (100 एमएम केएच2पीओ4,बफर पीएच 7.5)। चुंबकीय हलचल बार के साथ एक 10 मिमी सीडी क्यूवेट में नमूने के 2 एमएल लोड करें।
  2. माध्यमिक संरचना के पुनर्गठन की पुष्टि करने के लिए बीएलए जी 1 के सीडी स्पेक्ट्रम को मापें। सुनिश्चित करें कि फोटोमल्टीप्लायर (पीएमटी) वोल्टेज निर्माता सिफारिशों (आम तौर पर 1 केवी) से अधिक नहीं है।
    1. 0.2 एनएम के डेटा पिच के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 260-200 एनएम से सीडी सिग्नल और 1 एस के डेटा एकीकरण समय के साथ 20 एनएम/एस की स्कैन दर को मापें।
  3. सीडी सेल में तापमान 05 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम की दर से 25 डिग्री सेल्सियस-95 डिग्री सेल्सियस से बढ़ाएं। यह सुनिश्चित करने के लिए चुंबकीय हलचल बार को सक्रिय करें कि नमूना भर में तापमान एक समान है।
  4. 222 एनएम पर सीडी की निगरानी करें, हर 2 डिग्री सेल्सियस रीडिंग ले रहे हैं।
  5. पिघलने के तापमान को निर्धारित करने के लिए 2-राज्य बोल्ट्ज़मैन वक्र के परिणामस्वरूप डेटा फिट करें। बीएलए जी 1 की उच्च स्थिरता के कारण, पिघलने के तापमान (एमटी25)को उस तापमान के रूप में परिभाषित किया गया था जिस पर प्रोटीन ने अपनी प्रारंभिक सीडी का 25% 222 एनएम खो दिया है।

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Representative Results

एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके, पुनः संयोजन जीएसटी-बला जी 1 को आसानी से उच्च स्तर की शुद्धता(चित्रा 1 ए)में अलग कर दिया गया था, जो सेल संस्कृति के ~ 2-4 मिलीग्राम/एल की उपज का उत्पादन करता था। रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर TEV प्रोटीज के साथ इनक्यूबेशन जीएसटी टैग को हटाने के लिए पर्याप्त है, ~24 केडीए पर अंतिम उत्पाद उपज। ध्यान दें कि इस उदाहरण में प्रवाह के माध्यम से और धोने के अंशों में जीएसटी-बला जी 1 की एक महत्वपूर्ण राशि है, जिसमें ग्लूटाथिएक राल बाध्यकारी क्षमता को पार करने का सुझाव दिया गया था। नमूना लोडिंग और उन्मूलन के अधिक राल या कई चक्रों का उपयोग इस समस्या के लिए उपाय प्रदान कर सकता है।

एक रिवर्स चरण C18 कॉलम के लिए बीएलए जी 1 लागू करने से एक विशिष्ट एल्यूशन प्रोफाइल(चित्रा 1 बी)होता है, जिसमें ~ 50% बफर बी पर दो बड़ी चोटियां होती हैं, और परिणामस्वरूप अंशों के ~ 75% बफर बी एसडीएस-पेज विश्लेषण में एक दूसरी बड़ी चोटी से पता चलता है कि पूर्व क्लीव्ड जीएसटी टैग के अनुरूप है, जबकि बाद में ब्ला जी 1 से मेल खाता है। कभी-कभी एक तिहाई, छोटे शिखर अवशिष्ट, गैर-क्लीव्ड जीएसटी-बला जी 1 के अनुरूप मध्य में होते हैं। इस अन-क्लीव्ड उत्पाद की उपस्थिति को दरार प्रतिक्रिया में नियोजित TEV की मात्रा में वृद्धि या इनक्यूबेशन समय का विस्तार करके समाप्त किया जा सकता है। जबकि अधूरा दरार उपज को कम करेगा, C18 कॉलम पर प्राप्त अलगाव यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है कि अंतिम बला जी 1 उत्पाद की शुद्धता असुविधाित बनी हुई है। रिवर्स-चरण एचपीएलसी का परिणाम यह है कि अंतिम प्रोटीन उत्पाद को कार्बनिक विलायक वातावरण में शामिल किया जाता है। हालांकि यह किसी भी हाइड्रोफोबिक लिगामेंट्स को हटाने की सुविधा प्रदान करता है, लेकिन लिओफिलाइजेशन के माध्यम से इस सॉल्वेंट को हटाने की आवश्यकता होती है, जो एक शराबी सफेद पाउडर(चित्रा 1C)उपज देता है।

प्रोटीन की एनीलिंग देशी बला जी 1 गुना पुनर्गठन करने के लिए आवश्यक है और या तो अनुपस्थिति या लिपिड कार्गो की उपस्थिति में किया जा सकता है। रिवलन बफर से पहले सूखे बला जी 1 और फॉस्फोलिपिड कार्गो में डीएमएसओ के अलावा घुलनशीलता प्रक्रिया की सुविधा प्रदान करता है, हालांकि कुछ लंबी श्रृंखला लिपिड कार्गो पूरी तरह से ऊंचा तापमान पर भी भंग नहीं होंगे। हालांकि, यह हमारे अध्ययनों(चित्रा 1C)में परीक्षण किए गए लिपिड के बीच लोडिंग प्रभावकारिता को प्रभावित करने के लिए नहीं देखा गया था। इसी तरह, अतिरिक्त लिपिड अक्सर समाधान से बाहर निकलते हैं या ठंडा होने पर बड़े वेसिकल्स बनाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एनीलिंग(चित्रा 1 सी)के बाद बादल दिखने लगते हैं। यह लोडिंग दक्षता को प्रभावित करने के लिए भी नहीं देखा गया था, और किसी भी समुच्चय को स्पष्ट, पारदर्शी समाधान प्राप्त करने के लिए निस्पंदन और बाद में बफर एक्सचेंज चरणों के माध्यम से आसानी से हटा दिया जाता है। कठोर परिस्थितियों के बावजूद, बला जी 1 के लिए कोई थर्मोलिसिस नहीं देखा गया था।

Figure 1
चित्रा 1: बला जी 1 की प्रारंभिक शुद्धि। (A)एसडीएस-पेज प्रारंभिक लाइसिस (एस) के बाद घुलनशील प्रोटीन अंश दिखा रहा है; फ्लो-थ्रिल (एफटी), वॉश (डब्ल्यू), और ग्लूटाथिएक-सेफ्रॉज कॉलम (ई) से एल्यूशन; और जीएसटी टैग (TEV) के TEV दरार के बाद अंतिम बीएलए जी 1 उत्पाद। टीईवी क्लीवेज के बाद परिणामस्वरूप बीएलए जी 1 उत्पाद की एचपीएलसी एल्यूशन प्रोफाइल(बी)में दिखाया गया है। एक280 नीले रंग में दिखाया गया है, जबकि एल्यूशन ढाल (% बफर बी) हरे रंग में दिखाया गया है। क्लीव्ड जीएसटी टैग (एच 1, एच 2), अवशिष्ट अन-क्लीव्ड जीएसटी-बला जी 1 (एच 3), और शुद्ध बीएलए जी 1 (एच 4) के अनुरूप अंश क्रमशः ~ 50%, ~ 65%, और ~ 74% बफर बी पर लाल तीर के साथ इंगित किए गए हैं। एसडीएस-पृष्ठ अंशों का पृष्ठ विश्लेषण H1-H4(ए)में दिखाया गया है और तदनुसार लेबल किया जाता है। (ग)एनीलिंग प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में बीएलए जी 1 दिखाने वाले प्रतिनिधि चित्र । ध्यान दें कि द्वितीय और तृतीय में दर्शाए गए वर्षा गठन की सटीक और सीमा नियोजित लिपिड कार्गो के प्रकार पर निर्भर करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

31 एपीओ-बला जी 1 का पी-एनएमआर स्पेक्ट्रा इस तरीके से शुद्ध एनएमआर(चित्रा 2 ए)या पतली परत क्रोमोटोग्राफी (डेटा नहीं दिखाया गया) द्वारा कोई पता लगाने योग्य फॉस्फोलिपिड नहीं दिखाता है। इसके विपरीत, एक डिटेरोइलफोस्फेटिडिलकोलिन (डीएसपीसी) फॉस्फोलिपिड से भरे बला जी 1 के लिए प्राप्त इसी तरह के स्पेक्ट्रा फॉस्फेटिडिलकोलिन हेडग्रुप के अनुरूप एक मजबूत चोटी दिखाते हैं। तुलना के लिए, एक प्रतिनिधि 31पी-एनएमआर स्पेक्ट्रम बीएलए जी 1 का पुनः संयोजन ई. कोलाई से शुद्ध लिपिड हटाने/एनीलिंग प्रोटोकॉल के उपयोग के बिना यहां वर्णित (एकबला जी 1) पुनर्संयोजक अभिव्यक्ति प्रणाली(चित्रा 2B)से निकाले गए अंतर्जात लिपिड का एक विषम मिश्रण दिखाता है । एनएमआर की मात्रात्मक प्रकृति का लाभ उठाते हुए, ज्ञात डीएसपीसी सांद्रता(चित्रा 2 सी)के संदर्भ नमूनों का उपयोग करके एक मानक वक्र का उत्पादन किया जा सकता है। इस मानक वक्र के खिलाफ डीएसपीसी-बला जी 1 से प्राप्त 31पी सिग्नल तीव्रता की तुलना करने से प्रति प्रोटीन 4.7 ± 0.5 लिपिड की बाध्यकारी स्टोइचिओमेट्री होती है; एक मूल्य है कि अनुकूल भविष्यवाणी की तुलना पूर्ण बाध्यकारी स्टोइकिओमेट्री सिलिको अध्ययन और संरचनात्मक विश्लेषण9में से प्राप्त . ध्यान रहे कि इस तकनीक से केवल लिगामेंट्स का पता लगाया जा सकेगा जिसमें 31पी न्यूक्लियस जैसे फॉस्फोस्फोस्फोलिपिड्स, लाइसोफोस्फोक्लिपिड्स, लिपोपॉलिसाकराइड्स आदि होते हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को 13सी-एनएमआर विश्लेषण के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इस मामले में, मिथाइल-13सी लेबल फैटी एसिड अपने अनुकूल एनएमआर विश्राम गुणों के कारण सिफारिश की जाएगी। एक ही साइट पर आइसोटोपिक लेबलिंग को प्रतिबंधित करने से स्पेक्ट्रल व्याख्या की सुविधा भी होती है, क्योंकि केवल एक चोटी की उम्मीद होती है, जबकि साथ ही एक समान 13सी-लेबल वाले समकक्षों के सापेक्ष लागत को कम किया जाता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण बंधे लिगांड की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर कल्पना को नियोजित करना होगा, जैसा कि पिछले अध्ययन में दिखाया गया था, जिसने तिलचट्टा फ्रास (एनबला जी 1)9से अलग बीएलए जी 1 के प्राकृतिक कार्गो के रूप में फैटी एसिड के मिश्रण की पहचान की थी। हालांकि, द्रव्यमान युक्ति की सीमित मात्रा क्षमताओं ने पर्याप्त मानकों के बिना बाध्यकारी स्टोइचिओमेट्री का सटीक माप किया।

Figure 2
चित्रा 2: लिपिड हटाने और बीएलए जी 1 की लोडिंग की पुष्टि करना। (A) 31पी-एनएमआर स्पेक्ट्रा ऑफ एपीओ-(ब्लैक) या डीएसपीसी-लोडेड बीएलए जी 1 (लाल) इस काम में वर्णित एनीलिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किया गया था, जो पूर्व में लिपिड को पूरी तरह से हटाने का प्रदर्शन करता है, और बाद में प्राप्त फॉस्फेटिलकोलिन (पीसी) लिपिड की सजातीय लोडिंग । इसके विपरीत, इस विधि(बी) का उपयोग करके विश्लेषण किए जाने पर लीपाग्रिजेस फॉस्फेटिडिल इथेनोलामाइन (पीई) और फॉस्फेटिडिलग्लीसेरोल (पीजी) लिपिड का एक विषम मिश्रण दिखाता है। ज्ञात सांद्रता के डीएसपीसी संदर्भ नमूनों से प्राप्त एक प्रतिनिधि मानक वक्र(सी)में दिखाया गया है, जिसमें से बला जी 1 बाध्यकारी स्टोइचिओमेट्री प्राप्त किया जा सकता है। फू एट अल (2019) से अनुकूलित आंकड़े और क्रिएटिव कॉमन्स सीसी बाय लाइसेंस9के तहत प्रस्तुत किए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

बला जी 1 की क्रिस्टल संरचनाएं 12 एम्फीपैथिक अल्फा-हेलिक्स से मिलकर एक अद्वितीय गुना प्रकट करती हैं। परिपत्र डिक्रोमिज़्म यह आकलन करने के लिए एक त्वरित और सुविधाजनक विधि का प्रतिनिधित्व करता है कि क्या एनीलिंग प्रक्रिया के बाद इस गुना का सफलतापूर्वक पुनर्गठन किया गया है। एपीओ के लिए सीडी स्पेक्ट्रा- और लिपिड (एनएमआईएक्स) - लोडेड बला जी 1 शो मिनीमा ~ 220 और 210 एनएम मुख्य रूप से अल्फा-हेलिकल संरचना(चित्रा 3 ए)का संकेत है। यह स्पेक्ट्रम एक्बला जी 1 और एनब्ला जी 1 के लिए प्राप्त करने के समान है, जो आगे सबूत प्रदान करता है कि बला जी 1 की देशी संरचना सफलतापूर्वक बरामद की गई है। इसकी पुष्टि 19एफ और 1 एच-15एन सॉल्यूशन-एनएमआर के उपयोग के माध्यम से की गई, जिसकी पूरी चर्चा9अन्यत्र उपलब्ध है । सीडी आधारित थर्मल डेनैचेशन परखते हुए अल्फा-पेचिक माध्यमिक संरचना का सहकारी नुकसान एक जोड़ गोलाकार डोमेन(चित्रा 3B)का संकेत देता है। परिणामी पिघलने वाले तापमान(चित्रा 3सी) काविश्लेषण एनएमिक्स लिगांड बाइंडिंग पर एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाता है। यह ऊंचा थर्मोस्थेटाबिलिटी nBla जी 1 के लिए गणना के अनुरूप है, यह दर्शाता है कि हम पूरी तरह से बीएलए जी 1 की प्राकृतिक स्थिति को पुन: पेश करने में सक्षम हैं। ध्यान दें कि एकला जी 1 भी एक समान दिखाता है, यदि थर्मोस्थायता में अधिक वृद्धि नहीं होती है, तो पारंपरिक एफपीएलसी-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके शुद्ध एलर्जी के जैव भौतिक लक्षण वर्णन के साथ हस्तक्षेप करने के लिए अवशिष्ट अंतर्जात रूप से बाध्य लिपिड की क्षमता को दर्शाती है। इसके विपरीत, एलर्जेंस जैसे बला जी 1 से हाइड्रोफोबिक कार्गो को मात्रात्मक रूप से हटाने और फिर से लोड करने की क्षमता एलर्जी प्रतिक्रिया में लिपिड की भूमिका की जांच करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करती है। यहां, हम एलर्जिक प्रोटीन की संरचना, स्थिरता और एंडोसोमल प्रसंस्करण पर लिपिड कार्गो के प्रभाव की जांच करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, हालांकि अध्ययन के अन्य रास्ते पर विचार किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: बला जी 1 गुना की सफल वसूली की पुष्टि। (A)एपीओ की सीडी स्पेक्ट्रा- (काला) या एनएममिक्स-लोडेड (लाल) बीएलए जी 1 शुद्ध और यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, ~ 220 और 210 एनएम पर मिनीमा के साथ उपलब्ध एक्स-रे क्रिस्टल संरचना के अनुरूप मुख्य रूप से अल्फा-पेचिकल संरचना का संकेत है। एपीओ-और एनएममिक्स-लोडेड बला जी 1 स्पेक्ट्रा दोनों बेहद समान हैं जो बीएलए जी 1 के लिए पुनः संयोजन ई. कोलाई (एक्बला जी 1, ग्रीन) से या लिपिड हटाने और एनीलिंग प्रोटोकॉल के बिना अपने प्राकृतिक एलर्जिक स्रोत (एनबीएल जी 1, ब्लू) से शुद्ध होते हैं, आगे पूर्व में देशी संरचना की सफल वसूली का समर्थन करते हैं। (ख)एपीओ के लिए प्रतिनिधि थर्मल प्रोफाइल- (काला) और एनएमआईएक्स-लोडेड (लाल) बीएलए जी 1 एक सिग्मॉयडल कर्व सांकेतिक सहकारी खुलासा दिखा रहा है। nBla जी 1 (नीला) और एक्बला जी 1 (हरा) संदर्भ के रूप में दिखाया गया है। बीएलए जी 1 के गणना किए गए पिघलने वाले तापमान(एमटी 25)(सी)में दिखाए गए हैं। एनएमिक्स लिगांड (लाल) के बंधन में एपीओ-बला जी 1 (काला) के सापेक्ष थर्मसस्थिरता में उल्लेखनीय वृद्धि होती है। यह nBla जी 1 (नीला) के लिए मनाया प्रवृत्ति दर्पण, सुझाव है कि हम सफलतापूर्वक मूल राज्य को ठीक करने में सक्षम हैं । एकब्ला जी 1 के लिए देखी गई और भी अधिक स्थिरता एलर्जी के जैव भौतिक लक्षण वर्णन में हस्तक्षेप करने के लिए अंतर्जात रूप से बाध्य लिपिड की क्षमता पर प्रकाश डालती है। सी में प्रस्तुतएमटी 25 मान कम से कम तीन स्वतंत्र परीक्षणों से प्राप्त औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करते हैं। त्रुटि सलाखों के इसी मानक विचलन मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं। फू एट अल (2019) से अनुकूलित आंकड़े और क्रिएटिव कॉमन्स सीसी बाय लाइसेंस9के तहत प्रस्तुत किए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक बला जी 1 के लिपिड बाध्यकारी गुणों का व्यवस्थित अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। इससे कार्गो बाइंडिंग, थर्मोस्थेबिलिटी और एंडोसोमल प्रोसेसिंग के बीच एक सहसंबंध का पता चला, जिसके बाद इम्यूनोजेनिकिटी9,18के संभावित प्रभावों के साथ एक ज्ञात टी-सेल एपिटोप की पीढ़ी में कमी के साथ सहसंबद्ध था। बला जी 1 के अलावा, अन्य एलर्जी जैसे प्रू पी 3 और बेट वी 1 को मानक आत्मीयता और आकार-अपवर्जन क्रोमेटोग्राफीविधियों13, 19, 20, 21,22का उपयोग करके शुद्ध किए जाने पर अपनी अंतर्जात-बाध्य कार्गो को बनाए रखनेकेलिए दिखाया गया है। ये अनिष्ट मेहमान इन प्रोटीनों के जैव भौतिक और प्रतिरक्षा गुणों को इसी तरह से बदल सकते हैं, जिससे यहां प्रस्तुत किए गए एक जैसे पूर्ण परिसीमन सुनिश्चित करने के लिए तकनीकों की आवश्यकता पर प्रकाश डाला जा सकता है।

जबकि एलर्जी के शुद्धिकरण में रिवर्स-फेज एचपीएलसी के उपयोग को पहले2वर्णित किया गया है, इसे थर्मल एनीलिंग प्रोटोकॉल के साथ युग्मन करना प्राकृतिक और संयुक्त राष्ट्र-प्राकृतिक लिगामेंट्स की एक श्रृंखला के साथ एलर्जी का पुनर्गठन करने का असामान्य अवसर प्रदान करता है, जिससे उपयोगकर्ताओं को लिपिड-एलर्जी इंटरैक्शन की जांच करने की अनुमति मिलती है। यह थर्मल डेनैचेशन कदम दो मुख्य प्रयोजनों के लिए आवश्यक पाया गया था। सबसे पहले, थर्मल डेनैचेशन को उनके बाध्यकारी गुहाओं तक लिगांड पहुंच की सुविधा प्रदान करने की आवश्यकता होती है, जो उनकी हाइड्रोफोबिक प्रकृति के कारण, अक्सर जलीय विलायक9,22से दूर दफन हो जाते हैं। दूसरे, हाइड्रोफोबिक लिगांड जैसे फैटी एसिड और फॉस्फोलिपिड अक्सर जलीय वातावरण में रखे जाने पर मिसेल्स या वेसिकल्स जैसे बड़े सुपरामोलिकुलर संरचनाएं बनाते हैं। प्रोटीन बाइंडिंग के लिए उपलब्ध मोनोमेरिक, या "फ्री" लिगामेंट्स की एकाग्रता को महत्वपूर्ण मिसेल एकाग्रता (सीएमसी) का उपयोग करके अनुमानित किया जा सकता है। डीएसपीसी और अन्य लंबी श्रृंखला फॉस्फोलिपिड्स में एनएम रेंज में सीएमसी मान हैं, जो यह दर्शाता है कि बीएलए जी 1 बाध्यकारी के लिए वस्तुतः कोई मुफ्त लिगांड उपलब्ध नहीं है। यहां तक कि शॉर्ट चेन लिपिड और फैटी एसिड में सीएमसी कम माइक्रोन से एमएम रेंज में होता है, जो यह दर्शाता है कि इन लिगामेंट्स का एक बड़ा हिस्सा मिसेलर या बाइलेयर चरण23में रहता है। हालांकि, हमारे विकृति प्रोटोकॉल में नियोजित उच्च तापमान इन बड़े समुच्चय को फैलाता है, जिससे बाध्यकारी की सुविधा होती है। पिछले अध्ययनों ने आम तौर पर इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए लंबे समय तक इनक्यूबेशन अवधियों को नियोजित किया है। तथापि, थर्मल डेनैचिंग/एनीलिंग प्रक्रिया की कमी लोडिंग की प्रभावकारिता पर संदेह उठाती है । उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट फैटी एसिड एनालॉग 11-(डैंसिलेमिनो) दुविधा में पड़ने वाले एसिड (दाउडा) के साथ पतंग एलर्जेन डेर पी 5 को इनक्यूबेटिंग करने से बला जी 124के बराबर एक बड़ा हाइड्रोफोबिक गुहा रखने के बावजूद 0.66 की बाध्यकारी स्टोइचिओमेट्री उत्पीड हुई। इसी तरह, संयंत्र nsLTPs की बाध्यकारी विशिष्टता और उदासीनता को इस बात पर निर्भर करता है कि क्या लिपिड और प्रोटीन पहले जलीय बफर के अलावा मेथनॉल में घुलनशील हैं, यह दर्शाता है कि लिगांड और/या बाध्यकारी साइट पहुंच एक सीमित कारक25था ।

बला जी 1 के अलावा, हमने तिलचट्टे और मच्छर(ए एजिप्टी)के साथ-साथ डेर पी 2 (डेटा नहीं दिखाए गए) से कई अन्य एमए डोमेन प्रोटीन के लिए एक ही रणनीति को सफलतापूर्वक लागू किया है। हमने कहा कि दोनों बला जी 1 होमोलॉग और डेर पी 2 C18 कॉलम (चरण 3.3) से बला जी 1 की तुलना में एक अलग समय पर eluted। इस चरण में एल्यूशन ग्रेडिएंट को अन्य प्रोटीन के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।  वैकल्पिक रूप से, कम हाइड्रोफोबिक स्थिर चरण (जैसे, सी 8) के साथ एचपीएलसी कॉलम नियोजित किए जा सकते हैं, हालांकि बीएलए जी 1 के मामले में सी 18 कॉलम की बढ़ी हुई हाइड्रोफोबिकिटी को पूरी तरह से एकब्ला जी 1 से कार्डियक फॉस्फोलिपिड संदूषकों को हटाने के लिए आवश्यक था। जैव भौतिक और जैव रासायनिक गुणों में अंतर के बावजूद, हमने इस प्रोटोकॉल को बेहद मजबूत पाया है और इसे आसानी से अन्य एलर्जिक प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है। जबकि नियोजित कठोर परिस्थितियों में एक संभावित सीमा पेश हो सकती है, कई एलर्जी के लिए मनाया गया लचीलापन इसके प्रभाव को कम करता है26,27। दरअसल, थर्मल डेनैचेशन के बाद उनकी संरचना और इम्यूनोजेनिसिटी को ठीक करने के लिए डेर पी 2, बेर ई 1, आरा ए 6 और लेप डब्ल्यू 1 जैसे कई खाद्य और साँस लेने वाले एलर्जी देखे गए हैं, हालांकि बफर स्थितियों के अनुकूलन के लिए28, 29,30,32,32,33की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए एनएसटीएलपी (कोर ए 8) और थौमेटिन्स (माल डी 2 और एक्ट डी 2) का प्रतिवर्ती विकृति केवल अम्लीय (पीएच <4) शर्तों28,30, 31के तहत मनायाजाताहै। इसके अतिरिक्त, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लेखकों ने एनीलिंग प्रोटोकॉल में नियोजित समय या तापमान को अनुकूलित करने का प्रयास नहीं किया। यह संभव है कि लिगांड घुलनशीलता और प्रोटीन फोल्डिंग /खुलासा कम अधिकतम तापमान का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जैसा कि बीआर ई 1 के साथ देखा गया है जिसके लिए रिवर्सिबल डेनैचेशन 82 डिग्री सेल्सियस29पर प्राप्त किया जाता है। इस तरह के उपायों के उपयोग से एलर्जी की सीमा का विस्तार होने की उम्मीद है जिस पर इस प्रोटोकॉल को लागू किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल को अन्य एलर्जी प्रणालियों में अनुकूल करते समय एक और महत्वपूर्ण विचार एनीलिंग प्रक्रिया के दौरान आवश्यक लिगांड की एकाग्रता है। बला जी 1 के मामले में अपेक्षित उपज प्रति 1 एल सेल संस्कृति प्रोटीन का ~ 0.25-0.4 माइक्रोमोल है। 8 फैटी एसिड या 4 डिसिल चेन लिपिड प्रति एलर्जी के प्रदर्शन वाले बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री को देखते हुए, कार्गो (5-10 माइक्रोमोल) की 20-40 गुना मोलर अतिरिक्त नियोजित की गई थी। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बला जी 1 और इसके समरूपों की लिपिड बाध्यकारी क्षमता अद्वितीय है; उदाहरण के लिए nsLTP आम तौर पर सबसे दो लिपिड ligands25 पर बांध स्वीकार किए जाते हैं, जबकि लिपोकैलिन से कम 1 stoichiometry34है . इस प्रकार, इस प्रकार के एलर्जी की पूरी लोडिंग को लिगांड की छोटी अधिकता के साथ पूरा किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को अन्य एलर्जी प्रणालियों में अनुकूल करते समय एक अंतिम विचार डिसल्फाइड बांड की उपस्थिति है, जो यदि डीनाचरिंग से पहले ठीक से नहीं बनती है तो समस्याग्रस्त हो सकती है। एक संभव दृष्टिकोण 2 एमएम डीटीटी जैसे कम करने वाले एजेंट की उपस्थिति में एनीलिंग प्रक्रिया को पूरा करना होगा। मूल डिसल्फाइड बांड को बाद में कम और ऑक्सीकृत ग्लूटाथिएक के अलावा फिर से बनाया जा सकताहैजैसा कि अलबर्स एट अल द्वारा अध्ययन किए गए मूंगफली एलर्जेन टुकड़े के लिए वर्णित है। इस मामले में, सही डिसल्फाइड बॉन्डिंग की वसूली का अनुभवजन्य रूप से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री35द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

इस काम में हम एक तकनीक का वर्णन करते हैं जिसके माध्यम से एलर्जी को विभिन्न फॉस्फोलिपिड और फैटी एसिड कार्गो के साथ फिर से और पुनः एनीमल किया जा सकता है। हालांकि, आम एलर्जी जलाशयों के भीतर संभावित इम्यूनोजेनिक या एडजुवेंटाइजिंग लिगांड के कई अन्य वर्ग हैं। उदाहरण के लिए, बिल्ली, कुत्ते और पतंग एलर्जी को घर की धूल36से लिपोपॉलीसैकराइड्स (एलपीएस) और अन्य बैक्टीरियल लिपिड को बांधने का प्रस्ताव किया गया है, जबकि बेट वी 1 को पराग मैट्रिक्स13से जटिल फ्लेवोनॉइड निकालने के लिए दिखाया गया है। इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल को अधिक विस्तृत तरीके से इन लिपिड की भूमिका का पता लगाने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। अवधारणा के एक सबूत के रूप में हम यह प्रदर्शित करने में सक्षम रहे हैं कि बला जी 1 का हाइड्रोफोबिक गुहा ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया की कोशिका दीवारों से लिपोटेइकोइक एसिड (एलटीए) को बाध्यकारी करने में सक्षम है, लेकिन ग्राम नकारात्मक प्रजातियों से एलपीएस को शामिल नहीं करता है, संभावित रूप से बादके 9में एसील चेन की अधिक संख्या को दर्शाती है। यह एक कदम आगे ले जाते हुए, एक थर्मल denaturation/annealing प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए फ्लोरोसेंट जांच और एलर्जी प्रोटीन में अंय गैर प्राकृतिक फैटी एसिड एनालॉग शामिल कर सकता है । दरअसल, हम डीएयूडीए के साथ बला जी 1 के मच्छर समरूप के हाइड्रोफोबिक गुहा को लोड करने में सक्षम थे, जो एलर्जिक रोग पर लिपिड लिगांड के प्रभावों की जांच करने के लिए अतिरिक्त रास्ते खोल रहे थे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ टॉम किर्बी, स्कॉट Gabel, और डॉ रॉबर्ट लंदन इस काम के दौरान उनकी मदद और सहायता के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, डॉ बॉब पेट्रोविच और लोरी एडवर्ड्स के साथ उनके इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग और इस अध्ययन में नियोजित बीएलए जी 1 निर्माण पैदा करने में उनकी सहायता के लिए । हम एंड्रिया एडम्स को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं, और एनएमआर इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ सहायता के लिए डॉ यूजीन डिरोज। इस शोध को एनआईएच, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एनवायरमेंटल हेल्थ साइंसेज, जेड01-ES102906 (गाम) के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bla g 1 Gene  Genescript N/a Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216
Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) Indoor biotechnologies N/a Custom order
Agilent 1100 Series HPLC System Agilent G1315B, G1311A, G1322A UV Detector, Pump, and Degasser
Agilent DD2 600 MHz spectrometer Agilent N/a
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit Amicon UFC-1008
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
Broad- band 5 mm Z-gradient probe Varian N/a
ChemStation for LC (Software) Agilent N/a
cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) Avanti Polar Lipids 850365C
E. Coli BL21 DE3 Cells New England Biolabs C2530H
Freezone 4.5 Freeze Dry System Labconco 7750000
Glutathione Resin Genescript L00206
Glutathione, Reduced Fisher Scientific BP25211
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific 34060
Jasco  CD spectropolarimeter Jasco J-815
Millex Syringe Filter Unit EMD Millipore SLGS033SS
NMRPipe (Software) Delaglio et al.  N/a Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995).
NMRViewJ (Software) Johnson et al.  N/a Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994).
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008
Pierce BCA Protein Assay Sigma-Aldrich BCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column Agilent SKU: A2000250X100
SD-200 Vacuum Pump Varian VP-195
Sodium Cholate Hydrate Sigma-Aldrich C6445
Sodium Palmitate Sigma-Aldrich P9767
Sodium Stearate Sigma-Aldrich S3381
VnmrJ (Software) Varian N/a

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References

  1. Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
  2. Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
  3. Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
  4. Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
  5. Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
  6. Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
  7. Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
  8. Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
  9. Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
  10. Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
  11. Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
  12. Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
  13. Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
  14. Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
  15. Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
  16. Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  17. Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
  18. Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
  19. Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
  20. Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
  21. Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
  22. Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
  23. Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
  24. Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
  25. Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
  26. Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
  27. Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
  28. Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
  29. Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
  30. Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
  31. Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
  32. Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
  33. de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
  34. Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
  35. Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
  36. Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).

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बायोकेमिस्ट्री अंक 168 एलर्जी बायोकेमिस्ट्री बायोफिजिक्स फैटी एसिड-बाइंडिंग प्रोटीन फैटी एसिड लिपिड प्रोटीन बाइंडिंग प्रोटीन स्थिरता
लिपिड-बाउंड प्रोटीन और एलर्जेंस से एंडोजेनस लिगांड को हटाना और प्रतिस्थापन
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Foo, A. C. Y., Thompson, P. M., Mueller, G. A. Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens. J. Vis. Exp. (168), e61780, doi:10.3791/61780 (2021).

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