Summary
Denne protokollen beskriver fjerning av endogene lipider fra allergener, og deres erstatning med brukerangitte ligander gjennom omvendt fase HPLC kombinert med termisk annealing. 31 P-NMR og sirkulær dikroisme muliggjør rask bekreftelse av ligandfjerning/lasting, og gjenvinning av innfødt allergenstruktur.
Abstract
Mange store allergener binder seg til hydrofobe lipidlignende molekyler, inkludert Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 og Fel d 1. Disse ligandene er sterkt beholdt og har potensial til å påvirke sensibiliseringsprosessen enten gjennom direkte stimulering av immunsystemet eller endring av biofysiske egenskaper til det allergifremkallende proteinet. For å kontrollere for disse variablene er det nødvendig med teknikker for fjerning av endogenede bundet ligander og om nødvendig erstatning med lipider av kjent sammensetning. Kakerlakkallergenet Bla g 1 omslutter et stort hydrofobt hulrom som binder en heterogen blanding av endogene lipider når de renses ved hjelp av tradisjonelle teknikker. Her beskriver vi en metode der disse lipidene fjernes ved hjelp av omvendt fase HPLC etterfulgt av termisk gløding for å gi Bla g 1 i enten Apo-form eller lastet på nytt med en brukerdefinert blanding av fettsyre eller fosfolipidlaster. Kobling av denne protokollen med biokjemiske analyser avslører at fettsyrelaster betydelig endrer termo ustabiliteten og proteolytisk motstand av Bla g 1, med nedstrøms implikasjoner for frekvensen av T-celle epitopgenerering og allergifremkallende. Disse resultatene fremhever viktigheten av lipidfjerning / reloading protokoller som den som er beskrevet heri når du studerer allergener fra både rekombinante og naturlige kilder. Protokollen er generaliserbar for andre allergenfamilier, inkludert lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) og Uteroglobin (Fel d 1), og gir et verdifullt verktøy for å studere lipidenes rolle i den allergiske responsen.
Introduction
En undersøkelse av allergendatabasen avslører at allergener finnes i bare 2% av alle kjente proteinfamilier, noe som tyder på at vanlige funksjonelle og biofysiske egenskaper bidrar til allergifremkallende1. Av disse egenskapene synes evnen til å binde lipidlaster å være sterkt overrepresentert blant allergener, noe som tyder på at disse lastene kan påvirke sensibiliseringsprosessen1. Faktisk har det vist seg at Brasil Nut allergen Ber e 1 krever samtidig administrasjon med sin endogene lipid for å realisere sitt fulle sensibiliserende potensial2. Disse lipidene kan potensielt stimulere immunforsvaret direkte som illustrert av myteallergenene Der p 2 og Der p 7, som begge deler en sterk strukturell homologi med LPS-bindende proteiner3,4,5. Basert på denne observasjonen ble det foreslått at Derp 2 og Der p 7 kunne binde bakterielle lipider og direkte stimulere vertsimmunsystemet gjennom TLR4-mediert signalering, noe som letter sensibiliseringsprosessen5,6. Det er også mulig at endogene bundet lipider kan endre de biofysiske egenskapene til allergifremkallende proteiner selv. For eksempel, evnen til Sin a 2 (sennep) og Ara h 1 (peanøtter) til å samhandle med fosfolipid vesicles betydelig forbedret deres motstand mot mage og endosomal nedbrytning7, mens ligand binding til de store bjørk pollen allergen Bet v 1 endret både graden av endosomal behandling og mangfoldet av de resulterende peptider8. Dette er spesielt relevant for allergifremkallende gitt korrelasjonen som er observert mellom stabilitet, T-celle epitopgenerering og allergifremkallende for proteiner som Bet v 1 og Bla g 1; sistnevnte vil være gjenstand for dette arbeidet9,10.
Bla g 1 representerer det prototypiske medlemmet av insektet Major Allergen (MA) proteinfamilien, og har en unik struktur bestående av 12 amfipatiske alfahælika som omslutter et unormalt stort hydrofobt hulrom9,11. Den tilgjengelige røntgenkrystallstrukturen til Bla g 1 viser elektrontetthet i dette hulrommet i samsvar med bundet fosfolipid eller fettsyreligander; en formodning bekreftet av 31P-NMR og massespektrometri. Disse lastene var heterogene i naturen, og deres sammensetning var sterkt avhengig av allergenkilden, med forskjellige lipidprofiler observert for rekombinant Bla g 1 uttrykt i E. coli og P. pastoris. Merkelig nok inneholdt Bla g 1 renset fra sin naturlige allergenkilde (kakerlakkfrass) overveiende fettsyrer i bindingsstedet, med en blanding av palmitat, oleat og stearate som ble identifisert som sine "naturlige" ligander9,11. Bla g 1s evne til å beholde lipider og fettsyrer etter flere rensetrinn hindrer arbeidet med å studere proteinet isolert. Omvendt har det blitt antydet at den naturlige palmitaten, stearate og oleate ligander av Bla g 1 (heretter referert til som nMix) spiller en nøkkelrolle i både dens allergifremkallende og innfødte biologiske funksjon9. Disse ligandene er imidlertid ikke til stede i Bla g 1 hentet fra rekombinante kilder, noe som gjør det vanskelig å vurdere denne hypotesen. Lignende problemer har blitt observert for andre lipidbindingsallergener som Bet v 112,13. For å lette den systematiske studien av lipid-allergeninteraksjoner har vi utviklet en protokoll der allergener kan bli kvantitativt strippet for sine endogene bundet lipider og rekonstituert i enten Apo-form eller lastet med spesifikke ligander.
Allergener renses oftest fra sine naturlige eller rekombinante kilder ved hjelp av affinitetskromatografi og/eller størrelsesekskluderingskromatografi. Her introduserer vi et ekstra rensetrinn i form av høyytelses væskekromatografi (HPLC) som bruker en omvendt fase C18-kolonne hvorfra allergenet slippes inn i et organisk løsningsmiddel som ligner protokoller utviklet for fettsyrebindingsproteiner14. Det resulterende proteinet blir deretter utsatt for et termisk annealing trinn i fravær eller tilstedeværelse av fettsyrer og / eller fosfolipider. I tillegg til å gjenvinne den innfødte Bla g 1-folden, øker de forhøyede temperaturene løseligheten og tilgjengeligheten til lipidlastene, noe som gir Bla g 1 i enten Apo-formen eller jevnt lastet med ønsket hydrofob ligand. 31 P-NMR spektra av Bla g 1 renset på denne måten bekreftet fullstendig fjerning av endogenede bundet ligander og ensartet erstatning med de ønskede forbindelser, mens sirkulær dikroisme bekreftet vellykket utvinning av Bla g 1 fold. Nytten av denne metoden er fremhevet i et nylig arbeid der lastbinding ble funnet å forbedre Bla g 1 termo ustabilitet og proteolytisk motstand, og endret kinetikken til T-celle epitopgenerering med potensielle implikasjoner for sensibilisering og allergifremkallende9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bla g 1 kloning
- Få gen for allergen Bla g 1.0101 (rester 34-216), som representerer en enkelt gjentakelse av MA-domenet. For enkelhets skyld vil Bla g 1 bli brukt gjennom hele arbeidet for å representere denne enkelt gjentakelsen, i stedet for hele Bla g 1.0101 transkripsjon.
- Subclone Bla g 1 genet i ønsket vektor. I denne studien ble genet som inneholder en N-terminal glutathione S-transferase (GST) tag koblet til et tobakksetsjevirus (TEV) protease spaltingssted satt inn i en pGEX-vektor for uttrykk som beskrevet tidligere11.
- Forvandle Bla g 1 pGEX-vektoren til BL21 DE3 E. coli-celler.
- Forbered en 10 ng / μL lager av ønsket vektor.
- Kombiner 1 μL 10 ng/μL DNA-lager med 50 μL BL21 DE3-celler som leveres av produsenten.
- Inkuber BL21 DE3-DNA-blanding i 30 min på is. Overfør til et 42 °C vannbad i 1 min, og overfør deretter umiddelbart tilbake på is i ytterligere 1 min inkubasjon.
- Tilsett 200 μL LB-medier i cellene og inkuber i ytterligere 1 time ved 37 °C.
- Plate de transformerte cellene på LB-Agar plater som inneholder 100 mg / L ampicillin og vokse ved 37 °C over natten.
2. Innledende uttrykk og rensing
- Inokuler 1 L LB-medier som inneholder 100 mg/L ampicillin med en enkelt koloni av BL21 DE3-celler forvandlet med Bla g 1-vektoren som beskrevet i 1.3. Vokse ved 37 °C over natten.
- Neste dag høster du celler (OD600 ~1,5) via sentrifugering ved 6000 x g i 10 minutter og resuspend i 2 L 2x YT-medier som inneholder 100 mg/l ampicillin. La cellene vokse i ytterligere 1 time ved 37 °C til en OD600 > 0,6.
- Induser proteinuttrykk gjennom tilsetning av 0,5 mM IPTG. Overfør celler til 18 °C og inkuber over natten.
- Neste dag høster celler som beskrevet i 2.2. Den resulterende cellepelleten kan fryses og lagres ved -20 °C.
- Resuspend pellet oppnådd fra 1 L kultur i 50 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) som inneholder 1 proteasehemmertablett (eller tilsvarende) og 1 μL benzonasekjerneknusase.
- Lyse celler som bruker en sondesonator (500 W, 20 kHz) satt til 30–50 % effekt i 4 minutter med en driftssyklus på 50 %. Hold lysatet i et isbad under sonikering
- Sentrifuge lysat på 45.000 x g i 20 min. Kast uoppløselig brøkdel (pellet).
- Fjern 28 μL løselig protein. Kombiner med 7 μL 5x SDS-PAGE buffer og lagre for SDS-PAGE-analyse. Gjenta dette trinnet for GST-kolonnen gjennomstrømning, vask og elutionfraksjoner før og etter inkubasjon med TEV.
- Påfør løselige proteiner (supernatant) på en glutathione harpikskolonne (~ 10 ml totalt sengevolum) likevektet i PBS pH 7.4.
- Vask ut ubundne proteiner ved hjelp av 50 ml PBS.
- Elute GST-Bla g 1 med 50 ml PBS som inneholder 10 mM redusert glutathione.
- Inkuber eluted protein med 0,2 kU TEV protease over natten ved 4 °C, eller romtemperatur i 6 timer for å fjerne GST-taggen.
3. Endogen lipidfjerning via omvendt fase HPLC
- Samle den spaltede Bla g 1 og konsentrer den til ~ 2 ml ved hjelp av en sentrifugalfilterenhet med en <10 kDa molekylvektavskjæring.
- Legg <12 ml prøve til toppen av konsentratoren og spinn på 5000 x g i 10-15 min i en svingbøtterotor.
MERK: Prøvevolumet og spinnhastigheten vil variere avhengig av det spesifikke filteret og hvilken type rotor som brukes. Se dokumentasjonen fra produsenten før bruk.
- Legg <12 ml prøve til toppen av konsentratoren og spinn på 5000 x g i 10-15 min i en svingbøtterotor.
- Last konsentratet på et 250 x 10 mm HPLC-system utstyrt med en C18 omvendt fase kromatografikolonne likevektet med 97% buffer A (vann, 0,1% trifluoroeddiksyre) og 3% buffer B (acetonitril, 0,1% triorofluastisk syre).
MERK: Mindre kolonner kan brukes, men protein må kanskje lastes og eluteres ved hjelp av flere sykluser for å imøtekomme redusert bindingskapasitet. Når du velger en kolonne, må du sørge for at harpiksperlene har en partikkelstørrelse på < 5 μm og porestørrelse på >200 Å for å tillate effektiv separasjon av proteinstore molekyler
FORSIKTIG: Trifluoroacetic acid er svært etsende og bør dispenseres i en avtrekkshette ved hjelp av passende PPE (dvs. nitrilhansker, labfrakk og vernebriller). Acetonitril er både moderat giftig, flyktig og svært brannfarlig, bør brukes og dispenseres i en avtrekkshette ved hjelp av passende PPE (dvs. nitrilhansker, labfrakk og vernebriller). - Elute Bla g 1 ved hjelp av protokollen vist i tabell 1 med en strømningshastighet på 1,5–4,0 ml/min. Overvåk elutionprosessen ved hjelp av fluorescensabsorbering ved 280 nm.
- Samle og basseng Bla g 1 brøkdeler. Bla g 1 elutes vanligvis ved >74% buffer B, eller ~ 34-40 min.
MERK: Elution-tiden vil variere noe avhengig av strømningshastigheten eller kolonnestørrelsen. Samle brøker basert på A280 for best resultat.
- Samle og basseng Bla g 1 brøkdeler. Bla g 1 elutes vanligvis ved >74% buffer B, eller ~ 34-40 min.
| Tid (min) | Buffer A (%) | Buffer B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tabell 1: Elution-protokoll for Bla g 1. Tabell som illustrerer elutiongradienten som brukes i isolasjonen av Bla g 1 ved hjelp av en C18 HPLC-kolonne.
- Aliquot prøven i glass reagensrør, fylle ingen reagensrør mer enn halvveis (~ 4 ml). Dekk rørene med parafinfilm og perforer dekselet med to hull for å tillate ventilasjon.
- Forbered en separat 1 ml aliquot (test aliquot). Dette vil bli brukt til å bestemme forventet avkastning.
- Frys prøvene og test aliquot ved å plassere dem i en -80 °C fryser i 1 time, eller nedsenking i flytende nitrogen. I tilfelle av det senere må røret roteres kontinuerlig for å unngå brudd på reagensrøret på grunn av utvidelse av væskefasen ved frysing.
- Tørk de resulterende delipiderte proteinprøvene ved hjelp av en lyofilisator. Tørket protein kan lagres ved 4 °C i flere måneder i en forseglet beholder.
4. Rekonstituering av Apo- og lastlastet Bla g 1
- Bestem det forventede Bla g 1-utbyttet.
- Resuspend lyofilisert, delipidert (post-HPLC) test aliquot i 5 ml refolding buffer, (50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
- Varm blandingen i et vannbad (500 ml beger med 250 ml vann og rør bar over en varm plate) til 95 °C. Virvelløsninger intermitterende og inkuberer ved 95 °C i 0,5–1 time.
- Fjern varmen og la vannet bade likevekt til romtemperatur (~1 t). Annealed protein kan lagres i denne formen over natten ved 4 °C om nødvendig.
- Før glødet Bla g 1-lipidblanding gjennom et 0,22 μM sprøytefilter for å fjerne svevestøv.
- Bufferen bytter det filtrerte proteinet 3x inn i PBS pH 7.4 ved hjelp av et sentrifugalfilter med 10 kDa-avskjæring som beskrevet i 3.1 for å fjerne restfrie fettsyrer og organisk løsningsmiddel.
- Vurder proteinkonsentrasjon ved hjelp av BCA-analyse eller annen foretrukket metode som UV-absorbans. Bruk denne til å bestemme forventet avkastning for de resterende Bla g 1 aliquots.
- Rekonstituer Apo- eller lastbelastet Bla g 1
- Resuspend Bla g 1 aliquots i refolding buffer som beskrevet i 4.1.1.
- For å produsere Apo-Bla g 1 gjentar du trinn 4.1.2-4.1.6 for å oppnå ønsket utbytte.
- For å laste Bla g 1 med fettsyrer, lag 20 mM lagerløsninger av ønsket fettsyrelast i metanol eller DMSO. Deretter hopper du til trinn 4.2.5.
- For å laste Bla g 1 med fosfolipider, lag en 10 mg / ml lager av ønsket last i kloroform inne i et glassrør.
- Fordamp kloroformen for å produsere en lipidfilm. Tilsett PBS i reagensrøret for å produsere en endelig fosfolipidkonsentrasjon på 20 mM.
FORSIKTIG: Kloroform er skadelig ved innånding eller svelging. Brukes i en kjemisk avtrekkshette eller bruk åndedrettsvern hvis utilstrekkelig ventilasjon er tilgjengelig. Bruk nitrilhansker, labfrakk og vernebriller ved håndtering. Se MSDS før bruk. - Rehydrer lipidfilmen ved å varme den over faseovergangstemperaturen til lipidlasten og virvelen til løsningen blir overskyet. Vær oppmerksom på at sonikering kan være nødvendig for å resuspendere og rehydrere noen last fullt ut.
- Hvis sonikering er nødvendig, plasser reagensglasset i badesonatoren (100 W, 42 kHz) og soniker med maksimal effekt til lasten er resuspendert. Alternativt kan en sondesonator (beskrevet i 2.6) brukes med en 10-20% effekt med en 50% driftssyklus.
FORSIKTIG: Sonikering bruker høyfrekvente lydbølger som kan skade hørselen. Bruk støydempende personlig verneutstyr (ørepropper eller lyddempere). Hvis det er mulig, plasser sonikeren inne i lyddempende kabinett eller kammer.
- Fordamp kloroformen for å produsere en lipidfilm. Tilsett PBS i reagensrøret for å produsere en endelig fosfolipidkonsentrasjon på 20 mM.
- Tilsett ønsket fettsyre eller fosfolipid last for å produsere et 20x molar overskudd av ligander i forhold til Bla g 1 basert på forventet utbytte bestemt i 4.1. Det totale volumet av organisk løsningsmiddel tilsatt i dette trinnet bør ikke overstige 2%. Virvel å blande.
MERK: 1 L Bl 21 DE3-celler gir vanligvis ~0,25–0,4 nmol protein, tilsvarende ~400 μM ligand per rør. - Anneal proteinet som beskrevet i 4.1.
5. Bekrefte fjerning/lasting av fosfolipidlast via 31P-NMR
- Konsentratprøver av Apo- eller lastbelastet Bla g 1 til >100 μM ved hjelp av en sentrifugalfilterenhet som beskrevet i 3.1.
- Rehydrer referansefosfolipid i PBS-buffer til endelige konsentrasjoner på 2, 1,5, 1, 0,5 og 0,25 mM.
- Fortynn prøver 1:1 med cholate buffer (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% m/v cholate) til et totalt volum på ~ 600 μL.
MERK: Cholate brukes i dette trinnet for å fullstendig trekke ut og løse lipider fra Bla g 1 hydrofob hulrom. Dette sikrer at det kjemiske miljøet rundt fosfolipidhodegruppene er konsistent mellom ulike prøver, noe som muliggjør kvantitativ vurdering ved hjelp av 31P-NMR. Bruk av cholate kan erstattes av kloroform/metanol som beskrevet tidligere15. - Skaff deg 1D 31P-NMR-spektra av de kolat-solubiliserte Bla g 1-prøvene og referer til fosfolipidstandarder ved hjelp av en bredbåndssonde.
MERK: 31P-NMR-spektra presentert i dette arbeidet ble oppnådd ved hjelp av et spektrometer på 600 MHz. Tidligere studier som benytter lignende teknikker tyder imidlertid på at akseptabel følsomhet kan oppnås ved feltstyrker så lave som 150-200 MHz15. - Behandle resultatdataene ved hjelp av riktig programvare16.
- Oppnå toppintensiteter ved hjelp av foretrukket NMR-visningsprogramvare17.
- Sammenlign Bla g 1 31P-NMR-spektra med de som er oppnådd for fosfolipidreferanseprøvene for å bekrefte fjerning av endogenede ligander og/eller binding av ønskede ligander basert på de kjemiske skiftene til de synlige toppene (eller mangel på disse).
- Bekreft full binding stoichiometri ved å sammenligne toppintensiteten i Bla g 1-spekteret med fosfolipidreferansestandardene.
6. Bekrefte Bla g 1 folding
- Klargjør 0,5 μM-prøver av Bla g 1 i CD-buffer (100 mM KH2PO4, buffer pH 7.5). Legg 2 ml av prøven i en 10 mm CD-cuvette med magnetisk rørestang.
- Mål CD-spekteret av Bla g 1 for å bekrefte rekonstituering av sekundær struktur. Forsikre deg om at Photomultiplier (PMT) spenning ikke overstiger produsentens anbefalinger (vanligvis 1 kV).
- Mål CD-signalet fra 260–200 nm ved 25 °C med en dataavstand på 0,2 nm og en skannehastighet på 20 nm/s med en dataintegrasjonstid på 1 s.
- Øk temperaturen i CD-cellen fra 25 °C til 95 °C med en hastighet på 0,5 °C/min. Aktiver magnetisk rørestang for å sikre at temperaturen er jevn over prøven.
- Overvåk CD ved 222 nm, og ta avlesninger hver 2 °C.
- Tilpass resulterende data til en 2-tilstands Boltzman-kurve for å bestemme smeltetemperaturen. På grunn av den høye stabiliteten til Bla g 1 ble smeltetemperaturen (MT25) definert som temperaturen der proteinet har mistet 25% av sin første CD ved 222 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av affinitetskromatografi ble rekombinant GST-Bla g 1 lett isolert til et høyt renhetsnivå (figur 1A), noe som ga et utbytte på ~ 2-4 mg / l cellekultur. Overnatting inkubasjon med TEV protease ved 4 °C er tilstrekkelig til å fjerne GST-taggen, noe som gir sluttproduktet på ~24 kDa. Merk at i dette tilfellet er det en betydelig mengde GST-Bla g 1 i gjennomstrømnings- og vaskefraksjonene, noe som tyder på at Glutathione-harpiksbindingskapasiteten ble overskredet. Bruk av mer harpiks eller flere sykluser med prøvelasting og elution kan gi rette for dette problemet.
Bruk av Bla g 1 på en omvendt fase C18-kolonne gir en særegen elutionprofil (figur 1B), med to store topper på ~ 50% buffer B, og en annen stor topp på ~ 75% buffer B. SDS-PAGE analyse av de resulterende fraksjonene antyder at førstnevnte tilsvarer den spaltede GST-taggen, mens sistnevnte tilsvarer Bla g 1. Noen ganger vil en tredjedel, mindre topp oppstå i midten tilsvarende gjenværende, ikke-cleaved GST-Bla g 1. Tilstedeværelsen av dette ikke-cleaved produktet kan elimineres ved å øke mengden TEV som brukes i spaltingsreaksjonen eller forlenge inkubasjonstiden. Selv om ufullstendig spalting vil redusere utbyttet, er separasjonen oppnådd på C18-kolonnen tilstrekkelig for å sikre at renheten til det endelige Bla g 1-produktet forblir kompromissløs. En konsekvens av omvendt fase HPLC er at det endelige proteinproduktet slippes inn i et organisk løsningsmiddelmiljø. Selv om dette letter fjerning av hydrofobe ligander, er det nødvendig å fjerne dette løsningsmidlet via lyofilisering, noe som gir et mykt hvitt pulver (figur 1C).
Annealing av proteinet er nødvendig for å rekonstituere den innfødte Bla g 1 fold og kan utføres enten i fravær eller tilstedeværelse av en lipid last. Tilsetning av DMSO til de tørkede Bla g 1- og fosfolipidlastene før omfoldingsbufferen letter løselighetsprosessen, selv om noen lengre kjede lipidlaster ikke vil oppløses helt selv ved forhøyede temperaturer. Dette ble imidlertid ikke observert for å påvirke lasteeffekten blant lipidene som ble testet i studiene våre (figur 1C). På samme måte vil overflødige lipider ofte utfelle ut av løsningen eller danne store vesicles ved kjøling, noe som resulterer i et overskyet utseende etter annealing (Figur 1C). Dette ble heller ikke observert for å påvirke lasteeffektiviteten, og eventuelle aggregater fjernes lett gjennom filtrerings- og påfølgende bufferutvekslingstrinn for å gi en klar, gjennomsiktig løsning. Til tross for de tøffe forholdene ble det ikke observert termolyse for Bla g 1.
Figur 1: Innledende rensing av Bla g 1. (A) SDS-PAGE som viser den løselige proteinfraksjonen etter første lysis (S); gjennomstrømning (FT), vask (W) og elution fra glutathione-sepharose kolonnen (E); og det endelige Bla g 1-produktet etter TEV-spalting av GST-taggen (TEV). HPLC elution-profilen til det resulterende Bla g 1-produktet etter TEV-spalting er vist i (B). En280 vises i blått, mens elutiongradienten (% buffer B) vises i grønt. Brøker som tilsvarer den spaltede GST-taggen (H1, H2), gjenværende ikke-spaltet GST-Bla g 1 (H3) og renset Bla g 1 (H4) er indikert med røde piler på henholdsvis ~ 50%, ~ 65% og ~ 74% Buffer B. SDS-PAGE analyse av brøker H1-H4 vises i (A) og merkes tilsvarende. (C) Representative bilder som viser Bla g 1 på ulike stadier av glødeprosessen. Merk at nøyaktig og utstrekning av bunnformasjon som avbildet i ii og iii er avhengig av typen lipidlast som brukes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
31 P-NMR-spektra av Apo-Bla g 1 renset på denne måten viser ingen påvisbare fosfolipider verken av NMR (figur 2A) eller tynnlagskromatografi (data ikke vist). Til sammenligning viser lignende spektra oppnådd for Bla g 1 lastet med en distearoylfosfatidylkolin (DSPC) fosfolipid en sterk topp som tilsvarer fosfatidylkolinhodegruppen. Til sammenligning viser et representativt 31P-NMR-spekter av Bla g 1 renset fra rekombinant E. coli uten bruk av lipidfjernings-/annealingprotokollen som er beskrevet her (ecBla g 1) en heterogen blanding av endogene lipider ekstrahert fra det rekombinante uttrykkssystemet (Figur 2B). Ved å dra nytte av NMRs kvantitative karakter kan en standardkurve produseres ved hjelp av referanseprøver av kjente DSPC-konsentrasjoner (figur 2C). Sammenligning av 31P-signalintensiteten oppnådd fra DSPC-Bla g 1 mot denne standardkurven gir en bindende stoichiometri på 4,7 ± 0,5 lipider per protein; en verdi som sammenligner gunstig med den predikerte fulle bindende stoichiometri oppnådd fra i silicostudier og strukturell analyse9. Vær oppmerksom på at denne teknikken bare vil oppdage ligander som inneholder en 31P kjerne som fosfolipider, lysofosfolipider, lipopolysakkarider etc. Denne protokollen kan imidlertid enkelt tilpasses for 13C-NMR-analyser. I dette tilfellet vil metyl-13C-merkede fettsyrer anbefales på grunn av sine gunstige NMR-avslapningsegenskaper. Begrensning av isotopisk merking til ett enkelt sted letter også spektral tolkning, da bare en enkelt topp forventes, samtidig som kostnadene reduseres i forhold til ensartede 13C-merkede kolleger. En alternativ tilnærming ville være å bruke massespesifikasjoner for å identifisere bundne ligander, som vist i en tidligere studie som identifiserte en blanding av fettsyrer som den naturlige lasten til Bla g 1 isolert fra frass (nBla g 1)9. Imidlertid utelukket de begrensede mengdeegenskapene til massespesifikasjon en nøyaktig måling av bindende stoichiometri uten tilstrekkelige standarder.
Figur 2: Verifisering av fjerning av lipid og lasting av Bla g 1. (A) 31P-NMR spektra av Apo- (svart) eller DSPC-lastet Bla g 1 (rød) utarbeidet ved hjelp av glødeprotokollen beskrevet i dette arbeidet som demonstrerer fullstendig fjerning av lipider i førstnevnte, og den homogene belastningen av fosfatidylolin (PC) lipider oppnådd i sistnevnte. Bla g 1 renset derimot fra rekombinant E. coli uten lipidstriping og gløding (ecBla g 1) viser en heterogen blanding av endogen fosfatidyletanolamin (PE) og fosfatidylglyserol (PG) lipider når de analyseres ved hjelp av denne metoden (B). En representativ standardkurve hentet fra DSPC-referanseprøver av kjente konsentrasjoner er vist i (C), hvorfra Bla g 1 bindingsartet stoichiometri kan oppnås. Tall tilpasset Foo et al. (2019) og presentert under Creative Commons CC BY License9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Krystallstrukturer av Bla g 1 avslører en unik fold bestående av 12 amfipatiske alfa-helikvier. Sirkulær dikroisme representerer en rask og praktisk metode for å vurdere om denne folden har blitt rekonstituert etter glødeprosessen. CD-spektra for Apo- og lipid (nMix)-lastet Bla g 1 viser minima ~220 og 210 nm som indikerer en overveiende alfa-spiralisk struktur (Figur 3A). Dette spekteret er ekstremt likt det som er oppnådd for ecBla g 1 og nBla g 1, og gir ytterligere bevis på at den opprinnelige strukturen til Bla g 1 er vellykket gjenopprettet. Dette ble ytterligere bekreftet ved bruk av 19F og 1H-15N løsning-NMR, en full diskusjon som er tilgjengelig andre steder9. CD-baserte termiske denaturasjonsanalyser viser et samarbeidstap av alfa-spiralformet sekundærstruktur som indikerer et brettet kuleformet domene (Figur 3B). Analyse av de resulterende smeltetemperaturene (Figur 3C) viser en betydelig økning ved nMix ligandbinding. Denne forhøyede termo ustabiliteten er i tråd med det som er beregnet for nBla g 1, noe som indikerer at vi er i stand til å reprodusere den naturlige tilstanden til Bla g 1 fullt ut. Merk at ecBla g 1 også viser en lignende, om ikke større forbedring i termo ustabilitet, som illustrerer potensialet for gjenværende endogent bundet lipider for å forstyrre biofysisk karakterisering av allergener renset ved hjelp av tradisjonelle FPLC-baserte tilnærminger. Derimot gir evnen til kvantitativt å fjerne og reload hydrofobiske last fra allergener som Bla g 1 en unik mulighet til å undersøke lipidenes rolle i den allergiske responsen. Her beskriver vi en metode for å undersøke påvirkningen av lipidlaster på struktur, stabilitet og endosomal behandling av de allergifremkallende proteinene selv, selv om andre studieveier kan vurderes.
Figur 3: Bekrefte vellykket gjenoppretting av Bla g 1-folden. (A) CD-spektra av Apo- (svart) eller nMix-lastet (rød) Bla g 1 renset og glødet ved hjelp av protokollen beskrevet heri, med minima ved ~ 220 og 210 nm som indikerer en overveiende alfa-spiralisk struktur i samsvar med den tilgjengelige røntgenkrystallstrukturen. Både Apo- og nMix-lastet Bla g 1 spektra er ekstremt like med det som er oppnådd for Bla g 1 renset fra rekombinant E. coli (ecBla g 1, grønn) eller fra sin naturlige allergifremkallende kilde (nBla g 1, blå) uten lipidfjerning og glødingsprotokoll, som ytterligere støtter vellykket gjenoppretting av den opprinnelige strukturen i førstnevnte. (B) Representative termiske profiler for Apo- (svart) og nMix-lastet (rød) Bla g 1 som viser en sigmoidal kurve indikativ kooperativ utfoldelse. nBla g 1 (blå) og ecBla g 1 (grønn) vist som referanse. De beregnede smeltetemperaturene (MT25) av Bla g 1 er vist i (C). Binding av nMix-ligander (rød) gir en betydelig økning i termo ustabilitet i forhold til Apo-Bla g 1 (svart). Dette gjenspeiler trenden observert for nBla g 1 (blå), noe som tyder på at vi er i stand til å gjenopprette den opprinnelige tilstanden. Den enda større stabiliteten observert for ecBla g 1 fremhever potensialet til endogene bundet lipider for å forstyrre biofysisk karakterisering av allergener. MT25-verdier presentert i C representerer gjennomsnittsverdien oppnådd fra minst tre uavhengige forsøk. Feilfelt representerer de tilsvarende standardavviksverdiene. Tall tilpasset Foo et al. (2019) og presentert under Creative Commons CC BY License9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet i dette arbeidet har blitt brukt til systematisk å studere lipidbindingsegenskapene til Bla g 1. Dette avslørte en sammenheng mellom lastbinding, termo ustabilitet og endosomal behandling, hvorav sistnevnte var korrelert med reduksjon i genereringen av en kjent T-celle epitop med potensielle implikasjoner for immunogenisitet9,18. I tillegg til Bla g 1 har andre allergener som Pru p 3 og Bet v 1 vist seg å beholde sine endogene last når de renses ved hjelp av standard affinitets- og størrelsesekskluderingskromatografimetoder13,19,20,21,22. Disse uvelkomne gjestene kan endre de biofysiske og immunologiske egenskapene til disse proteinene på en lignende måte, og fremhever behovet for teknikker for å sikre fullstendig delipidasjon som den som presenteres her.
Mens bruk av omvendt fase HPLC i rensing av allergener har blitt beskrevet tidligere2, kobling det med en termisk annealing protokoll gir den ganske uvanlig mulighet til å rekonstituere allergener med en rekke naturlige og ikke-naturlige ligander, slik at brukerne kan sondere lipid-allergen interaksjoner. Dette termiske denatureringstrinnet ble funnet å være avgjørende for to hovedformål. For det første er termisk denaturering nødvendig for å lette ligand tilgang til deres bindende hulrom som på grunn av deres hydrofobe natur ofte blir begravet vekk fra det vandige løsningsmidlet9,22. For det andre danner hydrofobe ligander som fettsyrer og fosfolipider ofte større supramolekulære strukturer som micelles eller vesicles når de plasseres i et vandig miljø. Konsentrasjonen av monomeriske, eller "frie" ligander tilgjengelig for proteinbinding kan tilnærmes ved hjelp av den kritiske micellekonsentrasjonen (CMC). DSPC og andre langkjedede fosfolipider har CMC-verdier i nM-området, noe som indikerer at det nesten ikke er noen ledige ligander tilgjengelig for Bla g 1 binding. Selv korte kjedelipider og fettsyrer har CMC-er i det lave μm til mM-området, noe som indikerer at en stor andel av disse ligandene forblir i micellar eller bilayer fase23. Imidlertid sprer de høye temperaturene som brukes i vår denatureringsprotokoll disse større aggregatene, noe som letter bindingen. Tidligere studier har vanligvis brukt langvarige inkubasjonsperioder for å lette denne prosessen. Mangelen på en termisk denaturerings-/glødeprosess reiser imidlertid tvil om effekten av lasting. For eksempel ga inkubering av myteallergenet Der p 5 med den fluorescerende fettsyreanalogen 11-(Dansylamino)undecanoic acid (DAUDA) et bindende stoichiometri på 0,66 til tross for at den hadde et stort hydrofobt hulrom på linje med Bla g 124. På samme måte ble bindingsspesifisiteten og stoichiometrien til plante nsLTPer funnet å variere sterkt avhengig av om lipidene og proteinet først er solubilisert i metanol før tilsetning av vandig buffer, noe som indikerer at ligand og / eller bindingssted tilgjengelighet var en begrensende faktor25.
I tillegg til Bla g 1 har vi vellykket brukt den samme strategien på flere andre MA-domeneproteiner fra og mygg (A. aegypti), samt Der p 2 (data ikke vist). Vi bemerket at både Bla g 1 homologer og Der p 2 unngikk på et annet tidspunkt enn Bla g 1 fra C18-kolonnen (trinn 3.3). Elution gradienter i dette trinnet må kanskje optimaliseres for andre proteiner. Alternativt kan HPLC-kolonner med en mindre hydrofob stasjonær fase (f.eks. C8) brukes, men når det gjelder Bla g 1, var den økte hydrofobiteten til C18-kolonnen nødvendig for å fjerne diacyl fosfolipidforurensninger helt fra ecBla g 1. Til tross for forskjellene i biofysiske og biokjemiske egenskaper, har vi funnet at denne protokollen er ekstremt robust og lett kan brukes på andre allergifremkallende proteiner. Mens de tøffe forholdene som brukes kan utgjøre en potensiell begrensning, reduserer den økte motstandskraften som observeres for mange allergener virkningen26,27. Faktisk har flere mat- og innåndingsallergener som Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 og Lep w 1 blitt observert for å gjenopprette sin struktur og immunogenisitet etter termisk denaturering, selv om optimalisering av bufferforhold kan være nødvendig28,29,30,31,32,33; For eksempel observeres reversibel denaturering av nsLTPs (Cor a 8) og thaumatins (Mal d 2 og Act d 2) bare under sure (pH <4) forhold28,30,31. I tillegg skal det bemerkes at forfatterne ikke forsøkte å optimalisere enten timingen eller temperaturene som brukes i annealingprotokollen. Det er mulig at ligand-solubilisering og proteinfolding/utfoldelse kan oppnås ved hjelp av en lavere maksimumstemperatur sett med Ber e 1 som reversibel denaturering oppnås ved 82 °C29. Bruken av slike tiltak forventes å utvide spekteret av allergener som denne protokollen kan brukes på.
Et annet viktig hensyn ved tilpasning av denne protokollen til andre allergensystemer er konsentrasjonen av ligander som kreves under glødingsprosessen. Ved Bla g 1 er det forventede utbyttet ~ 0,25-0,4 μmol protein per 1 L cellekultur. Gitt den påviste bindende stoichiometrien av 8 fettsyrer eller 4 diacylkjedelipider per allergen, ble det brukt et 20-40 ganger molar overskudd av last (5-10 μmol). Det skal bemerkes at Lipidbindingsevnen til Bla g 1 og dens homologer er unik; For eksempel er nsLTPs generelt akseptert å binde maksimalt to lipidliginer25 mens lipocalins har mindre enn 1 stisiometri34. Som sådan kan fullstendig lasting av disse typer allergener oppnås med et mindre overskudd av ligander. En endelig vurdering ved tilpasning av denne protokollen til andre allergensystemer er tilstedeværelsen av disulfidbindinger, noe som kan være problematisk hvis det ikke dannes riktig før denaturering. En mulig tilnærming vil være å utføre glødeprosessen i nærvær av et reduksjonsmiddel som 2 mM DTT. De innfødte disulfidbindingene kan senere dannes på nytt gjennom tilsetning av redusert og oksidert glutathione som beskrevet for peanøttallergenfragmentet studert av Aalberse et al.35. I dette tilfellet bør utvinning av riktig disulfidbinding vurderes empirisk ved massespektrometri35.
I dette arbeidet beskriver vi en teknikk der allergener kan delipideres og re-annealed med ulike fosfolipid og fettsyrelaster. Imidlertid er det mange andre klasser av potensielt immunogene eller adjuventiserende ligander tilstede i vanlige allergenreservoarer. For eksempel har katt, hund og myte allergener blitt foreslått å binde lipopolysakkarider (LPS) og andre bakterielle lipider fra husstøv36, mens Bet v 1 har vist seg å trekke ut komplekse flavonoider fra pollenmatrisen13. Protokollen beskrevet i dette arbeidet kan enkelt tilpasses for å utforske rollen til disse lipidene på en mer detaljert måte. Som et konseptbevis har vi vært i stand til å demonstrere at det hydrofobe hulrommet i Bla g 1 er i stand til å binde lipoteichoic acid (LTA) fra celleveggene til gram positive bakterier, men utelukker LPS fra gram negative arter, noe som potensielt reflekterer det større antallet acylkjeder i sistnevnte9. Tar man dette et skritt videre, kan man bruke den termiske denaturerings-/glødeprotokollen til å inkorporere fluorescerende sonder og andre ikke-naturlige fettsyreanaloger i allergenproteiner. Faktisk var vi i stand til å laste det hydrofobe hulrommet i mygg homologen til Bla g 1 med DAUDA, og åpnet flere veier for å undersøke effekten av lipidligander på allergifremkallende sykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke Dr. Tom Kirby, Scott Gabel og Dr. Robert London for deres hjelp og hjelp gjennom dette arbeidet, sammen med Dr. Bob Petrovich og Lori Edwards for bruken av deres instrumentering og deres hjelp til å generere Bla g 1-konstruksjonene som er ansatt i denne studien. Vi takker Andrea Adams for hjelp med massespektrometrien, og Dr. Eugene DeRose for hjelp med NMR-instrumenteringen. Denne forskningen ble støttet av Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institute of Environmental Health Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
