Summary
Dit protocol beschrijft de verwijdering van endogene lipiden uit allergenen en hun vervanging door door de gebruiker gespecificeerde liganden door middel van omgekeerde fase HPLC in combinatie met thermisch gloeien. 32 P-NMR en circulair dichroïsme zorgen voor een snelle bevestiging van ligandverwijdering/-belasting en het herstel van de inheemse allergenenstructuur.
Abstract
Veel belangrijke allergenen binden zich aan hydrofobe lipide-achtige moleculen, waaronder Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 en Fel d 1. Deze liganden worden sterk behouden en hebben het potentieel om het sensibilisatieproces te beïnvloeden, hetzij door het immuunsysteem rechtstreeks te stimuleren of de biofysische eigenschappen van het allergene eiwit te veranderen. Om deze variabelen te controleren, zijn technieken nodig voor het verwijderen van endogene liganden en, indien nodig, vervanging door lipiden van bekende samenstelling. Het kakkerlakallergeen Bla g 1 omsluit een grote hydrofobe holte die een heterogeen mengsel van endogene lipiden bindt wanneer het wordt gezuiverd met behulp van traditionele technieken. Hier beschrijven we een methode waarmee deze lipiden worden verwijderd met behulp van omgekeerde fase HPLC, gevolgd door thermisch gloeien om Bla g 1 in zijn Apo-vorm op te leveren of opnieuw geladen met een door de gebruiker gedefinieerd mengsel van vetzuur of fosfolipide ladingen. Door dit protocol te koppelen aan biochemische assays blijkt dat vetzuurladingen de thermostabiliteit en proteolytische resistentie van Bla g 1 aanzienlijk veranderen, met downstream implicaties voor de snelheid van T-cel epitoopgeneratie en allergeniciteit. Deze resultaten benadrukken het belang van lipidenverwijderings-/herlaadprotocollen zoals hierin beschreven bij het bestuderen van allergenen uit zowel recombinante als natuurlijke bronnen. Het protocol is generaliseerbaar voor andere allergenenfamilies, waaronder lipocalines (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) en Uteroglobin (Fel d 1), en biedt een waardevol hulpmiddel om de rol van lipiden in de allergische reactie te bestuderen.
Introduction
Een onderzoek van de allergenendatabase toont aan dat allergenen worden gevonden in slechts 2% van alle bekende eiwitfamilies, wat suggereert dat gemeenschappelijke functionele en biofysische eigenschappen bijdragen aan allergeniciteit1. Van deze eigenschappen lijkt het vermogen om lipideladingen te binden sterk oververtegenwoordigd te zijn onder allergenen, wat suggereert dat deze ladingen het sensibilisatieproces kunnen beïnvloeden1. Het is inderdaad aangetoond dat het ParaNoot allergeen Ber e 1 co-toediening met zijn endogene lipide vereist om zijn volledige sensibiliserende potentieel te realiseren2. Deze lipiden kunnen het immuunsysteem mogelijk direct stimuleren, zoals blijkt uit de mijtallergenen Der p 2 en Der p 7, die beide een sterke structurele homologie delen met LPS-bindende eiwitten3,4,5. Op basis van deze observatie werd voorgesteld dat Derp 2 en Der p 7 bacteriële lipiden konden binden en het immuunsysteem van de gastheer rechtstreeks konden stimuleren door middel van TLR4-gemedieerde signalering, waardoor het sensibilisatieproces5,6werdvergemakkelijkt . Het is ook mogelijk dat endogene gebonden lipiden de biofysische eigenschappen van allergene eiwitten zelf kunnen veranderen. Bijvoorbeeld, het vermogen van Sin a 2 (mosterd) en Ara h 1 (pinda's) om te interageren met fosfolipide blaasjes aanzienlijk verbeterd hun weerstand tegen maag- en endosomale afbraak7, terwijl ligand binding aan de belangrijkste berkenpollen allergeen Bet v 1 veranderde zowel de snelheid van endosomale verwerking en de diversiteit van de resulterende peptiden8. Dit is met name relevant voor allergeniciteit gezien de correlatie die is waargenomen tussen stabiliteit, T-cel epitoopgeneratie en allergeniciteit voor eiwitten zoals Bet v 1 en Bla g 1; waarvan deze laatste het onderwerp zullen zijn van deze werkzaamheden9,10.
Bla g 1 vertegenwoordigt het prototypische lid van de insecten major allergene (MA) eiwitfamilie, en bezit een unieke structuur bestaande uit 12 amphipathische alfa helices die een abnormaal grote hydrofobeholteomsluiten 9,11. De beschikbare röntgenkristalstructuur van Bla g 1 toont de elektronendichtheid in deze holte die overeenkomt met gebonden fosfolipide of vetzuur liganden; een vermoeden bevestigd door 31P-NMR en massaspectrometrie. Deze ladingen waren heterogeen van aard en hun samenstelling was sterk afhankelijk van de allergene bron, met verschillende lipidenprofielen waargenomen voor recombinant Bla g 1 uitgedrukt in E. coli en P. pastoris. Merkwaardig genoeg bevatte Bla g 1 gezuiverd uit zijn natuurlijke allergene bron (kakkerlak frass) voornamelijk vetzuren binnen zijn bindingsplaats, waarbij een mengsel van palmitaat, oleaat en stearaat werd geïdentificeerd als zijn "natuurlijke" liganden9,11. Het vermogen van Bla g 1 om lipiden en vetzuren te behouden na meerdere zuiveringsstappen belemmert de inspanningen om het eiwit afzonderlijk te bestuderen. Omgekeerd is gesuggereerd dat de natuurlijke palmitaat, stearaat en oleaat liganden van Bla g 1 (voortaan aangeduid als nMix) een sleutelrol spelen in zowel de allergeniciteit als de inheemse biologische functie9. Deze liganden zijn echter niet aanwezig in Bla g 1 verkregen uit recombinante bronnen, waardoor het moeilijk is om deze hypothese te beoordelen. Soortgelijke problemen zijn waargenomen voor andere lipidebindende allergenen zoals Bet v 112,13. Om de systematische studie van lipiden-allergeneninteracties te vergemakkelijken, hebben we een protocol ontwikkeld waarmee allergenen kwantitatief kunnen worden ontdaan van hun endogene gebonden lipiden en kunnen worden gereconstitueerd in Apo-vorm of geladen met specifieke liganden.
Allergenen worden meestal gezuiverd uit hun natuurlijke of recombinante bronnen met behulp van affiniteitschromatografie en/of grootte-uitsluitingschromatografie. Hier introduceren we een extra zuiveringsstap in de vorm van hoogwaardige vloeistofchromatografie (HPLC) met behulp van een omgekeerde fase C18-kolom waaruit het allergeen wordt geëuteerd tot een organisch oplosmiddel vergelijkbaar met protocollen ontwikkeld voor vetzuurbindende eiwitten14. Het resulterende eiwit wordt vervolgens onderworpen aan een thermische gloeistap bij afwezigheid of aanwezigheid van vetzuren en/of fosfolipiden. Naast het herstellen van de inheemse Bla g 1-vouw, verhogen de verhoogde temperaturen de oplosbaarheid en toegankelijkheid van de lipideladingen, waardoor Bla g 1 in de Apo-vorm wordt opgeleverd of gelijkmatig wordt geladen met de gewenste hydrofobe ligand. 32 P-NMR spectra van Bla g 1 op deze manier gezuiverd bevestigden de volledige verwijdering van endogene gebonden liganden en uniforme vervanging door de gewenste verbindingen, terwijl circulair dichroïsme het succesvolle herstel van de Bla g 1-vouw bevestigde. Het nut van deze methode wordt benadrukt in een recent werk waarin ladingbinding werd gevonden om Bla g 1 thermostabiliteit en proteolytische weerstand te verbeteren, waardoor de kinetiek van T-cel epitoopgeneratie werd gewijzigd met mogelijke implicaties voor sensibilisatie en allergeniciteit9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bla g 1 klonen
- Verkrijg gen voor kakkerlakallergeen Bla g 1.0101 (residuen 34-216), wat een enkele herhaling van het MA-domein vertegenwoordigt. Omwille van de eenvoud zal Bla g 1 gedurende het hele werk worden gebruikt om deze enkele herhaling weer te geven, in plaats van het hele Bla g 1.0101 transcript.
- Subcloneer het Bla g 1 gen in de gewenste vector. In deze studie werd het gen met een N-terminale glutathion S-transferase (GST) tag gekoppeld aan een tabak etsvirus (TEV) protease decolleté site ingevoegd in een pGEX vector voor expressie zoals eerder beschreven11.
- Transformeer de Bla g 1 pGEX vector in BL21 DE3 E. coli cellen.
- Bereid een voorraad van 10 ng/μL van de gewenste vector.
- Combineer 1 μL 10 ng/μL DNA-voorraad met 50 μL BL21 DE3-cellen zoals verstrekt door de fabrikant.
- Incubeer BL21 DE3-DNA mengsel gedurende 30 min op ijs. Breng gedurende 1 minuut over naar een waterbad van 42 °C en breng het vervolgens onmiddellijk terug op ijs voor een extra incubatietijd van 1 minuut.
- Voeg 200 μL LB media toe aan de cellen en incubeer nog eens 1 uur bij 37 °C.
- Plaat de getransformeerde cellen op LB-Agar platen met 100 mg/L ampicilline en groeien bij 37 °C 's nachts.
2. Initiële expressie en zuivering
- Ent 1 L LB-media met 100 mg/L ampicilline met één kolonie BL21 DE3-cellen getransformeerd met de Bla g 1-vector zoals beschreven in 1.3. Groei 's nachts bij 37 °C.
- Oogst de volgende dag cellen (OD600 ~1,5) via centrifugeren bij 6.000 x g gedurende 10 minuten en resuspend in 2 L 2x YT-media met 100 mg/L ampicilline. Laat cellen nog eens 1 uur groeien bij 37 °C tot een OD600 > 0,6.
- Induceer eiwitexpressie door toevoeging van 0,5 mM IPTG. Breng cellen over naar 18 °C en incubeer 's nachts.
- Oogst de volgende dag cellen zoals beschreven in 2.2. De resulterende celkorrel kan worden ingevroren en opgeslagen bij -20 °C.
- Resuspend pellet verkregen uit 1 L cultuur in 50 ml lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) met 1 proteaseremmertablet (of gelijkwaardig) en 1 μL benzonasenuclease.
- Lyse cellen met behulp van een sonde sonicator (500 W, 20 kHz) ingesteld op 30-50% vermogen voor 4 min met een 50% duty cycle. Houd het lysaat in een ijsbad tijdens sonicatie
- Centrifugeer lysaat op 45.000 x g gedurende 20 min. Gooi onoplosbare fractie (pellet) weg.
- Verwijder 28 μL oplosbare eiwitten. Combineer met 7 μL 5x SDS-PAGE buffer en bewaar voor SDS-PAGE analyse. Herhaal deze stap voor de GST-kolomdoorstromings-, was- en elutied fracties voor en na incubatie met TEV.
- Breng oplosbare eiwitten (supernatans) aan op een glutathionharskolom (~10 ml totaal bedvolume) die in PBS pH 7,4 is geëquilibreerd.
- Was alle ongebonden eiwitten uit met 50 ml PBS.
- Elute GST-Bla g 1 met 50 ml PBS met 10 mM gereduceerd glutathion.
- Incubeer geëlueerd eiwit met 0,2 kU TEV protease 's nachts bij 4 °C, of kamertemperatuur gedurende 6 uur om de GST-tag te verwijderen.
3. Endogene lipidenverwijdering via omgekeerde fase HPLC
- Verzamel de gespleten Bla g 1 en concentreer deze tot ~2 ml met behulp van een centrifugaalfiltereenheid met een <10 kDa moleculaire gewichtsafsnijding.
- Voeg <12 ml monster toe aan de bovenkant van de concentrator en draai gedurende 10-15 minuten op 5.000 x g in een swing-bucket rotor.
OPMERKING: Het monstervolume en de centrifugesnelheid variëren afhankelijk van het specifieke filter en het type rotor dat wordt gebruikt. Raadpleeg de documentatie van de fabrikant voor gebruik.
- Voeg <12 ml monster toe aan de bovenkant van de concentrator en draai gedurende 10-15 minuten op 5.000 x g in een swing-bucket rotor.
- Plaats het concentraat op een 250 x 10 mm HPLC-systeem dat is uitgerust met een C18 reverse-phase chromatografiekolom met 97% buffer A (water, 0,1% trifluorazijnzuur) en 3% buffer B (acetonitril, 0,1% trifluorazijnzuur).
OPMERKING: Kleinere kolommen kunnen worden gebruikt, maar eiwitten moeten mogelijk worden geladen en geëuteerd met behulp van meerdere cycli om de verminderde bindingscapaciteit op te vangen. Zorg er bij het selecteren van een kolom voor dat de harsparels een deeltjesgrootte hebben van < 5 μm en een poriegrootte van >200 Å om een effectieve scheiding van moleculen ter grootte van eiwitten mogelijk te maken
LET OP: Trifluorazijnzuur is zeer corrosief en moet in een zuurkast worden afgegeven met behulp van geschikte PBM (d.w.z. nitrilhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril). Acetonitril is zowel matig giftig, vluchtig als licht ontvlambaar, moet worden gebruikt en in een zuurkast worden toegediend met behulp van geschikte PBM (d.w.z. nitrilhandschoenen, laboratoriumjas en bril). - Elute Bla g 1 met behulp van het protocol in tabel 1 bij een debiet van 1,5–4,0 ml/min. Bewaak het elutieproces met behulp van de fluorescentieabsorpantie bij 280 nm.
- Verzamel en pool Bla g 1 fracties. Bla g 1 volgt normaal gesproken bij >74% buffer B, of ~34–40 min.
OPMERKING: De elutietijd varieert enigszins, afhankelijk van het debiet of de kolomgrootte. Verzamel breuken op basis van A280 voor het beste resultaat.
- Verzamel en pool Bla g 1 fracties. Bla g 1 volgt normaal gesproken bij >74% buffer B, of ~34–40 min.
| Tijd (Min) | Buffer A (%) | Buffer B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tabel 1: Elutieprotocol voor Bla g 1. Tabel ter illustratie van de elutiegradiënt die wordt gebruikt bij de isolatie van Bla g 1 met behulp van een C18 HPLC-kolom.
- Aliquot het monster in glazen reageerbuizen, het vullen van geen reageerbuis meer dan halverwege (~ 4 ml). Bedek buizen met paraffinefolie en perforeert de bekleding met twee gaten om ontluchting mogelijk te maken.
- Bereid een aparte 1 ml aliquot (test aliquot). Dit wordt gebruikt om de verwachte opbrengst te bepalen.
- Vries de monsters in en test aliquot door ze gedurende 1 uur in een vriezer van -80 °C te plaatsen of onder te dompelen in vloeibare stikstof. In het geval van de latere moet de buis continu worden gedraaid om breuk van de reageerbuis als gevolg van uitzetting van de vloeistoffase bij bevriezing te voorkomen.
- Droog de resulterende gedelipideerde eiwitmonsters met behulp van een lyophilizer. Gedroogde eiwitten kunnen gedurende enkele maanden bij 4 °C worden bewaard in een verzegelde recipiënt.
4. Reconstitutie van Apo- en ladingbeladen Bla g 1
- Bepaal de verwachte Bla g 1 opbrengst.
- Resuspend lyophilized, delipidated (post-HPLC) test aliquot in 5 mL of refolding buffer, (50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
- Verwarm het mengsel in een waterbad (500 ml bekerglas met 250 ml water en roerstaaf over een hete plaat) tot 95 °C. Vortexoplossingen met tussenpozen en incuberen bij 95 °C gedurende 0,5-1 uur.
- Verwijder het vuur en laat het waterbad langzaam op kamertemperatuur komen (~1 uur). Gegloeid eiwit kan indien nodig 's nachts in deze vorm bij 4 °C worden bewaard.
- Geef gegloeid Bla g 1-lipidenmengsel door een spuitfilter van 0,22 μM om deeltjes te verwijderen.
- Bufferwissel het gefilterde eiwit 3x in PBS pH 7.4 met behulp van een centrifugaalfilter met 10 kDa cutoff zoals besproken in 3.1 om restvrije vetzuren en organisch oplosmiddel te verwijderen.
- Beoordeel de eiwitconcentratie met behulp van BCA-test of een andere voorkeursmethode zoals UV-absorptie. Gebruik dit om de verwachte opbrengst voor de resterende Bla g 1 aliquots te bepalen.
- Reconstitueren Apo- of ladingbeladen Bla g 1
- Resuspend Bla g 1 aliquots in refolding buffer zoals beschreven in 4.1.1.
- Herhaal stap 4.1.2–4.1.6 om de gewenste opbrengst te verkrijgen om Apo-Bla g 1 te produceren.
- Om Bla g 1 met vetzuren te laden, bereidt u 20 mM voorraadoplossingen van de gewenste vetzuurlading in methanol of DMSO. Ga vervolgens naar stap 4.2.5.
- Om Bla g 1 met fosfolipiden te laden, bereidt u een voorraad van 10 mg/ml van de gewenste lading in chloroform in een glazen reageerbuis.
- Verdamper de chloroform om een lipidefilm te produceren. Voeg PBS toe aan de reageerbuis om een uiteindelijke fosfolipideconcentratie van 20 mM te produceren.
LET OP: Chloroform is schadelijk bij inademing of inslikken. Gebruik in een chemische zuurkast of gebruik een gasmasker als er onvoldoende ventilatie beschikbaar is. Gebruik nitrilhandschoenen, laboratoriumjas en bril bij het hanteren. Raadpleeg MSDS voor gebruik. - Rehydrateer de lipidefilm door deze boven de faseovergangstemperatuur van de lipidenlading te verwarmen en te vortexen totdat de oplossing troebel wordt. Merk op dat sonicatie nodig kan zijn om sommige ladingen volledig te resuspenden en te rehydrateren.
- Als sonicatie nodig is, plaatst u de reageerbuis in bad sonicator (100 W, 42 kHz) en soniceert op maximaal vermogen totdat de lading is geresuspendeerd. Als alternatief kan een sonde sonicator (beschreven in 2.6) worden gebruikt een 10-20% vermogen met een 50% duty cycle.
LET OP: Sonicatie maakt gebruik van hoogfrequente geluidsgolven die het gehoor kunnen beschadigen. Gebruik ruisonderdrukkende PBM (oordopjes of dempers). Plaats de sonicator indien mogelijk in de geluiddempende kast of kamer.
- Verdamper de chloroform om een lipidefilm te produceren. Voeg PBS toe aan de reageerbuis om een uiteindelijke fosfolipideconcentratie van 20 mM te produceren.
- Voeg de gewenste vetzuur- of fosfolipidelading toe om een 20x molaire overmaat liganden te produceren ten opzichte van Bla g 1 op basis van de verwachte opbrengst bepaald in 4.1. Het totale volume organisch oplosmiddel dat in deze stap wordt toegevoegd, mag niet meer dan 2% bedragen. Vortex om te mengen.
OPMERKING: 1 L Bl 21 DE3-cellen levert meestal ~ 0,25-0,4 nmol-eiwit op, wat overeenkomt met ~ 400 μM ligand per buis. - Gloei het eiwit zoals beschreven in 4.1.
5. Bevestiging van het verwijderen/laden van fosfolipidelading via 31P-NMR
- Concentraatmonsters van met Apo of lading geladen Bla g 1 tot >100 μM met behulp van een centrifugaalfiltereenheid zoals beschreven in punt 3.1.
- Rehydrateer referentiefosfolipide in PBS-buffer tot eindconcentraties van 2, 1,5, 1, 0,5 en 0,25 mM.
- Verdun monsters 1:1 met cholaatbuffer (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% w/v cholaat) tot een totaal volume van ~600 μL.
OPMERKING: Cholaat wordt in deze stap gebruikt om lipiden uit de Bla g 1 hydrofobe holte volledig te extraheren en te solubiliseren. Dit zorgt ervoor dat de chemische omgeving rond de fosfolipide hoofdgroepen consistent is tussen verschillende monsters, waardoor de kwantitatieve beoordeling ervan met 31P-NMR mogelijk is. Het gebruik van cholaat kan worden vervangen door chloroform/methanol zoals eerder beschreven15. - Verkrijg 1D 31P-NMR spectra van de met cholaat gesofisticeerde Bla g 1 monsters en referentiefosfolipide normen met behulp van een breedbandsonde.
OPMERKING: De 31P-NMR spectra die in dit werk worden gepresenteerd, zijn verkregen met behulp van een 600 MHz spectrometer. Eerdere studies met vergelijkbare technieken suggereren echter dat aanvaardbare gevoeligheid kan worden bereikt bij veldensterktes van slechts 150-200 MHz15. - Verwerk de resulterende gegevens met behulp van de juiste software16.
- Piekintensiteiten verkrijgen met behulp van de gewenste NMR-weergavesoftware17.
- Vergelijk de Bla g 1 31P-NMR spectra met die verkregen voor de fosfolipide referentiemonsters om de verwijdering van endogene liganden en/of binding van gewenste liganden te bevestigen op basis van de chemische verschuivingen van de zichtbare pieken (of het ontbreken daarvan).
- Bevestig volledige binding stoichiometrie door de piekintensiteit van het Bla g 1-spectrum te vergelijken met die van de fosfolipidereferentienormen.
6. Bevestigen Bla g 1 vouwen
- Bereid 0,5 μM monsters van Bla g 1 in CD buffer (100 mM KH2PO4, buffer pH 7,5). Plaats 2 ml van het monster in een 10 mm CD cuvette met magnetische roerstaaf.
- Meet het CD-spectrum van Bla g 1 om de reconstitutie van de secundaire structuur te bevestigen. Zorg ervoor dat de pmt-spanning (Photomultiplier) de aanbevelingen van de fabrikant (over het algemeen 1 kV) niet overschrijdt.
- Meet het CD-signaal van 260–200 nm bij 25 °C met een datahoogte van 0,2 nm en een scansnelheid van 20 nm/s met een data-integratietijd van 1 s.
- Verhoog de temperatuur in de cd-cel van 25 °C tot 95 °C met een snelheid van 0,5 °C/min. Activeer de magnetische roerstaaf om ervoor te zorgen dat de temperatuur gelijkmatig is over het monster.
- Monitor CD bij 222 nm en neem metingen om de 2 °C.
- Monteer de resulterende gegevens in een 2-state Boltzman curve om de smelttemperatuur te bepalen. Vanwege de hoge stabiliteit van Bla g 1 werd de smelttemperatuur (MT25) gedefinieerd als de temperatuur waarbij het eiwit 25% van zijn oorspronkelijke cd bij 222 nm heeft verloren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van affiniteitschromatografie werd recombinant GST-Bla g 1 gemakkelijk geïsoleerd tot een hoog zuiverheidsniveau(figuur 1A),waardoor een opbrengst van ~2–4 mg/L celkweek werd verzdiend. Nachtelijke incubatie met TEV-protease bij 4 °C is voldoende om de GST-tag te verwijderen, waardoor het eindproduct ~24 kDa oplevert. Merk op dat er in dit geval een aanzienlijke hoeveelheid GST-Bla g 1 in de doorstroom- en wasfracties zit, wat suggereert dat de glutathionharsbindingscapaciteit is overschreden. Het gebruik van meer hars of meerdere cycli van monsterbelasting en elutie zou dit probleem kunnen verhelpen.
Het toepassen van de Bla g 1 op een omgekeerde fase C18 kolom levert een onderscheidend elutieprofiel op (figuur 1B), met twee grote pieken bij ~50% buffer B, en een tweede grote piek bij ~75% buffer B. SDS-PAGE analyse van de resulterende breuken suggereert dat de eerste overeenkomt met de gespleten GST tag, terwijl de laatste overeenkomt met Bla g 1. Af en toe treedt in het midden een derde, kleinere piek op die overeenkomt met de resterende, niet-gespleten GST-Bla g 1. De aanwezigheid van dit niet-gespleten product kan worden geëlimineerd door de hoeveelheid TEV die wordt gebruikt in de decolletéreactie te verhogen of de incubatietijd te verlengen. Hoewel onvolledig decolleté de opbrengst zal verminderen, is de scheiding die op de C18-kolom wordt verkregen voldoende om ervoor te zorgen dat de zuiverheid van het uiteindelijke Bla g 1-product compromisloos blijft. Een gevolg van omgekeerde fase HPLC is dat het uiteindelijke eiwitproduct wordt geëuteerd in een organische oplosmiddelomgeving. Hoewel dit de verwijdering van hydrofobe liganden vergemakkelijkt, is verwijdering van dit oplosmiddel via lyofilisatie vereist, wat een pluizig wit poeder oplevert (Figuur 1C).
Gloeien van het eiwit is vereist om de inheemse Bla g 1-voudige te reconstitueren en kan worden uitgevoerd bij afwezigheid of aanwezigheid van een lipidelading. Toevoeging van DMSO aan de gedroogde Bla g 1- en fosfolipideladingen voorafgaand aan de herplooiingsbuffer vergemakkelijkt het oplosbaarheidsproces, hoewel sommige langere ketenlipideladingen zelfs bij verhoogde temperaturen niet volledig zullen oplossen. Dit werd echter niet waargenomen om de belastingseffectiviteit te beïnvloeden onder de lipiden die in onze studies werden getest (Figuur 1C). Evenzo zullen overtollige lipiden vaak uit de oplossing neerslaan of grote blaasjes vormen bij afkoeling, wat resulteert in een troebel uiterlijk na het gloeien (Figuur 1C). Dit werd ook niet waargenomen om de belastingsefficiëntie te bewerkstelligen, en eventuele aggregaten worden gemakkelijk verwijderd door de filtratie en de daaropvolgende bufferuitwisselingsstappen om een duidelijke, transparante oplossing te produceren. Ondanks de zware omstandigheden werd geen thermolyse waargenomen voor Bla g 1.
Figuur 1: Eerste zuivering van Bla g 1. (A) SDS-PAGE met de oplosbare eiwitfractie na de eerste lysis (S); doorstroom (FT), was (W) en elutie uit de glutathion-sepharose kolom (E); en het laatste Bla g 1-product na TEV-decolleté van de GST-tag (TEV). Het HPLC-elutieprofiel van het resulterende Bla g 1-product na TEV-decolleté wordt weergegeven in (B). Een280 wordt blauw weergegeven, terwijl het elutiegradiënt (% Buffer B) groen wordt weergegeven. Breuken die overeenkomen met de gespleten GST-tag (H1, H2), resterende niet-gespleten GST-Bla g 1 (H3) en gezuiverde Bla g 1 (H4) worden aangegeven met rode pijlen bij respectievelijk ~ 50%, ~ 65% en ~ 74% Buffer B. SDS-PAGE analyse van breuken H1-H4 worden weergegeven in (A) en dienovereenkomstig gelabeld. (C) Representatieve beelden van Bla g 1 in verschillende stadia van het gloeiproces. Merk op dat de precieze en omvang van de neerslagvorming zoals afgebeeld in ii en iii afhankelijk is van het type lipidelading dat wordt gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
32 P-NMR spectra van Apo-Bla g 1 die op deze wijze zijn gezuiverd, vertonen geen detecteerbare fosfolipiden door NMR (figuur 2A) of dunne laagchromotografie (gegevens niet weergegeven). Vergelijkbare spectra die zijn verkregen voor Bla g 1 geladen met een distearoylfosfatidylcholine (DSPC) fosfolipide vertonen daarentegen een sterke piek die overeenkomt met de kopgroep van de fosfatidylcholine. Ter vergelijking: een representatief 31P-NMR-spectrum van Bla g 1 gezuiverd uit recombinant E. coli zonder het gebruik van het hierin beschreven lipidenverwijderings-/gloeiprotocol (ecBla g 1) toont een heterogeen mengsel van endogene lipiden geëxtraheerd uit het recombinante expressiesysteem (Figuur 2B). Gebruikmakend van de kwantitatieve aard van NMR kan een standaardcurve worden geproduceerd met behulp van referentiemonsters van bekende DSPC-concentraties (figuur 2C). Het vergelijken van de 31P signaalintensiteit verkregen uit DSPC-Bla g 1 met deze standaardcurve levert een bindende stoichiometrie op van 4,7 ± 0,5 lipiden per eiwit; een waarde die gunstig is vergeleken met de voorspelde volledige bindende stoichiometrie verkregen uit silicostudies en structurele analyse9. Merk op dat deze techniek alleen liganden detecteert die een kern van 31P bevatten, zoals fosfolipiden, lysofosfolipiden, lipopolysachariden enz. Dit protocol kan echter eenvoudig worden aangepast voor 13C-NMR-analyse. In dit geval,methyl-13C gelabelde vetzuren zou worden aanbevolen vanwege de gunstige NMR ontspanningseigenschappen. Het beperken van isotopenetikettering tot één enkele locatie vergemakkelijkt ook spectrale interpretatie, omdat slechts één piek wordt verwacht, terwijl tegelijkertijd de kosten worden verminderd ten opzichte van uniforme tegenhangers met een C-label van 13C. Een alternatieve benadering zou zijn om massaspecificaties te gebruiken om gebonden liganden te identificeren, zoals aangetoond in een eerdere studie die een mengsel van vetzuren identificeerde als de natuurlijke lading van Bla g 1 geïsoleerd uit kakkerlak frass (nBla g 1)9. De beperkte kwantificeringsmogelijkheden van massaspecificaties verhinderden echter een nauwkeurige meting van bindende stoichiometrie zonder voldoende normen.
Figuur 2: Controleren van lipidenverwijdering en -belasting van Bla g 1. (A) 31P-NMR spectra van Apo- (zwart) of DSPC-geladen Bla g 1 (rood) bereid met behulp van het in dit werk beschreven gloeiprotocol dat de volledige verwijdering van lipiden in de eerste aantoont, en de homogene belasting van fosfatidylcholine (PC) lipiden die bij de laatste worden bereikt. Bla g 1 gezuiverd van recombinant E. coli zonder lipidenstripping en gloeien (ecBla g 1) vertoont daarentegen een heterogeen mengsel van endogene fosfatidylethanolamine (PE) en fosfatidylethanolamine (PE) en fosfatidylglycerol (PG) lipiden wanneer geanalyseerd met behulp van deze methode (B). Een representatieve standaardcurve verkregen uit DSPC-referentiemonsters van bekende concentraties is weergegeven in (C), waaruit de Bla g 1 bindende stoichiometrie kan worden verkregen. Cijfers aangepast van Foo et al. (2019) en gepresenteerd onder de Creative Commons CC BY License9. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Kristalstructuren van Bla g 1 onthullen een unieke vouw bestaande uit 12 amfipathische alfa-helices. Circulair dichroïsme is een snelle en handige methode om te beoordelen of deze vouw na het gloeiproces met succes is gereconstitueerd. CD spectra voor Apo- en lipide (nMix)-geladen Bla g 1 tonen minima ~220 en 210 nm indicatief voor een overwegend alfa-spiraalvormige structuur (Figuur 3A). Dit spectrum is zeer vergelijkbaar met dat verkregen voor ecBla g 1 en nBla g 1, wat verder bewijs levert dat de inheemse structuur van Bla g 1 met succes is hersteld. Dit werd verder bevestigd door het gebruik van 19F en 1H-15 N oplossing-NMR, waarvan een volledige bespreking elders beschikbaar is9. Cd-gebaseerde thermische denaturatietesten tonen een coöperatief verlies van alfa-spiraalvormige secundaire structuur die wijst op een gevouwen bolvormig domein (Figuur 3B). Analyse van de resulterende smelttemperaturen (figuur 3C) laat een significante toename zien van nMix ligandbinding. Deze verhoogde thermostabiliteit is in lijn met die berekend voor nBla g 1, wat aangeeft dat we in staat zijn om de natuurlijke toestand van Bla g 1 volledig te reproduceren. Merk op dat ecBla g 1 ook een vergelijkbare, zo niet grotere verbetering in thermostabiliteit vertoont, die het potentieel illustreert voor resterende endogene gebonden lipiden om te interfereren met biofysische karakterisering van allergenen gezuiverd met behulp van traditionele FPLC-gebaseerde benaderingen. Het vermogen om hydrofobe ladingen van allergenen zoals Bla g 1 kwantitatief te verwijderen en opnieuw te laden, biedt daarentegen een unieke manier om de rol van lipiden in de allergische reactie te onderzoeken. Hier beschrijven we een methode om de invloed van lipidenladingen op de structuur, stabiliteit en endosomale verwerking van de allergene eiwitten zelf te onderzoeken, hoewel andere studiemogelijkheden kunnen worden overwogen.
Figuur 3: Bevestiging van succesvol herstel van de Bla g 1 vouw. (A) CD spectra van Apo- (zwart) of nMix-geladen (rood) Bla g 1 gezuiverd en gegloeid volgens het hierin beschreven protocol, met minima bij ~220 en 210 nm indicatief voor een overwegend alfa-spiraalvormige structuur die overeenkomt met de beschikbare röntgenkristalstructuur. Zowel Apo- als nMix-geladen Bla g 1 spectra lijken sterk op die verkregen voor Bla g 1 gezuiverd van recombinant E. coli (ecBla g 1, groen) of van zijn natuurlijke allergene bron (nBla g 1, blauw) zonder het lipidenverwijderings- en gloeiprotocol, wat het succesvolle herstel van de inheemse structuur in de eerste verder ondersteunt. (B) Representatieve thermische profielen voor Apo- (zwart) en nMix-geladen (rood) Bla g 1 met een sigmoïdale curve indicatieve coöperatieve ontvouwing. nBla g 1 (blauw) en ecBla g 1 (groen) weergegeven als referentie. De berekende smelttemperaturen (MT25) van Bla g 1 zijn weergegeven in (C). Binding van nMix liganden (rood) levert een significante toename van thermostabiliteit op ten opzichte van Apo-Bla g 1 (zwart). Dit weerspiegelt de trend die is waargenomen voor nBla g 1 (blauw), wat suggereert dat we de oorspronkelijke status met succes kunnen herstellen. De nog grotere stabiliteit waargenomen voor ecBla g 1 benadrukt het potentieel van endogene gebonden lipiden om te interfereren met biofysische karakterisering van allergenen. Mt25-waarden in C vertegenwoordigen de gemiddelde waarde die is verkregen uit ten minste drie onafhankelijke proeven. Foutbalken vertegenwoordigen de overeenkomstige standaarddeviatiewaarden. Cijfers aangepast van Foo et al. (2019) en gepresenteerd onder de Creative Commons CC BY License9. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het in dit werk beschreven protocol is met succes toegepast om systematisch de lipidenbindende eigenschappen van Bla g 1 te bestuderen. Hieruit bleek een correlatie tussen ladingbinding, thermostabiliteit en endosomale verwerking, waarvan de laatste gecorreleerd was met een afname van de productie van een bekende T-celeptoop met mogelijke implicaties voor immunogeniciteit9,18. Naast Bla g 1 is aangetoond dat andere allergenen zoals Pru p 3 en Bet v 1 hun endogene ladingen behouden wanneer ze worden gezuiverd met behulp van standaardaffiniteits - en grootte-uitsluitingschromatografiemethoden13,19,20,21,22. Deze ongewenste gasten konden de biofysische en immunologische eigenschappen van deze eiwitten op een vergelijkbare manier veranderen, waarbij de noodzaak van technieken werd benadrukt om volledige delipidatie te garanderen, zoals hier gepresenteerd.
Hoewel het gebruik van omgekeerde fase HPLC bij de zuivering van allergenen eerder is beschreven2, biedt het koppelen ervan aan een thermisch gloeiprotocol de nogal ongebruikelijke mogelijkheid om allergenen te reconstrueren met een reeks natuurlijke en niet-natuurlijke liganden, waardoor gebruikers lipide-allergene interacties kunnen onderzoeken. Deze thermische denaturatiestap bleek essentieel te zijn voor twee hoofddoelen. Ten eerste is thermische denaturatie vereist om ligandtoegang tot hun bindingsholtes te vergemakkelijken, die vanwege hun hydrofobe aard vaak worden begraven weg van het waterige oplosmiddel9,22. Ten tweede vormen hydrofobe liganden zoals vetzuren en fosfolipiden vaak grotere supramoleculaire structuren zoals micellen of blaasjes wanneer ze in een waterige omgeving worden geplaatst. De concentratie monomeer of "vrije" liganden die beschikbaar zijn voor eiwitbinding kan worden benaderd met behulp van de kritische micelleconcentratie (CMC). DSPC en andere fosfolipiden met lange keten hebben CMC-waarden in het nM-bereik, wat aangeeft dat er vrijwel geen vrije liganden beschikbaar zijn voor Bla g 1-binding. Zelfs korte keten lipiden en vetzuren hebben CMC's in het lage μm tot mM bereik, wat aangeeft dat een groot deel van deze liganden in de micellaire of tweelaagse fase23blijft . De hoge temperaturen die in ons denaturatieprotocol worden gebruikt, verspreiden deze grotere aggregaten echter, waardoor binding wordt vergemakkelijkt. Eerdere studies hebben meestal langdurige incubatieperioden gebruikt om dit proces te vergemakkelijken. Het ontbreken van een thermisch denaturatie-/gloeiproces doet echter twijfel rijzen over de doeltreffendheid van het laden. Het incuberen van het mijtallergeen Der p 5 met het fluorescerende vetzuur analoog 11-(Dansylamino)undecanoic acid (DAUDA) leverde bijvoorbeeld een bindende stoichiometrie op van 0,66 ondanks het bezit van een grote hydrofobe holte op gelijke voet met Bla g 124. Evenzo bleken de bindingsspecifiekheid en stoichiometrie van plant nsLTPs sterk te variëren, afhankelijk van de vraag of de lipiden en eiwitten eerst in methanol worden oplosbaar voordat een waterige buffer wordt toevoeging, wat aangeeft dat ligand en/of bindingsplaatstoegankelijkheid een beperkende factor25was .
Naast Bla g 1 hebben we met succes dezelfde strategie toegepast op verschillende andere MA-domeineiwitten van kakkerlakken en muggen (A. aegypti), evenals Der p 2 (gegevens niet weergegeven). We merkten op dat zowel de Bla g 1 homologues als Der p 2 op een ander tijdstip uit de C18 kolom (stap 3.3) eluteerden. De elutiegradiënten in deze stap moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor andere eiwitten. Als alternatief kunnen HPLC-kolommen met een minder hydrofobe stationaire fase (bijv. C8) worden gebruikt, hoewel in het geval van Bla g 1 de verhoogde hydrofobiciteit van de C18-kolom noodzakelijk was om diacylfosfolipideverontreinigingen uit ecBla g 1 volledig te verwijderen. Ondanks de verschillen in biofysische en biochemische eigenschappen, hebben we dit protocol extreem robuust gevonden en gemakkelijk kunnen worden toegepast op andere allergene eiwitten. Hoewel de gebruikte zware omstandigheden een potentiële beperking kunnen vormen , vermindert de verhoogde veerkracht die voor veel allergenen wordt waargenomen de impact ervan26,27. Er zijn inderdaad verschillende voedsel- en inhalatieallergenen zoals Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 en Lep w 1 waargenomen om hun structuur en immunogeniciteit te herstellen na thermische denaturatie, hoewel optimalisatie van bufferomstandigheden vereist kan zijn28,29,30,31,32,33; bijvoorbeeld reversibele denaturatie van nsLTP's (Cor a 8) en thaumatinen (Mal d 2 en Act d 2) wordt alleen waargenomen bij zure (pH <4) aandoeningen28,30,31. Bovendien moet worden opgemerkt dat de auteurs niet hebben geprobeerd om de timing of temperaturen die in het gloeiprotocol worden gebruikt, te optimaliseren. Het is mogelijk dat ligandslubilisatie en eiwitvouwen/uitvouwen kunnen worden bereikt met een lagere maximumtemperatuur zoals gezien bij Ber e 1 waarvoor omkeerbare denaturatie wordt bereikt bij 82 °C29. Het gebruik van dergelijke maatregelen zal naar verwachting het scala aan allergenen waarop dit protocol kan worden toegepast, uitbreiden.
Een andere belangrijke overweging bij het aanpassen van dit protocol aan andere allergene systemen is de concentratie liganden die nodig is tijdens het gloeiproces. In het geval van Bla g 1 is de verwachte opbrengst ~0,25–0,4 μmol eiwit per 1 L celkweek. Gezien de aangetoonde bindende stoichiometrie van 8 vetzuren of 4 diacylketenlipiden per allergeen, werd een 20-40-voudig molair overmaat aan lading (5-10 μmol) gebruikt. Opgemerkt moet worden dat het lipidenbindende vermogen van Bla g 1 en zijn homologen uniek is; bijvoorbeeld nsLTP's worden algemeen aanvaard om maximaal twee lipide liganden25 te binden, terwijl lipocalines minder dan 1 stoichiometriehebben 34. Als zodanig kan het volledig laden van dit soort allergenen worden bereikt met een kleinere overmaat aan liganden. Een laatste overweging bij het aanpassen van dit protocol aan andere allergene systemen is de aanwezigheid van disulfidebindingen, die problematisch kunnen zijn als ze niet goed worden gevormd voorafgaand aan de denaturering. Een mogelijke aanpak zou zijn om het gloeiproces uit te voeren in aanwezigheid van een reductiemiddel zoals 2 mM DTT. De inheemse disulfidebindingen kunnen vervolgens opnieuw worden gevormd door de toevoeging van gereduceerd en geoxideerd glutathion zoals beschreven voor het pinda-allergeenfragment bestudeerd door Aalberse et al.35. In dit geval moet het herstel van de juiste disulfidebinding empirisch worden beoordeeld aan de hand van massaspectrometrie35.
In dit werk beschrijven we een techniek waarmee allergenen kunnen worden gedelipideerd en opnieuw gegloeid met verschillende fosfolipide- en vetzuurladingen. Er zijn echter veel andere klassen van potentieel immunogene of adjuventiserende liganden aanwezig in gemeenschappelijke allergenenreservoirs. Er zijn bijvoorbeeld katten-, honden- en mijtallergenen voorgesteld om lipopolysacchariden (LPS) en andere bacteriële lipiden uit huisstof te binden36, terwijl is aangetoond dat de Bet v 1 complexe flavonoïden uit de pollenmatrix13extraheert. Het protocol dat in dit werk wordt beschreven, kan eenvoudig worden aangepast om de rol van deze lipiden op een meer gedetailleerde manier te verkennen. Als proof of concept hebben we kunnen aantonen dat de hydrofobe holte van Bla g 1 in staat is lipoteichoïnezuur (LTA) te binden aan de celwanden van grampositieve bacteriën, maar LPS uitsluit van gramnegatieve soorten, wat mogelijk het grotere aantal acylketens in de laatste9weerspiegelt. Nog een stap verder zou men het thermische denaturatie/gloeiprotocol kunnen gebruiken om fluorescerende sondes en andere niet-natuurlijke vetzuuranalogen in allergene eiwitten op te nemen. Inderdaad, we waren in staat om de hydrofobe holte van de muggenhomoloog van Bla g 1 met DAUDA te laden, waardoor extra wegen werden geopend om de effecten van lipide liganden op allergene ziekten te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We willen Dr. Tom Kirby, Scott Gabel en Dr. Robert London bedanken voor hun hulp en bijstand tijdens dit werk, samen met Dr. Bob Petrovich en Lori Edwards voor het gebruik van hun instrumentatie en hun hulp bij het genereren van de Bla g 1-constructies die in deze studie worden gebruikt. We danken Andrea Adams voor hulp bij de massaspectrometrie en Dr. Eugene DeRose voor hulp bij de NMR-instrumentatie. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramuraal Onderzoeksprogramma van het NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of Environmental Health Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
