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Biology

Ingénierie génomique des cellules B humaines primaires à l’aide de CRISPR/Cas9

Published: November 3, 2020 doi: 10.3791/61855
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Pediatrics, University of Minnesota, 2Center for Genomic Engineering, University of Minnesota, 3Masonic Cancer Center, University of Minnesota

Summary

Ici, nous fournissons un protocole détaillé, étape par étape pour crispr / Cas9 basée sur l’ingénierie du génome des cellules B humaines primaires pour les gènes KNOCKOUT (KO) et knock-in (KI) pour étudier les fonctions biologiques des gènes dans les cellules B et le développement de la thérapeutique à cellules B.

Abstract

Les cellules B sont des lymphocytes dérivés de cellules souches hématopoïétiques et sont un composant clé du bras humoristique du système immunitaire adaptatif. Ils font des candidats attrayants pour les thérapies cellulaires en raison de leur facilité d’isolement du sang périphérique, leur capacité à se développer in vitro, et leur longévité in vivo. En outre, leur fonction biologique normale , pour produire de grandes quantités d’anticorps - peut être utilisé pour exprimer de très grandes quantités d’une protéine thérapeutique, comme un anticorps recombinant pour lutter contre l’infection, ou une enzyme pour le traitement des enzymopathies. Ici, nous fournissons des méthodes détaillées pour isoler les cellules B humaines primaires des cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMCs) et activer/étendre les cellules B isolées in vitro. Nous démontrons ensuite les étapes impliquées dans l’utilisation du système CRISPR/Cas9 pour le KO spécifique au site des gènes endogènes dans les cellules B. Cette méthode permet de KO efficace de divers gènes, qui peuvent être utilisés pour étudier les fonctions biologiques des gènes d’intérêt. Nous démontrons ensuite les étapes à prendre pour utiliser le système CRISPR/Cas9 ainsi qu’un vecteur viral recombinant, associé à l’adéno-associé (rAAV) pour une intégration efficace spécifique au site d’une cassette d’expression transgénique dans les cellules B. Ensemble, ce protocole fournit une plate-forme d’ingénierie étape par étape qui peut être utilisée dans les cellules B humaines primaires pour étudier les fonctions biologiques des gènes ainsi que pour le développement de la thérapeutique à cellules B.

Introduction

Les cellules B sont un sous-groupe de la lignée des lymphocytes dérivés des cellules souches hématopoïétiques. Ils jouent un rôle critique dans le système immunitaire adaptatif de l’humour en produisant de grandes quantités d’anticorps en réponse aux défis immunitaires1. Les cellules B sont également des précurseurs des cellules B de mémoire et des cellules plasmatiques en phase terminale différenciées et de longue durée, fournissant ainsi une immunité humoristiquedurable 2. Les cellules plasmatiques, en particulier, sont uniques parmi les cellules immunitaires dans leur capacité à produire de grandes quantités d’un anticorps spécifique tout en survivant pendant des années ou desdécennies 3. En outre, la facilité d’isolement du sang périphérique fait de la lignée des cellules B un excellent candidat pour les nouvelles thérapies cellulaires4.

Auparavant, des méthodes d’intégration aléatoires, telles que celles utilisant des vecteurs lentiviraux ou un transposon de la Belle au bois dormant, ont été utilisées pour concevoir des cellules B pour la livraison et l’expression transgéniques5,6,7,8. Cependant, la nature non spécifique de ces approches rend difficile l’étude des fonctions biologiques d’un gène spécifique dans les cellules B et comporte un risque inhérent de mutagenèse insertionnelle et d’expression transgénique variable et/ou de silencing dans le cadre thérapeutique.

Le système CRISPR/Cas9 est un puissant outil d’ingénierie du génome qui permet aux chercheurs de modifier avec précision le génome de diverses cellules chez de nombreuses espèces. Récemment, deux groupes, dont le nôtre, ont développé avec succès des méthodes d’expansion ex vivo et d’ingénierie génomique ciblée des cellules Bhumaines primaires 9,10. Nous décrira le processus de purification des cellules B humaines primaires à partir d’un échantillon de leucémie. Après cela, nous allons décrire notre protocole mis à jour pour l’expansion des cellules B et l’activation des cellules B isolées. Nous décrira ensuite un processus d’assommage du cluster de différenciation 19 (CD19), un récepteur spécifique des cellules B et une caractéristique des cellules B, par électroporation pour introduire l’ARNm CRISPR/Cas9 ainsi que le SGRNA CD19 dans les cellules B activées.

L’ARNm Cas9 est traduit et se lie au CD19 sgRNA pour former un complexe ribonucléoprotéine CRISPR/Cas9-sgRNA (RNP). Par la suite, sgRNA dans le complexe conduit Cas9 à créer une rupture à double brin (DSB) à la séquence cible sur l’exon 2 du gène. Les cellules répareront l’ORD en « joignant l’extrémité non homologue » en introduisant ou en supprimant les nucléotides, ce qui entraîne une mutation du changement de cadre et l’étruisation du gène. Nous mesureons ensuite la perte de CD19 par cytométrie de débit et analyserons la formation d’indélébiles en suivant les indélébiles par analyse de décomposition (TIDE).

Nous décririons ensuite le processus d’utilisation de CRISPR/Cas9 avec un vecteur recombinant AAV6 (rAAV6, un modèle de donneur pour la réparation dirigée par homologie (HDR)) pour médiation de l’insertion spécifique au site de protéines fluorescentes vertes améliorées(EGFP) au site d’intégration du virus associé à l’adéno-associé 1 (AAVS1) gène. Le gène AAVS1 est un locus actif sans fonctions biologiques connues et un site d’intégration virale AAV sur le génome humain; par conséquent, il est considéré comme une « sphère de sécurité » pour l’ingénierie génomique. Ici, nous rapportons que l’expansion et l’activation des cellules B ont permis jusqu’à 44 fois l’expansion en 7 jours de culture (figure 1). L’électroporation des cellules B a montré une légère réduction de la santé globale des cellules (figure 2A) à 24 h post-transfection. L’analyse de l’intrigue scatter du marqueur CD19 (Figure 2B) a montré jusqu’à 83% de réduction dans les cellules éditées (Figure 2C).

L’analyse TIDE des chromatographes (figure 3A) a révélé que les indels en % étaient semblables à la perte de % de protéines par cytométrie de débit (figure 3B). L’analyse de cytométrie de flux de l’expérience KI a montré que les cellules qui ont reçu le vecteur AAV (figure 4), ainsi que le RNP, ont exprimé jusqu’à 64 % de cellules egfp-positives (figure 5A) et plus tard ont montré l’intégration réussie par la réaction en chaîne de polymétrose de jonction (PCR) (figure 5B). Le dénombrement des cellules a montré que tous les échantillons se sont rapidement rétablis dans les 3 jours suivantl’ingénierie ( figure 5C).

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Protocol

Des échantillons de leucémie provenant de donneurs en bonne santé ont été obtenus auprès d’une banque de sang locale. Toutes les expériences décrites ici ont été déclarées exemptes de recherche par l’Institutional Review Board (IRB) et ont été approuvées par le Institutional Biosafety Committee (IBC) de l’Université du Minnesota.

REMARQUE : Toutes les expériences ont été effectuées conformément à la précaution universelle pour les agents pathogènes transmissibles par le sang, avec des techniques stériles/aseptiques et un équipement de niveau 2 de biosécurité approprié.

1. Préparez des suppléments pour le milieu d’expansion de B-cellule

  1. Reconstituer l’oligonucléotide cpg à une concentration de 1 mg/mL.
  2. Reconstituer le CD40 ligand (CD40L) à une concentration de 100 μg/mL.
  3. Reconstituer l’IL-10 humain recombinant (rhIL-10) à une concentration de 50 μg/mL.
  4. Reconstituer l’IL-15 humain recombinant (rhIL-15) à une concentration de 10 μg/mL.
    REMARQUE : Gardez chaque supplément en petits aliquots à -20 °C à -80 °C jusqu’à 6 mois.

2. Préparer le milieu basal

  1. Combinez le milieu basal à cellules B avec un supplément média de 5 % (v/v) pour l’expansion in vitro des cellules immunitaires (p. ex., CTS Immune Cell SR) et de 1 % (v/v) de pénicilline et de streptomycine.
  2. Stériliser le milieu basal à l’aide d’un adaptateur filtre de 0,22 μm dans une bouteille stérilisée.
  3. Garder le milieu basal à 4 °C jusqu’à 1 mois.

3. Préparer le milieu d’expansion des cellules B

  1. Transférer la quantité requise du milieu basal dans un récipient stérile pour culturer les cellules B à 5 × 105 cellules/mL.
  2. Compléter le milieu basal avec 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 et 10 ng/mL rhIL-15.
  3. Filtrer le milieu d’expansion des cellules B à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
  4. Equilibrer le milieu d’expansion des cellules B dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 °C, 5 % de CO2 avec humidité pendant au moins 30 min avant utilisation.
    REMARQUE : Préparez un milieu d’expansion frais à cellules B à utiliser pendant une journée. Ne préparez pas le milieu d’expansion des cellules B à utiliser pendant plusieurs jours. Cette recette médiatique encourage la prolifération des cellules B de mémoire et des cellules B humaines primaires activées.

4. Purification et expansion des cellules B humaines

REMARQUE : Ajouter de l’alcool isopropylique à 99 à 100 % dans un contenant de congélation à température contrôlée, suivant les instructions du fabricant, et réfrigérer le contenant de congélation à 4 °C avant de commencer l’étape 4.1.

  1. Isoler les PBMCs d’un échantillon de leucémie
    1. Transférer un échantillon de leucémie (environ 8-10 mL) dans un tube conique stérile de 50 mL.
    2. Porter le volume à 35 mL avec une solution saline stérile de 1 x tamponné de phosphate (PBS).
    3. Superposez soigneusement un échantillon de leucémie de 35 mL sur 15 mL de dénivelé moyen.
    4. Centrifugeuse à 500 × g pendant 25 min sans frein, enlever la couche plasmatique sans déranger la couche buffy (couche PBMC), collecter les PBMCs de l’interface, et le transfert vers un nouveau tube conique stérile de 50 mL.
    5. Faites monter les PBMCs à 50 mL avec 1x PBS.
    6. Centrifugeuse à 500 × g pendant 5 min sans frein. Retirez le supernatant sans déranger la pastille PBMC, qui peut sembler rouge.
    7. Ajouter 7 mL de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium, pipette 3 fois pour bien mélanger et incuber à température ambiante (RT) pendant 3 min.
    8. Porter le volume à 50 mL avec 1x PBS.
    9. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min avec frein à faible résistance. Retirer le surnatant sans déranger la pastille. La pastille doit avoir l’air rosée ou blanche.
      REMARQUE : Pour continuer à culturer les cellules B fraîchement isolées, préparez le milieu d’expansion des cellules B avant de commencer l’isolement des cellules B (étape 4.2).
  2. Isolement des cellules B des PMC à l’aide d’un kit d’isolement négatif primaire à cellules B humaines
    1. Resuspendez les PBMCs dans le tampon d’isolement à une concentration de 5 × 107 cellules/mL.
      REMARQUE : Si le nombre total de PBMCs est inférieur à 5 × 107 cellules, réduire le volume de tampon d’isolement pour maintenir 5 × 107 cellules/mL. Les volumes minimaux et maximaux de suspension cellulaire sont respectivement de 0,25 mL et de 8 mL.
    2. Transférer jusqu’à 8 mL (5 × 107 cellules/mL) dans un tube stérile en polypropylène à fond rond avec capuchon.
    3. Ajouter 50 μL/mL d’exhausteur de cocktails aux PBMCs.
    4. Ajouter 50 μL/mL de cocktail isolation aux PBMCs, capuchon le tube et inverser 2 à 3 fois pour mélanger.
    5. Incuber à RT pendant 5 min; à la4ème minute d’incubation, les microbilles magnétiques vortex pendant au moins 30 s.
    6. Transférer 50 μL de microbilles magnétiques par 1 mL de PBMCs, capuchon le tube, et inverser 2-3 fois pour mélanger.
    7. Rechargez jusqu’à 10 mL avec tampon d’isolement et pipette doucement de haut en bas 2-3 fois.
    8. Placer le tube dans une station magnétique et incuber à RT pendant 3 min.
    9. Maintenez l’aimant et le tube ensemble, et en un seul mouvement, inversez l’aimant et le tube ensemble pour verser la suspension cellulaire dans le nouveau tube. Jeter l’ancien tube.
    10. Répétez l’étape 4.2.8 (réduisez le temps d’incubation à 2 min) et versez la suspension de la cellule B dans un tube conique propre.
    11. Les cellules B enrichies sont prêtes à l’emploi. Si les cellules sont utilisées immédiatement, continuer à la section 4.3 (expansion des cellules B humaines). Vérifiez la pureté des cellules B isolées par cytométrie d’écoulement (facultatif). Si les cellules doivent être congelées avant utilisation, continuer à marcher 4.2.12.
    12. Pour congeler les cellules B, centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min, et jeter le supernatant sans déranger la pastille.
    13. Resuspendez les cellules dans le milieu de congélation à10 7 cellules/mL, et aliquot 1 mL/cryovial.
    14. Placer le cryovial dans le contenant de congélation réfrigéré et conserver à -80 °C toute la nuit; puis, transférer le cryovial congelé dans un réservoir d’azote liquide; garder les cellules congelées jusqu’à 1 an.
      REMARQUE : Le rendement prévu des cellules B isolées est de 2 % à 8 % du total des PMC, avec une viabilité de 95 % à 99 %.
  3. Expansion humaine des cellules B
    REMARQUE : Si vous utilisez des cellules B fraîchement isolées, sautez les étapes 4.3.1-4.3.5. Comptez les cellules et transférez le nombre requis de cellules dans un tube conique stérile et continuez avec l’étape 4.3.6.
    1. Sérum bovin fœtal préchauffé (FBS) dans un bain d’eau avant le dégel des cellules B. Préparer 20 mL de milieu d’expansion des cellules B, transférer dans un flacon T25 et prééquilibrer le milieu dans un incubateur de culture tissulaire (à 37 °C, 5 % de CO2,avec humidité) au moins 15 minutes avant utilisation.
    2. Décongeler les cellules B dans un bain d’eau de 37 °C. En attendant, transférer 2 mL de FBS préchauffé dans un tube conique stérile de 15 mL.
    3. Une fois que les cellules B sont complètement décongelées, ajouter immédiatement 1 mL de FBS préchauffé, drop-wise, dans l’échantillon. Incuber à RT pendant 1 min.
    4. Pipette doucement pour résuspendre l’échantillon et transférer l’ensemble du volume, dans le sens de la goutte, dans un tube conique contenant 2 mL de FBS préchauffé.
    5. Porter le volume à 15 mL avec 1x PBS stérile, capuchon, et inverser le tube doucement 2-3 fois.
    6. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min.
    7. Jetez le supernatant sans déranger la pastille cellulaire, résuspendez la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu d’expansion pré-équilibré de cellules B, et comptez les cellules. Le nombre total de cellules devrait être d’environ 107 cellules.
    8. Transférer les cellules dans un flacon contenant 20 mL du milieu d’expansion pré-équilibré des cellules B. La concentration finale des cellules doit être d’environ 5 x 105 cellules/mL.
    9. Incuber le flacon verticalement dans un incubateur de culture tissulaire.
    10. Rafraîchissez complètement le milieu d’expansion tous les 2 jours en transférant tout le volume des cellules B dans un tube conique stérile et répétez les étapes 4.3.6-4.3.9.
      REMARQUE : Le flacon T25 peut contenir de 10 à 20 mL de milieu; Le flacon T75 peut contenir jusqu’à 20 à 60 mL de milieu.

5. Ingénierie humaine primaire de B-cellule

  1. Cellules B d’ingénieur à 48 ± 2 h après expansion/activation pour des résultats optimaux. Préparer le milieu d’expansion des cellules B, aliquot 1 mL du milieu dans une plaque de culture tissulaire de 48 puits, et pré-équilibrer dans un incubateur de culture tissulaire au moins 15 minutes avant utilisation.
    REMARQUE : Lors de la conception d’un SGRNA CRISPR/Cas9 pour un gène d’intérêt, suivez les étapes décrites ci-dessous.
    - Concevoir sgRNAs à l’aide d’un outilen ligne 11.
    - Concevoir des sgARN sur un exon commun à tous les isoformes de la protéine.
    - Commandez du sgRNA chimiquement modifié auprès d’entreprises réputées.
    - sgRNA vient généralement sous forme lyophilisée; reconstituer le sgRNA dans le tampon stérile DNase/RNase-free Tris-EDTA (TE) à une concentration de 1 μg/μL.
  2. Préparer le substrat transfecteur CRISPR/Cas9 en mélangeant 1 μL (1 μg/μL) de sgRNA chimiquement modifié avec 1,5 μL (1 μg/μL) de pyogènes Streptococcus cas 9 (S.p. Cas9) par réaction transfection. Pour le contrôle, utilisez 1 μL de tampon TE au lieu de sgRNA.
    REMARQUE : Lorsque le CD19 sgRNA est utilisé pour une expérience de KO génétique, voir la figure 2 pour obtenir des résultats. Lorsque l’AAVS1 sgRNA est utilisé pour une expérience ki génétique, voir la figure 5 pour obtenir des résultats.
    • Gardez tous les composants sur la glace.
  3. Mélanger délicatement et transférer 2,5 μL de substrat transfecteur CRISPR/Cas9 par réaction dans un tube d’une bande de 0,2 mL à 8 tubes; mis de côté à RT.
  4. Allumez un nucléofector (électroporateur) et préparez des réaccentrages de transfection comme le montre le tableau 1.
    REMARQUE : Il s’agit d’une bonne étape pour une pause, si nécessaire, en mettant tous les reagents sur la glace. Retirez tous les reagents de la glace lorsqu’ils sont prêts à reprendre l’expérience. Lors de l’utilisation de la protéine S.p. Cas9, l’investigateur DOIT pré-complexe CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein en mélangeant 1 μg sgRNA avec 5 μg de protéine S.p. Cas9, en évitant toute bulle, et en incubant le mélange à RT pendant au moins 20 min avant utilisation pour des résultats optimaux.
  5. Comptez et transférez10 cellules B par réaction de transfection dans un tube conique stérile.
  6. Porter le volume à 15 mL avec 1x PBS stérile, et centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min. En attendant, préparez le réaccente de transfection des cellules primaires (tableau 2) et mettez de côté à RT.
  7. Jetez le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  8. Resuspendez la pastille cellulaire avec 10 mL de 1x PBS stérile et centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min.
  9. Jetez complètement le surnatant sans déranger la pastille cellulaire.
  10. Transférer 0,5 μg d’ARNm GFP chimiquement modifié (en tant que reporter de transfection) par 10cellules B à la pastille cellulaire (facultatif).
  11. Resuspendre la pastille cellulaire avec 20 μL réaménagement de transfection cellulaire primaire par 10cellules B 6; mélanger délicatement en pipetting 5-6 fois. Transférer 20,5 μL par réaction de transfection dans le tube de 0,2 mL de la bande à 8 tubes contenant 2,5 μL du substrat de transfection CRISPR/Cas9.
  12. Pipette de haut en bas une fois pour mélanger et transférer l’ensemble du volume (23 μL) dans une cuvette transfection. Capuchon et appuyez doucement sur la cuvette sur le banc pour vous assurer que le liquide recouvre le fond de la cuvette.
  13. Utilisez le protocole primaire humain de B-cellule sur le nucléofector pour la transfection.
    REMARQUE : Le nucléofector (électroporateur) peut être placé et utilisé à l’extérieur du capot de culture tissulaire. Capuchon de la cuvette pour assurer la stérilité.
  14. Reposer les cellules électroporées dans la cuvette à RT pendant 15 min.
  15. Transférer 80 μL du milieu d’expansion pré-équilibré des cellules B de la plaque de culture tissulaire dans la réaction de transfection dans la cuvette. Placer la cuvette dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 30 min.
  16. Pipette doucement à quelques reprises pour mélanger et transférer tout le volume de l’échantillon de la cuvette à un puits approprié d’une plaque de culture tissulaire de 48 puits contenant 1 mL du milieu d’expansion des cellules B. La concentration finale des cellules doit être de 106 cellules/mL.
  17. Si vous effectuez une expérience de KI génétique, transférez le vecteur rAAV6 à 500 000 multiplicité d’infection dans le puits approprié contenant des cellules électroporées (environ 45 min après électroporation). Voir exemple de construction vectorielle rAAV6 dans la figure 4A.
    REMARQUE : Par exemple : Un échantillon de contrôle sera électroporé sans CRISPR/Cas9 ou le vecteur rAAV6. Un échantillon vectoriel uniquement sera électroporé sans CRISPR/Cas9, puis transduit avec le vecteur rAAV6. Un échantillon KI sera électroporé avec CRISPR/Cas9, puis transduit avec le vecteur rAAV6. rAAV6 doit contenir des bras d’homologie en amont et en aval du site ciblé de l’ORD pour hdr.
  18. Placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C et 5 % de CO2 avec humidité.
  19. Comptez les cellules et enregistrez la viabilité au jour 1 après l’ingénierie.
  20. Rafraîchissez le milieu d’expansion des cellules B tous les 2 jours en comptant les cellules, puis en transférant tout le volume des cellules dans un tube de microcentrifugeuse propre de 1,5 mL. Centrifugeuse à 400 × g pendant 5 min, et jeter le supernatant sans déranger la pastille. Resuspendez les cellules avec 100 μL de milieu frais d’expansion de B-cellule, et transférez à un puits d’une plaque de culture de tissu de 24 puits. Faire monter le volume moyen pour atteindre une concentration cellulaire finale à 5 × 105 cellules/mL.
    REMARQUE : Une plaque de 48 puits peut contenir jusqu’à 1 mL moyen/puits; une plaque de 24 puits peut contenir jusqu’à 2 mL moyen/puits; une plaque de 12 puits peut contenir jusqu’à 4 mL moyen/puits, et une plaque de 6 puits peut contenir jusqu’à 8 mL moyen/bien.
  21. Permettre aux cellules modifiées de se développer pendant au moins 5 jours avant d’effectuer des analyses en aval, comme pour l’analyse de la cytométrie du débit, l’analyse TIDE et la jonction PCR.

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Representative Results

Le protocole d’expansion et d’activation mis à jour a permis l’expansion rapide des cellules B jusqu’à 44 fois en 7 jours(figure 1; n =3 donneurs). Dans l’expérience KO, le nombre de cellules B utilisant la coloration bleue Trypan a montré plus de 80% de cellules viables avec une légère réduction de la récupération cellulaire dans le contrôle et les échantillons de KO CD19 à 24 h après électroporation (Figure 2A; p ≥ 0,05, n = 3 donneurs). Ce résultat indique que l’électroporation a légèrement affecté la santé globale des cellules B. Des cellules B ont été rassemblées le jour 5 post-transfection pour la cytométrie d’écoulement et les analyses de MARÉE. Les diagrammes représentatifs de dispersion de l’échantillon de contrôle et de KO ont montré 14% et 95% de cellules CD19-négatives, respectivement (figure 2B). La quantitation des parcelles de débit a montré une réduction significative de l’expression du CD19 dans les échantillons de KO par rapport au contrôle(figure 2B; p ≤ 0,0001, n = 3 donneurs). Les chromatogrammes de séquençage génomique (voir séquences d’amorce dans le tableau 3)ont montré des pics doubles dans les cellules CD19 KO B, indiquant des insertions/suppressions de nucléotides post-CRISPR/Cas9-2008, tandis que des pics simples ont été observés dans le contrôle, indiquant qu’aucune DSB ne s’est produite dans cet échantillon (figure 3A). L’analyse indélébile des chromatographes (à l’aide d’un outil d’analyse TIDE en ligne gratuit) des échantillons de KO a montré un pourcentage élevé de formation d’indélébiles (>90%) au locus CD19, ce qui correspond à la perte de protéines CD19 en % détectée par cytométrie du débit(figure 3B; p ≥ 0,05, n = 3 donneurs). Ces résultats indiquent que CRISPR/Cas9 a généré efficacement un KO CD19 dans les cellules B. Les cellules B de l’expérience KI ont été collectées le jour 12 après l’ingénierie pour la cytométrie du débit et les analyses PCR de jonction (tableau 4). Les parcelles scatter ont montré 64 % des cellules positives à l’EGFP dans l’échantillon qui a reçu le vecteur rAAV6 (figure 4) ainsi que le RNP, alors qu’aucune cellule positive à l’EGFP n’a été observée dans le contrôle; une positivité minimale de l’EGFP a été observée dans l’échantillon qui n’a reçu qu’un vecteur AAV (figure 5A). Une amplification pcr de jonction (voir séquences d’amorce dans le tableau 3) a montré 1,5 Kbps amplicons dans l’échantillon KI (Figure 5B), alors qu’aucun produit PCR n’a été observé dans l’échantillon de contrôle ou vectoriel seulement. Le nombre de cellules a montré que le processus d’ingénierie affecte la récupération cellulaire dans l’échantillon KI plus que le contrôle ou les échantillons vectoriels seulement (figure 5B). Toutefois, tous les échantillons ont rapidement rebondi dans les 3 jours suivant l’ingénierie( figure 5B). Ensemble, ces résultats indiquent que l’intégration réussie de l’EGFP au locus AAVS1 conduit à l’expression stable de l’EGFP au moins 12 jours après l’ingénierie.

Figure 1
Figure 1 : Expansion in vitrodes cellules B. Les cellules B ont été ensemencées à 1 ×10 6 cellules le jour 0 (zéro) à une densité de 5 × 105 par mL et élargies 44 fois en 7 jours (n=3 donneurs indépendants). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2A
Figure 2A : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2B
Figure 2B : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2C
Figure 2C : KNOCKOUT CD19 (KO) à 19 œillets CRISPR/Cas9 dans les cellules B. (A) Graphique à barres montre >70% récupération cellulaire (panneau gauche) et >80% viabilité (panneau droit) des cellules post transfection ont été observés à la fois dans le contrôle et les échantillons de CD19 KO à 24 heures après électroporation. (B) Les parcelles représentatives de flux de CD19 gating des cellules vivantes montre 84,3% et 3,43% de cellules CD19 positives dans l’échantillon de contrôle et l’échantillon DE CD19 KO, respectivement. (C) Le graphique à barres montre une réduction significative du CD19 dans le groupe KO CD19 à 19 œils CRISPR/Cas9 (p ≤ 0,0001). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3A
Figure 3A : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3B
Figure 3B : Perte de protéines CD19 par rapport à la formation d’indélébiles. (A) Les chromatogrammes représentent les pics de séquençage de l’échantillon de contrôle et de CD19 KNOCKOUT (KO). La boîte grise sur les pics de commande met en évidence la séquence cible de CD19 gRNA avec le site de coupe prévu indiqué par une flèche. Cd19 KO a montré des « doubles pics » de séquençage autour du site de coupe prévu, indiquant l’insertion/suppression des nucléotides après la rupture à double brin. (B) Graphique à barres montrant des résultats cohérents entre % de perte de protéines CD19 et % de formation d’indélébiles au locus CD19 (p ≥ 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : construction vectorielle RAAV6 AAVS1 MND-GFP. La cassette d’expression contient une séquence synthétique forte de promoteur (MND), immédiatement suivie d’une séquence de codage améliorée de protéine verte de fluorescence (EGFP) et d’une séquence de polydénylation (Poly A). Les bras homologiques AAVS1 flanquent en amont du promoteur MND et en aval des séquences de poly A. L’EGFP sera exprimée en vertu de la réglementation du promoteur du MDN. Les longueurs de séquence sont indiquées au-dessus de chaque composant de la construction. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5A
Figure 5A : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5B
Figure 5B : Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5C
Figure 5C : Intégration spécifique au site de CRISPR/Cas9 et rAAV6 de la cassette de reporter EGFP dans les cellules B au jour 12 post-ingénierie. (A) La parcelle de flux représentatif ne montre aucune cellule B positive à l’EGFP ni dans l’échantillon de contrôle ni dans l’échantillon vectoriel seulement contre 64,4 % des cellules B positives à l’EGFP de l’échantillon knockin (KI). (B) La réaction en chaîne de polymése de jonction de l’échantillon de KI montre la bande prévue de 1,5 Kbps ; aucune bande n’a été trouvée dans l’échantillon de contrôle ou de vecteur seulement. L’eau a été utilisée pour s’assurer qu’il n’y avait pas de contamination pendant le processus de PCR. (C) Graphique à barres représente la croissance cellulaire de la lutte, le vecteur seulement, et les échantillons EGFP-KI sur une période de 3 jours après l’ingénierie. La ligne cassée indique le 1 × entrée de10 6 cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

nom séquence gRNA
CD19 (en) 5'-GCTGTGCTGCTGCTGCCTCAA-3'
AAVS1 (en) 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3'

Tableau 1 : séquences d’ARN gRNA.

Réactifs Volume par réaction 1
Solution P3 Primary Cell 16,4 mL
Supplément 1 3,6 mL
total 20 mL

Tableau 2 : Préparation du mélange de reagent nucléofection.

description séquence but
Amorce avant CD19 5'-AAATTCAGGAAAGGGTTGGAAG-3' Amplifier le locus CD19 pour l’analyse Indel
CD19 Amorce inversée 5'-GCGGACCTCTTCTGTCCATG-3' Amplifier le locus CD19 pour l’analyse Indel
Jonction PCR amorce avant 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' Jonction PCR
Jonction PCR Inversion de l’amorce 5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3 Jonction PCR

Tableau 3 : Amorce utilisée.

description Fluorophore clone
CD19 anti-humain PerCP (PerCP) HIB19 (HIB19)
Colorant de viabilité eFlour 780 -

Tableau 4 : Anticorps de cytométrie d’écoulement et colorant de viabilité.

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Discussion

L’ingénierie précise du génome dans les cellules B humaines primaires a été difficilejusqu’à récemment 9,10. Nous avions précédemment publié des protocoles utilisant CRISPR/Cas9 pour concevoir les cellules B humaines primaires9. Ici, nous décrivons des protocoles améliorés pour l’isolement, l’expansion et l’ingénierie des cellules B pour permettre un KO efficace de CD19 ou pour frapper-in EGFP.

Ici, nous démontrons que notre protocole d’expansion permet l’expansion rapide des cellules B en culture pour une expansion jusqu’à 44 fois en 7 jours (Figure 1). Ce protocole a montré un taux d’expansion plus rapide que ceux rapportés par Johnson et coll.9 et Hung et coll.10 Les étapes critiques pour assurer une expansion saine et rapide des cellules B primaires réapprovisionnent le milieu avec des facteurs d’activation frais tous les deux jours et veillent à ce que le nombre total de cellules B en culture ne dépasse pas 2 × 106 cellules/mL.

Nous avons également constaté que notre protocole amélioré pour la transfecting du système CRISPR/Cas9 pour CD19 KO a entraîné une efficacité élevée de CD19 KO (figure 2 et figure 3). Semblable à une étude précédente9, nous avons observé une légère réduction de la récupération cellulaire et la viabilité post-électroporation à 24 h. Ceci indique que l’électroporation affecte la santé globale de cellules des cellules B primaires ; cependant, les cellules finissent par rebondir dans les 48 h (données non montrées).

L’avantage de l’utilisation de ce protocole d’électroporateur est que nous pouvons électroporer des échantillons à un rythme beaucoup plus rapide (16 réactions en moins de 1 min), alors que les protocolesprécédents 9,10 prennent environ 10-12 min pour 16 réactions. En outre, ce système de transfection élimine l’arc électrique potentiel de l’électroporateur observé dans les études précédentes9,10. En outre, cette méthode d’ingénierie peut être mise à l’échelle pour un plus grand nombre de cellules B à l’aide de cuvettes plus grandes et disponibles dans le commerce (données non affichées).

Quelques étapes cruciales pour assurer une santé globale optimale des cellules et des gains d’efficacité de l’KO : Premièrement, assurez-vous que le milieu d’expansion des cellules B est préparé et prééquilibré pendant au moins 15 minutes avant utilisation. Deuxièmement, le volume total du substrat de transfection ne doit pas dépasser 20 % (v/v) du réaccente de nucléofection. Troisièmement, les cellules doivent être élargies/activées pendant 48 ± 2 h pour obtenir des résultats optimaux. Quatrièmement, appuyez doucement sur la cuvette d’électroporation avant de la placer dans l’électroporateur pour vous assurer que la solution de réaction de transfection couvre le fond de la cuvette. Cinquièmement, assurez-vous de reposer les cellules électroporées dans la cuvette pendant seulement 15 min à RT; laisser les cellules dans le réaccente de nucléofection après électroporation pendant trop longtemps peut nuire à la survie globale des cellules. Sixièmement, assurez-vous d’incuber les cellules avec des supports dans la cuvette pendant au plus 30 min. Septièmement, placer 106 cellules électroporées dans 1 mL pour les 48 premières h tend à aider les cellules à récupérer plus rapidement que de les culturer à une densité inférieure (données non montrées). Enfin, l’utilisation de l’ARNm Cas9 ou de la protéine Cas9 se traduira par des gains d’efficacité d’édition similaires (données non affichées); cependant, nous avons utilisé l’ARNm Cas9 pour plus de commodité et de coût.

Deux préoccupations majeures lors de l’utilisation de CRISPR/Cas9 sont les effets hors cible et les translocations chromosomiques. Les effets hors cible causés par des paires de base inadéquations de sgRNA à la séquence cible, conduisent à de nombreux sites de liaison possibles sur le génome et créent plusieurs KOs génétiques indésirables. Par conséquent, le score hors cible prévu devrait être pris en considération avec le score sur la cible afin de minimiser ce problème. La translocation chromosomique peut se produire en raison d’effets hors cible ou lors de l’assommation de plusieurs gènes. Cela peut provoquer des événements catastrophiques expérimentalement et cliniquement. Les éditeursde base 12 modifient un seul nucléotide (deux classes : éditeur de base de cytosine et éditeur de base d’adénine) pour perturber l’élément épissant, pour créer un codon prématuré d’arrêt, ou pour créer une mutation ponctuelle, menant au gène cible KO sans DSB (examiné intensivement ailleurs12). Ainsi, l’approche d’édition de base peut être utilisée pour les KOs mono ou à gène multiple pour contourner les translocations chromosomiques.

Nous démontrons également que CRISPR/Cas9, avec rAAV6, peut être utilisé pour servir efficacement de médiateur à ki spécifique au site et à l’expression de l’EGFP au locus AAVS1. Nous avons observé l’expression EGFP pendant au moins 12 jours après l’ingénierie. Nous avons également observé deux populations positives à l’EGFP : une expression élevée et intermédiaire-EGFP dans l’échantillon KI le jour 12 (figure 5A), tandis que l’échantillon vectoriel seulement a montré un pourcentage minimal de cellules avec l’expression intermédiaire d’EGFP. Nous spéculons que ce phénomène de « populations élevées et intermédiaires » est dû à l’intégration bialélique du vecteur. Une étude plus approfondie utilisant le PCR13 des cellules intermédiaires et à haute EGFP peut être faite pour confirmer cette hypothèse. Deux mises en garde sur l’utilisation de l’AAV comme vecteur : premièrement, les vecteurs AAV ont une petite capacité de chargement, jusqu’à 4,7 kilobases, ce qui pose des problèmes lorsqu’ils frappent un gros gène. La réduction de la taille des bras d’homologie permettra l’adaptation d’un gène plus grand, ce qui à son tour réduira l’efficacité ki (données non montrées). Alternativement, l’intégration simultanée ou séquentielle de vecteurs multiples de chargement de gènes peutêtre utilisée 14,15. Des études ont rapporté une réponse immunitaire et un dégagement des cellules aav-transduced dans les modèles animaux immunocompétents16,17. Alternativement, un modèle hdr donneur non viral peut être exploré pour contourner ce problème.

En résumé, nous avons démontré des processus complets, étape par étape, d’isolement, d’expansion et d’ingénierie des cellules B, ce qui a permis d’améliorer l’efficacité des modifications génétiques. Cette méthode d’ingénierie peut être utilisée pour le gène KO et pour étudier les fonctions des gènes dans les cellules B. En outre, cette méthode peut être utilisée pour concevoir des cellules B pour exprimer un anticorps recombinant pour lutter contre l’infection. Enfin, cette méthode peut être appliquée aux cellules B de l’ingénieur pour exprimer et sécréter des enzymes thérapeutiques qui peuvent être utilisées comme thérapie autologue à base de cellules pour traiter les enzymopathies.

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Disclosures

Un brevet a été déposé sur les méthodes de fabrication et d’utilisation de cellules B éditées par le génome avec M.J.J, K.L. et B.S.M. comme inventeurs. B.S.M est consultant et détient des actions d’Immusoft Inc. Immusoft Inc. a parrainé des recherches dans le laboratoire de B.S.M.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par le Children’s Cancer Research Fund (CCRF) et les NIH R01 AI146009 à B.S.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug IDT 1081059 smaller size is also available
Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza V4XP-3032
Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer Quality Biological 118-156-101
CleanCap chemically modified Cas9 mRNA Trilink Biotechnology L-7206-1000
CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg Invivogen TLRL-2006-5 different sizes available
Cryostor CS10, 100 mL STEMCELL Technology 7930
CTS Immune Cell SR Thermo Fisher Scientific A2596101
EasySep human B cells isolation kit STEMCELL Technology 17954
eBioscience fixable viability dye eFlour 780 eBiosciences 65-0865-14
Excellerate B cell media, Xeno-free R&D Systems CCM031 B-cell basal medium
Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube Corning 352059
Fetal Bovine Serum (FBS) R&D Systems S11550 For thawing B cells only
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03
GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps BioExpress T-3035-1 / 490003-692
Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS GE lifesciences SH30256.01
Lonza 4D Nucleofector core unit Lonza AAF-1002B
Lonza 4D Nucleofector X unit Lonza AAF-1002X
Mega CD40 Ligand Enzo Life Sciences ALX-522-110-C010
Mr. Frosty Sigma-Aldrich C1562-1EA For freezing cells
Pen/Strep 100X Sigma-Aldrich TMS-AB2-C
PerCP anti-human CD19 clone HIB19 biolegend 302228 smaller size is also available
rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) Vigene Biosciences N/A large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL
Recombinant human IL-10 protein 250 ug R&D Systems 217-IL-250 different sizes available
Recombinant human IL-15 protein 25 ug R&D Systems 247-ILB-025 different sizes available
The Big Easy EasySep Magnet STEMCELL Technology 18001 different sizes available
Tris-EDTA (TE) buffer Fisher Scientific BP2476100

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References

  1. LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
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Biologie Numéro 165 CRISPR/Cas9 ingénierie génomique AAV recombinant édition de gènes cellules B humaines primaires
Ingénierie génomique des cellules B humaines primaires à l’aide de CRISPR/Cas9
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Laoharawee, K., Johnson, M. J., Lahr, W. S., Peterson, J. J., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (165), e61855, doi:10.3791/61855 (2020).

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