Summary
Здесь мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол для CRISPR / Cas9 основе генома инженерных первичных клеток человека B для гена нокаут (KO) и стук-в (KI) для изучения биологических функций генов в клетках В и развитие В-клеточной терапии.
Abstract
В-клетки являются лимфоцитами, полученными из гематопоэтических стволовых клеток и являются ключевым компонентом гуморальной руки адаптивной иммунной системы. Они делают привлекательных кандидатов для клеточной терапии из-за их легкости изоляции от периферической крови, их способность расширяться в пробирке, и их долговечность in vivo. Кроме того, их нормальная биологическая функция – производить большое количество антител – может быть использована для выражения очень большого количества терапевтического белка, такого как рекомбинантное антитело для борьбы с инфекцией, или фермент для лечения энзимопатий. Здесь мы предоставляем подробные методы для изоляции первичных клеток человека B от периферических моноядерных клеток крови (PBMCs) и активации / расширения изолированных В-клеток in vitro. Затем мы демонстрируем шаги, связанные с использованием системы CRISPR/Cas9 для конкретного участка KO эндогенных генов в клетках группы В. Этот метод позволяет эффективно кОК различных генов, которые могут быть использованы для изучения биологических функций генов, представляющих интерес. Затем мы демонстрируем шаги по использованию системы CRISPR/Cas9 вместе с рекомбинантным, адено-ассоциированным, вирусным (rAAV) вектором для эффективной интеграции трансгенной экспресс-кассеты в B-клетках. Вместе этот протокол обеспечивает пошаговую инженерную платформу, которая может быть использована в первичных клетках В человека для изучения биологических функций генов, а также для развития В-клеточной терапии.
Introduction
В-клетки являются подгруппой линии лимфоцитов, полученных из гематопоэтических стволовых клеток. Они выполняют важную роль в адаптивной гуморальной иммунной системе, производя большое количество антител в ответ на иммунные проблемы1. В-клетки также являются предшественниками клеток памяти В и неизлечимо дифференцированных, долгоиговых плазменных клеток, обеспечивая тем самым прочный гуморальныйиммунитет 2. Плазменные клетки, в частности, уникальны среди иммунных клеток в их способности производить большое количество конкретных антител, выживая в течение многих лет илидесятилетий 3. Кроме того, легкость изоляции от периферической крови делает линию B-клеток отличным кандидатом для новых клеточных методовлечения 4.
Ранее методы случайной интеграции, такие как использование лентивирусных векторов или транспосона Спящей Красавицы, использовались для разработки В-клеток для доставкии выражения трансгенов 5,6,7,8. Однако неспецифический характер этих подходов затрудняет изучение биологических функций конкретного гена в клетках группы В и несет в себе риск вставки мутагенеза и переменной трансгенной экспрессии и/или замалчивания в терапевтической обстановке.
Система CRISPR/Cas9 является мощным инструментом инженерии генома, который позволяет исследователям точно редактировать геном различных клеток различных видов. В последнее время две группы, в том числе наши собственные, успешно разработали методы расширения ex vivo и целенаправленной инженерии генома первичныхклеток человека B 9,10. Мы опишем процесс очистки первичных клеток человека B из образца лейкофореза. После этого мы опишем наш обновленный протокол расширения B-клеток и активации изолированных В-клеток. Затем мы опишем процесс выбивания кластера дифференциации 19 (CD19), специфического В-клеточного рецептора и отличительной чертой В-клеток, путем электропорации для введения CRISPR/Cas9 mRNA вместе с CD19 sgRNA в активированные B-клетки.
Cas9 мРНК переводится и связывается с CD19 sgRNA, чтобы сформировать CRISPR/Cas9-sgRNA рибонуклеопротеин комплекс (RNP). Впоследствии, sgRNA в комплексе приводит Cas9 к созданию двухцепочего разрыва (DSB) в целевой последовательности на exon 2 гена. Клетки будут ремонтировать DSB путем "не-гомологичный конец присоединения" путем введения или удаления нуклеотидов, что приводит к мутации кадров и вызывая ген будет выбит. Затем мы измерим потерю CD19 по цитометрии потока и проанализируем образование индрета путем отслеживания иделей путем анализа разложения (TIDE).
Затем мы опишем процесс использования CRISPR/Cas9 вместе с рекомбинантным вектором AAV6 (rAAV6, донорским шаблоном для гомологического ремонта (HDR)) для опоставки вставки расширенного зеленого флуоресцентного белка(EGFP) на адено-ассоциированном вирусе интеграционного сайта 1 (AAVS1). Ген AAVS1 является активным локусом без известных биологических функций и местом вирусной интеграции AAV в геноме человека; поэтому он считается «безопасной гаванью» для геномной инженерии. Здесь мы сообщаем, что расширение и активация В-клеток позволили до 44-кратного расширения в 7 дней культуры(рисунок 1). Электропорация В-клеток показала небольшое снижение общего здоровья клеток(рисунок 2A) при 24 ч после трансфекции. Рассеянный анализ участка маркера CD19(рисунок 2B) показал до 83% сокращения отредактированных ячеек(рисунок 2C).
Анализ TIDE хроматографов (рисунок3A) показал, что % indels был похож на % потери белка по цитометрии потока(рисунок 3B). Цитометрия потока анализа эксперимента KI показала, что клетки, получившие вектор AAV(рисунок 4),вместе с RNP, выразили до 64% EGFP-положительных клеток(рисунок 5A),а затем показали успешную интеграцию путем соединения полимеразной цепной реакции (PCR) (Рисунок 5B). Количество ячеек показало, что все образцы быстро восстанавливаются в течение 3 дней после инженерии(рисунок 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы лейкафереза у здоровых доноров были получены в местном банке крови. Все эксперименты, описанные здесь, были определены как освобождаемые от исследований Институциональным советом по обзору (IRB) и были одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности (МКБ) в Университете Миннесоты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились в соответствии с универсальной мерой предосторожности для патогенных микроорганизмов, передающихся через кровь, с стерильными/асептическими методами и надлежащим оборудованием уровня биобезопасности-2.
1. Подготовка добавок для B-клеток расширения среды
- Восстановить cpG олигонуклеотид до концентрации 1 мг/мл.
- Восстановить лиганд CD40 (CD40L) до концентрации 100 мкг/мл.
- Восстановлен рекомбинантный человек ИЛ-10 (RHIL-10) с концентрацией 50 мкг/мл.
- Реконститующий рекомбинантный человеческий Ил-15 (RHIL-15) с концентрацией 10 мкг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите каждое дополнение в небольших aliquots при -20 градусов по Цельсию до -80 градусов по Цельсию на срок до 6 месяцев.
2. Подготовка базальной среды
- Объедините B-клеточную базальную среду с 5% (v/v) медиа дополнением для расширения иммунных клеток in vitro (например, CTS Immune Cell SR) и 1% (v/v) пенициллин и стрептомицин.
- Фильтр-стерилизовать базальной среде с помощью фильтра 0,22 мкм адаптер в стерилизованную бутылку.
- Держите базально-подкольную среду при 4 градусах Цельсия на срок до 1 месяца.
3. Подготовка среды расширения B-клеток
- Передача необходимого количества базальной среды в стерильный контейнер для культуры В-клеток на 5 ×10 5 клеток/мл.
- Дополните базальную среду 1 мкг/мл CpG, 100 нг/мл CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 и 10 ng/mL rhIL-15.
- Фильтруйте среду расширения B-клеток с помощью фильтра 0,22 мкм.
- Equilibrate B-клеток расширения среды в инкубаторе культуры тканей при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 с влажностью, по крайней мере 30 минут перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка свежих B-клеток расширения среды для использования в течение одного дня. Не подготовьтесь к использованию среды расширения B-клеток в течение нескольких дней. Этот рецепт средств массовой информации поощряет распространение клеток памяти В и активированных первичных клеток человека B.
4. Очистка и расширение В-клеток человека
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 99-100% изопропиловый спирт в контролируемый температурой замораживающий контейнер, следуя указанию производителя, и охладите замораживающий контейнер при температуре 4 градусов по Цельсию перед началом шага 4.1.
- Изолировать ПХМ От образца лейкофореза
- Перенесите образец лейкофореза (приблизительно 8-10 мл) в стерильную коническую трубку 50 мл.
- Довести громкость до 35 мл с стерильным 1x фосфат-буферным солевым раствором (PBS).
- Тщательно слой 35 мл лейкафорез образца на 15 мл плотности градиента среды.
- Центрифуга при 500 × г в течение 25 мин без тормоза, удалите плазменный слой, не нарушая баффи пальто (слой PBMC), соберите ПБК из интерфейса и перенесите в новую стерильную коническую трубку 50 мл.
- Довять ПМГ до 50 мл с 1x PBS.
- Центрифуга при 500 × 5 мин без тормозов. Удалите супернатант, не нарушая гранулы PBMC, которые могут показаться красными.
- Добавьте 7 мл буфера лиза аммония-хлорида калия, пипетку 3 раза, чтобы хорошо перемешать, и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 3 минут.
- Доветь громкость до 50 мл с 1x PBS.
- Центрифуга при 400 × г в течение 5 мин с тормозом низкого сопротивления. Удалите супернатант, не нарушая гранулы. Гранулы должны выглядеть розовато или белыми.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продолжить культуру свежеиспеченные В-клетки, подготовьте среду расширения B-клеток перед началом изоляции B-клеток (шаг 4.2).
- B-клеточная изоляция от PBMCs с использованием человека первичного B-клеток отрицательной изоляции комплект
- Повторное количество ПБМК в буфере изоляции до концентрации 5 × 107 ячеек/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если общее количество ПБМТ составляет менее 5 × 107 ячеек, смоем объем буфера изоляции для поддержания 5 × 107 ячеек/мл. Минимальные и максимальные объемы подвески ячейки - 0,25 мл и 8 мл соответственно. - Перенесите до 8 мл (5 × 107 клеток/мл) в стерильную, полипропиленовую, круглую нижнюю трубку с крышкой.
- Добавьте в ПКМЦ 50 йл/мл усилителя коктейлей.
- Добавьте 50 йл/мл изоляционные коктейли в ПКМС, крышка трубки, и инвертировать 2-3 раза, чтобы смешать.
- Инкубация на RT в течение 5 мин; на4-й минуте инкубации вихревые магнитные микробусы не менее 30 с.
- Передача 50 МКЛ магнитных микробусов на 1 мл ПБМТ, крышка трубки, и инвертировать 2-3 раза, чтобы смешать.
- Пополнить до 10 мл с буфером изоляции и аккуратно пипеткой вверх и вниз 2-3 раза.
- Поместите трубку в магнитной станции и инкубировать на RT в течение 3 минут.
- Держите магнит и трубку вместе, и одним движением, инвертировать магнит и трубку вместе, чтобы залить подвеску клетки в новую трубку. Отбросьте старую трубку.
- Повторите шаг 4.2.8 (уменьшите время инкубации до 2 мин) и вылейте В-клеточную подвеску в чистую коническую трубку.
- Обогащенные В-клетки готовы к использованию. Если ячейки будут использованы немедленно, продолжайте раздел 4.3 (Расширение В-клеток человека). Проверьте чистоту изолированных В-клеток по цитометрии потока (по желанию). Если ячейки должны быть заморожены перед использованием, продолжайте шаг 4.2.12.
- Чтобы заморозить В-клетки, центрифуга при 400 × в течение 5 минут, и отбросить супернатант, не нарушая гранулы.
- Повторное замораживание клеток в среде замораживания при 107 клетках/мл и aliquot 1 мл/криовиальный.
- Поместите криовиал в охлажденный замораживающий контейнер и храните при -80 градусов по Цельсию на ночь; затем перенесите замороженный криовиальный в резервуар с жидким азотом; держать замороженные клетки до 1 года.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемая доходность изолированных В-клеток составляет 2%-8% от общего объема ПХМТ, при этом 95%-99% жизнеспособности.
- Повторное количество ПБМК в буфере изоляции до концентрации 5 × 107 ячеек/мл.
- Расширение B-клеток человека
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании недавно изолированных В-клеток пропустите шаги 4.3.1-4.3.5. Подсчитайте клетки и перенесите необходимое количество клеток в стерильную коническую трубку и продолжайте шаг 4.3.6.- Предварительно теплая сыворотка крупного рогатого скота плода (FBS) в водяной бане до оттаивания В-клеток. Подготовьте 20 мл среды расширения B-клеток, перенесите в колбу T25 и предварительно эквилибруйте среду в инкубаторе ткани-культуры (при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2, с влажностью) не менее чем за 15 минут до использования.
- Клетки оттепели B в водяной бане 37 градусов по Цельсию. Во время ожидания перенесите 2 мл предварительно разогретой FBS в стерильную коническую трубку 15 мл.
- После того, как В-клетки полностью разморожены, немедленно добавьте в образец 1 мл предварительно разогретого FBS, дроп-мудрый. Инкубация на RT в течение 1 мин.
- Аккуратно пипетку для повторного перерасхода образца и передачи всего объема, dropwise, в коническую трубку, содержащую 2 мл предварительно разогретой FBS.
- Довнесите громкость до 15 мл со стерильным 1x PBS, крышкой и инвертировать трубку осторожно 2-3 раза.
- Центрифуга при 400 × в течение 5 мин.
- Отбросьте супернатант, не нарушая клеточные гранулы, перерасходуйте клеточные гранулы с помощью 1 мл предварительно равнорассмысленой среды расширения В-клеток и посчитайте клетки. Общее количество клеток должно быть около 107 ячеек.
- Перенесите клетки в колбу, содержащую 20 мл предварительно равнорассмысленой среды расширения B-клеток. Окончательная концентрация клеток должна быть примерно 5 х 105 клеток/мл.
- Инкубировать колбу вертикально в инкубаторе ткани-культуры.
- Освежите среду расширения полностью каждые 2 дня, передав весь объем В-клеток в стерильную коническую трубку и повторите шаги 4.3.6-4.3.9.
ПРИМЕЧАНИЕ: T25 колба может в течение 10-20 мл среды; Колба T75 может вьться до 20-60 мл среды.
5. Первичная инженерия B-клеток человека
- Инженерные B-клетки на 48 ± 2 ч после расширения/активации для достижения оптимальных результатов. Подготовьте среду расширения B-клеток, aliquot 1 мл среды в 48-хорошо ткани культуры пластины, и до эквилибрата в ткани культуры инкубатора по крайней мере 15 минут до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: При проектировании CRISPR/Cas9 sgRNA для гена, представляющих интерес, следуйте шагам, изложенным ниже.
- Дизайн sgRNAs с помощью онлайн-инструмента11.
- Дизайн sgRNAs на экзон, который является общим для всех изоформ белка.
- Заказать химически модифицированные sgRNA от авторитетных компаний.
- sgRNA обычно приходит в лиофилизированной форме; восстановленная сгРНК в стерильном буфере DNase/RNase Без Трис-ЭДТА (TE) с концентрацией 1 мкг/ОЛ. - Подготовка CRISPR/Cas9 трансфицирует субстрат путем смешивания 1 мкл (1 мкг/ЛЬ) химически модифицированной сгРНК с 1,5 МЛ (1 мкг/ЛЬ) химически модифицированных стрептококковых пиогенов Cas 9 (S.p. Cas9) ядра в трансфекции реакции. Для контроля используйте 1 МКЛ буфера TE вместо sgRNA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда CD19 sgRNA используется для эксперимента KO гена, см. Рисунок 2 для результатов. Когда AAVS1 sgRNA используется для эксперимента гена KI, см. Рисунок 5 для результатов.- Храните все компоненты на льду.
- Смешайте осторожно и перенесите 2,5 мл трансфектного субстрата CRISPR/Cas9 на реакцию в трубку 8-трубчатой полосы 0,2 мл; отложить на RT.
- Включите нуклеофектор (электропоратор) и подготовь реагенты трансфекции, как показано в таблице 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это хороший шаг для паузы, если это необходимо, поставив все реагенты на лед. Удалите все реагенты со льда, когда готовы возобновить эксперимент. При использовании белка S.p. Cas9, исследователь должен предварительно комплекс CRISPR/Cas9-sgRNA рибонуклеопротеин путем смешивания 1 мкг сгРН с 5 мкг белка S.p. Cas9, избегая каких-либо пузырьков, и инкубации смеси на RT, по крайней мере 20 минут до использования для достижения оптимальных результатов. - Подсчитайте и перенесите 106 В-клеток на реакцию трансфекции в стерильную коническую трубку.
- Довяжте объем до 15 мл со стерильным 1x PBS и центрифугой при 400 × в течение 5 минут. Ожидая, подготовь основной реагент трансфекции клеток(таблица 2)и отложите на RT.
- Откажитесь от супернатанта, не нарушая клеточные гранулы.
- Повторное распределение клеточной гранулы с 10 мл стерильных 1x PBS и центрифуги при 400 × в течение 5 мин.
- Отбросьте супернатант полностью, не нарушая гранулы клетки.
- Передача 0,5 мкг химически модифицированной GFP мРНК (в качестве трансфекции репортер) на 106 В-клеток в ячейку гранулы (по желанию).
- Повторное поглощение клеточной гранулы с 20 йл первичной клеточной трансфекции реагент на 106 В клеток; аккуратно перемешать, промокая 5-6 раз. Перенесите 20,5 МКЛ на трансфекцию в 0,2 мл трубки 8-трубчатой полосы, содержащей 2,5 МКЛ трансфектного субстрата CRISPR/Cas9.
- Pipette вверх и вниз один раз, чтобы смешать и передать весь объем (23 МКЛ) в трансфекции cuvette. Крышка и нажмите cuvette на скамейке осторожно, чтобы убедиться, что жидкость охватывает дно кювета.
- Используйте первичный В-клеточный протокол человека на нуклеофекторе для трансфекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нуклеофектор (электропоратор) может быть помещен и использоваться вне ткани культуры капота. Cap cuvette для обеспечения стерильности. - Отдых электропоротерных клеток в кювете на RT в течение 15 мин.
- Передача 80 МКЛ предварительно equilibrated B-клеток расширения среды из ткани культуры пластины в трансфекции реакции в cuvette. Поместите кюветт в инкубатор культуры тканей на 30 мин.
- Аккуратно пипетку пару раз смешать и перенести весь объем образца из кюветта в соответствующий колодец 48-хорошо ткани культуры пластины, содержащей 1 мл B-клеток расширения среды. Окончательная концентрация клеток должна быть 106 клеток/мл.
- При проведении эксперимента по гену KI переносит вектор rAAV6 на 500 000 кратности инфекции в соответствующий хорошо содержащий электропотерные клетки (примерно 45 мин после электропорации). Смотрите пример векторной конструкции rAAV6 на рисунке 4A.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например: контрольный образец будет электропотезирован без CRISPR/Cas9 или вектора rAAV6. Образец только для переносчиков будет электропотезирован без CRISPR/Cas9, а затем трансурсирован с вектором rAAV6. Образец KI будет электропотезирован с помощью CRISPR/Cas9, а затем транспонирован с вектором rAAV6. rAAV6 должен содержать гомологические руки вверх и вниз по течению от целевого сайта DSB для HDR. - Поместите пластину в инкубатор культуры тканей при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 с влажностью.
- Подсчитайте ячейки и засчитайте жизнеспособность в первый день после инженерии.
- Освежите среду расширения B-клеток каждые 2 дня, подсчитывая клетки, а затем перенося весь объем клеток в чистую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 400 × в течение 5 минут, и отбросить супернатант, не нарушая гранулы. Повторное распространение клеток с 100 йл свежей среды расширения B-клеток, и передача в колодец 24-хорошо пластины культуры тканей. Принесите средний объем для достижения окончательной концентрации клеток на 5 × 105 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: 48-хорошо пластина может в течение 1 мл среднего / хорошо; 24-хорошо пластина может в течение 2 мл среднего / хорошо; 12-хорошо пластина может ввести до 4 мл среднего / хорошо, и 6-хорошо пластины может в течение 8 мл среднего / хорошо. - Разрешить инженерии клеток расширить, по крайней мере 5 дней, прежде чем выполнять вниз по течению анализы, такие как для анализа цитометрии потока, TIDE анализа и соединения ПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обновленный протокол расширения и активации позволил быстро расширить В-клетки до 44 раз за 7 дней(рисунок 1; n No 3 доноров). В эксперименте KO, B-клеток кол с использованием Trypan синий окрашивания показали более 80% жизнеспособных клеток с небольшим снижением восстановления клеток в обоих контроля и CD19 KO образцов на 24 ч после электропорации (Рисунок 2A; р ≥ 0,05, n No 3 доноров). Этот результат указывает на то, что электропорация слегка повлияла на общее состояние здоровья В-клеток. В-клетки были собраны на 5-й день после трансфекции для анализа цитометрии потока и TIDE. Представитель рассеяния участков управления и KO образца показали 14% и 95% CD19-отрицательных клеток, соответственно(рисунок 2B). Количественная оценка участков потока показала значительное снижение экспрессии CD19 в образцах KO по сравнению с контролем(рисунок 2B; p ≤ 0.0001, n No 3 доноров). Хроматограммы геномного секвенирования (см. праймер последовательности в таблице 3) показали двойные пики в клетках CD19 KO B, указывая на вставки/удаления нуклеотидов после CRISPR/Cas9-опосредованного DSB, в то время как одиночные пики наблюдались в контроле, указывая, что в этом образце не произошло DSB(рисунок 3A). Идельный анализ хроматографов (с помощью бесплатного онлайн-инструмента анализа TIDE) образцов KO показал высокий % образования indel (nogt;90%) на локусе CD19, который соответствует % потере белка CD19, обнаруженной цитометрией потока(рисунок 3B;p ≥ 0.05, n No 3 доноров). Эти результаты показывают, что CRISPR/Cas9 эффективно генерирует CD19 KO в клетках группы В. В-клетки из эксперимента KI были собраны на 12-й день после инженерии для цитометрии потока и анализа соединения ПЦР(таблица 4). Участки рассеяния показали 64% EGFP-положительных ячеек в выборке, которая получила вектор rAAV6(рисунок 4) вместе с RNP, в то время как не EGFP-положительная ячейка не наблюдалась в контроле; минимальная EGFP-положительность наблюдалась в выборке, которая получила вектор AAV только(рисунок 5A). Соединение ПЦР-усиления (см. праймер последовательности в таблице 3)показало 1,5 Кбит/с ампликонов в образце KI(рисунок 5B),в то время как ни один продукт ПЦР не наблюдался ни в контрольном, ни в векторном образце. Количество ячеей показало, что инженерный процесс влияет на восстановление клеток в образце KI больше, чем контроль или вектор только образцы(рисунок 5B). Тем не менее, все образцы быстро отскочил в течение 3 дней после проектирования(рисунок 5B). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что успешная интеграция EGFP в локус AAVS1 приводит к стабильному выражению EGFP по крайней мере 12 дней после проектирования.
Рисунок 1: расширение B клеток in vitro. В-клетки были посеяны на 1 × 106 клеток на день 0 (ноль) при плотности 5 × 105 на мл и расширена в 44 раза в 7 дней (n'3 независимых доноров). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2B: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2C: CRISPR/Cas9-опосредован cd19 нокаут (KO) в клетках группы В. (A) Бар график показывает, что 70% восстановления клеток (левая панель) и 80% жизнеспособности (правая панель) клеток после трансфекции наблюдались как в контроле и CD19 KO образцов на 24 часов после электропорации. (B)Репрезентативные участки потока CD19 gating живых клеток показывает 84.3% и 3.43% CD19-положительные клетки в образце управления и образце CD19 KO, соответственно. (C) Бар график показывает значительное сокращение CD19 в CRISPR / Cas9-опосредованной CD19 KO группы (≤ 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3B: потеря белка CD19 против образования indel. (A) Хроматограммы изображают секвенирование пиков управления и CD19 нокаутом (KO) образца. Серая коробка на пиках управления выделяет целевую последовательность CD19 gRNA с прогнозируемым участком разреза, указанным стрелкой. CD19 KO показал «двойные пики» последовательности вокруг прогнозируемого участка разреза, что указывает на вставку/удаление нуклеотидов после двухместного перерыва. (B) Бар график, показывающий последовательные результаты между % CD19 потери белка и % indel формирования на CD19 локус (≥ 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP векторная конструкция. Экспресс-кассета содержит сильный синтетический промоутер (MND) последовательность, сразу же следуют расширенный зеленый белок флуоресценции (EGFP) кодирования последовательности и поли аденилирования (Поли А) последовательности. AAVS1 гомологии оружия фланг вверх по течению от MND промоутер и вниз по течению поли последовательностей. EGFP будет выражена в соответствии с постановлением MND промоутер. Длины последовательности указаны над каждым компонентом конструкции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5A: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5B: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5C: CRISPR/Cas9- и rAAV6-опосредованная интеграция репортёра EGFP в ячейках B в день 12 после инженерии. (A)Участок потока представителя не показывает никакие EGFP-положительные клетки B в или управлении или вектор-только образце против 64.4% из EGFP-положительных В клеток от образца knockin (KI). (B)Соединение полимеразной цепной реакции образца KI показывает прогнозируемую полосу 1,5 Кбит/с; в контрольном или векторном образце не было обнаружено ни одной полосы. Вода использовалась для обеспечения не загрязнения в процессе ПЦР. (C)Бар график изображает рост клеток управления, вектор только, и EGFP-KI образцов в течение 3 дней после проектирования. Сломанная линия указывает на 1 × 106 ввода ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| имя | gRNA последовательность |
| CD19 | 5'-GCTGTGGCAGTGCCTCAA-3' |
| AAVS1 | 5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3' |
Таблица 1: последовательности gRNA.
| Реагентов | Объем на 1 реакцию |
| Решение для первичных ячеев P3 | 16,4 мл |
| Дополнение 1 | 3,6 мл |
| итог | 20 мл |
Таблица 2: Подготовка смеси реагентов нуклеофеции.
| описание | последовательность | цель |
| CD19 вперед грунтовки | 5'-AAATTCAGGAAAGGGGGAAG-3' | Усиление локуса CD19 для анализа Indel |
| CD19 Обратная грунтовка | 5'-GCGGACCTCTTCTGGCATG-3' | Усиление локуса CD19 для анализа Indel |
| Перекресток ПЦР вперед грунтовка | 5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3' | Перекресток ПЦР |
| Перекресток PCR Обратная грунтовка | 5'-ГАГАКАГТГАККААККАТЦК-3 | Перекресток ПЦР |
Таблица 3: Праймеры используются.
| описание | Флюорофор | клон |
| Анти-человеческий CD19 | ПерКП | HIB19 |
| Жизнеспособность красителя | eFlour 780 | - |
Таблица 4: Поток цитометрии антитела и жизнеспособности красителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Точная инженерия генома в первичных клетках человека B была сложной задачей донедавнего времени 9,10. Ранее мы публиковали протоколы с использованием CRISPR/Cas9 для инженера первичных клеток B человека9. Здесь мы наметим улучшенные протоколы для изоляции, расширения и проектирования B-клеток, чтобы обеспечить эффективное KO CD19 или для стука в EGFP.
Здесь мы демонстрируем, что наш протокол расширения позволяет быстрое расширение В-клеток в культуре до 44-кратного расширения в течение 7 дней(рисунок 1). Этот протокол показал более быструю скорость расширения, чемте, о которых сообщили Johnson et al. 9 и Hung et al.10 Критические шаги по обеспечению здорового и быстрого расширения первичных В-клеток пополняют среду свежими факторами активации каждые два дня и гарантируют, что общее количество В-клеток в культуре не превышает 2 × 106 клеток/мл.
Мы также обнаружили, что наш улучшенный протокол для трансфектирования системы CRISPR/Cas9 для CD19 KO привел к высокой эффективности CD19 KO(рисунок 2 и рисунок 3). Как и в предыдущемисследовании 9, мы наблюдали небольшое снижение восстановления клеток и жизнеспособности после электропорации на 24 ч. Это указывает на то, что электропорация влияет на общее состояние клеток первичных В-клеток; однако, клетки в конечном итоге отскок в пределах 48 ч (данные не показаны).
Преимущество использования этого протокола электропоратора заключается втом,что мы можем электропотать образцы с гораздо более быстрыми темпами (16 реакций менее чем за 1 мин), в товремя как предыдущие протоколы 9,10 занять примерно 10-12 мин для 16 реакций. Кроме того, эта трансфекция система устраняет потенциальную электрическую дугу электропоратора наблюдается в предыдущихисследованиях 9,10. Кроме того, этот инженерный метод может быть расширен для большего числа В-клеток с использованием больших, коммерчески доступных кюветов (данные не показаны).
Несколько важных шагов для обеспечения оптимального общего здоровья клеток и эффективности KO: Во-первых, убедитесь, что среда расширения B-клеток подготовлена и предварительно уравновешена в течение по крайней мере 15 минут перед использованием. Во-вторых, общий объем трансфекционного субстрата не должен превышать 20% (v/v) нуклеофекторного реагента. В-третьих, клетки должны быть расширены / активированы в течение 48 ± 2 ч для достижения оптимальных результатов. В-четвертых, нажмите на куветт электропорации осторожно перед помещением в электропоратор, чтобы убедиться, что раствор реакции трансфекции покрывает дно кюветта. В-пятых, не забудьте отдохнуть электропоротерных клеток в кювет всего за 15 минут на RT; оставляя клетки в реагенте нуклеофеции после электропорации слишком долго может нанести вред общей выживаемости клеток. В-шестых, не забудьте инкубировать клетки со средствами массовой информации в кювет не более 30 минут. В-седьмых, размещение10 6 электропотерированных клеток в 1 мл в течение первых 48 ч, как правило, помогает клеткам восстанавливаться быстрее, чем культивирование их при более низкой плотности (данные не показаны). Наконец, использование либо Cas9 mRNA или Cas9 белка приведет к аналогичной эффективности редактирования (данные не показаны); однако, мы использовали Cas9 mRNA для удобства и стоимости.
Двумя основными проблемами при использовании CRISPR/Cas9 являются внецеленные эффекты и хромосомные транслокации. Нецелесоцеличные эффекты, вызванные несовместимыми базовыми парами sgRNA с целевой последовательностью, приводят к многочисленным возможным связывающим участкам генома и создают несколько нежелательных кодов генов. Таким образом, прогнозируемый нецелеый балл должен быть принят во внимание вместе с целевым баллом, чтобы свести к минимуму этот вопрос. Хромосомная транслокация может произойти из-за внецелегового воздействия или при выбивах нескольких генов. Это может привести к катастрофическим событиям экспериментально и клинически. Базовыередакторы 12 изменяют один нуклеотид (два класса: редактор базы цитозина и редактор адениновой базы), чтобы нарушить элемент сращивания, создать преждевременное стоп-кодон или создать точеную мутацию, что приведет к целевому гену KO без DSB (рассмотрено вдругих местах 12). Таким образом, базовый подход к редактированию может быть использован для одно- или многогенных нокаутов для обхода хромосомных транслокаций.
Мы также демонстрируем, что CRISPR/Cas9, вместе с rAAV6, может быть использован для эффективного окаймлять сайт-специфический KI и выражение EGFP в локусе AAVS1. Мы наблюдали выражение EGFP в течение по крайней мере 12 дней после инженерии. Мы также наблюдали два EGFP-позитивных популяций: высокое и промежуточное выражение EGFP в выборке KI на 12 день(рисунок 5A), в то время как вектор только выборка показала минимальный процент клеток с промежуточным выражением EGFP. Мы полагаем, что это явление «высоких и промежуточных популяций» обусловлено белеличной интеграцией вектора. Для подтверждения этой гипотезыможно провести дальнейшее исследование с использованием ПЦР 13 промежуточных и высоко egFP-клеток. Два предостережения об использовании AAV в качестве вектора: Во-первых, векторы AAV имеют небольшую грузоподъемность, до 4,7 килоба баз, вызывая проблемы при стуке в большой ген. Уменьшение размера гомологических рук позволит выдать более крупный ген, что, в свою очередь, снизит эффективность КИ (данные не показаны). Кроме того, можно использовать одновременное или последовательное интеграцию нескольких векторов загрузки генов14,15. Исследования сообщили, иммунный ответ и зазор AAV-транс-транс-клеток в иммунокомпетентныхмоделей животных 16,17. Кроме того, невирусный шаблон HDR донора можно изучить, чтобы обойти эту проблему.
Таким образом, мы продемонстрировали всеобъемлющие, пошаговые процессы изоляции, расширения и проектирования В-клеток, что привело к высокой эффективности модификации генов. Этот инженерный метод может быть использован для гена KO и для изучения функций генов в клетках группы В. Кроме того, этот метод может быть использован для инженера В-клеток, чтобы выразить рекомбинантные антитела для борьбы с инфекцией. Наконец, этот метод может быть применен к инженеру В-клеток, чтобы выразить и секрет терапевтических ферментов, которые могут быть использованы в качестве аутологичной клеточной терапии для лечения энзимопатий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Патент был подан на методы изготовления и использования генома отредактированных B-клеток с M.J.J.J., K.L., и B.S.M. в качестве изобретателей. B.S.M является консультантом и владеет акциями Immusoft Inc. Immusoft Inc. спонсировала исследования в лаборатории B.S..M.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Детским онкологическим исследовательским фондом (CCRF) и NIH R01 AI146009 до B.S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug | IDT | 1081059 | smaller size is also available |
| Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza | V4XP-3032 | |
| Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CleanCap chemically modified Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | different sizes available |
| Cryostor CS10, 100 mL | STEMCELL Technology | 7930 | |
| CTS Immune Cell SR | Thermo Fisher Scientific | A2596101 | |
| EasySep human B cells isolation kit | STEMCELL Technology | 17954 | |
| eBioscience fixable viability dye eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| Excellerate B cell media, Xeno-free | R&D Systems | CCM031 | B-cell basal medium |
| Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube | Corning | 352059 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D Systems | S11550 | For thawing B cells only |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS | GE lifesciences | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector core unit | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40 Ligand | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | For freezing cells |
| Pen/Strep 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP anti-human CD19 clone HIB19 | biolegend | 302228 | smaller size is also available |
| rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.) | Vigene Biosciences | N/A | large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL |
| Recombinant human IL-10 protein 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | different sizes available |
| Recombinant human IL-15 protein 25 ug | R&D Systems | 247-ILB-025 | different sizes available |
| The Big Easy EasySep Magnet | STEMCELL Technology | 18001 | different sizes available |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher Scientific | BP2476100 |
References
- LeBien, T. W., Thomas, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. The generation of antibody-secreting plasma cells. Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).
- Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. Humoral immunity due to long-lived plasma cells. Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).
- Spriggs, M. K., et al. Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion. Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).
- Fusil, F., et al. A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status. Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).
- Luo, X. M., et al. Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes. Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).
- Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells. Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).
- Heltemes-Harris, L. M., et al. Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools. Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).
- Rees, H. A., Liu, D. R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).
- Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jiménez, G., Sarov, M. CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture. Methods. 164-165, 49-58 (2019).
- Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome. PLoS One. 9, 110404 (2014).
- Bak, R. O., Porteus, M. H. CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).
- Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. Immune responses to viral gene therapy vectors. Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).
- Martino, A. T., Markusic, D. M. Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).
