Estimación del contenido de lignina de biomasa vegetal utilizando ácido tioglicólico (TGA)

La lignina es uno de los componentes de carga vitales de las paredes celulares de las plantas y el segundo polímero más abundante en la Tierra^1. Químicamente, la lignina es un heteropolímero reticulado compuesto por compuestos fenólicos complejos de alto peso molecular que forman una fuente natural renovable de polímeros aromáticos y síntesis de biomateriales^2,3. Este polímero natural juega un papel importante en el crecimiento de las plantas, el desarrollo, la supervivencia, el soporte mecánico, la rigidez de la pared celular, el transporte de agua, el transporte de minerales, la resistencia al alojamiento, el desarrollo de tejidos y órganos, la deposición de energía y la protección contra tensiones bióticas y abióticas^4,5,6,7. La lignina se compone principalmente de tres monolignoles diferentes: alcoholes de coniferilo, sinapilo y p-coumaril que se derivan de la vía proanoide fenilo^8,9. La cantidad de lignina y la composición de los monómeros varían según la especie vegetal, el tipo de tejido/órgano y las diferentes etapas del desarrollo de las plantas¹⁰. La lignina se clasifica ampliamente en lignina de madera blanda, madera dura y hierba en función de la fuente y la composición del monolignol. La madera blanda se compone principalmente de alcohol de coniferilo en un 95% con un 4% de p-coumaryl y un 1% de alcoholes sinapílicos. La madera dura tiene alcoholes de coniferilo y sinapilo en proporciones iguales, mientras que la lignina de hierba está compuesta por varias proporciones de alcoholes de coniferilo, sinapilo y p-coumarílico^11,12. La composición de los monómeros es crítica, ya que determina la resistencia a la lignina, la descomposición y la degradación de la pared celular, así como la determinación de la estructura molecular, la ramificación y la reticulación con otros polisacáridos^13,14.

La investigación de la lignina está ganando importancia en forrajeo, industrias textiles, industrias papeleras, y para bioetanol, biocombustibles y bioproductos debido a su bajo costo y alta abundancia^15,16. Se utilizaron varios métodos químicos (por ejemplo, bromuro de acetilo, detergentes ácidos, Klason y oxidación de permanganato) junto con métodos instrumentales (por ejemplo, espectroscopia de infrarrojo cercano (NIR), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y espectrofotometría ultravioleta (UV)) para la cuantificación de lignina^9,17. Los métodos de análisis de lignina generalmente se clasifican en función de la radiación electromagnética, la gravimetría y la solubilidad. El principio detrás de la estimación de la lignina por radiación electromagnética se basó en la propiedad química de la lignina por la cual absorbe la luz en longitudes de onda específicas. Estos resultados fueron estimados basados en el principio que la lignina tiene una absorbancia ULTRAVIOLETA más fuerte que carbohidratos. En 1962, Bolker y Somerville utilizaron pellets de cloruro de potasio para estimar el contenido de lignina en la madera¹⁸. Sin embargo, este método tiene inconvenientes en la estimación del contenido de lignina a partir de muestras herbáceas debido a la presencia de compuestos fenólicos no lignina y la ausencia de un coeficiente de extinción adecuado. En 1970, Fergus y Goring encontraron que los máximos de absorción de los compuestos de guaiacyl y syringyl estaban en 280 nm y 270 nm, lo que corrigió el problema del coeficiente de extinción del método Bolker y Somerville¹⁹. Más tarde, la espectroscopia infrarroja, una técnica altamente sensible para caracterizar fenólicos, también se utilizó para la estimación de lignina con una pequeña cantidad de muestras de biomasa vegetal. Un ejemplo de esta tecnología fue la espectrofotometría de transformada de Fourier de reflectancia difusa. Este método, sin embargo, carece de un estándar adecuado similar al método UV²⁰. Más tarde, el contenido de lignina fue estimado por NIRS (espectroscopia de infrarrojo cercano) y RMN (espectroscopia de resonancia magnética nuclear). Aunque, hay desventajas en estos métodos, no alteran la estructura química de la lignina, conservando su pureza^20.

El método gravimétrico de Klason es un método analítico directo y más fiable para la estimación de lignina de tallos leñosos. La base para la estimación gravimétrica de la lignina es la hidrólisis/solubilización de compuestos no lignínicos y la recolección de lignina insoluble para gravimetría^21. En este método, los hidratos de carbono se eliminan por hidrólisis de la biomasa con H2 CONCENTRADO₂SO₄ para extraer residuos de lignina^20,22. El contenido de lignina estimado por este método se conoce como lignina insoluble en ácido o lignina Klason. La aplicación del método Klason depende de la especie de planta, el tipo de tejido y el tipo de pared celular. La presencia de cantidades variables de componentes no lignínicos como taninos, polisacáridos y proteínas, da lugar a diferencias proporcionales en la estimación del contenido de lignina insoluble/soluble en ácido. Por lo tanto, el método de Klason sólo se recomienda para la estimación de lignina de biomasa con alto contenido de lignina, como los tallos leñosos^17,23. Los métodos de solubilidad como el bromuro de acetilo (AcBr), la lignina insoluble en ácido y el ácido tioglicólico (TGA) son los métodos más comúnmente utilizados para estimar el contenido de lignina de varias fuentes de biomasa vegetal. Kim et al. establecieron dos métodos para la extracción de lignina por solubilización. El primer método extrae lignina como residuo insoluble solubilizando celulosa y hemicelulosa, mientras que el segundo método separa la lignina en la fracción soluble, dejando la celulosa y la hemicelulosa como residuo insoluble^24.

Métodos similares empleados en la estimación de la lignina basados en la solubilidad son los métodos del ácido tioglicólico (TGA) y del bromuro de acetilo (AcBr)²⁵. Tanto los métodos de TGA como los de bromuro de acetilo estiman el contenido de lignina midiendo la absorbancia de la lignina solubilizada a 280 nm; sin embargo, el método AcBr degrada los xilanos durante el proceso de solubilización de lignina y muestra un falso aumento en el contenido de lignina²⁶. El método del tioglicolato (TGA) es el método más confiable, ya que depende de la unión específica con los grupos de tioéter de los grupos de alcohol bencílico de lignina con TGA. La lignina unida a TGA se precipita en condiciones ácidas utilizando HCl, y el contenido de lignina se estima utilizando su absorbancia a 280 nm^27. El método TGA tiene ventajas adicionales de menos modificaciones estructurales, una forma soluble de estimación de lignina, menos interferencia de componentes no lignina y una estimación precisa de lignina debido a la unión específica con TGA.

Este método de TGA se modifica en función del tipo de muestra de biomasa vegetal utilizada para la estimación del contenido de lignina. Aquí, modificamos y adaptamos el método rápido de TGA de pajitas de arroz²⁷ a los tejidos de algodón para estimar el contenido de lignina. Brevemente, las muestras de plantas en polvo secas se sometieron a tampón de solubilización de proteínas y extracción de metanol para eliminar las proteínas y la fracción soluble en alcohol. El residuo insoluble del alcohol fue tratado con TGA y la lignina precipitada bajo condiciones ácidas. Se generó una curva estándar de lignina utilizando lignina de bambú comercial y se obtuvo una línea de regresión (y = mx+c). El valor "x" utiliza valores de absorbancia promedio de lignina a 280 nm, mientras que los valores "m" y "c" se ingresaron desde la línea de regresión para calcular la concentración desconocida de lignina en muestras de biomasa de plantas de algodón. Este método se divide en cinco fases: 1) preparación de muestras de plantas; 2) lavar las muestras con agua y metanol; 3) tratamiento del pellet con TGA y ácido para precipitar lignina; 4) precipitación de lignina; y 5) la preparación de la curva estándar y la estimación del contenido de lignina de la muestra. Las dos primeras fases se centran principalmente en la preparación del material vegetal, seguida de las extracciones de agua, PSB (tampón de solubilización de proteínas) y metanol para obtener el material insoluble en alcohol. Luego, se trató con TGA (ácido tioglicólico) y HCl para formar un complejo con lignina en la tercera fase. Al final, se utilizó HCl para precipitar lignina, que se disolvió en hidróxido de sodio para medir su absorbancia a 280 nm^28.

1. Preparación de muestras de plantas

1. Recoger plantas de algodón de dos meses de edad del invernadero (Figura 1A).
2. Voltee las macetas de las plantas suavemente para separar el suelo y las raíces con raíces laterales intactas aflojando el suelo alrededor de la planta (Figura 1B).
3. Lavar bien las plantas recolectadas en bandejas llenas de agua para eliminar toda la suciedad (para muestras de raíces) (Figura 1C).
4. Use toallas de papel para secar los tejidos separados de raíces, tallos y hojas, y etiquételos (Figura 1D). Secar al aire durante 2 días a temperatura ambiente para evitar cualquier contaminación fúngica (Figura 1E).
5. Transfiera los tejidos de la muestra a recipientes etiquetados/papeles de aluminio e incube en una incubadora de temperatura controlada a 49 °C durante 7 a 10 días (Figura 1F).
   NOTA: Las temperaturas más altas pueden alterar la estructura de la lignina. Alternativamente, se puede usar un liofilizador para secar muestras durante 1 a 2 días sin causar ningún cambio químico en la biomasa de la planta.
6. Utilice una cuchilla para cortar el tejido seco de la incubadora en piezas de tamaño de 5 mm o, alternativamente, emplee una amoladora de biomasa para moler los tejidos de la planta(Figura 1G, Figura 1H).
   NOTA: La amoladora/cuchilla de biomasa debe limpiarse después de que cada muestra haya sido cortada/molida.
7. Transferir el tejido cortado /material vegetal conectado a tierra de biomasa en viales de molienda y moler en polvo fino de tamaño de 1 mm utilizando un molino congelador o amoladora criogénica con líquido N₂.
8. Moler muestras durante tres ciclos a razón de 10 CPS (cada ciclo de 2 min) en un polvo uniforme(Figura 1I,1J, 1K).
   NOTA: El experimento se puede pausar en este punto y las muestras se pueden almacenar a temperatura ambiente en contenedores herméticos para su almacenamiento a largo plazo.

2. Lavar muestras con agua, PSB y metanol

1. Mida y registre el peso de todos los tubos de microfuge vacíos de 2 mL utilizados para la estimación del contenido de lignina en el cuaderno de laboratorio.
2. Transfiera 20 mg del polvo de la muestra molida al tubo prepesado. Pesar el tubo con tejido y polvo de tejido y registrar estos pesos en el cuaderno de laboratorio.
3. Incubar los tubos de microfugio de 2 mL (con tapas abiertas) con 20 mg de polvo de tejido en un bloque de calor u horno a 60 °C durante 1 hora.
4. Después de la incubación, enfríe las muestras durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
5. Añadir 1,8 mL de agua a cada tubo de microfugio y mezclar por vórtice. A continuación, centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min a RT y desechar el sobrenadante (Figura 2).
6. Añadir 1,8 mL de tampón de solubilización de proteínas (PSB)(Tabla 1)a cada pellet retenido y mezclar por vórtice. Centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min en RT y desecha el sobrenadante.
7. Repita el paso 2.6 de nuevo para cada muestra.
8. Añadir 1,8 mL de agua a cada pellet, mezclar por vórtice, y centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min. Después de la centrifugación, guarde el pellet y deseche el sobrenadante.
9. Al pellet retenido, añadir 1,8 mL de metanol e incubar en un bloque de calor de 60 °C durante 20 min. Luego, centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min en RT. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y conserve el pellet (Figura 2).
10. Repita el paso 2.9 de nuevo para cada muestra.
11. Seque al aire el pellet en RT o proceda inmediatamente por secado al vacío. Seque al vacío usando secador al vacío a 30 °C durante 2 a 3 horas o hasta que el pellet esté completamente seco.
    NOTA: El experimento se puede pausar en este punto por secado al aire durante la noche o continuar por secado al vacío.
12. Después del secado, pese los tubos de muestra con el pellet seco y registre el peso junto al peso del tubo vacío respectivo en el cuaderno de laboratorio. Estime el peso del pellet restando los dos valores. Estos pesos se utilizarán para la estimación de lignina al final del proceso de extracción de lignina.
13. En este punto de extracción de lignina, se incluye la lignina de bambú comercial para la generación de la curva estándar de lignina. Mida la lignina de bambú comercial en tubos separados que van desde 0,5 mg a 5 mg en incrementos de 0,5 mg (0,5 mg, 1,5 mg, 1,5 mg, 2 mg, 3 mg, 3,5 mg, 4 mg, 4,5 mg y 5,0 mg). Mida cada concentración tres veces para tres réplicas técnicas.
    NOTA: A partir de aquí, los estándares medidos en el paso anterior se procesaron de la misma manera que las muestras que se secaron.

3. Tratamiento de pellets con TGA y ácido para precipitar lignina

1. Someta las muestras procesadas del paso anterior, junto con los estándares medidos, al tratamiento de TGA (ácido tioglicólico).
2. Añadir 1 mL de 3 N HCl (Tabla 1) y 100 μL de TGA a cada pellet.
3. Vórtice e incubar en un bloque de calor precalentado a 80 °C durante 3 horas en una campana extractora de humos (Figura 2).
   NOTA: El paso de calentamiento a 80 °C debe ser monitoreado. La acumulación de alta presión puede abrir las tapas y puede conducir a derrames químicos. Se recomiendan los tubos de tapón de rosca, pero los tubos de 2 mL se pueden tapar libremente durante este paso como una alternativa para evitar tales derrames.
4. Después de la incubación, enfríe los tubos en RT durante 10-15 min y la centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min a RT.
   NOTA: Los residuos generados a partir de disolventes ácidos y orgánicos deben separarse y almacenarse en recipientes de vidrio con tapas ventiladas. Utilice recipientes de vidrio separados para la recolección de residuos de ácido TGA y residuos ácidos.
5. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y conserve el pellet. Añadir 1 mL de agua, mezclar por vórtice, y centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min en RT.
6. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y mezcle el pellet en NaOH 1 N durante 24 h a 37 °C coctelera/mezclador térmico a baja velocidad (Figura 2).
   NOTA: Este tiempo de incubación se puede reducir a 1 hora^7.
7. Después de la incubación, centrífuga los tubos de microfubra de 2 mL a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min en RT. Conserve el sobrenadante para el siguiente paso.
   NOTA: El procedimiento implica el uso de ácidos fuertes y otros productos químicos que son corrosivos en la naturaleza. Por lo tanto, se recomienda usar epp adecuado durante todo el proceso de estimación de lignina. TGA tiene un fuerte olor desagradable y es corrosivo en la naturaleza. Por lo tanto, se recomienda usar solo en la campana extractora de humos.

4. Precipitación de lignina

1. Transferir el sobrenadante a un tubo de microfugio fresco de 2 mL y añadir 200 μL de HCl concentrado. Incubar a 4 °C durante 4 horas o durante la noche (Figura 2).
   NOTA: El proceso de extracción se puede pausar en este punto extendiendo el paso de refrigeración a la noche.
2. Centrífuga a 25.200 x g (15.000 rpm) durante 10 min a RT y disuelva el pellet en 1 mL de 1 N NaOH.
3. Incubar en la coctelera en RT durante 10 min para suspender el pellet completamente en NaOH.
4. Finalmente, mida la absorbancia de muestras a 280 nm usando un espectrofotómetro y compárese con la curva de lignina estándar.
5. Mida la concentración desconocida de lignina utilizando los valores de la línea de regresión de la curva de calibración y las absorbancias de las muestras extraídas a 280 nm.

5. Preparación de la curva estándar y estimación de lignina en la muestra

1. Procese los estándares de lignina de la misma manera que las muestras experimentales del tratamiento con TGA.
2. Mida los estándares comerciales de lignina de bambú en incrementos de 0.5 mg a partir de 0.5 mg, 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3.0 mg, 3.5 mg, 4.0 mg, 4.5 mg y 5 mg. A continuación, el proceso por TGA, HCl, se disuelve en 1 N NaOH seguido de la medición de la absorbancia a 280 nm(Figura 3A).
3. Utilice valores de concentración de lignina y lecturas de absorbancia para generar una gráfica dispersa de la curva de lignina estándar (Figura 3B).
4. Utilice la línea de regresión, y = mx+c generada en la gráfica dispersa, para la estimación del contenido desconocido de lignina de muestras preparadas utilizando valores "x" de absorbancias promedio de muestras extraídas a 280 nm y valores "m" y "c" de la línea de regresión de la curva estándar de lignina.
5. Divida el contenido de lignina en el valor y resultante por el peso total de la muestra de biomasa vegetal secada al vacío/aire después de la extracción de metanol en mg (aproximadamente 15 mg) para obtener la concentración de lignina por mg. Luego, multiplique este valor por 100 para calcular el porcentaje de lignina por mg.

Se compararon dos líneas experimentales de algodón diferentes para las diferencias en su contenido de lignina en diferentes tejidos. El contenido de lignina extraído de cada muestra se midió a 280 nm y registró sus respectivos valores de absorbancia. Los valores medios de absorbancia de cada réplica biológica se compararon con la línea de regresión de la curva estándar de lignina(Tabla 2, Figura 3C). La línea de regresión, y = mx + c, se utiliza para calcular el contenido desconocido de lignina de las líneas experimentales extraídas, muestra 1 y muestra 2. Los resultados de los valores medios de OD se sustituyeron en "x" mientras que los valores "m" y "c" se taparon a partir de la línea de regresión de la curva estándar de lignina para obtener la concentración de lignina "y" en mg (Tabla 3, Figura 3B). En el siguiente paso, para calcular por 1 mg de contenido de lignina, divida el valor "y" por el peso de la muestra (15 mg) después de la extracción de metanol. En el siguiente paso, para calcular por gramo (= 1.000 mg) el valor y/15 se multiplicó por 1.000. Para obtener % de lignina dividimos el valor de y/15 entre 1.000 y multiplicamos por 100. El promedio de lignina % para tres réplicas biológicas (de cada línea, muestra 1 y muestra 2) se comparó entre las dos líneas experimentales de la muestra 1 (11,7%) y muestra 2 (10,3%). Los valores de lignina fueron consistentes entre las réplicas biológicas, lo que sugiere que el método TGA es un método confiable y altamente específico para medir el contenido de lignina. También se realizaron estudios de comparación entre diferentes tipos de tejidos (raíz, tallo y hojas) de dos líneas experimentales de algodón, y ambas líneas mostraron un contenido relativamente menor de lignina en las hojas (3,4%) en comparación con los tallos (9,4% a 9,9%) y raíces (9,4% a 9,2%) (Tabla 4, Figura 4).

Figura 1: Preparación de la muestra de biomasa vegetal.  (A) Material vegetal de algodón recolectado de la casa verde. (B) Macetas suavemente volteadas para separar las raíces. (C) Lavado a fondo en agua para eliminar toda la suciedad. (D) Tejidos separados de raíces, tallos y hojas. (E)Tejido secado al aire durante 2 días después de separar el tejido. (F) El tejido secado al aire se transfiere a la incubadora a 49 °C durante 10 días. (G)Se utilizó una amoladora de biomasa para moler muestras de biomasa vegetal. (H) Muestras de biomasa de plantas de tierra de raíz, tallo y hoja. (I)Las muestras de tierra se cargan en los viales de molienda, se colocan en la cámara del molino congelador, se ponen a tierra en el molino congelador a una velocidad de 10 CPS durante 3 ciclos. (J) Viales triturados que muestren polvo de tejido finamente molido después de la molienda en el molino congelador. (K) Polvo de tejido finamente molido de raíz, tallo y hoja después de utilizar el molino congelador para la molienda. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 2:Pasos críticos involucrados en la extracción de lignina mediada por TGA. Diagrama de flujo de los pasos críticos involucrados en la extracción de lignina de la biomasa vegetal a la estimación del contenido de lignina utilizando el método TGA: 1. Preparación de muestras de plantas mediante secado y molienda suficientes en polvo fino utilizando el molino congelador; 2. 20 mg de polvo tisular se sometieron a PSB, metanol y lavados con agua, secó y se extrajo material insoluble en alcohol; 3. Usando TGA y ácido, la lignina fue precipitada; 4. Preparación de la curva estándar de lignina utilizando lignina de bambú comercial; 5. Estimación del contenido de lignina. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura 3:Preparación de la curva estándar y estimación dela lignina en la muestra. (A) Tabla que muestra las diferentes concentraciones de lignina de bambú comercial utilizada para generar la curva estándar de lignina a partir de lecturas de absorbancia a 280 nm. (B)Gráfica dispersa generada con el programa Excel utilizando los valores de la tabla A.(C)Gráficas de barras que representan el contenido estimado de lignina del tejido radicular de las muestras 1 y 2. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Tabla 1: Preparación de las soluciones utilizadas en el protocolo. Tabla que muestra la preparación de las diferentes soluciones utilizadas en el protocolo.

Tabla 2: Curva estándar de lignina preparada de 0,5 mg a 3,5 mg de lignina de bambú industrial. Gráfico disperso con línea de regresión que muestra los valores m y c. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Plantilla de lignina utilizada para el cálculo del contenido desconocido de lignina utilizando lecturas de absorbancia de muestras a 280 nm (como x) y valores de línea de regresión de curva estándar 'm' y 'c' de la curva estándar. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 4: Contenido de lignina de diferentes tejidos (raíz, tallo y hojas) de la planta de algodón en la etapa posterior a la floración. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.