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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas

Published: August 7, 2021 doi: 10.3791/62136
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1,2,3
1Department of Surgery, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Immunology and Molecular Microbiology, Texas Tech University Health Sciences Center, 3TTUHSC Surgery Burn Center of Research Excellence, Texas Tech University Health Sciences Center
* These authors contributed equally

Summary

Aquí, se describen métodos ex vivo e in vivo para evaluar la dispersión bacteriana de una infección de la herida en ratones. Este protocolo se puede utilizar para probar la eficacia de las terapias antimicrobianas y anti-biofilm tópicas, o para evaluar la capacidad de dispersión de diferentes cepas o especies bacterianas.

Abstract

Las infecciones relacionadas con el biofilm están implicadas en una amplia gama de condiciones crónicas como úlceras del pie diabético no curativas, sinusitis crónica, otitis media recurrente y muchas más. Las células microbianas dentro de estas infecciones están protegidas por una sustancia polimérica extracelular (EPS), que puede evitar que los antibióticos y las células inmunes del huésped despejen la infección. Para superar este obstáculo, los investigadores han comenzado a desarrollar agentes de dispersión como terapia potencial. Estos agentes se dirigen a varios componentes dentro de la EPS de biopelícula, debilitando la estructura e iniciando la dispersión de las bacterias, lo que teóricamente puede mejorar la potencia de los antibióticos y el aclaramiento inmunológico. Para determinar la eficacia de los agentes de dispersión para las infecciones de heridas, hemos desarrollado protocolos que miden la dispersión de biopelículas tanto ex vivo como in vivo. Utilizamos un modelo quirúrgico de la supresión del ratón que se ha descrito bien para crear infecciones crónicas biofilm-asociadas de la herida. Para monitorizar la dispersión in vivo,infectamos las heridas con cepas bacterianas que expresan luciferasa. Una vez establecidas las infecciones maduras, regamos las heridas con una solución que contiene enzimas que degradan los componentes del biofilm EPS. A continuación, supervisamos la ubicación y la intensidad de la señal luminiscente en los órganos de la herida y filtrado para proporcionar información sobre el nivel de dispersión alcanzado. Para el análisis ex vivo de la dispersión de biopelículas, el tejido de la herida infectada se sumerge en una solución enzimática que degrada la biopelícula, después de lo cual se evalúa la carga bacteriana restante en el tejido, frente a la carga bacteriana en solución. Ambos protocolos tienen fortalezas y debilidades y se pueden optimizar para ayudar a determinar con precisión la eficacia de los tratamientos de dispersión.

Introduction

El aumento de la resistencia a los antibióticos en todo el mundo está llevando a la falta de opciones de antibióticos para tratar una variedad de infecciones bacterianas1. Además de la resistencia a los antibióticos, las bacterias pueden ganar tolerancia a los antibióticos mediante la adopción de un estilo de vida asociado a labiopelícula 2. Una biopelícula es una comunidad de microorganismos que están protegidos por una matriz de polisacáridos, ADN extracelular, lípidos y proteínas3,denominada colectivamente sustancia polimérica extracelular (EPS). A medida que continúa la crisis de resistencia a los antibióticos, se necesitan urgentemente nuevas estrategias que prolonguen el uso de antibióticos o potencien su eficacia. Los agentes anti-biopelículas son una solución prometedora4.

Entre las diferentes estrategias anti-biopelículas que se han propuesto, la utilización de agentes de dispersión, que se dirigen a diferentes componentes de la EPS de la biopelícula, están a la vanguardia del desarrollo terapéutico5. Las hidrolasas de glucósido (GH) son una de esas clases de agente de dispersión. Gh son una gran clase de enzimas que catalizan la escisión de diferentes enlaces dentro de los polisacáridos que proporcionan integridad estructural a la EPS. Nuestro grupo, así como otros, han demostrado que la GH puede degradar eficazmente las biopelículas, inducir la dispersión y mejorar la eficacia de los antibióticos para una serie de especies bacterianas diferentes, tanto in vitro como in vivo6,7,8,9,10,11.

Con un creciente interés en la dispersión de biopelículas, es importante desarrollar métodos efectivos que evalúen la eficacia de la dispersión. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el tratamiento de las infecciones de heridas asociadas a biopelículas con un agente de dispersión en ratones, y la evaluación de la eficacia de la dispersión, in vivo y ex vivo. El objetivo general es proporcionar métodos efectivos que se puedan utilizar con modelos preclínicos para medir la dispersión de biopelículas de manera efectiva y eficiente.

Un modelo quirúrgico murine de la infección de la supresión fue utilizado en estos estudios para establecer una infección biofilm-asociada. Hemos utilizado este modelo durante más de 15 años y publicado nuestras observaciones ampliamente7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. En general, este es un modelo de infección no letal donde las bacterias permanecen localizadas en el lecho de la herida y están asociadas al biofilm (bacterias que se ven en agregados rodeados de EPS), estableciendo una infección crónica que dura hasta 3 semanas. Sin embargo, si los ratones están inmunodeprimidos (con diabetes tipo 1, por ejemplo), pueden volverse más susceptibles a desarrollar una infección sistémica fatal en este modelo.

En este informe, proporcionamos protocolos para evaluar la dispersión de bacterias de una herida, tanto in vivo como ex vivo. Ambos protocolos se pueden utilizar para examinar la eficacia de un agente de dispersión y tienen sus propias fortalezas y debilidades. Por ejemplo, evaluar la dispersión in vivo puede proporcionar información importante en tiempo real sobre la propagación de bacterias a otras partes del cuerpo después de la dispersión, y cómo responde el huésped. Por otro lado, evaluar la dispersión ex vivo puede ser más deseable para la detección de múltiples agentes, dosis o formulaciones, ya que el tejido se puede dividir en múltiples secciones que se pueden probar por separado, reduciendo así el número de ratones requeridos. Al evaluar múltiples agentes, normalmente medimos la dispersión primero in vitro como se describió anteriormente 6,9,22. Luego probamos el más efectivo ex vivo y reservamos la prueba in vivo para un número limitado de agentes muy prometedores.

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Protocol

Este protocolo animal fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Texas Tech (número de protocolo 07044). Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

1. Preparación de bacterias para infecciones de ratón

NOTA: Aquí describimos la infección de ratones sólo con Pseudomonas aeruginosa. Sin embargo, otras especies bacterianas se pueden utilizar para causar la infección. Las cepas y materiales bacterianos se detallan en la Tabla de Materiales.

  1. Utilizar Pseudomonas aeruginosa cepa de tipo salvaje PAO1 portadora del plásmido de luminiscencia pQF50-lux23 para estos experimentos como se describió anteriormente7.
  2. Cultivar cepas de P. aeruginosa en matraces Erlenmeyer desconcertados, con agitación a 200 rpm, en caldo Luria-Bertani (LB) a 37 °C durante 16 a 20 h. Añadir una concentración final de 100 μg/mL de ampicilina al cultivo nocturno de PAO1(pQF50-lux) para el mantenimiento del plásmido.
  3. Subcultivo P. aeruginosa añadiendo 100 μL del cultivo nocturno a un matraz Erlenmeyer que contiene 10 mL de caldo LB con una concentración final de 100 μg/mL de ampicilina. Luego crecer durante 2-2.5 h a 37 °C con agitación, a un OD600 nm de 0.4, y luego diluir en serie (1:10) tres veces para una dosis infectante de aproximadamente 104 células.

2. Preparación de la enzima de dispersión de biopelículas

NOTA: Para este estudio utilizamos una solución al 10% de partes iguales de amilasa y celulasa (5% de cada una), que se denominará "GH", para el tratamiento de dispersión.

  1. Utilice una solución de GH al 10% (p/v) de amilasa (de Bacillus subtilis)y celulasa fúngica (de Aspergillus niger)diluida en solución salina de tampón de fosfato 1x (PBS). Utilice PBS como tratamiento de control del vehículo.
  2. Calentar todos los tratamientos a 37 °C durante 30 min para la activación de enzimas.

3. Animales de experimentación y configuración preoperatoria

  1. Ratones domésticos, 5 compañeros de camada por jaula, en condiciones controladas por el ambiente, con ciclos de luz/oscuridad de 12 h y acceso adecuado a alimentos y agua.
  2. Preferiblemente, utilice ratones Webster suizos hembra, entre 8 y 10 semanas de edad.
  3. Pesar ratones para determinar la cantidad adecuada de anestesia para administrar.
  4. Administrar anestesia mediante la inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina 10 mg/kg de xilazina.
  5. Aplique crema para los ojos (por ejemplo, Refresh P.M.) cuidadosamente sobre el ojo usando un hisopo de algodón para reducir la sequedad.
  6. Controle los parámetros fisiológicos incluyendo ritmo respiratorio, coloración de la piel, y temperatura corporal a través de la cirugía.

4. Cirugía de escisión de espesor completo dorsal

  1. Evaluar el plano quirúrgico de la anestesia por pellizco en el dedo del dedo deldo del sistema y la supervisión de la frecuencia respiratoria y del esfuerzo. Afeitarse la superficie dorsal y aplicar una crema depilatoria durante 10 minutos (o según las instrucciones del producto), después de lo cual retirar suavemente, asegurando que la piel estaba seca.
  2. Para el manejo del dolor, administre 0,05 mL de lidocaína por vía subcutánea en el área a extirpar e inyecte 0,02 mL de buprenorfina por vía subcutánea en el cuello. Espere 10 minutos para asegurarse de que se alcanzó el manejo del dolor.
  3. Antes de la escisión, desinfecte la superficie dorsal con un hisopo de alcohol y dibuje un círculo de 1,5 cm de diámetro hacia la parte posterior de la espalda. Mantenga un campo quirúrgico estéril durante todo el procedimiento y use instrumentos en autoclave y guantes estériles. Para limitar la contaminación, realice la cirugía con un quemador Bunsen encendido y use herramientas limpias para cada animal.
  4. Administre una herida de piel de espesor completo y escisión al nivel del músculo panniculus con tijeras quirúrgicas.
  5. Después de la supresión, cubra inmediatamente las heridas con un apósito de poliuretano semipermeable.
  6. Inyecte aproximadamente 104 UFC de bacterias en 100 μL de PBS debajo del apósito, en el lecho de la herida, para establecer una infección.
    NOTA: Las heridas también pueden infectarse con múltiples especies de bacterias y/u hongos simultáneamente, o colocando biopelículas pre-formadas12,o incluso tejido de desbridamiento extraído de pacientes19,en el lecho de la herida.
  7. Después de la infección, coloque a los ratones en jaulas con almohadillas de calefacción y vigile hasta que recuperen su reflejo derecho.
    NOTA: Asegúrese de que los ratones no se enfríen, ya que esto puede llevar a la muerte.
  8. Establecer infecciones de heridas durante 48 h.
  9. Inspeccione los apósitos adhesivos diariamente para los rasgones y las áreas de la no-adherencia y substituido si es necesario.

5. Tratamiento de dispersión in vivo

NOTA: Aquí describimos la administración de los agentes dispersantes mediante la aplicación de una serie de 3 soluciones tópicas de irrigación de heridas(Figura 1). Sin embargo, el protocolo se puede adaptar para otros tipos de parto como la aplicación de geles, cremas o aderezos.

  1. Coloque ratones bajo anestesia con isoflurano (al 3% y 1 L por minuto de oxígeno) mientras administra los tratamientos.
  2. Preparar tres jeringas de 1 ml, con agujas de 25 G, que contengan 200 μL de tratamiento para cada ratón.
  3. Inyecte 200 μL de solución enzimática o control de PBS sobre la herida levantando y pellizcando cuidadosamente la piel con pinzas, ligeramente por encima de la herida hacia la cabeza del animal. Perfore cuidadosamente la jeringa a través de la piel levantada e inyecte lentamente la solución entre el apósito y el lecho de la herida. El apósito utilizado en este estudio a menudo se adhiere tanto al lecho de la herida como al tejido circundante.
    1. Para asegurarse de que todo el lecho de la herida esté cubierto por una solución, levante suavemente el apósito con las fuerzas, alejándolo del lecho de la herida, mientras inyecta lentamente la solución.
  4. Después del tratamiento, coloque a los ratones de nuevo en sus jaulas durante 30 minutos.
  5. Después de 30 minutos de exposición al tratamiento, vuelva a anestesiar a los ratones con isoflurano y aspire la solución con una jeringa, asegurándose de perforar en la misma área que antes.
    NOTA: Esta solución aspirada contiene células bacterianas dispersas, que pueden guardarse para varios análisis aguas abajo.
  6. Administrar el segundo y tercer tratamiento de riego como el primero, utilizando una jeringa nueva cada vez.

6. Imágenes y análisis de dispersión in vivo

NOTA: Si se utiliza una cepa luminiscente de bacterias para iniciar la infección, se puede utilizar un sistema de imágenes in vivo (IVIS) para visualizar la dispersión desde el lecho de la herida.

  1. Imagen de ratones inmediatamente antes y después del tratamiento y a las 10 y 20 h después del tratamiento (Figura 2 y Figura Suplementaria 1).
  2. Realice la proyección de imagen mientras que los ratones están bajo anestesia colocándolos individualmente en el IVIS y proyección de imagen cada uno para 5 s en una longitud de onda de 560 nanómetro. Guarde las imágenes para su posterior análisis.
    NOTA: La longitud de onda y el tiempo de exposición óptimos dependerán del reportero utilizado y del instrumento IVIS y del software de imágenes.
  3. Para el análisis, abra las imágenes en el software IVIS y seleccione el área a analizar en la Paleta de herramientas.
  4. Para tener en cuenta el fondo, coloque un círculo en el fondo de una foto y luego coloque el mismo círculo del tamaño en la parte superior de la cama de la herida para cada ratón.
  5. Para cargar valores de medición, seleccione Ver -> medidas de región de interés (ROI) y cargue la tabla de mediciones en una hoja de cálculo. Reste la lectura del círculo de fondo de cada una de las mediciones del lecho de la herida para calcular la luminiscencia de cada muestra. Calcular el porcentaje de luminiscencia cambiado por:
    ROI pre-tratamiento-ROI post-tratamiento/ ROI pre-tratamiento) x 100.
    NOTA: Los ratones de control y tratados deben analizarse simultáneamente para normalizar las variables que pueden afectar la adquisición de la imagen o la luminosidad.

7. Evaluación de la dispersión mediante la determinación de la UFC

  1. Eutanasia humanamente ratones mediante la inyección intraperitoneal de 0,2 mL de pentobarbital sódico (p. ej., Fatal Plus) bajo anestesia con 100 mg/kg de ketamina 10 mg/kg de xilazina.
  2. Coseche el tejido del lecho de la herida quitando primero suavemente el apósito con fórceps estériles, y después corte alrededor del perímetro de la cama de la herida con las tijeras quirúrgicas estériles. Levante suavemente un extremo del lecho de la herida con las lórceps mientras usa tijeras para cortar / burlarse de la muestra lejos de la capa muscular.
  3. Coloque el tejido del lecho de la herida en un tubo de homogeneización de 2 mL premarcado y prepesado que contenga 1 mL de PBS. Pesar los tubos de nuevo después de insertar las muestras, y luego invertir suavemente 3-5 veces para enjuagar cualquier bacteria dispersa o poco adherida, y retire el PBS. Añadir 1 mL de PBS fresco.
  4. Con el fin de cosechar los bazos, coloque a los ratones en una posición anatómica supina y asegurar fijando sus extremidades a una superficie de disección. Remoje el área a diseccionar con etanol al 70% para desinfectar el área y evitar que el pelaje contamine la muestra.
  5. Haga cuidadosamente una pequeña incisión perpendicular a la línea media con tijeras quirúrgicas en la dermis de la parte inferior del abdomen, asegurándose de levantar y alejar la piel de los órganos internos. Continúe la incisión interiormente, a lo largo de la línea media, hasta que se alcance el esternón. Una vez que la cavidad peritoneal fue expuesta y los órganos internos eran visibles, separe suavemente el bazo del tejido conectivo y colóquese en un tubo separado de la homogeneización.
  6. Pesar el bazo y enjuagar con PBS, como se describe para el tejido de la cama de la herida.
    NOTA: Otros órganos de interés pueden ser cosechados de manera similar.
    1. Al hacer la incisión inicial, tenga cuidado de evitar perforar los intestinos u otros órganos.
  7. Homogeneizar muestras en tubos de molino de perlas precargados de 2 mL utilizando un homogeneizador de sobremesa a 5 m/s durante 60 s, dos veces.
  8. Para enumerar la UFC, diluya en serie las muestras y la placa puntual en agar selectivo. Para la dilución en serie, pipetee 100 μL de la muestra en 900 μL de PBS en un tubo de 1,5 mL, vórtice, y repita 5 veces. Pipeta 10 μL de cada dilución sobre una placa de agar como se muestra en la Figura 3.
    NOTA: Si se requiere una cuantificación de UFC más precisa, esparcir 100 μL de cada dilución de la muestra a través de placas de agar separadas.

8. Evaluación ex vivo de la dispersión ( Figura4)

  1. Hiere ratones e infecta con aproximadamente 104 PAO1 como se describió anteriormente, y luego eutanasia 48 h después de la infección.
  2. Retire cuidadosamente el apósito con pinzas, utilizando técnica estéril y sin perturbar el lecho de la herida.
  3. Use tijeras quirúrgicas estériles para cortar el perímetro del lecho de la herida lejos de la piel no infectada mediante el uso de fórceps para levantar un extremo del lecho de la herida y tijeras para extirpar el tejido infectado de la herida de la capa muscular debajo y el tejido no infectado circundante. Divida las muestras del lecho de la herida en partes iguales o use entero.
  4. Coloque el tejido de la herida en tubos de homogeneización de molinos de perlas vacíos y prepesados de 2 mL. Luego, vuelva a pesar los tubos después de agregar la muestra. Calcule el peso de la muestra por:
    peso después de agregar la muestra - peso antes de agregar la muestra.
  5. Agregue 1 mL de PBS e invierta suavemente el tubo 3-5 veces para enjuagar la muestra y eliminar cualquier célula planctónica. Quite y descarte el PBS.
  6. Añadir 1 mL de tratamiento con GH (o PBS como control negativo) a la muestra e incubar durante 2 h a 37 °C con agitación a 80 rpm.
  7. Retire la solución de dispersión de biopelículas y colóquela en un tubo separado de 1,5 mL. Esto contiene las celdas dispersas.
  8. Agregue 1 mL de PBS a la muestra de tejido restante e invierta suavemente 3-5 veces para enjuagar las células dispersas restantes. Quite y descarte el PBS.
  9. Añadir 1 mL de PBS al tejido restante y homogeneizar a 5 m/s durante 60 s utilizando un homogeneizador de sobremesa.
  10. Diluir en serie la solución de células dispersas y la muestra de tejido homogeneizado colocando 100 μL de muestra en 900 μL de PBS en un tubo de 1,5 mL, y repitiendo cinco veces para un total de 6 diluciones.
  11. Placa puntual de 10 μL de cada dilución en agar selectivo de medios (por ejemplo, Agar aislamiento de Pseudomonas para P. aeruginosa)e incubar las placas a 37 °C durante la noche.
  12. Cuente la UFC y calcule el "porcentaje disperso" como (UFC en sobrenadante/ (UFC en sobrenadante + UFC en el tejido de biopelícula)) x 100.

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Representative Results

En este experimento, 8-10 ratones suizos suizos hembra de la semana de edad Webster fueron infectados con10 4 UFC de PAO1 que lleva el plásmido de luminiscencia pQF50-lux. Según lo descrito arriba, una infección fue permitida establecer para 48 h antes de administrar 3 x 30 tratamientos mínimos de PBS (control del vehículo) o del 10% GH (tratamiento) para digerir el biofilm EPS. Los ratones fueron fototratado pretratamiento, directamente después del tratamiento (0 h) y en 10 h y 20 h post-tratamiento. La Figura 2A y la Figura Suplementaria 1 muestran una infección establecida dentro del lecho de la herida generando una señal bioluminiscente brillante. La dispersión de bacterias fuera de la cama de la herida se puede visualizar inmediatamente después del tratamiento del GH (0 h), pero no después del tratamiento de PBS. Cabe señalar que en estudios anteriores, detectamos bacterias en la sangre y el bazo tan pronto como 5 h después del tratamiento con GH7. La diseminación bacteriana en los órganos también se puede ver colocando el ratón en su lado para la toma de imágenes, como se muestra en el panel inferior de la Figura 2A.

Las imágenes de los ratones pbs y gh-tratados demostraron un aumento en la señal luminiscente en 20 h después del tratamiento comparado al pretratamiento (cuadro 2B). Presumimos que esto se debe a la interrupción mecánica de la biopelícula causada por el riego de la solución. En el poste-tratamiento de 20 h, los ratones fueron euthanized, y las camas y los bazos de la herida fueron recogidos para enumerar CFU/gramo de tejido. Mientras que las cargas bacterianas en los lechos de heridas eran similares(Figura 2C),las bacterias sólo se detectaron en los bazos de los ratones tratados con GH(Figura 2D),lo que sugiere la diseminación diseminada de las bacterias dispersas.

Anteriormente, hemos demostrado que el tratamiento con GH puede romper agregados de bacterias, mejorando los recuentos deUFC 21. Esto puede explicar el ligero aumento de la carga bacteriana en los lechos de heridas de los ratones tratados con GH. Por último, aunque las camas de heridas tratadas con GH tenían un CFU/gramo ligeramente más alto, hubo un cambio bioluminiscente de menor porcentaje. Estos resultados sugieren la importancia de confirmar luminiscencia con cuentas de CFU. Estos resultados representativos dan un ejemplo de los datos que se pueden recopilar mediante la utilización de los protocolos descritos anteriormente.

Figure 1
Figura 1. Establecer infecciones de heridas asociadas a biopelículas y evaluar la eficacia del agente de dispersión in vivo. Los apósitos se revisaron para detectar desgarros o pérdida de adherencia a la piel del ratón antes del tratamiento. Los apósitos comprometidos fueron reemplazados. Los ratones fueron colocados bajo anestesia inmediatamente antes de la administración del tratamiento. Se inyectaron 200 μL de solución enzimática, o un control del vehículo, en el espacio entre el lecho de la herida y el apósito. La preparación fue levantada suavemente usando los pórceps para asegurarse de que la herida entera fuera saturada en la solución. El tratamiento fue dejado en la cama de la herida por el minuto 30. Después de 30 min, el tratamiento se aspiraba con una jeringa, y se añadieron otros 200 μL de tratamiento. Esto fue repetida para un total de 3 tratamientos. Para medir la dispersión en tiempo real, los ratones fueron fototrados usando IVIS antes del tratamiento, inmediatamente después del tratamiento (0 h), 10 h, y 20 h después del tratamiento. En el poste-tratamiento de 20 h, los ratones fueron euthanized, y las camas y los bazos de la herida fueron recogidos. Las muestras se enjuagaron en PBS y luego se homogeneizaron en PBS fresco dos veces a 5 m/s durante 60 s. Las muestras se diluyeron en serie y se platearon puntualmente. CFU fueron enumerados y CFU/gramo fueron calculados. El nivel de dispersión de bacterias de la herida puede ser evaluado por IVIS o determinando el número de UFC que se extendió sistémicamente al bazo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Los datos representativos demuestran cómo evaluar la dispersión in vivo. Las heridas infectadas con 104 PAO1 (pQF50-lux) para 48 h fueron tratadas con PBS, o el 10% GH (solución de la enzima de la dispersión del biofilm). El tratamiento de PBS fue utilizado como control del vehículo. Las camas de la herida fueron tratadas con 3 x 30 tratamientos mínimos. Los ratones fueron fotodos usando IVIS antes del tratamiento, inmediatamente después del tratamiento, 10 h después del tratamiento, y 20 h después del tratamiento. Cabe señalar que las imágenes de vista lateral son de diferentes PBS y ratones tratados con GH que los que se muestran en las imágenes de vista aérea (A). El ROIs para cada cama de la herida del tratamiento previo y cada cama de la herida del poste-tratamiento de 20 h fue registrado. El cambio porcentual con cargo al pretratamiento se calculó como (ROI pretratamiento-ROI post-tratamiento/ROI pretratamiento) x 100 (B). En el poste-tratamiento de 20 h, los ratones fueron euthanized. Los lechos de heridas y bazos fueron recogidos y pesados para determinar la UFC/gramo (C y D, respectivamente). N=3. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Dilución en serie y revestimiento puntual. La muestra homogeneizada se vortexed y 100 μL se transfirió a un tubo eppendorf de 1,5 mL que contenía 900 μL de PBS. La muestra se vortexed y 100 μL se transfirió a otro tubo eppendorf de 1,5 mL con 900 μL de PBS. Este proceso se repitió 5 veces. Comenzando con el último tubo de dilución, 10 μL de muestra se placaron en la placa de agar en el punto10-8. Esto se continuó hasta la dilución 10-3. Típicamente, la diluciónde 10 -3 resulta en un césped de bacterias dentro del lugar. Algunos órganos, que tienen bajas cargas bacterianas, pueden requerir revestimiento puntual hasta la dilución de 10-1. Repita para cada muestra de tejido. Colocar la placa de agar en una incubadora a 37 °C durante 24-48 h, o crecer en condiciones óptimas para las especies bacterianas de interés. Para enumerar la UFC, cuente las colonias individuales en la dilución más baja posible y multiplique por el factor de dilución apropiado para determinar la UFC/mL o utilice el peso del tejido para calcular la UFC/g de tejido. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Medición de la dispersión del tejido infectado ex vivo. Los ratones fueron euthanized y el tejido infectado de la herida fue quitado asépticamente. El tejido infectado fue colocado en un tubo de homogeneización del molino del grano de 2 mL y aclarado brevemente con PBS. Se añadió 1 mL de agente de dispersión y la muestra se incubó durante 2 h a 37 °C con agitación a 80 rpm. Después de la incubación, la solución que contenía las células dispersas se retiró y se colocó en un tubo separado de 1,5 mL. El tejido restante fue aclarado con 1 mL de PBS. 1 mL de PBS fresco fue añadido al tejido y homogeneizado en 5 m/s por 60 s. La solución enzimática y el tejido homogeneizado entonces fueron diluidas en serie y manchadas sobre el agar selectivo. Se enumeraron los UFC y se calculó la dispersión como: UFC de solución enzimática/ (UFC de solución enzimática + UFC de tejido) x 100. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Figura complementaria 1. Medición de la dispersión in vivo. Las heridas fueron infectadas con 104 PAO1 (pQF50-lux) para 48 h y después tratadas con PBS, o el 10% GH (solución de la enzima de la dispersión del biofilm). El tratamiento de PBS fue utilizado como control del vehículo. Las camas de la herida fueron tratadas con 3 x 30 tratamientos mínimos de la irrigación. Los ratones fueron foto- usando IVIS antes del tratamiento, inmediatamente después del tratamiento, del poste-tratamiento de 10 h, y del poste-tratamiento de 20 h (a). En el poste-tratamiento de 20 h, los ratones fueron euthanized. Los lechos de heridas y bazos fueron recogidos y pesados para determinar UFC/gramo (B y C, respectivamente). N=3. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Aquí se describen los protocolos que se pueden utilizar para estudiar la eficacia de los agentes de dispersión de biopelículas. Estos protocolos se pueden adaptar fácilmente para su uso con diferentes tipos de agentes de dispersión, especies bacterianas o muestras ex vivo, incluidas las muestras de desbridamiento clínico. Este protocolo también proporciona un modelo clínicamente relevante para recolectar y estudiar células bacterianas dispersas. Se ha demostrado que los fenotipos de las células bacterianas dispersas son distintos de los de las células planctónicas o de biopelículas 5,24,25,26; sin embargo, los fenotipos de bacterias dispersadas in vivo todavía tienen que serdescritos. Si los agentes de dispersión se van a utilizar terapéuticamente, es importante determinar su eficacia, así como comprender el fenotipo que adoptan estas células. Además, este protocolo podría utilizarse para estudiar cómo las variaciones en la estructura de EPS o la alteración de las vías de señalización afectan a la dispersión. Por ejemplo, la dispersión de cepas de P. aeruginosa con mutaciones en diferentes componentes de exopolisacárido (por ejemplo, Pel, Psl, Alginato) podría compararse con la de cepas de tipo salvaje.

En general, este protocolo se puede dividir en cuatro secciones principales: (1) establecer una infección (2) administrar el tratamiento o (3) recoger el tejido infectado para el tratamiento ex vivo y (4) determinar la eficacia de la dispersión. La parte crítica de la sección 1 es el establecimiento acertado de la infección en la cama de la herida. Si las cepas luminiscentes, que requieren antibióticos para mantener la estabilidad del plásmido, se están utilizando, es imperativo agregar los antibióticos apropiados al cultivar las cepas en preparación para la infección. También debe considerarse que los plásmidos pueden no mantenerse durante la infección en el animal (sin presión antibiótica), por lo que la evaluación de la carga bacteriana no debe basarse completamente en las imágenes IVIS, sino que debe ser confirmada por la UFC. La dosis inoculante también es un paso crítico para iniciar la infección. Para P. aeruginosa y S. aureus, se suele utilizar una dosis infectante de 104-5 UFC, pero la dosis óptima puede variar dependiendo de las especies bacterianas y de ratón utilizadas.

La parte crítica de la sección 2 es asegurar que el lecho de la herida esté cubierto por el apósito durante todo el desarrollo de la infección y el tratamiento. Si el apósito no se adhiere correctamente, el tratamiento puede escaparse del lecho de la herida y puede ser ineficaz. El apósito también es importante para mantener el lecho de la herida protegido de contaminantes potenciales, y perjudicar la curación contráctil por el ratón, que es esencial para imitar la cicatrización de heridas humanas. Por último, la parte crítica de la sección 3 es manejar adecuadamente las muestras recogidas. Para enumerar la UFC, el tejido infectado debe enjuagarse con 1 mL de PBS antes de la adición de otro 1 mL de PBS para la homogeneización. Órganos más fibrosos, como los pulmones, pueden requerir una homogeneización más completa.

Las limitaciones primarias de estos protocolos incluyen la supervisión cercana requerida de la preparación y de la utilización de IVIS a la dispersión de la imagen y hacen suposiciones sobre eficacia de la dispersión. Para los estudios a largo plazo, el re-crecimiento de la piel puede ser problemático porque puede impedir la adherencia del apósito al sitio de la herida. Los apósitos a menudo requieren reemplazo, y su eliminación puede conducir al desbridamiento accidental de la herida y la oportunidad de contaminación. Para visualizar la dispersión del lecho de la herida, se debe utilizar una cepa bacteriana bioluminiscente. Si la especie bacteriana de interés carece de un reportero bioluminiscente, esta opción no es factible. Otra limitación es el potencial del tratamiento de dispersión para inducir bacteriemia, que puede conducir a la muerte del ratón. Sin embargo, hemos visto que las células dispersas pueden ser efectivamente asesinadas por antibióticos in vivo7.

Los resultados representativos representados en la Figura 2 ilustran una limitación de IVIS para medir la eficacia de la dispersión. En primer lugar, se debe utilizar una cepa luminiscente de la especie bacteriana de interés. La cepa debe producir una señal luminiscente que sea lo suficientemente brillante como para detectar a través de múltiples capas de tejido con el fin de visualizar la dispersión desde el lecho de la herida a otras partes del cuerpo. Se ha sugerido que se requiere un mínimo de aproximadamente 106 bacterias para producir una señal luminiscente lo suficientemente fuerte como para detectarla por IVIS27. También se ha descrito una disminución de la señal luminiscente cuando las bacterias entran en la faseestacionaria 28. Esto puede causar una desconexión entre los ROIs medidos y la UFC enumerados29. Esta limitación puede conducir a suposiciones falsas cuando no hay una señal lo suficientemente fuerte para la detección, pero las bacterias todavía están presentes. Como se muestra en la Figura 2B,el PBS y los tratamientos con GH al 10% resultaron en un aumento de la luminiscencia después del tratamiento. Se trata de una observación curiosa y consistente, que también se ha visto tras dispersar las células in vitro (CláudiaMarques, Binghamton University, comunicación personal). Es posible que la interrupción física de la biopelícula de la administración del tratamiento simplemente se extiende a cabo las células que estaban bien embaladas, lo que resulta en un aumento de la señal de luz. Alternativamente, el tratamiento de la dispersión podría "despertar" las células del biofilm que eran previamente metabólico inactivas, dando por resultado bioluminiscencia creciente. De cualquier manera, es crucial confirmar los resultados de las imágenes IVIS con datos de UFC. Por último, existe una distribución heterogénea de bacterias dentro del tejido de la herida infectado30,31. Por lo tanto, si el tejido se divide ex vivo para proporcionar más muestras, no se debe asumir que la carga bacteriana en cada sección de la herida es idéntica.

Hay modificaciones y solución de problemas que se pueden llevar a cabo para superar las limitaciones de estos modelos. En primer lugar, la cantidad de tiempo asignado para la exposición de la crema depilatoria puede necesitar ser ajustada dependiendo de la especie de ratón utilizada. Por ejemplo, 7 min se utiliza típicamente para ratones Webster suizos, mientras que los ratones C57BL/6 pueden necesitar hasta 10 min de exposición para eliminar con éxito el pelaje. Esto, por supuesto, también depende del producto utilizado, y los tiempos de exposición nunca deben exceder las instrucciones del fabricante. Si se está llevando a cabo un estudio largo (más de 4 días), es posible que sea necesario volver a aplicar la crema depilatoria para eliminar el pelaje re-crecido y asegurar un sellado adecuado del apósito. A continuación, si una señal luminiscente es difícil de detectar, el tiempo de exposición puede aumentar durante las imágenes IVIS. La dosis de inoculación y el tiempo de infección también se pueden ajustar. Es importante usar una dosis infectante que no sea demasiado alta que abrume al ratón, pero tampoco es demasiado baja que las bacterias se eliminen inmediatamente por la respuesta inmune.

En este protocolo, describimos el tratamiento de 48 infecciones de heridas h-old con agentes dispersantes, ya que este es un punto de tiempo en el que hemos demostrado que se establecen infecciones causadas por P. aeruginosa y/o S. aureus y se asocian a biopelículas 12,15,16. Sin embargo, dependiendo de la especie bacteriana, otros puntos de tiempo pueden ser más óptimos. Idealmente, la carga bacteriana en la herida debe estancarse una vez que se establece una infección. Por ejemplo, hemos visto que tanto con P. aeruginosa como con S. aureus, la carga bacteriana en la herida alcanza aproximadamente 108 UFC/g de tejido por 48 h después de la infección y permanece en ese nivel hasta el cierre de la herida. La Figura 1 ilustra el tratamiento con una solución que requiere lavados de 3 x 30 min. Sin embargo, si el agente de dispersión estaba en otra forma, los lavados no serían necesarios. Por ejemplo, una crema, gel o apósito de ingeniería podría simplemente colocarse en la parte superior de la cama de la herida. Por último, la herida puede infectarse de diversas maneras, incluyendo la inoculación de células bacterianas planctónicas, biopelículas preformadas12,o incluso tejido de desbridamiento infectado de otro animal o humano19,32. Hemos visto que trasplantar una biopelícula preformada o una muestra de desbridamiento al lecho de la herida resulta en infecciones polimicrobianas más exitosas que cuando se inoculan múltiples especies en su forma planctónica12.

En general, estos protocolos describen métodos para estudiar la dispersión de biopelículas y la evaluación de agentes terapéuticos de dispersión de biopelículas. Estos modelos permiten el desarrollo de infecciones complejas asociadas a biopelículas polimicrobianas que imitan infecciones humanas clínicamente relevantes. Nuestra esperanza es que estos protocolos sean utilizados y refinados para promover el desarrollo de agentes de dispersión anti-biopelícula para uso terapéutico.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (R21 AI137462-01A1), la Fundación Ted Nash Long Life, la Fundación Jasper L. y Jack Denton Wilson y el Departamento de Defensa (DoD MIDRP W0318_19_NM_PP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher 14823434 Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle Fisher 14823434 Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt Fisher BP1760-5 Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase MP Biomedicals 2100447 Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL) ZooPharm RX216118 Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase MP Biomedicals 2150583 Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream Walmart 287746 Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips Fisher 12-460-536 Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL Fisher 101406 Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer MP Biomedicals 6VFV9 Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 0298-9373-68 Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal) Fisher 15340151 Used to homogenize samples for plating
Isoflurane Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN Sigma Aldrich K4138 Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller Fisher BP1426-2 Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable Diamond Back Drugs 2468 Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem Sigma Aldrich PHR1772-500MG Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges Fisher 13-761-52 Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain Ref [13] N/A PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes Fisher PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x Fisher BP3991 Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing Mckesson 66024007 Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar VWR 90004-394 Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M. Walmart Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads Fisher 22-363-750 Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors Fisher 89515 Can also use curved scissors
Swiss Webster mice Charles River 551NCISWWEB Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL Fisher 14823434 Used to administer drugs and enzyme treatment

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References

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Inmunología e Infección Número 174 Ex vivo, In vivo,biofilm dispersión infección de heridas agente anti-biofilm Pseudomonas aeruginosa
Evaluación de la dispersión de biopelículas en heridas murinas
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Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing Biofilm Dispersal in Murine Wounds. J. Vis. Exp. (174), e62136, doi:10.3791/62136 (2021).

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