Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In vitro Analyse af E3 Ubiquitin Ligase Funktion

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

Denne undersøgelse giver detaljerede in vitro allestedsnærværende assay protokoller til analyse af E3 ubiquitin ligase katalytisk aktivitet. Rekombinante proteiner blev udtrykt ved hjælp af prokaryote systemer såsom Escherichia coli kultur.

Abstract

Den kovalente fastgørelse af allestedsnærværende (Ub) til indre lysinrester (r) af et substratprotein, en proces, der kaldes allestedsnærværende, repræsenterer en af de vigtigste postoversættelsesmæssige modifikationer i eukaryote organismer. Allestedsnærværende ubiquitylation medieres af en sekventiel kaskade af tre enzymklasser, herunder allestedsnærværende aktiverende enzymer (E1 enzymer), allestedsnærværende konjugaterende enzymer (E2 enzymer) og allestedsnærværende ligaser (E3 enzymer), og nogle gange, ubiquitin-kæde forlængelse faktorer (E4 enzymer). Her leveres in vitro-protokoller for allestedsnærværende analyser, som gør det muligt at vurdere E3-ubiquitin ligaseaktivitet, samarbejdet mellem E2-E3-par og substratvalg. Samarbejdende E2-E3 par kan screenes ved at overvåge dannelsen af frie poly-ubiquitin kæder og / eller auto-allestedsnærværende af E3 ligase. Substrat allestedsnærværende er defineret ved selektiv binding af E3 ligase og kan påvises ved vestlig blotting af in vitro reaktion. Desuden er der beskrevet en E2~Ub-udledningsanalyse, som er et nyttigt redskab til direkte vurdering af funktionelt E2-E3-samarbejde. Her følges den E3-afhængige overførsel af allestedsnærværende fra det tilsvarende E2-enzym til frie lysin aminosyrer (efterligne substrat allestedsnærværende) eller interne lysiner af selve E3 ligase (auto-allestedsnærværende). Afslutningsvis er tre forskellige in vitro protokoller, der er hurtige og nemme at udføre for at løse E3 ligase katalytisk funktionalitet.

Introduction

Allestedsnærværende er den proces, hvorved Ub er kovalent forbundet med et substratprotein1. Ub-modifikationen katalyseres af successive enzymatiske reaktioner, der involverer virkningen af tre forskellige enzymklasser, dvs.Ub-aktiverende enzymer (E1'er), Ub-konjugaterende enzymer (E2s), Ub ligaser (E3'er) og muligvis Ub kædeforlængelsesfaktorer (E4s)2,3,4,5. Efter adenosin triphosphat (ATP) - og magnesium (Mg2 +)-afhængige aktivering af Ub ved E1, det aktive sted cystein af E1 angriber C-terminal glycin af Ub, danner en thioester kompleks (Ub ~ E1). Den energi, der trækkes fra ATP hydrolyse forårsager Ub at opnå en høj energi overgangstilstand, som opretholdes i hele følgende enzym kaskade. Dernæst overfører E2-enzymet den aktiverede Ub til sin indre katalytiske cystein og danner derved en forbigående Ub ~ E2 thioesterbinding. Efterfølgende overføres Ub til substrateproteinet.

Dette kan gøres på to måder. Enten E3 ligase kan først binde sig til E2, eller E3 ligase kan direkte binde Ub. Sidstnævnte måde resulterer i dannelsen af en E3 ~ Ub mellemliggende. I begge tilfælde er Ub forbundet med substrateproteinet ved dannelse af en isopeptidbinding mellem C-terminal carboxylgruppen af Ub og lysin Ɛ-aminogruppen af substratet6. Det menneskelige genom koder to E1'ere, ca. 40 E2'ere og mere end 600 putative ubiquitin ligaser7. Baseret på Ub overførsel mekanisme af E3, Ub ligaser er opdelt i tre kategorier, der involverer Homologe til E6AP C-Terminus (HECT)-type, Virkelig interessant nyt gen (RING)/U-box-type, og RING mellem RING (RBR)-type ligaser8. I denne undersøgelse anvendes U-boxen, der indeholder ligase, Carboxyl Terminus af HSC70-interacting Protein (CHIP), som et repræsentativt E3-enzym. I modsætning til HECT-type E3 enzymer, der danner Ub ~ E3 thioesters, U-box domæne CHIP binder E2 ~ Ub og fremmer den efterfølgende Ub / substrat overførsel direkte fra E2 enzym8,9. Baseret på U-boxens betydning for enzymatisk funktion anvendes en inaktiv CHIP U-box mutant, CHIP (H260Q), som en kontrol. CHIP(H260Q) undlader at binde sig til sin cognate E2s, og dermed mister sin E3 ligase aktivitet10.

Protein allestedsnærværende spiller en afgørende rolle i reguleringen af et væld af cellulære begivenheder i eukaryote celler. Mangfoldigheden af cellulære resultater, der fremmes af den reversible fastgørelse af Ub molekyler til substratproteiner, kan tilskrives Ub's molekylære egenskaber. Da Ub selv indeholder syv lysin (K) rester til yderligere allestedsnærværende, er der et rigt udvalg af Ub kædetyper med forskellige størrelser og / eller topologier11. For eksempel kan substrater ændres af et enkelt Ub-molekyle ved en (mono-allestedsnærværende) eller flere lysiner (multi mono-allestedsnærværende) og endda af Ub-kæder (poly-allestedsnærværende)11. Ub kæder dannes enten homo- eller heterotypisk via de samme eller forskellige lysinrester af Ub, hvilket endda kan resultere i forgrenede Ub-kæder9. Således fører protein allestedsnærværende til forskellige arrangementer af Ub molekyler, der giver specifikke oplysninger, f.eks.,for nedbrydning, aktivering eller lokalisering af konjugerede proteiner12,13. Disse forskellige Ub-signaler muliggør hurtig omprogrammering af cellulære signalveje, hvilket er et vigtigt krav for cellens evne til at reagere på skiftende miljøbehov.

Et centralt aspekt af allestedsnærværende er relateret til protein kvalitetskontrol. Misfoldede eller uigenkaldeligt beskadigede proteiner skal nedbrydes og erstattes af nyligt syntetiserede proteiner for at opretholde protein homøostase eller proteostase14. Kvalitetskontrol E3 ligase, CHIP, samarbejder med molekylære chaperoner i Ub-afhængige nedbrydning af beskadigede proteiner9,15,16,17. Bortset fra det regulerer CHIP stabiliteten af den myosin-ledede chaperone, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), som er tæt koordineret med muskelfunktion og afvigelser fra de optimale niveauer fører til menneskelig myopati18,19,20,21. Nedbrydning af UNC-45B ved 26S proteasomet medieres ved fastgørelse af en K48-forbundet poly-Ub kæde9. I mangel af substratproteiner udfører CHIP auto-allestedsnærværende10,22,23, som er karakteristisk for RING /U-box E3 ubiquitin ligaser24,25 og anses for at regulere ligaseaktivitet26. Anvendelse af in vitro allestedsnærværende assay metoder beskrevet i dette papir bidraget til systematisk at identificere E2 enzymer, der går sammen med CHIP til at fremme dannelsen af frie poly-Ub kæder og / eller auto-allestedsnærværende af CHIP (protokol afsnit 2). Desuden blev CHIP-afhængige allestedsnærværende UNC-45B observeret, som er et kendt substrat af E3 ligase18,19 (protokol afsnit 3). I sidste ende blev CHIP-afhængig overførsel af aktiveret Ub fra Ub ~ E2 thioester overvåget (protokolafsnit 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Udarbejdelse af buffere og reagenser

BEMÆRK: Buffere og reagenser, der er manuelt forberedt i laboratoriet, er angivet nedenfor. Alle andre buffere og reagenser, der anvendes i protokollerne, blev købt fra forskellige kilder og anvendt i henhold til producentens anvisninger.

  1. Forbered 10x fosfat-buffered saltvand (10x PBS). Til dette formål blandes 1,37 M natriumchlorid (NaCl), 27 mM kaliumchlorid (KCl), 80 mM disodium-hydrogen-fosfatdihydrat (Na2HPO4,2H2O) og 20 mM kalium-dihydrogenphosphat (KH2PO4) i 1 L dobbeltdestilleret H2O (ddH2O). Autoklave 10x PBS, og forbered en 1x PBS-opløsning i ddH2O.
    1. Autoklaver udføres i 15 min ved 121 °C og 98,9 kPa.
      BEMÆRK: Autoklavering udføres under disse forhold for alle buffere og løsninger. Hvis andet ikke er angivet, opbevares opløsninger ved stuetemperatur (RT).
  2. Klargør 1 L PBS-Tween (PBS-T) løsning ved at tilføje 0,1% Mellem til 1 L af 1x PBS.
  3. Der fremstilles 10 mL af en 0,5 M L-lysinlageropløsning ved at opløse L-lysin i ddH2O. Aliquot L-lysin i 1 mL portioner, og opbevar dem ved -20 °C, indtil den er videre.
    BEMÆRK: L-lysin kan fryses og optøes gentagne gange.
  4. Opløsning på 0,25 M ethylendiamin tetraacetsyre (EDTA) opløses ved opløsning af EDTA i 200 ml ddH2O.
    1. pH-tallet justeres til 8,0 med natriumhydroxid (NaOH).
    2. Juster lydstyrken til 250 mL med ddH2O.
    3. Autoklave løsningen.
  5. Der fremstilles 10 mL af en BSA-opløsning (20 mg/mL kvægserum albumin) ved opløsning af BSA i ddH2O. Opbevar ved -20 °C i 200 μL aliquots.
    BEMÆRK: BSA kan fryses og optøs gentagne gange.
  6. 1 L 2-(N-morpholino)ethansulfonsyre (MES) løbebuffer ved opløsning af 50 mM MES, 50 mM Tris base, 3,47 mM natrium dodecyl sulfat (SDS) og 1,03 mM EDTA i 0,9 L ddH2O. Når du har blandet korrekt, justeres lydstyrken til 1 L.
    1. pH-1x-bufferen er 7,6. PH-skærmen må ikke justeres med syre eller base.
  7. Der fremstilles 200 mL blokeringsopløsning (5% mælk) ved opløsning af 10 g mælkepulver i 1x PBS-T. Blokeringsopløsningen opbevares ved 4 °C i op til en uge.
  8. Klargør 1 L overførselsbuffer (se materialetabellen)i overensstemmelse med producentens instruktion.
  9. 2x SDS-prøvebufferen opløses ved at opløse 125 mM Tris-basen, 4 % SDS, 4 % glycerol, 0,03 % bromophenolblå og 50 μL/mL β-mercaptoethanol i 50 mL ddH2O. Aliquot i 1 mL portioner og opbevares ved -20 °C indtil brug.

2. In vitro auto-allestedsnærværende assay

  1. Forberedelse og udførelse af analyser
    1. Beregn mængden af hvert reagens, der kræves pr. reaktion, baseret på de givne molariteter af proteinerne og proteinkoncentrationerne i proteinopløsningerne. Pr. auto-allestedsnærværende reaktion skal du bruge 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 og 50 μM Ub. Lydstyrken af reaktionen justeres til 20 μL med ddH2O.
      BEMÆRK: ATP-løsning og allestedsnærværende buffer blev købt som 10x lagerløsninger og brugt på 1x.
    2. Forbered en pipetterordning for alle reaktioner. Test ni forskellige E2-enzymer for deres evne til at fungere (I) med CHIP, (II) med en katalytisk inaktiv CHIP(H260Q) mutant og (III) uden CHIP i individuelle allestedsnærværende reaktioner.
    3. For at undgå pipetteringsfejl skal du forberede en masterblanding på is, der indeholder den mængde, der kræves til alle reaktioner plus en ekstra reaktion. Beregn mængden af master mix kræves pr reaktion.
      BEMÆRK: Master mix komponenter er reagenser, der er lige så nødvendige for hver reaktion, dvs.
    4. Tilsæt ddH2O og master mix til polymerase kædereaktion (PCR) rør. Hold rørene på is.
    5. Før allestedsnærværende reaktioner påbegyndes ved at tilsætte E2-enzymerne, skal du oprette en PCR termisk cycler med følgende program: 2 h, 37 °C efterfulgt af 4 °C, uendeligt.
    6. Der tilsættes 1 μM af E2-enzymerne i de respektive rør, og prøverne inkuberes i PCR-termocyklussen i den angivne periode.
    7. Efter 2 timer tilsættes SDS-prøvebufferen til hver reaktion, og blandes ved at pipetter op og ned flere gange.
      BEMÆRK: Den krævede volumen af prøvebufferen afhænger af stikprøvebufferens lagerkoncentration. Her blev der tilføjet 20 μL 2x SDS-prøvebuffer til hver reaktion.
    8. Kog straks prøverne ved 95 °C i 5 min, og fortsæt med polyacrylamidgelelektroforese (PAGE). Opbevar de denaturerede proteiner ved -20 °C.
  2. Gel elektroforese og vestlige blot
    1. Når du har optøet, drejes prøverne ned i ca. 10 s og SDS-PAGE gelen indlæses. Brug en protein stige som størrelse reference.
      BEMÆRK: Her blev der anvendt 4-12% Bis-Tris gradient geler og 3 μL protein stigen. Prøvens volumener opdeles, og der indlæses to geler på samme måde ved hjælp af 20 μL af hver prøve.
    2. Kør gelen ved 160-200 V i ca. 30-45 min, så prøvefronten når bunden af gelen.
    3. Overfør hver gel til en plastbeholder fyldt med halvdry blotting buffer, og inkuber den i 2-5 min på RT. Fjern stablingsgelen.
    4. Forbered to stykker gel-størrelse blotting papir og en gel-størrelse nitrocellulose membran pr SDS gel og pre-soak i semidry blotting buffer. Saml den vestlige blot (WB) sandwich i et WB kammer fra bund til top i følgende rækkefølge: blotting papir, nitrocellulose membran, SDS-PAGE gel, blotting papir.
    5. Fjern luftbobler, der kan have været fanget mellem sandwich lag. Til dette formål skal du bruge en rulle til forsigtigt at rulle over sandwichen et par gange.
    6. Luk kammeret, og lad overskydende blot buffer til at løbe ud.
    7. Placer kammeret i den respektive blotting enhed, og brug følgende program til semidry blotting: 25 V, 1,0 A, 30 min.
    8. Overfør den blottede membran til en plastbeholder fyldt med blokeringsopløsning, og inkuber i 30 minutter ved RT.
    9. Den primære antistofopløsning tilsættes ved at tilsætte antistoffet til 10 mL PBS-T, der indeholder et blokerende reagens (se materialetabellen).
      BEMÆRK: Arbejdskoncentrationen af antistoffet er antistofspecifik. I dette tilfælde blev der anvendt et monoklonalt museantinokinantistof ved en fortynding på 1:5.000. Til den anden gel blev der anvendt et monoklonalt anti-CHIP antistof mod chip ved 1:5.000 i PBS-T/blokerende reagens.
    10. Udskift blokeringsopløsningen med den primære antistofopløsning, og inkuber natten over ved 4 °C på en rocker.
    11. Vask membranen tre gange i 10 min med PBS-T.
    12. Den sekundære antistofopløsning tilsættes ved at tilsætte det respektive antistof til 10 mL PBS-T.
      BEMÆRK: Her anvendes gede anti-mus og mus anti-kanin antistoffer ved en fortynding af 1:10,000.
    13. Inkuber membranen med det sekundære antistof i 1 time på RT på en rocker.
    14. Vask membranen tre gange i 5 min med PBS-T.
  3. Dataanalyse
    1. Tilføj vestlige blotdetekteringsreagenser til peberrodsperoxidase (HRP)-konjugerede antistoffer mod den vaskede membran i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger, og fang HRP-signalet ved hjælp af røntgenfilm eller et opladningskoblet enhedskamera (Figur 1).

3. In vitro substrat allestedsnærværende assay

  1. Forberedelse og udførelse af analyser
    1. Beregn mængden af hvert reagens, der kræves pr. reaktion, baseret på de givne molariteter af proteinerne og proteinkoncentrationerne af proteinopløsningerne. Per substrat allestedsnærværende reaktion, brug 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM substrat og 50 μM Ub. Brug 10x ATP-løsning og 10x allestedsnærværende buffer ved 1x. Volumen af substrat allestedsnærværende reaktion til 20 μL med ddH2O.
    2. Forbered en pipetterordning for alle reaktioner. Medtag korrekte kontrolreaktioner, der bekræfter, at substratets allestedsnærværende er E3-specifik. Brug proteinet UNC-45B som et repræsentativt substrat af CHIP og en katalytisk inaktiv CHIP mutant (H260Q) som en kontrol. Forbered følgende reaktioner: E1, E2, Ub mix (herunder Ub, ATP, allestedsnærværende buffer); E1, E2, Ub mix, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; og E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. For at undgå pipetteringsfejl skal du forberede en masterblanding på is, der indeholder den mængde, der kræves til alle reaktioner plus en ekstra reaktion. Beregn mængden af mastermix, der kræves pr. reaktion.
      BEMÆRK: Master mix komponenter til denne analyse omfatter E1, E2, Ub, ATP, og allestedsnærværende buffer.
    4. Tilføj reaktionskomponenter i følgende rækkefølge: ddH2O, substrat, E3 ligase.
    5. Før allestedsnærværende reaktion ved tilsætning af master mix, oprette en PCR termisk cycler med følgende program: 2 h, 37 °C efterfulgt af 4 °C, uendeligt.
    6. Tilsæt masterblandingen til hvert rør, og inkuber prøverne i PCR-termisk cycler i den angivne periode.
    7. Efter 2 timer tilsættes 2x SDS-prøvebufferen til hver reaktion, og blandes ved at pipetter op og ned flere gange.
    8. Efter kørslen koges prøverne straks ved 95 °C i 5 min, og fortsæt med PAGE. Alternativt kan de denaturerede proteiner opbevares ved -20 °C.
  2. Gel elektroforese og vestlige blot
    1. Udføre gelelektroforese og western blot som beskrevet i punkt 2.2. Brug specifikke antistoffer til påvisning af henholdsvis substratet og E3 ligasen.
      BEMÆRK: Her er UNC-45B smeltet sammen til et polypeptidproteinmærke, der er afledt af c-myc-genproduktet, der giver mulighed for brug af et monoklonalt museanti-MYC-antistof. Anti-MYC bruges kl. 1:10.000.
  3. Dataanalyse
    1. Udfør dataanalyse som beskrevet i afsnit 2.3 (Figur 2).

4. Lysin udledning assay

  1. Forberedelse og udførelse af analyser
    1. Opladning af E2-enzymet med Ub by E1
      1. Beregn mængden af hvert reagens, der kræves pr. reaktion, baseret på de givne molariteter af proteinerne og proteinkoncentrationerne i proteinopløsningerne. Ved opladningsreaktion skal du bruge 2 μM E1, 4 μM E2 og 4 μM lysinfri ubiquitin (Ub K0). Brug 10x ATP og 10x allestedsnærværende buffer ved 1x. Opladningsreaktionens volumen justeres til 20 μL med ddH20.
        BEMÆRK: Den lysinfri Ub K0 mutant bruges til at håndhæve den eksklusive produktion af mono-allestedsnærværende E2. Wild-type Ub kan også bruges; Dette kan dog føre til forskellige E2~Ub-ændringer (f.eks.poly-allestedsnærværende E2), som er vanskeligere at analysere. For første gang brug eller ved brug af et nyt E2 enzym, bestemme niveauet af Ub opladning på E2, der kan opnås ved E1. For at bestemme udbyttet af opladning, visualisere ikke opladet vs opladet E2 via Coomassie farvning. Her blev ca. halvdelen af Ub K0 pålideligt konverteret til UBE2D2~Ub ved brug af ækvimolarforhold på UBE2D2 og Ub K0 (Supplerende figur S2A).
      2. Forbered en pipetterordning til opladningsreaktionen. Juster opladningsreaktionens volumen til de efterfølgende udladningsreaktioner efter eget valg, f.eks. Forbered således dobbelt så meget volumen som en opladningsreaktion.
        BEMÆRK: Ved første brug skal du teste forskellige koncentrationer af den valgte E3-ligase for at overvåge optimale udledningsforhold og analysere dem ved vestlig blotting. I en ideel tilstand vil udledningen af Ub fra E2 stige over tid, indtil det respektive E2 ~ Ub proteinbånd forsvinder.
      3. Inkuberes opladningsreaktionen i 15 min ved 37 °C.
    2. Afslutning af opladningsreaktionen
      1. Stop opladningsreaktionen ved tilsætning af apyrase ved en endelig koncentration på 1,8 U/mL. Inkubationen udføres med apyrase i 5 min på RT, efterfulgt af tilsætning af EDTA ved en endelig koncentration på 30 mM. Opladningsreaktionens lydstyrke justeres til 30 μL med ddH2O.
        BEMÆRK: Apyras bruges til at konvertere ATP-molekyler til ADP -molekyler (adenosindiphosphat). Da aktiviteten af E1-enzymet er ATP-afhængig, kan E1 ikke længere oplade E2. EDTA bruges desuden til at sikre, at E1 hæmmes ved at slukke Mg2+ ioner, der er nødvendige co-faktorer for E1. Mængden af apyrase, der er nødvendig for at stoppe reaktionen kan variere mellem assay betingelser. Selvom apyrase alene allerede slukker tilgængelige ATP-molekyler, var en kombination af apyrase og EDTA mere effektiv til at stoppe opladningsreaktionen for E1-UBE2D2-parret. Da standsning af reaktionen er en afgørende faktor for analyse reproducerbarhed, effektiv stop bør testes for nye E1-E2 par. Til dette formål skal du konfigurere en opladningsreaktion, stoppe den og indsamle prøver på bestemte tidspunkter, f.eks. Ikke-skiftende niveauer af E2~Ub angiver, at reaktionen er stoppet, og at thioesteren var stabil i denne periode (supplerende figur S2B).
    3. Afladning af E2~Ub ved E3
      1. Fire rør, der svarer til de forskellige tidspunkter (t0, t1, t2, t3); tilsætte ikke-reducerende prøvebuffer (6,7 μL 4x lithium dodecyl-sulfatbuffer (LDS) til hvert rør.
        BEMÆRK: Brug ikke reduktionsmidlet i prøvebufferen.
      2. 6 μL fra den standsede opladningsreaktion i t0, og juster lydstyrken til 20 μL med ddH2O.
      3. Inkuberes t0-prøven i 10 min ved 70 °C.
        BEMÆRK: Kog ikke prøven ved at forlænge inkubationstiden, da thioesters er labile ved højere temperaturer.
      4. Beregn mængden af hvert reagens, der kræves pr. udledningsreaktion. Brug de resterende 24 μL af den ladede E2, og tilsæt 10 mM L-lysin, 1 mg/ml BSA og 500 nM af E3 ligase. Brug allestedsnærværende anordning buffer ved 1x, og justere lydstyrken til 80 μL med ddH2O.
      5. Forbered en pipetterordning for alle udledningsreaktioner, og brug CHIP(H260Q) som kontrol ud over CHIP(WT).
      6. Konfigurer udledningsreaktioner på is ved at tilføje de nødvendige komponenter i følgende rækkefølge: ddH2O, allestedsnærværende buffer, BSA, lysin, E3 ligase og den ladede E2 for at starte reaktionen.
      7. Inkuber udledningsreaktionen på RT.
      8. Prøven udtages efter 5, 30 og 60 min ved at overføre 20 μL af udledningsreaktionen til de respektive prøverør.
        BEMÆRK: Passende tidspunkter, der giver mulighed for korrekt overvågning af udledningen, kan variere mellem E2-E3-par.
      9. Prøven hvirvles straks, og inkuber den ved 70 °C i 10 min.
      10. Gå direkte videre med PAGE.
        BEMÆRK: E2~Ub thioesters kan være labile selv efter denaturering i prøvebuffer. Gelelektroforese bør således udføres umiddelbart efter assay udførelse.
  2. Gel elektroforese og vestlige blot
    1. Gelelektroforesen og den vestlige blotting som beskrevet i punkt 2.2. Brug et Ub-specifikt antistof, og hvis det er tilgængeligt, skal du også bruge et E3-specifikt antistof, der er opdrættet i en anden art, hvilket giver mulighed for samtidig påvisning af Ub- og E3-ligasesignalet.
  3. Dataanalyse
    1. Udfør dataanalyse som beskrevet i afsnit 2.3 (Figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at identificere E2 enzymer, der samarbejder med ubiquitin ligase CHIP, blev et sæt E2-kandidater testet i individuelle in vitro allestedsnærværende reaktioner. Samarbejdende E2-E3 par blev overvåget af dannelsen af E3-afhængige allestedsnærværende produkter, dvs.auto-allestedsnærværende af E3 ligase og dannelsen af frie Ub polymerer. Allestedsnærværende produkter blev analyseret ved vestlig blotting. Datafortolkning er baseret på størrelsessammenligningen af de resulterende proteinbånd med molekylvægtmarkører. Protein allestedsnærværende fører til dannelsen af specifikke bånd mønstre karakteriseret ved udseendet af dobbelt bands eller flere iterative bånd med en respektive størrelse forskel på 8,6 kDa (størrelse af et enkelt Ub molekyle).

Her blev ni E2'eres evne til at fremme dannelsen af allestedsnærværende produkter testet i nærværelse af wild-type CHIP (Figur 1A), den inaktive U-box mutant CHIP (H260Q) (Figur 1B) eller uden CHIP (Supplerende figur S1). E3-uafhængige allestedsnærværende produkter blev dannet i nærværelse af inaktiv CHIP og i mangel af CHIP (figur 1B og supplerende figur S1). Inaktiv CHIP blev ikke auto-allestedsnærværende (Figur 1B). I modsætning hertil blev wild-type CHIP auto-allestedsnærværende, når de kombineres med medlemmer af UBE2D-familien (D1-D3) og medlemmer af UBE2E-familien (E1, E3) henholdsvis (figur 1A, vognbaner 3, 4 og 5). Mens der blev produceret frie poly-Ub-kæder i samarbejde med UBE2D1-3, blev dette ikke påvist for henholdsvis UBE2E1 eller UBE2E3 (figur 1A, vognbane 6 og 7).

UBE2D-familiens evne til at fremme både dannelsen af frie Ub-polymerer og auto-allestedsnærværende chip er blevet tilskrevet tilstedeværelsen af et ikke-kovalent ubiquitin bindende sted på bagsiden af E227,28. På samme måde er ube2N/V1's eksklusive dannelse af frie Ub-kæder(figur 1A, bane 9) blevet tilskrevet bindingen af Ub af en bestemt UBE2V1-underenhed (Uev-underenhed), der styrer dannelsen af K63-forbundne Ub-kæder29. Ingen allestedsnærværende produkter blev dannet i overværelse af UBE2C1 og UBE2H(figur 1A, vognbane 2 og 8). Afslutningsvis kan CHIP samarbejde med flere E2 enzymer in vitro; dens auto-allestedsnærværende er dog E2 enzym-specifik.

Dernæst blev UBE2D2-CHIP-parret brugt til at undersøge allestedsnærværende ubsning af den myosin-instruerede chaperone, UNC-45B, ved CHIP ligase aktivitet (Figur 2). Substrat allestedsnærværende blev analyseret via vestlige blotting. Ikke-allestedsnærværende UNC-45B har en molekylvægt på 103 kDa (Figur 2, vognbane 4). Den inaktive U-box mutant af CHIP udført hverken allestedsnærværende UNC-45B eller auto-allestedsnærværende(Figur 2, lane 3). I modsætning hertil blev allestedsnærværende UNC-45B og auto-allestedsnærværende CHIP opdaget ved inkubation med wild-type CHIP (Figur 2, lane 6). Chip kan således allestedsnærværende UNC-45B in vitro, hvilket tyder på, at UNC-45B er et konserveret substrat på CHIP18.

I sidste ende blev CHIP's katalytiske aktivitet analyseret i mangel af substratprotein. Til dette formål blev der udført en lysinudladningsanalyse, hvor frie lysin aminosyrer kan tjene som Ub acceptor i mangel af E3 substrater (Figur 3, Supplerende Figur S2C). Udledningsanalysen består af et ladetrin, hvor Ub læsses på E2 af E1, et stoptrin for at forhindre yderligere belastning af Ub på E2, og et udledningstrin, hvor Ub overføres fra den forbigående Ub ~E2 thioester til frie lysin aminosyrer og/eller på lysinrester af E3 ligase. Western blot analyse blev udført for at visualisere både Ub-modificerede proteiner og E3 ligase CHIP. Det ube2D2-enzym, der ikke er opladet, har en molekylvægt på 17 kDa (supplerende figur S2C).

Når den oplades med et enkelt Ub-molekyle-sikret ved brug af lysinfri Ub (Ub K0)-den molekylvægt af UBE2D2~Ub skifter opad til ca. 26 kDa. Tidspunktet nul (t0) repræsenterer det samlede udbytte af opkrævet E2 (figur 3). I nærværelse af inaktiv CHIP (35 kDa), en svag E3 ligase-uafhængig udledning af UBE2D230,31, men ingen auto-allestedsnærværende chip, blev opdaget. I modsætning hertil blev der i nærværelse af wild-type CHIP (35 kDa) opdaget en hurtigere udledning af UBE2D2, hvilket gav en fuldstændig udledning inden for 60 min. Samtidig blev der observeret auto-allestedsnærværende chip, hvilket indikerer, at CHIP fremmede overførslen af Ub på sine egne lysinrester.

Figure 1
Figur 1: Western blot analyse for E2-E3 enzym samarbejde in vitro. In vitro auto-allestedsnærværende reaktioner med forskellige humane E2 enzymer (fra venstre mod højre: tom, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H, og -N/V1) blev udført som angivet ved hjælp af (A) wild-type CHIP eller (B) den inaktive CHIP U-box mutant, CHIP(H260Q), som E3 ubiquitin ligase. Prøverne blev delt ligeligt, kørt på separate polyacrylamidgeler og immunblæser med anti-CHIP og anti-Ub antistoffer for at visualisere reaktionsprodukter. Forkortelser: Ub = allestedsnærværende; CHIP = carboxylterminus af HSC70-interagerende protein; ATP = adenosin triphosphat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Western blot analyse overvågning substrat allestedsnærværende. In vitro substrat allestedsnærværende reaktioner blev udført som indiceret til at opdage allestedsnærværende af human UNC-45B af CHIP wild-type eller inaktiv CHIP U-box mutant, CHIP(H260Q). Human UBE2D2 blev brugt som E2 enzym. Forkortelser: WT = wild-type; Ub = allestedsnærværende; CHIP = carboxylterminus af HSC70-interagerende protein. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Western blot analyse overvågning chip-afhængige Ub overførsel fra UBE2D2 ~ Ub thioester. Opladning af human UBE2D2 ved lysinfri Ub (Ub K0), standsning af opladningsreaktionen og udledning af UBE2D2~Ub blev udført som beskrevet. Til udledningsreaktionerne blev wild-type CHIP eller den inaktive CHIP U-box mutant, CHIP(H260Q), anvendt som allestedsnærværende ligaser og 10 mM L-lysin blev leveret som den potentielle Ub acceptor. Prøverne blev indsamlet efter de angivne tidsperioder, kørt på en polyacrylamidgel og immunblæser med en anti-Ub/anti-CHIP antistofblanding. Forkortelser: Ub = allestedsnærværende; CHIP = carboxylterminus af HSC70-interagerende protein; ATP = adenosin triphosphat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur S1: Repræsentativ western blot overvågning E2 enzym aktiviteter i mangel af E3. In vitro allestedsnærværende reaktioner med forskellige humane E2 enzymer (fra venstre mod højre: tom, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H og -N/V1) blev udført som angivet i mangel af en E3 ligase til at screene E3-uafhængige reaktionsprodukter. Prøverne blev kørt på en polyacrylamidgel og immunblæser med anti-Ub. Forkortelser: Ub = allestedsnærværende; ATP = adenosin triphosphat. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur S2: Analyse af ube2D2~Ub K0 thioesters ladeudbytte og stabilitet. (A) Udbyttet af UBE2D2-opladning opnået ved E1 blev testet under forskellige forhold. Den første opladningsreaktion (I) bestod af 5 μM E1, 5 μM E2 og 50 μM Ub K0. Den anden opladningsreaktion (II) bestod af 2 μM E1, 4 μM E2 og 4 μM Ub K0. Opladningsreaktionerne blev udført som beskrevet i 30 min ved 37 °C. Prøverne blev indsamlet efter 15 og 30 min. Reaktionerne blev stoppet ved tilsætning af 4x LDS-prøvebuffer og inkuberet ved 70 °C i 10 min før gelelektroforese og Coomassie-farvning. Ube2D2, der ikke er opladet, blev brugt som kontrol. Ca. halvdelen af UBE2D2 blev konverteret til UBE2D2~Ub. Der blev ikke registreret yderligere opladning efter 15 min. Desuden ændrede hverken stigningen i E1 eller stigningen i gratis allestedsnærværende opkrævningsudbyttet af UBE2D2~Ub. Opladningen blev således efterfølgende udført i 15 min ved 37 °C ved hjælp af 2 μM E1, 4 μM E2 og 4 μM Ub K0. (B) Efter opladningen blev reaktionen stoppet ved tilsætning af 1,8 U/mL apyrase og 30 mM EDTA og inkuberet ved RT. Prøverne blev indsamlet efter 2, 5, 8, 10 og 15 min (vognbaner 2-6), og ube2D2 blev brugt som kontrol (bane 1). Der blev tilføjet 4x LDS-prøvebuffer, og prøverne blev inkuberet ved 70 °C i 10 min før gelelektroforese og Coomassie-farvning. Standsning var effektiv målt ved den konstante båndintensitet af UBE2D2~Ub-proteinet, hvilket også indikerede, at thioesteren var stabil i den angivne tidsperiode. (C) Opladning af menneskelige UBE2D2 ved lysin-fri Ub (Ub K0), standsning af opladning reaktion, og udledning af UBE2D2 ~ Ub blev udført som beskrevet. Til udledningsreaktionerne blev chip af vild type eller den inaktive CHIP U-box-mutant anvendt som den potentielle Ub-acceptor. Prøverne blev indsamlet efter de angivne tidsperioder, kørt på separate polyacrylamidgeler og Coomassie-farvede. Klik her downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir beskriver grundlæggende in vitro allestedsnærværende metoder til analyse af E3 ligase funktion. Når der udføres in vitro allestedsnærværende assays, Bør det overvejes, at nogle E2 enzymer kan udføre auto-allestedsnærværende på grund af angrebet af deres aktive cystein på deres egne lysin rester, der er placeret i nærheden af det aktive sted30. For at omgå dette problem anbefales brugen af en E2-mutant, hvor de respektive lysinrester udveksles til arginin, hvilket resulterer i et katalytisk aktivt E2-enzym, der er resistent over for auto-allestedsnærværende32. Dette er af særlig betydning ved overvågning af Ub overførsel via lysin udledning assays for at sikre reproducerbarhed af analysen. En anden kritisk faktor er den forbigående karakter af E2 ~ Ub thioester obligation. Hvis thioesterstabilitetsgrænserne kan anvendes in vitro-applikationer, kan de aktive cysteinrester af E2 udskiftes til en serin for at generere en mere stabil E2~Ub oxyester33. For første gang brug eller ved brug af et nyt E2 enzym, bestemme niveauet af Ub opladning på E2, der kan opnås ved E1. Opladningseffektiviteten kan påvirkes af flere faktorer, herunder artens oprindelse af E1, opladningsreaktionens temperatur og molarforholdet mellem Ub og E2. For at bestemme opladningsudbyttet skal du visualisere ikke-opladet vs. E2 via Coomassie farvning.

Alt i alt understreger disse potentielle begrænsninger betydningen af den empiriske optimering af in vitro-assay betingelser, såsom E2-E3 par, E2 opladning og udledning af kinetika, molaritet og aktivitet af rekombinante proteiner, især for lysin udledning assay, for at opnå reproducerbare resultater. I betragtning af de forskellige cellulære funktioner af den kovalente fastgørelse af Ub til substratproteiner er analysen af proteinsubrcitalitet et populært forskningsfelt. Analysen af allestedsnærværende begivenheder kan dog være vanskelig, især in vivo. Denne vanskelighed skyldes flere faktorer, herunder den forbigående karakter af E3-substratinteraktionen34, redundans af mange E3 ligaser samt promiskuitet af E3 ligaser for flere substrater35. Desuden er karakteriseringen af specifikke allestedsnærværende begivenheder in vivo hæmmet af eksistensen af yderligere medvirkende faktorer såsom allestedsnærværende kæde forlængelse faktorer og deubiquitylation enzymer, der modulerer allestedsnærværende kæde topologi36. Disse begrænsninger understreger betydningen af robuste in vitro-teknikker, der hjælper med at karakterisere enzymatiske aktiviteter af E3 allestedsnærværende ligaser i et defineret rekombinant system.

Bortset fra de beskrevne applikationer, in vitro allestedsnærværende assays kan også bruges til at opdage Ub-linkage type ved hjælp af linkage-type specifikke antistoffer. Som en yderligere mere detaljeret tilgang kan det respektive proteinbånd af det Ub-modificerede substrat ekstraheres fra polyacrylamidgelen og analyseres via massespektrometri. Identifikationen af linkagetypen understøtter forståelsen af den fysiologiske rolle af E3-substrateinteraktionen, som er af særlig betydning for karakteriseringen af sygdomsrelaterede substratforringelsesveje37,38. Tilsvarende lysin udledning assay kan bruges som et effektivt redskab til at optrævle katalytiske forskelle mellem E3 allestedsnærværende ligaser eller E3 ligase familier30. Afslutningsvis er de in vitro allestedsnærværende metoder, der er beskrevet heri, effektive værktøjer til at analysere forskellige aspekter af E3 ligase funktion. Ud over den relativt enkle udførelse af de beskrevne metoder er en stor fordel den generelle anvendelighed, da proteiner fra alle eukaryotekilder kunne udtrykkes og studeres in vitro igen uden behov for særligt udstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker medlemmerne af vores laboratorium for kritisk diskussion og nyttige råd om manuskriptet. Vi beklager, at vi ikke har citeret værdifulde bidrag på grund af størrelsesbegrænsning. Dette arbejde støttes af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 og Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD til TH. Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy - EXC 2030 - 390661388 og - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 til T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 en T.H. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Tags

Biologi udgave 171
<em>In vitro</em> Analyse af E3 Ubiquitin Ligase Funktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter