Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В пробирке Анализ функции E3 убиквитин лигазы

Published: May 14, 2021 doi: 10.3791/62393
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Summary

В настоящем исследовании представлены подробные протоколы анализа убиквитилирования in vitro для анализа каталитической активности убиквитинлигазы E3. Рекомбинантные белки экспрессировали с использованием прокариотических систем, таких как культура кишечной палочки.

Abstract

Ковалентное присоединение убиквитина (Ub) к внутреннему остатку (остаткам) лизина субстратного белка, процесс, называемый убиквитилированием, представляет собой одну из наиболее важных посттрансляционных модификаций в эукариотических организмах. Убиквитилирование опосредовано последовательным каскадом из трех классов ферментов, включая убиквитин-активирующие ферменты (ферменты E1), убиквитин-конъюгирующие ферменты (ферменты E2) и убиквитиновые лигазы (ферменты E3), а иногда и факторы удлинения убиквитиновой цепи (ферменты E4). Здесь представлены протоколы in vitro для анализов убиквитилирования, которые позволяют оценить активность убиквитин-лигазы E3, сотрудничество между парами E2-E3 и выбор субстрата. Сотрудничающие пары E2-E3 могут быть проверены путем мониторинга генерации свободных полиубиквитиновых цепей и/или автоубиквитилирования лигазы E3. Убиквитилирование субстрата определяется селективным связыванием Е3-лигазы и может быть обнаружено путем западного блоттинга реакции in vitro. Кроме того, описан анализ разряда E2~Ub, который является полезным инструментом для прямой оценки функционального сотрудничества E2-E3. Здесь Е3-зависимый перенос убиквитина следует из соответствующего фермента Е2 на свободные аминокислоты лизина (имитирующие убиквитилирование субстрата) или внутренние лизины самой Е3-лигазы (аутоубиквитилирование). В заключение, представлены три различных протокола in vitro, которые быстро и легко выполняются для решения каталитической функциональности E3-лигазы.

Introduction

Убиквитилирование — это процесс, посредством которого Ub ковалентно связан с субстратным белком1. Модификация Ub катализируется последовательными ферментативными реакциями, включающими действие трех различных классов ферментов, т.е.Ub-активирующих ферментов (E1s), Ub-конъюгирующих ферментов (E2s), Ub-лигазов (E3s) и, возможно, факторов удлинения цепи Ub (E4s)2,3,4,5. После аденозинтрифосфатной (АТФ)- имагниевой (Mg 2+)-зависимой активации Ub Е1, активный сайт цистеина Е1 атакует С-концевой глицин Ub, образуя тиофирный комплекс (Ub~E1). Энергия, получаемая от гидролиза АТФ, заставляет Ub достигать переходного состояния высокой энергии, которое поддерживается на протяжении всего следующего каскада ферментов. Затем фермент E2 переносит активированный Ub к своему внутреннему каталитическому цистеину, тем самым образуя переходную тиофирную связь Ub ~ E2. Впоследствии Ub переносится в субстрат белка.

Это можно сделать двумя способами. Либо Е3-лигаза может сначала связываться с Е2, либо Е3-лигаза может непосредственно связывать Ub. Последний способ приводит к образованию промежуточного продукта E3 ~Ub. В любом случае Ub связывается с белком субстрата путем образования изопептидной связи между С-концевой карбоксильной группой Ub и лизиновой Ɛ-аминогруппой субстрата6. Геном человека кодирует два E1, примерно 40 E2s и более 600 предполагаемых убиквитиновыхлигасов 7. Основываясь на механизме переноса Ub E3, лигазы Ub разделены на три категории, включающие гомологичный тип E6AP C-Terminus (HECT), действительно интересный новый ген (RING) / U-box-тип и RING между лигами типа RING (RBR)8. В этом исследовании U-бокс, содержащий лигазу, карбоксильный конец HSC70-взаимодействующего белка (CHIP), используется в качестве репрезентативного фермента E3. В отличие от ферментов HECT-типа E3, которые образуют тиоэфиры Ub~E3, домен U-box CHIP связывает E2~Ub и способствует последующему переносу Ub/субстрат непосредственно из фермента E28,9. Исходя из важности U-box для ферментативной функции, в качестве контроля используется неактивный мутант CHIP U-box, CHIP(H260Q). CHIP(H260Q) не связывается со своим родственным E2s, тем самым теряя свою активность E3 лигазы10.

Убиквитилирование белка играет решающую роль в регулировании множества клеточных событий в эукариотических клетках. Разнообразие клеточных исходов, которым способствует обратимое присоединение молекул Ub к белкам субстрата, можно отнести к молекулярным характеристикам Ub. Поскольку сам Ub содержит семь остатков лизина (K) для дальнейшего убиквитилирования, существует богатое разнообразие типов цепей Ub с различными размерами и/или топологиями11. Например, субстраты могут быть модифицированы одной молекулой Ub на одной (моноубиквитилирование) или несколькими лизинами (мультимоноубиквитилирование), и даже цепями Ub (полиубиквитилирование)11. Ub-цепи образуются гомо- или гетеротипически через одни и те же или разные остатки лизина Ub, что может даже привести к разветвленным цепям Ub9. Таким образом, убиквитилирование белка приводит к разнообразному расположению молекул Ub, которые предоставляют специфическую информацию, например,для деградации, активации или локализации конъюгированных белков12,13. Эти различные сигналы Ub позволяют быстро перепрограммировать клеточные сигнальные пути, что является важным требованием для способности клетки реагировать на изменяющиеся потребности окружающей среды.

Центральный аспект убиквитилирования связан с контролем качества белка. Неправильно свернутые или необратимо поврежденные белки должны быть деградированы и заменены вновь синтезированными белками для поддержания белкового гомеостаза или протеостаза14. Контроль качества E3 лигазы, CHIP, сотрудничает с молекулярными шаперонами в Ub-зависимой деградации поврежденных белков9,15,16,17. Кроме того, CHIP регулирует стабильность миозин-направленного шаперона, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), который тесно координируется с мышечной функцией и отклонения от оптимальных уровней приводят к миопатии человека18,19,20,21. Деградация UNC-45B протеасомой 26S опосредована присоединением K48-связанной поли-Ub цепи9. При отсутствии субстратных белков ЧИП выполняет аутоубиквитилирование10,22,23,что характерно для RING/U-box E3 убиквитиновых лигазов24,25 и считается регулирующим активность лигазы26. Применение методов анализа убиквитилирования in vitro, описанных в данной работе, помогло систематически идентифицировать ферменты E2, которые объединяются с CHIP для содействия образованию свободных поли-Ub цепей и/или автоубиквитилированию CHIP (раздел протокола 2). Кроме того, наблюдалось ЧИП-зависимое убиквитилирование UNC-45B, которое является известным субстратом Е3 лигазы18,19 (раздел протокола 3). В конечном счете, контролировалась CHIP-зависимая передача активированного Ub из тиоэфира Ub~E2 (раздел протокола 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка буферов и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы и реагенты, которые были вручную приготовлены в лаборатории, перечислены ниже. Все остальные буферы и реагенты, используемые в протоколах, закупались из разных источников и использовались в соответствии с инструкциями производителей.

  1. Приготовьте 10x фосфатно-буферного физиологического раствора (10x PBS). Для этого смешайте 1,37 М хлорида натрия (NaCl), 27 мМ хлорида калия (KCl), 80 мМ динатрия-гидрофосфатного дигидрата (Na2HPO4,2H2O) и 20 мМ калия-дигидрофосфата (KH2PO4)в 1 л двойного дистиллированногоH2O (ddH2O). Автоклавируйте 10x PBS и подготовьте 1x PBS раствор в ddH2O.
    1. Автоклавирование проводят в течение 15 мин при 121 °C и 98,9 кПа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоклавирование проводится в этих условиях для всех буферов и растворов. Если не указано иное, растворы хранят при комнатной температуре (RT).
  2. Приготовьте 1 л раствора PBS-Tween (PBS-T), добавив 0,1% Tween к 1 л 1x PBS.
  3. Готовят 10 мл 0,5 М раствора L-лизина, растворяя L-лизин в ddH2O. Аликвот L-лизина порциями по 1 мл, и хранят их при -20 °C до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: L-лизин можно замораживать и размораживать повторно.
  4. Готовят раствор тетра уксусной кислоты (ЭДТА) этилендиамина 0,25 М, растворяя ЭДТА в 200 мл ddH2O.
    1. Отрегулируйте pH до 8,0 с гидроксидом натрия (NaOH).
    2. Отрегулируйте громкость до 250 мл с ddH2O.
    3. Автоклав решения.
  5. Готовят 10 мл раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) 20 мг/мл путем растворения BSA в ddH2O. Хранить при -20 °C в 200 мкл аликвот.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BSA можно замораживать и размораживать неоднократно.
  6. Получают 1 л 2-(N-морфолино)этановой сульфоновой кислоты (MES), растворяя 50 мМ MES, 50 мМ основания Tris, 3,47 мМ додецилсульфата натрия (SDS) и 1,03 мМ ЭДТА в 0,9 л ddH2O. После правильного перемешивания отрегулируйте объем до 1 л.
    1. pH 1x буфера составляет 7,6. Не регулируйте рН с помощью кислоты или основания.
  7. Приготовить 200 мл блокирующего раствора (5% молока) растворив 10 г сухого молока в 1x PBS-T. Хранить блокирующий раствор при температуре 4 °C до одной недели.
  8. Подготовьте 1 л трансферного буфера (см. Таблицу материалов)в соответствии с инструкцией производителя.
  9. Приготовьте 2x буфера образцов SDS, растворив 125 мМ основания Tris, 4% SDS, 4% глицерина, 0,03% бромфенолового синего и 50 мкл / мл β-меркаптоэтанола в 50 мл ddH2O. Aliquot в порциях 1 мл и хранить при -20 °C до использования.

2. Анализ самоубиквитилирования in vitro

  1. Подготовка и проведение анализа
    1. Рассчитайте объем каждого реагента, необходимый для каждой реакции, исходя из заданных моляров белков и белковых концентраций белковых растворов. На реакцию автоубиквитилирования используют 100 нМ E1, 1 мкМ E2, 1 мкМ E3 и 50 мкМ Ub. Отрегулируйте объем реакции до 20 мкл с ddH2O.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор АТФ и буфер убиквитилирования были приобретены в виде 10-кратных стоковых растворов и использовались в 1 раз.
    2. Подготовьте схему пипетирования для всех реакций. Протестируйте девять различных ферментов E2 на их способность функционировать (I) с CHIP, (II) с каталитически неактивным мутантом CHIP(H260Q) и (III) без CHIP в отдельных реакциях убиквитилирования.
    3. Чтобы избежать ошибок пипетирования, приготовьте на льду мастер-микс, который содержит объем, необходимый для всех реакций, плюс одну дополнительную реакцию. Рассчитайте количество основной смеси, необходимое для одной реакции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компоненты основной смеси представляют собой реагенты, которые одинаково необходимы для каждой реакции, т.е.E1, E3, Ub, АТФ и буфер убиквитилирования.
    4. Добавьте ddH2Oи мастер-микс в трубки полимеразной цепной реакции (ПЦР). Держите трубки на льду.
    5. Перед началом реакций убиквитилирования путем добавления ферментов Е2 установите термоциклер ПЦР со следующей программой: 2 ч, 37 °C с последующим 4 °C, бесконечно.
    6. Добавьте 1 мкМ ферментов Е2 в соответствующие пробирки и инкубируйте образцы в термоциклере ПЦР в течение указанного периода времени.
    7. Через 2 ч добавьте буфер образцов SDS к каждой реакции и перемешайте путем пипетирования вверх и вниз несколько раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объем буфера проб зависит от концентрации запаса буфера пробы. Здесь к каждой реакции добавляли 20 мкл 2x буфера образцов SDS.
    8. Прокипятите образцы немедленно при 95 °C в течение 5 мин и продолжайте электрофорез полиакриламидного геля (PAGE). Хранить денатурированные белки при -20 °C.
  2. Гель-электрофорез и вестерн-блот
    1. После оттаивания открутите образцы примерно на 10 с и загрузите гель SDS-PAGE. Используйте белковую лестницу в качестве эталона размера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались 4-12% градиентных гелей Бис-Триса и 3 мкл белковой лестницы. Разделите объемы образца и загрузите два геля поровну, используя 20 мкл каждого образца.
    2. Запускайте гель при 160-200 В в течение примерно 30-45 минут так, чтобы передняя часть образца достигла дна геля.
    3. Переложите каждый гель в пластиковый контейнер, наполненный полусухим пластырным буфером, и инкубируйте его в течение 2-5 минут на RT. Удалите укладочный гель.
    4. Подготовьте два кусочка пластыря размером с гель и нитроцеллюлозную мембрану размером с гель на гель SDS и предварительно замочите в полусухом буфере. Соберите сэндвич с вестерн-блоттом (WB) в камере WB снизу вверх в следующем порядке: промокательная бумага, нитроцеллюлозная мембрана, гель SDS-PAGE, промокательная бумага.
    5. Удалите пузырьки воздуха, которые, возможно, были захвачены между слоями сэндвича. Для этого используйте валик, чтобы аккуратно перевернуть бутерброд несколько раз.
    6. Закройте камеру и дайте излишкому буферу пятен стечь.
    7. Поместите камеру в соответствующее блоттинговое устройство, и используйте следующую программу для полусухого блоттинга: 25 В, 1,0 А, 30 мин.
    8. Переложите промокшую мембрану в пластиковый контейнер, наполненный блокирующим раствором, и инкубируйте в течение 30 мин при РТ.
    9. Готовят раствор первичного антитела, добавляя антитело к 10 мл PBS-T, содержащего блокирующий реагент (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочая концентрация антитела является антитело-специфичной. В этом случае моноклональное мышиное антиубиквитиновое антитело применяли в разведении 1:5000. Для второго геля было использовано моноклональное антитело против кроличьего анти-ЧИПа в 1:5000 в PBS-T/блокирующем реагенте.
    10. Заменить блокирующий раствор раствором первичного антитела и инкубировать в течение ночи при 4 °C на коромысле.
    11. Промыть мембрану три раза в течение 10 мин С PBS-T.
    12. Готовят раствор вторичного антитела, добавляя соответствующее антитело к 10 мл PBS-T.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь козьи анти-мышиные и мышиные анти-кроликовые антитела используются в разведении 1:10,000.
    13. Инкубируют мембрану с вторичным антителом в течение 1 ч при РТ на коромысле.
    14. Промыть мембрану три раза в течение 5 мин С PBS-T.
  3. Анализ данных
    1. Добавьте к промытой мембране реагенты для обнаружения пероксидазы хрена (HRP)-конъюгированных антител в соответствии с инструкциями производителя и захватите сигнал HRP с помощью рентгеновских пленок или камеры устройства с зарядовой связью(рисунок 1).

3. Анализ убиквитилирования субстрата in vitro

  1. Подготовка и проведение анализа
    1. Рассчитайте объем каждого реагента, необходимый для каждой реакции, исходя из заданных молярности белков и белковых концентраций белковых растворов. На реакцию убиквитилирования субстрата используют 100 нМ E1, 1 мкМ E2, 1 мкМ E3, 1 мкМ субстрата и 50 мкМ Ub. Используйте 10-кратный раствор АТФ и 10-кратный буфер убиквитилирования при 1x. Отрегулируйте объем реакции убиквитилирования подложки до 20 мкл с ddH2O.
    2. Подготовьте схему пипетирования для всех реакций. Включите надлежащие реакции контроля, подтверждающие, что убиквитилирование субстрата специфично для E3. Используйте белок UNC-45B в качестве репрезентативного субстрата CHIP и каталитически неактивный мутант CHIP (H260Q) в качестве контроля. Готовят следующие реакции: Е1, Е2, Ub смесь (включая Ub, АТФ, буфер убиквитилирования); E1, E2, Ub микс, UNC-45B; E1, E2, Ub микс, CHIP(H260Q), UNC-45B; и E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.
    3. Чтобы избежать ошибок пипетирования, приготовьте на льду мастер-микс, который содержит объем, необходимый для всех реакций, плюс одну дополнительную реакцию. Рассчитайте объем основной смеси, необходимый для каждой реакции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные компоненты смеси для этого анализа включают E1, E2, Ub, ATP и буфер убиквитилирования.
    4. Добавляют реакционные компоненты в следующем порядке: ddH2O,субстрат, Е3 лигаза.
    5. Перед началом реакции убиквитилирования путем добавления основной смеси установите термоциклер ПЦР со следующей программой: 2 ч, 37 °C с последующим 4 °C, бесконечно.
    6. Добавьте мастер-смесь в каждую пробирку и инкубируйте образцы в термоциклере ПЦР в течение указанного периода времени.
    7. Через 2 ч добавьте 2x буфер образцов SDS к каждой реакции и перемешайте, дозируя вверх и вниз несколько раз.
    8. После запуска прокипятите образцы сразу при 95 °C в течение 5 минут и продолжайте с PAGE. Альтернативно, хранить денатурированные белки при -20 °C.
  2. Гель-электрофорез и вестерн-блот
    1. Выполняют гель-электрофорез и вестерн-блоттинг, как описано в разделе 2.2. Используют специфические антитела для обнаружения субстрата и Е3-лигазы соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь UNC-45B сливается с полипептидной белковой меткой, полученной из продукта гена c-myc, что позволяет использовать моноклональное мышиное антитело против MYC. Анти-MYC используется в 1:10 000.
  3. Анализ данных
    1. Выполните анализ данных, как описано в разделе 2.3(рисунок 2).

4. Анализ выделения лизина

  1. Подготовка и проведение анализа
    1. Зарядка фермента E2 Ub по E1
      1. Рассчитайте объем каждого реагента, необходимый для каждой реакции, исходя из заданных моляров белков и белковых концентраций белковых растворов. Для каждой реакции зарядки используйте 2 мкМ E1, 4 мкМ E2 и 4 мкМ без лизина убиквитина (Ub K0). Используйте 10x ATP и 10x буфер убиквитилирования при 1x. Отрегулируйте объем реакции зарядки до 20 мкл с ddH20.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мутант Ub K0 без лизина используется для обеспечения эксклюзивного производства моноубиквитилированного E2. Также можно использовать Ub дикого типа; однако это может привести к различным модификациям E2 ~Ub(например,полиубиквитилирование E2), которые труднее анализировать. Для первого использования или при использовании нового фермента E2 определите уровень зарядки Ub на E2, который может быть достигнут E1. Чтобы определить выход зарядки, визуализируйте незаряженный и заряженный E2 с помощью окрашивания Coomassie. Здесь примерно половина Ub K0 была надежно преобразована в UBE2D2 ~ Ub при использовании эквимолярных соотношений UBE2D2 и Ub K0(дополнительный рисунок S2A).
      2. Подготовьте схему пипетки для реакции зарядки. Отрегулируйте громкость реакции зарядки для последующих реакций разряда по выбору, например,используйте CHIP и CHIP(H260Q) в отдельных реакциях разряда. Таким образом, подготовьте удвоенный объем одной реакции зарядки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При первом использовании протестируйте различные концентрации выбранной Е3-лигазы для мониторинга оптимальных условий разряда и анализируйте их с помощью вестерн-блоттинга. В идеальном состоянии разряд Ub из E2 будет увеличиваться с течением времени, пока соответствующая белковая полоса E2 ~ Ub не исчезнет.
      3. Инкубировать реакцию зарядки в течение 15 мин при 37 °C.
    2. Прекращение реакции зарядки
      1. Остановить реакцию зарядки путем добавления апиразы в конечной концентрации 1,8 Ед/мл. Проводят инкубацию с апиразой в течение 5 мин на РТ с последующим добавлением ЭДТА в конечной концентрации 30 мМ. Отрегулируйте объем реакции зарядки до 30 мкл с ddH2O.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Апираза используется для преобразования молекул АТФ в молекулы АДФ (аденозиндифосфата). Поскольку активность фермента Е1 зависит от АТФ, Е1 больше не может заряжать Е2. ЭДТА дополнительно используется для обеспечения того, чтобы E1 ингибировался путем гашения ионов Mg2+, которые являются необходимыми кофакторами для E1. Объем апиразы, необходимый для остановки реакции, может варьироваться в зависимости от условий анализа. Хотя апираза сама по себе уже гасит доступные молекулы АТФ, комбинация апиразы и ЭДТА была более эффективной в остановке реакции зарядки для пары E1-UBE2D2. Поскольку остановка реакции является критическим фактором для воспроизводимости анализа, эффективная остановка должна быть проверена для новых пар E1-E2. Для этого настройте реакцию зарядки, остановите ее и соберите образцы в определенные моменты времени, например,через 2, 5, 10 и 15 минут. Неизменяющиеся уровни E2 ~ Ub указывают на то, что реакция остановилась, и что тиоэстр был стабилен в течение этого периода времени(дополнительный рисунок S2B).
    3. Разрядка E2~Ub по E3
      1. Подготовьте четыре трубы, соответствующие различным временным точкам (t0, t1, t2, t3); добавьте невосстанавливающий буфер образца (6,7 мкл 4x буфера додецилсульфата лития (LDS)) в каждую трубку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте восстановитель в буфере образцов.
      2. Извлеките 6 мкл из остановленной реакции зарядки для t0и отрегулируйте объем до 20 мкл с ddH2O.
      3. Инкубируйте образец t0 в течение 10 мин при 70 °C.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не кипятите образец, увеличивая время инкубации, так как тиоэфиры лабильны при более высоких температурах.
      4. Рассчитайте объем каждого реагента, необходимый для реакции разгрузки. Используйте оставшиеся 24 мкл заряженного E2 и добавьте 10 мМ L-лизина, 1 мг/мл BSA и 500 нМ лигазы E3. Используйте буфер убиквитилирования в 1 раз и отрегулируйте громкость до 80 мкл с ddH2O.
      5. Подготовьте схему дозирования для всех реакций разряда и используйте CHIP(H260Q) в качестве контроля в дополнение к CHIP(WT).
      6. Настройте реакции разряда на льду, добавив необходимые компоненты в следующем порядке: ddH2O, буфер убиквитилирования, BSA, лизин, E3 лигаза и заряженный E2 для запуска реакции.
      7. Инкубируют реакцию разряда на РТ.
      8. Возьмите образцы через 5, 30 и 60 мин, перенеся 20 мкл реакции разряда в соответствующие пробирки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящие временные точки, которые позволяют надлежащим образом контролировать разряд, могут варьироваться между парами E2-E3.
      9. Немедленно вращайте образец и инкубируйте его при 70 °C в течение 10 минут.
      10. Непосредственно перейдите на СТРАНИЦУ.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Тиоэфиры E2 ~ Ub могут быть лабильными даже после денатурации в буфере образца. Таким образом, гель-электрофорез следует проводить непосредственно после выполнения анализа.
  2. Гель-электрофорез и вестерн-блот
    1. Выполните гель-электрофорез и вестерн-блоттинг, как описано в разделе 2.2. Используйте Ub-специфическое антитело и, при наличии, также используйте E3-специфическое антитело, которое было выращено у другого вида, что позволяет одновременно обнаруживать сигнал Ub и E3 лигазы.
  3. Анализ данных
    1. Выполните анализ данных, как описано в разделе 2.3(рисунок 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы идентифицировать ферменты E2, которые сотрудничают с убиквитин-лигазой CHIP, набор кандидатов E2 был протестирован в отдельных реакциях убиквитилирования in vitro. Взаимодействующие пары E2-E3 контролировали путем образования Е3-зависимых продуктов убиквитилирования, т.е.автоубиквитилирования Е3 лигазы и образования свободных Ub полимеров. Продукты убиквитилирования были проанализированы методом вестерн-блоттинга. Интерпретация данных основана на сравнении размеров полученных белковых полос с маркерами молекулярной массы. Убиквитилирование белка приводит к образованию специфических полосовых паттернов, характеризующихся появлением двойных полос или нескольких итерационных полос с соответствующей разницей размеров 8,6 кДа (размер одной молекулы Ub).

Здесь способность девяти E2 способствовать образованию продуктов убиквитилирования была проверена в присутствии чипа дикого типа(рисунок 1A),неактивного U-box мутанта CHIP (H260Q)(рисунок 1B)или без CHIP(дополнительный рисунок S1). E3-независимые убиквитиновые продукты формировались в присутствии неактивного ЧИПА и в отсутствие ЧИПА(Рисунок 1В и Дополнительный Рисунок S1). Неактивный ЧИП не был автоматически убиквиталирован(рисунок 1B). Напротив, чип дикого типа был автоматически убиквитилирован в сочетании с членами семейства UBE2D (D1-D3) и членами семейства UBE2E (E1, E3) соответственно(рисунок 1A,полосы 3, 4 и 5). В то время как свободные поли-Ub цепи были получены в сотрудничестве с UBE2D1-3, это не было обнаружено для UBE2E1 или UBE2E3, соответственно(рисунок 1A,полосы 6 и 7).

Способность семейства UBE2D способствовать как образованию свободных полимеров Ub, так и автоубиквитилированию CHIP была объяснена наличием нековалентного сайта связывания убиквитина на обратной стороне E227,28. Аналогичным образом, исключительное формирование свободных цепей Ub UBE2N/V1(рисунок 1A,полоса 9) было приписано связыванию Ub конкретной субъединицей UBE2V1 (Uev subunit), направляющей формирование K63-связанных Цепей Ub29. Продукты убиквитилирования не образовывались в присутствии UBE2C1 и UBE2H(Фиг.1А,полосы 2 и 8). В заключение, CHIP может сотрудничать с несколькими ферментами E2 in vitro; однако его аутоубиквитилирование специфично для фермента Е2.

Затем пара UBE2D2-CHIP была использована для исследования убиквитилирования миозин-направленного шаперона, UNC-45B, активностью CHIP-лигазы(рисунок 2). Убиквитилирование субстрата было проанализировано с помощью западного блоттинга. Неубиквитилированный UNC-45B имеет молекулярную массу 103 кДа(рисунок 2,полоса 4). Неактивный U-box мутант CHIP не выполнял ни убиквитилирования UNC-45B, ни автоубиквитилирования(рисунок 2,полоса 3). Напротив, убиквитилирование UNC-45B и автоубиквитилирование CHIP были обнаружены при инкубации с чипом дикого типа(рисунок 2,полоса 6). Таким образом, CHIP может убиквитилировать UNC-45B in vitro,предполагая, что UNC-45B является консервированной субстратой CHIP18.

В конечном счете, каталитическая активность CHIP была проанализирована в отсутствие какого-либо субстратного белка. С этой целью был проведен анализ разряда лизина, в котором свободные аминокислоты лизина могут служить акцептором Ub в отсутствие субстратов E3(Рисунок 3, Дополнительный рисунок S2C). Анализ разряда состоит из стадии зарядки, на которой Ub загружается на E2 E1, стоп-стадии для предотвращения дальнейшей загрузки Ub на E2 и стадии разряда, где Ub переносится из переходного тиоэстера Ub ~ E2 на свободные аминокислоты лизина и / или на остатки лизина лигазы E3. Вестерн-блот-анализ проводился для визуализации как Ub-модифицированных белков, так и Е3-лигазы CHIP. Незаряженный фермент UBE2D2 имеет молекулярную массу 17 кДа(дополнительный рисунок S2C).

При зарядке одной молекулой Ub, обеспечиваемой использованием Ub (Ub K0) без лизина, молекулярная масса UBE2D2~Ub смещается вверх примерно до 26 кДа. Нулевая временная точка (t0)представляет собой общий выход заряженного E2(рисунок 3). В присутствии неактивного ЧИПА (35 кДа) слабого Е3-лигазо-независимого разряда UBE2D230,31,но не было обнаружено автоубиквитилирования ЧИПА. Напротив, в присутствии чипа дикого типа (35 кДа) был обнаружен более быстрый разряд UBE2D2, дающий полный разряд в течение 60 минут. Одновременно наблюдалось автоубиквитилирование CHIP, что указывает на то, что CHIP способствовал переносу Ub на собственные остатки лизина.

Figure 1
Рисунок 1:Анализ вестерн-блоттинга для коллаборации ферментов E2-E3 in vitro. Реакции аутоубиквитилирования in vitro с различными человеческими ферментами E2 (слева направо: пустые, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H и -N/V1) выполнялись, как указано с использованием(A)ЧИПА дикого типа или(B)неактивного мутанта CHIP U-box, CHIP(H260Q), как E3 убиквитин-лигазы. Образцы были разделены поровну, проведены на отдельных полиакриламидных гелях и иммуноблоттированы анти-CHIP и анти-Ub антителами для визуализации продуктов реакции. Сокращения: Ub = убиквитин; CHIP = карбоксильный конец HSC70-взаимодействующего белка; АТФ = аденозинтрифосфат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Вестерн-блот-анализ мониторинга убиквитилирования субстрата. Реакции убиквитилирования субстрата in vitro проводили, как указано, для обнаружения убиквитилирования человеческого UNC-45B диким типом CHIP или неактивным мутантом CHIP U-box, CHIP(H260Q). Человеческий UBE2D2 использовался в качестве фермента E2. Сокращения: WT = дикий тип; Ub = убиквитин; CHIP = карбоксильный конец HSC70-взаимодействующего белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Анализ вестерн-блоттинга, контролирующий CHIP-зависимый перенос Ub из тиоэфира UBE2D2~Ub. Зарядка человеческого UBE2D2 безлизиновым Ub (Ub K0), остановка реакции зарядки и разрядка UBE2D2 ~ Ub были выполнены так, как описано. Для реакций разряда в качестве убиквитиновых лигазов использовался ЧИП дикого типа или неактивный мутант CHIP U-box, CHIP(H260Q), а в качестве потенциального акцептора Ub был поставлен L-лизин 10 мМ. Образцы собирали по истечении указанных периодов времени, запускали на полиакриламидном геле и иммуноблоттировали смесью антител против Ub/АНТИ-CHIP. Сокращения: Ub = убиквитин; CHIP = карбоксильный конец HSC70-взаимодействующего белка; АТФ = аденозинтрифосфат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Репрезентативный мониторинг активности ферментов E2 в отсутствие E3. Реакции убиквитилирования in vitro с различными человеческими ферментами E2 (слева направо: пустой, UBE2-D1, -D2, -D3, -E1, -E3, -H и -N/V1) проводили, как указано в отсутствие E3-лигазы для скрининга E3-независимых продуктов реакции. Образцы были обработаны на полиакриламидном геле и иммуноблоттированы анти-Ub. Сокращения: Ub = убиквитин; АТФ = аденозинтрифосфат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Анализ мощности зарядки и стабильности тиэфира UBE2D2 ~ Ub K0. (A) Выход заряда UBE2D2, достигнутый E1, был протестирован в различных условиях. Первая реакция зарядки (I) состояла из 5 мкМ E1, 5 мкМ E2 и 50 мкМ Ub K0. Вторая реакция зарядки (II) состояла из 2 мкМ E1, 4 мкМ E2 и 4 мкМ Ub K0. Реакции зарядки проводили, как описано, в течение 30 мин при 37 °C. Образцы собирали через 15 и 30 мин. Реакции останавливали добавлением 4-кратного буфера образца LDS и инкубировали при 70 °C в течение 10 мин перед гелевым электрофорезом и окрашиванием Кумасси. В качестве управления использовался незаряженный UBE2D2. Приблизительно половина UBE2D2 была преобразована в UBE2D2 ~ Ub. Дополнительная зарядка не была обнаружена через 15 минут. Более того, ни увеличение E1, ни увеличение свободного убиквитина не изменили выход зарядки UBE2D2 ~ Ub. Таким образом, зарядку впоследствии выполняли в течение 15 мин при 37 °C с использованием 2 мкМ E1, 4 мкМ E2 и 4 мкМ Ub K0. (B)После зарядки реакцию останавливали добавлением 1,8 ЕД/мл апиразы и 30 мМ ЭДТА и инкубировали на RT. Образцы собирали через 2, 5, 8, 10 и 15 мин (полосы 2-6), а в качестве контроля использовали незаряженный UBE2D2 (полоса 1). Добавляли 4x буфер образцов LDS, и образцы инкубировали при 70 °C в течение 10 мин перед гелевым электрофорезом и окрашиванием Кумасси. Остановка была эффективной, поскольку измерялась постоянной интенсивностью полосы белка UBE2D2 ~ Ub, что также указывает на то, что тиоэстер был стабилен в течение указанного периода времени. (C) Зарядка человека UBE2D2 без лизина Ub (Ub K0), остановка реакции зарядки и разрядка UBE2D2 ~ Ub были выполнены так, как описано. Для реакций разряда в качестве убиквитиновых лигазов использовался ЧИП дикого типа или неактивный мутант CHIP U-box, CHIP(H260Q), а в качестве потенциального акцептора Ub-лизин был поставлен 10 мМ L-лизин. Образцы собирали по истечении указанных периодов времени, запускали на отдельных полиакриламидных гелях и окрашивали Кумасси. Пожалуйста, нажмите здесь, загрузите этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В статье описаны основные методы убиквитилирования in vitro для анализа функции Е3 лигазы. При выполнении анализов убиквитилирования in vitro следует учитывать, что некоторые ферменты E2 могут выполнять аутоубиквитилирование вследствие атаки их активного цистеина на собственные остатки лизина, которые расположены в непосредственной близости от активного центра30. Чтобы обойти эту проблему, рекомендуется использовать мутант E2, в котором соответствующий остаток лизина обменивается на аргинин, что приводит к каталитически активному ферменту E2, который устойчив к аутоубиквитилированию32. Это имеет особое значение при мониторинге переноса Ub с помощью анализов разгрузки лизина для обеспечения воспроизводимости анализа. Другим критическим фактором является переходный характер тиоэфирной связи E2 ~ Ub. В случае, если стабильность тиоэфира ограничивает возможные применения in vitro, активный цистеиновый остаток E2 может быть заменен на серин для получения более стабильного E2 ~ Ub оксиэстера33. Для первого использования или при использовании нового фермента E2 определите уровень зарядки Ub на E2, который может быть достигнут E1. На эффективность зарядки может влиять несколько факторов, включая видовое происхождение E1, температуру реакции зарядки и молярное отношение Ub к E2. Чтобы определить выход зарядки, визуализируйте незаряженные и . заряжен E2 через окрашивание Coomassie.

В целом, эти потенциальные ограничения подчеркивают важность эмпирической оптимизации условий анализа in vitro, таких как пара E2-E3, кинетика зарядки и разрядки E2, молярность и активность рекомбинантных белков, особенно для анализа разряда лизина, для получения воспроизводимых результатов. Учитывая разнообразные клеточные функции ковалентного присоединения Ub к субстратным белкам, анализ убиквитилирования белка является популярной областью исследований. Однако анализ событий убиквитилирования может быть затруднен, особенно in vivo. Эта трудность возникает из-за множества факторов, включая переходный характер взаимодействия E3-подложки34,избыточность многих газов E3, а также распущенность лигазов E3 для нескольких подложек35. Кроме того, характеристика специфических событий убиквитилирования in vivo затруднена существованием дополнительных способствующих факторов, таких как факторы удлинения цепи убиквитина и ферменты деубиквитилирования, которые модулируют топологию цепи убиквитина36. Эти ограничения подчеркивают важность надежных методов in vitro, которые помогают охарактеризовать ферментативную активность убиквитиновых лигазов E3 в определенной рекомбинантной системе.

Помимо описанных применений, анализы убиквитилирования in vitro также могут быть использованы для обнаружения типа Ub-связи с использованием специфических антител типа связи. В качестве дополнительного более подробного подхода соответствующая белковая полоса Ub-модифицированного субстрата может быть извлечена из полиакриламидного геля и проанализирована с помощью масс-спектрометрии. Идентификация типа связи способствует пониманию физиологической роли взаимодействия Е3-субстрат, что имеет особое значение для характеристики связанных с заболеванием путей деградации субстрата37,38. Аналогичным образом, анализ разряда лизина может быть использован в качестве эффективного инструмента для разгадки каталитических различий между лигазами убиквитина E3 или семействами лигазы E330. В заключение, способы убиквитилирования in vitro, описанные в настоящем описании, являются эффективными инструментами для анализа различных аспектов функции Е3-лигазы. Помимо относительно простого выполнения описанных способов, основным преимуществом является общая применимость, поскольку белки из всех эукариотических источников могут быть рекомбинантно экспрессированы и изучены in vitro без необходимости использования специального оборудования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим членов нашей лаборатории за критическое обсуждение и полезные советы по рукописи. Мы приносим извинения за то, что не процитировали ценные вклады из-за ограничения размера. Эта работа поддерживается Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 и Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD to TH. Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии - EXC 2030 - 390661388 и - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 T.H. gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amershan Protran 0.1 µm NC GE Healthcare 10600000 nitrocellulose membrane
Anti-CHIP Cell Signaling 2080 Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6
Anti-MYC Roche OP10 Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10
Anti-ubiquitin Upstate 05-944 Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11
Apyrase Sigma A6535-100UN
ATP (10x) Enzo 12091903
BSA Sigma A6003-10G
EDTA Roth 8043.2
KCl Roth 6781.1
K2HPO4 Roth P749.2
KH2PO4 Roth 3904.1
LDS sample buffer (4x) novex B0007
L-Lysine Sigma L5501-5G
MES Roth 4256.4
MeOH VWR Chemicals 2,08,47,307 100%
Milchpulver Roth T145.3
NaCl Roth P029.3
NuPAGE Antioxidant invitrogen NP0005
NuPAGE Transfer buffer (20x) novex NP0006-1
Page ruler plus Thermo Fisher 26619 Protein ladder
RotiBlock Roth A151.1 Blocking reagent
SDS (20%) Roth 1057.1
S1000 Thermal Cycler Bio Rad 1852196
Trans-Blot Turbo Bio Rad 1704150EDU Transfer system
Tris base Roth 4855.3
Tween 20 Roth 9127.2
UbcH Enzyme Set BostonBiochem K-980B E2 enzymes
Ubiquitin BostonBiochem U-100H
Ubiquitin-activating enzyme E1 Enzo BML-UW941U-0050
Ubiquitylation buffer (10x) Enzo BML-KW9885-001
Whatman blotting paper Bio Rad 1703969 Extra thick filter paper

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
  2. Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
  3. Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
  4. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  5. Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
  6. Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
  7. Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
  8. Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
  9. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
  10. Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
  11. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  12. Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
  13. Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
  14. Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).
  15. Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
  16. Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
  17. Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
  18. Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
  19. Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
  20. Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
  21. Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
  22. Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
  23. Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
  24. Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
  25. Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
  26. Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
  27. Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
  28. Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
  29. Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
  30. Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
  31. Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
  32. McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
  33. Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
  34. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  35. Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
  36. Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
  37. Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
  38. Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).

Tags

Биология выпуск 171
<em>В пробирке</em> Анализ функции E3 убиквитин лигазы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müller, L., Kutzner, C. E.,… More

Müller, L., Kutzner, C. E., Balaji, V., Hoppe, T. In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function. J. Vis. Exp. (171), e62393, doi:10.3791/62393 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter