Summary
SAMHD1 är ett deoxinukleosidtrifosfattrifosfohydrolas med kritiska roller i människors hälsa och sjukdom. Här presenterar vi en mångsidig enzymkopplad SAMHD1-aktivitetsanalys, distribuerad i ett 384-brunnars mikroplattformat, som möjliggör utvärdering av små molekyler och nukleotidanaloger som SAMHD1-substrat, aktivatorer och hämmare.
Abstract
Sterilt alfamotiv och HS-domäninnehållande protein 1 (SAMHD1) är en central regulator av intracellulära deoxinukleosidtrifosfatpooler (dNTP), eftersom detta enzym kan hydrolysera dNTP till deras motsvarande nukleosider och oorganiska trifosfater. På grund av dess kritiska roll i nukleotidmetabolismen, dess koppling till flera patologier och dess roll i terapiresistens, utförs för närvarande intensiv forskning för en bättre förståelse av både regleringen och cellulär funktion av detta enzym. Av denna anledning är det viktigt att utveckla enkla och billiga metoder med hög kapacitet för att undersöka småmolekylers interaktion med SAMHD1, såsom allosteriska regulatorer, substrat eller hämmare. För detta ändamål är den enzymkopplade malakitgröna analysen en enkel och robust kolorimetrisk analys som kan användas i ett 384-mikrobrunnsplattformat som möjliggör indirekt mätning av SAMHD1-aktivitet. Eftersom SAMHD1 frisätter trifosfatgruppen från nukleotidsubstrat kan vi koppla en pyrofosfatasaktivitet till denna reaktion och därigenom producera oorganiskt fosfat, som kan kvantifieras av malakitgrönt reagens genom bildandet av ett fosfomolybdatmalakitgrönt komplex. Här visar vi tillämpningen av denna metodik för att karakterisera kända hämmare av SAMHD1 och för att dechiffrera de mekanismer som är involverade i SAMHD1-katalys av icke-kanoniska substrat och reglering av allosteriska aktivatorer, exemplifierat av nukleosidbaserade anticancerläkemedel. Således är den enzymkopplade malakitgröna analysen ett kraftfullt verktyg för att studera SAMHD1, och kan dessutom också användas i studier av flera enzymer som frisätter fosfatarter.
Introduction
Sterilt alfamotiv och histidin-aspartatdomäninnehållande protein 1 (SAMHD1) är en central regulator av nukleotidhomeostas i däggdjursceller1 med många roller i människors hälsa och sjukdom2. Detta enzym kan hydrolysera deoxinukleosidtrifosfater (dNTP) till deras besläktade deoxinukleosid och oorganiska trifosfatmolekyler 3,4, och denna aktivitet regleras allosteriskt av (d)NTP-överflöd (granskad i referens5). Varje SAMHD1-monomer innehåller två allosteriska platser (AS1 och AS2) och ett katalytiskt ställe, och bildandet av det aktiva enzymet kräver en ordnad sammansättning av en homotetramer vid (d)NTP-bindning. Dimerisering av SAMHD1-monomerer utlöses först genom bindning av ett guanintrifosfat (GTP eller dGTP) till AS1, och efterföljande tetramerisering uppnås när ytterligare en dNTP-molekyl binder till AS2, vilket möjliggör substratåtkomst till katalytplatsen och efterföljande hydrolys.
SAMHD1-substrat inkluderar de fyra kanoniska dNTP:erna 3,4 tillsammans med vissa bas- och sockermodifierade nukleotider, inklusive trifosfatmetaboliterna av flera nukleosidbaserade läkemedel som används vid behandling av virusinfektioner och cancer, av vilka flera också kan fungera som allosteriska aktivatorer 6,7,8,9,10,11. Som en konsekvens av detta modulerar SAMHD1 effekten av många av dessa föreningar i sjukdomsmodellerna 7,8,9,10,11,12,13,14,15, och dessutom, när det gäller deoxicytidinanalogen cytarabin (ara-C), som har varit standardbehandling för akut myeloisk leukemi (AML) i årtionden, dikterar faktiskt behandlingseffekt vid denna sjukdom 7,8,16. SAMHD1 är därmed en potentiell biomarkör och terapeutiskt mål för att förbättra effekten av nukleosidbaserade terapier17, och därför har vi och andra försökt identifiera strategier för att inaktivera SAMHD1 i celler. Vi föreslog användningen av viralt protein X (Vpx) som en biologisk hämmare för att rikta in sig på SAMHD1 för nedbrytning inuti cancerceller7, men detta tillvägagångssätt har ett antal begränsningar (diskuterat i referens12), och vi rapporterade också nyligen ett indirekt tillvägagångssätt för att undertrycka SAMHD1-aktivitet via hämning av ribonukleotidreduktas som vi demonstrerade i olika modeller av AML18. Ett antal studier har försökt identifiera små molekyler som direkt kan hämma SAMHD1, och hittills har flera sådana molekyler rapporterats, dock endast dokumenterat hämning in vitro 6,9,19,20,21,22. Som en konsekvens av detta understryker bristen på små molekyler som kraftfullt hämmar SAMHD1-aktiviteten i celler i kombination med de komplexa mekanismerna för SAMHD1-katalys av nukleosidbaserade terapier, behovet av ytterligare forskning. Robusta och idealiskt genomströmningsvänliga metoder för att undersöka småmolekylers interaktion med SAMHD1 är därför idealiska för att identifiera substrat, allosteriska regulatorer och hämmare av detta kliniskt relevanta enzym.
Det finns flera metoder som direkt mäter dNTPas-aktiviteten hos SAMHD1, t.ex. tunnskiktskromatografi (TLC)9,20,23 och högpresterande vätskekromatografi (HPLC)9,21, men dessa är inte lätta att använda för konfigurationer med hög genomströmning. Ett undantag är analysen som rapporterats av Mauney et al., som utnyttjar förmågan hos SAMHD1 att hydrolysera bis (4-nitrofenyl) fosfat (b4NPP) till p-nitrofenol och p-nitrofenylfosfat när Mn2+ används som aktiverande katjon, vilket resulterar i en kolorimetrisk förändring som lätt kan mätas i en mikrobrunnsplatta21. Denna analys har framgångsrikt använts för identifiering och karakterisering av SAMHD1-hämmare, men det bör noteras att hydrolys sker i frånvaro av (d)NTP-aktivatorer och i närvaro av en trolig icke-fysiologisk aktiverande katjon, båda är viktiga varningar att ta hänsyn till. Detta gör också denna analys mindre användbar för studier och identifiering av allosteriska regulatorer av SAMHD1.
I detta sammanhang kan ett enzymkopplat tillvägagångssätt i kombination med malakitgrönt reagens, som beskrivs i denna rapport, vara en mångsidig metod för att indirekt mäta dNTPas-aktiviteten hos SAMHD1 och dessutom undersöka effekten av olika små molekyler på den. Den malakitgröna analysen är en robust och tillförlitlig kolorimetrisk teknik för detektion av fritt oorganiskt fosfat (Pi), baserad på bildandet av ett molybdofosforsyrakomplex som leder till en kolorimetrisk förändring mätt vid 620 nm24. Eftersom SAMHD1-hydrolys frigör trifosfatgruppen från nukleotidsubstrat är det därför nödvändigt att koppla denna reaktion med en (pyro)fosfatasaktivitet, som kommer att generera fritt oorganiskt fosfat, före tillsats av malakitgrönt reagens. Den malakitgröna analysen är känslig och kostnadseffektiv och har använts i stor utsträckning för identifiering och karakterisering av hämmare och substrat för enzymer som frisätter oorganiska fosfatgrupper antingen i sina reaktioner eller i närvaro av ett kopplingsenzym. Det har använts i stor utsträckning vid karakterisering av ATPas-aktiviteterna hos helikaser25,26,27, eller studien av CD73-enzymatisk aktivitet, som medierar nedbrytningen av AMP till adenosin och oorganiskt fosfat28. Dessutom, när det kopplas, har det använts i upptäckten av antibiotika som riktar sig mot UDP-2,3-diacylglukosaminpyrofosfatas LpxH, ett essentiellt enzym i de flesta gramnegativa patogener29. När det gäller cancerforskning har det enzymkopplade tillvägagångssättet använts i stor utsträckning mot NUDIX-hydrolaser, en familj av nukleotidmetaboliserande enzymer, både vid karakterisering av substrat 30,31,32 och vid identifiering och utveckling av läkemedel och kemiska sonder 33,34,35,36.
När det gäller dNTPase SAMHD1 har detta tillvägagångssätt använts i flera rapporter. Med hjälp av exopolyfosfatas Ppx1 från Saccharomyces cerevisiae som kopplingsenzym användes denna analys för att testa flera nukleotidanaloger som antingen substrat, aktivatorer eller hämmare av SAMHD1, och resulterade i identifieringen av trifosfatmetaboliten av det antileukemiska läkemedlet klofarabin som en aktivator och substrat6. Dessutom, med oorganiskt pyrofosfatas från Escherichia coli som kopplingsenzym, har det använts vid screening av ett bibliotek av kliniskt godkända föreningar mot SAMHD1 för att identifiera hämmare20. I vår forskning använde vi detta tillvägagångssätt för att visa att ara-CTP, den aktiva metaboliten av ara-C, är ett SAMHD1-substrat men inte allosterisk aktivator7 och använde därefter denna analys för att visa att flera små molekyler som kunde sensibilisera AML-modeller för ara-C på ett SAMHD1-beroende sätt, faktiskt inte direkt hämmade SAMHD118. I den här rapporten kommer vi att beskriva denna mångsidiga metod och demonstrera dess tillämplighet, i en konfiguration med hög genomströmning, för identifiering av hämmare, aktivatorer och substrat för SAMHD1.
Protocol
En schematisk översikt över metoderna nedan visas i figur 1 och en detaljerad lista över material och reagenser finns i materialtabellen.
1. Beredning av analysbuffertar.
- Beredning av lagerbuffertar.
OBS: Eftersom analysen är känslig för detektion av fosfater, vilket kan vara vanligt, skölj glasvaror tre gånger med ultrarent eller dubbeldestillerat vatten för att undvika kontaminering. Alla buffertar kan förvaras i rumstemperatur (RT).- Bered 1 l stamlösning av SAMHD1-reaktionsbuffert (RB) (25 mM Tris-Acetat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2) genom att lösa upp 4,5 g Trisacetat, 2,3 g NaCl och 0,2 g MgCl2 i cirka 800 ml vatten innan du justerar till pH 8 och slutlig volym.
- Bered 5 ml 0,1 M stamlösning av TCEP genom att späda 1 ml 0,5 M TCEP i 4 ml vatten.
- Bered 50 ml stamlösning med 11 % interpolering av 20 genom att späda 5 ml 100 % Tween-20 med 44,5 ml vatten.
OBS: Tween-20 är ljuskänsligt. - Bered 50 ml 0,5 M EDTA-stopplösning genom att lösa upp 9,3 g EDTA i cirka 40 ml vatten innan du justerar till pH 8 och slutlig volym.
- Bered stamlösningen malakitgrönt (MG) (3,2 mM malakitgrönt i H2SO4) genom att långsamt tillsätta 60 ml koncentrerad svavelsyra till 300 ml vatten i en brun glasflaska. Kyl lösningen till RT och lös upp 0,44 g malakitgrönt.
FÖRSIKTIGHET: Reaktionen av svavelsyra med vatten är exoterm och därför kan flaskan värmas upp och orsaka en tryckuppbyggnad; Se till att detta tryck släpps ofta.
OBS: Den resulterande orange lösningen är ljuskänslig (därav brun flaska) och stabil i minst 1 år vid RT. Fällning kan bildas med tiden, se till att endast supernatanten används. - Bered 50 ml 7% stamlösning av ammoniummolybdat genom att lösa upp 3,75 g ammoniummolybdat i 50 ml vatten.
OBS: Fällning kan bildas med tiden, se till att endast supernatanten används.
- Beredning av kompletta analysbuffertar
OBS: Detta bör göras på dagen för experimentet- Bered komplett SAMHD1 RB (25 mM Tris-Acetat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005 % Tween-20). Använd tidigare preparerade 11 % Tween-20 och 0,1 M TCEP-stammar för att tillsätta dessa komponenter vid en slutlig koncentration på 0,005 % för Tween-20 och 0,3 mM för TCEP till SAMHD1 RB-stammen.
- Bered EDTA-stopplösning (25 mM Tris-Acetat pH 8, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,3 mM TCEP, 0,005 % Tween-20, 7,9 mM EDTA). För att färdigställa SAMHD1 RB, använd 0,5 M EDTA-stamlösning för att tillsätta EDTA till en slutlig koncentration av 7,9 mM.
- Bered MG-arbetslösning (2,5 mM malakitgrön, 1,4 % ammoniummolybdat, 0,18 % Tween-20) genom att blanda 10 delar MG-stamlösning med 2,5 delar 7 % ammoniummolybdat och 0,2 delar 11 % Tween-20.
2. SAMHD1-hämningsanalys och bestämning av förening IC50
OBS: Slutliga analysbetingelser visas i tabell 1.
- Beredning av föreningar i analysplatta
OBS: Föreningar med liten molekylvikt löses vanligtvis i 100 % DMSO och nukleotidanaloger i vatten. Stamkoncentrationen varierar från 10 till 100 mM och påverkas av föreningarnas styrka och löslighet, tillsammans med analysens DMSO-tolerans. Kontrollera att den slutliga DMSO-koncentrationen i reaktionen inte överstiger 1 % för att säkerställa att enzymaktiviteten inte påverkas av detta lösningsmedel. Det är god praxis att testa analysens tolerans mot lösningsmedlet före experimentet.- Bered serieutspädda testföreningar vid 100 gånger slutkoncentrationen i det relevanta lösningsmedlet (t.ex. 100 % DMSO för små molekyler eller vatten för nukleotidanaloger) i en klar rundbottnad 96-hålsplatta av polypropen med hjälp av antingen en flerkanalspipett eller automatiserad vätskehanteringsutrustning.
OBS: Beroende på föreningens stabilitet kan utspädningsplattor förberedas i förväg, förseglas och förvaras vid -20 °C. Låt plattorna komma i jämvikt med RT innan du fortsätter med protokollet. - Använd komplett SAMHD1 RB och späd föreningarna till 25 gånger slutkoncentrationen (för att hålla den slutliga lösningsmedelskoncentrationen under 1 %) och överför 5 μL till lämpliga brunnar på en klar 384-håls flatbottnad analysplatta. Upprepa proceduren med kontrollprover med endast lösningsmedel.
- Bered serieutspädda testföreningar vid 100 gånger slutkoncentrationen i det relevanta lösningsmedlet (t.ex. 100 % DMSO för små molekyler eller vatten för nukleotidanaloger) i en klar rundbottnad 96-hålsplatta av polypropen med hjälp av antingen en flerkanalspipett eller automatiserad vätskehanteringsutrustning.
- Beredning av reaktionskomponenter
OBS: Detta bör göras på analysdagen. Rekombinanta humana SAMHD1- och E. coli-pyrofosfatasalikvoter (PPas) lagras under lång tid vid -80 °C utspädda vid 9,1 mg/ml respektive 23,0 mg/ml i lagringsbuffert (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM TCEP). När alikvoterna har tinats upp förvaras de kortvarigt vid -20 °C.- Bered enzym (SAMHD1/PPase) mastermix genom att späda rekombinant humant SAMHD1-protein och rekombinant PPas i komplett SAMHD1 RB till 4x önskad slutlig koncentration, alltså 1,4 μM SAMHD1 och 50 E/ml PPas.
- Bered aktivator/substrat dGTP genom att späda dGTP-materialet (vanligtvis 10 eller 100 mM i vatten) i komplett SAMHD1 RB till 2x slutkoncentrationen, alltså 50 μM dGTP.
- Utför analysen
OBS: Alla analyskomponenter bör vara i jämvikt med RT. Vätsketillsatser kan utföras med antingen en flerkanalspipett eller en vätskedispenser med bulkreagens.- Till en 384-håls analysplatta som innehåller blandningsutspädningar och endast lösningsmedelskontroller, dosera 5 μL SAMHD1/PPas-masterblandning. Dosera 5 μL komplett SAMHD1 RB till inga enzymkontrollbrunnar. Förinkubera enzym och föreningar i 10 minuter vid RT.
- Dosera 10 μL 2x dGTP-lösning till alla brunnar för att starta reaktionen.
- Inkubera reaktionen i 20 minuter vid RT.
- Stoppa reaktionen genom att dosera 20 μL EDTA-stopplösning till alla brunnar.
OBS: Experimentet kan pausas här om så önskas. - Tillsätt 10 μL MG arbetslösning till alla brunnar.
FÖRSIKTIGHET: MG-arbetslösning innehåller svavelsyra. - Säkerställ blandning av brunnsinnehållet med en orbital plattskakare för mikrobrunnar och centrifugering vid 1 000 x g i 1 minut.
- Inkubera plattan i 20 minuter vid RT.
- Läs av absorptionen vid 630 nm våglängd i en mikrobrunnsplattläsare.
- Datavisualisering och analys
- Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för de positiva och negativa kontrollbrunnarna (positiv, fullständig reaktion med lösningsmedel; negativ, dGTP ensam med lösningsmedel). Beräkna Z-faktor37 som en indikator på analyskvalitet.
- Normalisera varje absorbansvärde till medelvärdena för de positiva och negativa kontrollerna, ställ in den positiva kontrollen som 100 % SAMHD1-aktivitet och den negativa kontrollen som 0 % SAMHD1-aktivitet.
- Rita upp SAMHD1-aktiviteten (%) som en funktion av koncentrationen av föreningen och passa in en dos-responskurva med variabel lutning med fyra parametrar, vilket möjliggör bestämning av förenings-IC50.
3. SAMHD1-aktivator och substratskärm
OBS: Slutliga analysförhållanden visas i tabell 2. Rekombinanta SAMHD1- och PPas-alikvoter lagras under lång tid vid -80 °C utspädda vid 9,1 mg/ml respektive 23,0 mg/ml i lagringsbuffert (20 mM HEPES pH 7,5, 300 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM TCEP) vid -80 °C. När alikvoterna har tinats upp lagras de kortvarigt vid -20 °C.
- Beredning av nukleotidanaloger i analysplatta
- Späd ut nukleotidanaloga lager (vanligtvis 10 eller 100 mM i vatten) till 4x slutlig koncentration i komplett SAMHD1 RB, i vårt fall 800 μM nukleotidanalog, och överför 5 μL till lämpliga brunnar på en 384-brunnars analysplatta.
- Beredning av reaktionskomponenter
OBS: Detta bör göras på analysdagen- Bered enzym (SAMHD1/PPase) mastermix genom att späda rekombinant humant SAMHD1-protein och rekombinant E. coli-PPas i komplett SAMHD1 RB till 2x önskad slutlig koncentration, alltså 0,7 μM SAMHD1 och 25 E/ml PPas.
- Bered PPas ensamt lösning genom att späda rekombinant E. coli-PPas i komplett SAMHD1 RB till 2x önskad slutlig koncentration, alltså 25 E/ml PPas.
- Bered aktivatorerna GTP (AS1) och dGTPαS (AS1 och AS2) spädningsmaterial (vanligtvis 10 eller 100 mM i vatten) i komplett SAMHD1 RB till 4x slutkoncentrationen, alltså 50 μM GTP eller dGTPαS.
- Utför analysen
OBS: Alla analyskomponenter bör vara i jämvikt med RT. Vätsketillsatser kan utföras med antingen en flerkanalspipett eller en vätskedispenser med bulkreagens.- Till analysplattan med 384 brunnar som innehåller nukleotidanaloger, fördela 5 μL av aktivatorn (antingen GTP eller dGTPαS) eller fyll SAMHD1 RB till lämpliga brunnar.
- Starta reaktionen genom att dosera 10 μl SAMHD1/PPas-mastermix, PPas ensamt, eller komplett SAMHD1 RB till lämpliga brunnar.
- Inkubera reaktionen i 20 minuter vid RT.
- Stoppa reaktionen genom att dosera 20 μL EDTA-stopplösning till alla brunnar.
OBS: Experimentet kan pausas här om så önskas. - Tillsätt 10 μL MG arbetslösning till alla brunnar.
FÖRSIKTIGHET: MG-arbetslösning innehåller svavelsyra. - Säkerställ blandning av brunnsinnehållet med en orbital plattskakare för mikrobrunnar och centrifugering vid 1 000 x g i 1 minut.
- Inkubera plattan i 20 minuter vid RT.
- Läs av absorptionen vid 630 nm våglängd i en mikrobrunnsplattläsare.
- Datavisualisering och analys
- Beräkna de genomsnittliga absorbansvärdena för reaktionsbrunnarna med enbart PPase (negativ kontroll eller bakgrundssignal).
OBS: Som en positiv kontroll av en SAMHD1 allosterisk aktivator och substrat kan dGTP inkluderas i plattan. I det här fallet kan du använda detta villkor för att beräkna Z-faktor som en indikator på analyskvalitet. - Subtrahera bakgrundsvärdet från motsvarande brunnar i SAMHD1/PPase-reaktionerna.
- Plotta korrigerade absorbansvärden för varje nukleotidanalog med buffert-, GTP- och dGTPαS-förhållanden.
- Beräkna de genomsnittliga absorbansvärdena för reaktionsbrunnarna med enbart PPase (negativ kontroll eller bakgrundssignal).
Representative Results
Protokollet som beskrivs i figur 1 beskriver det grundläggande arbetsflödet för att använda den enzymkopplade malakitgröna analysen för att undersöka interaktionen mellan små molekyler och dNTPas SAMHD1 och kan anpassas på ett antal sätt för att undersöka olika biokemiska frågor. I de representativa resultaten som diskuteras i styckena nedan illustrerar vi exempel på hur man kan använda denna analys för att bestämma de hämmande egenskaperna hos små molekyler mot SAMHD1 och för att testa om olika nukleotidanaloger är substrat och/eller aktivatorer för detta enzym.
Resultaten som visas i figur 2 illustrerar flera huvudprinciper för denna analys. Det malakitgröna reagenset möjliggör kolorimetrisk detektion av oorganiskt fosfat genom bildandet av ett fosfomolybdatmalakitgrönt komplex, och följaktligen kan detta tillvägagångssätt tillämpas på studiet av enzymatiska reaktioner vars produkt är fosfat. För att demonstrera denna metods känslighet för detektion av fritt oorganiskt fosfat visar figur 2A de absorbansvärden som erhålls med ökande koncentrationer av Na3PO4 efter en 20 minuters inkubation med malakitgrönt reagens. Medan signalen når mättnad vid 0,25 mM Na3PO4, är det linjära detektionsområdet för fosfat synligt från 0,004 till 0,03 mM (figur 2A, höger panel), i överensstämmelse med andra studier som rapporterade ett fosfatlinjärt område upp till 10-20 μM med hjälp av malakitgrön analys38.
SAMHD1 är ett dNTPas som frisätter oorganiskt trifosfat vid hydrolysering av en dNTP-molekyl, och för att generera fritt oorganiskt fosfat för detektion av malakitgrönt krävs därför ett kopplingsenzym. Oorganiskt pyrofosfatas (PPas) från E. coli har visat sig vara användbart för detta ändamål, både med avseende på SAMHD1 7,20, men även andra nukleotidmetaboliserande enzymer 30,33,35. Dessutom är SAMHD1 ett aktivt dNTPas när det är en homotetramer, och detta kräver allosterisk aktivering av (d)NTP, specifikt ett guanintrifosfat (GTP eller dGTP) vid AS1 och eventuellt dNTP vid AS2. Därefter blir det katalytiska stället tillgängligt för substratbindning och den enzymatiska reaktionen äger rum. Eftersom dGTP uppfyller kraven för bindning till AS1 och AS2, och är ett substrat, förenklar användningen av denna nukleotid i hämningsanalysen arbetsflödet avsevärt. Figur 2B illustrerar kravet på de olika analyskomponenterna för att uppnå mätbar SAMHD1-aktivitet, vilket indikeras av en ökning av absorbansen vid 630 nm. Varken SAMHD1 eller PPas ensamma kan generera oorganiskt fosfat i närvaro av dGTP, vilket överensstämmer med de dokumenterade aktiviteterna hos dessa enzymer. Men i det tillstånd där alla analyskomponenter är närvarande (SAMHD1, PPas och dGTP-aktivatorn/substratet) observerar vi en ökning av signalen. Z-faktorn37 i exemplet som visas här (utan enzymer + dGTP som negativ kontroll och SAMHD1/PPas + dGTP som positiv kontroll) var 0,74, vilket indikerar en robust analys.
En av de potentiella tillämpningarna av den enzymkopplade SAMHD1-aktivitetsanalysen är identifiering av hämmare genom high-throughput screening (HTS). I denna rapport validerar vi därför detektionen av SAMHD1-hämning i denna analys med hjälp av en mängd olika föreningar som redan beskrivits i litteraturen. Seamon et al. utvärderade den dosberoende hämningen av kanoniska nukleosider mot SAMHD1 med hjälp av en liknande analys som visas här, och fann att deoxiguanosin (dGuo) var den enda kanoniska nukleosiden som signifikant kunde hämma SAMHD1, med ett IC50-värde på 488 μM20. En HTS av FDA-godkända läkemedel utförd med den direkta b4NPP-analysen avslöjade flera träffar som hämmade SAMHD1-aktiviteten vid mikromolära koncentrationer, från vilken lomofungin var den molekyl som mest potent hämmade SAMHD1 dNTPas-aktiviteten in vitro, uppvisade en IC50 på 20,1 μM när den bestämdes i närvaro av dGTP som substrat21. Dessutom har de fyra α,β-imido-dNTP-analogerna också identifierats som kompetitiva hämmare av SAMHD1 med hjälp av MDCC-PBP-sensorn och SAMHD1 kopplade till Ppx-aktivitet, vilket visade att de hämmande konstanterna för dNMPNPP-analogerna låg i det låga mikromolära / höga nanomolarintervallet 6,22. För att visa att den enzymkopplade SAMHD1-aktivitetsanalysen kan användas för att identifiera SAMHD1-hämmare användes dGuo, lomofungin och 2'-deoxytymidin-5'-[(α,β)-imido]trifosfat (dTMPNPP) för att validera tekniken. Figur 3A illustrerar de dos-responskurvor som erhållits för dessa föreningar, vilket visar att ökande koncentrationer effektivt hämmar SAMHD1-aktiviteten. De genomsnittliga IC50-värdena som erhölls för dessa molekyler från tre oberoende experiment (± standardavvikelse) var följande: dGuo = 361,9 ± 72,8 μM, lomofungin 6,78 ± 3,9 μM och dTMPNPP = 2,10 ± 0,9 μM. Som ett exempel på ett negativt resultat bestämdes också effekten av hydroxiurea (HU) på SAMHD1-aktiviteten. HU är en hämmare av ribonukleotidreduktas, och även om det begränsar SAMHD1 ara-CTPas-aktiviteten i olika AML-modeller, visade sig effekterna av HU på SAMHD1 vara indirekta och beroende av att störa den allosteriska regleringen av SAMHD118. Dos-responskurvan för HU visas i figur 3B, och inga förändringar i SAMHD1-aktivitet observerades med ökande HU-doser, vilket visar att HU inte hämmar SAMHD1-aktiviteten in vitro.
En annan användning av den enzymkopplade SAMHD1-aktivitetsanalysen är att undersöka om nukleotider och deras analoger är substrat och/eller allosteriska aktivatorer av detta enzym, vilket illustreras i figur 4. I detta experiment testades kanoniska nukleotider, såväl som de aktiva metaboliterna av flera anti-cancernukleosidanaloger, såsom cytarabin (ara-CTP), klofarabin (Cl-F-ara-ATP) och gemcitabin (dF-dCTP), som SAMHD1-substrat och aktivatorer. På grund av den komplexa allosteriska regleringen av SAMHD1 utförs reaktionen i närvaro av GTP som en AS1-aktivator eller den icke-hydrolyserbara dGTP-analogen 2'-deoxiguanosin-5'-(α-tio)-trifosfat (dGTPαS), som kan uppta AS1 och AS2. SAMHD1-aktivitet i närvaro av den testade nukleotidanalogen och GTP indikerar att nukleotiden kan binda till det sekundära allosteriska stället och katalytiska stället (dvs. AS2-aktivator och substrat), medan SAMHD1-aktivitet med nukleotidanalogen och dGTPαS indikerar att nukleotiden endast kan uppta det katalytiska stället (dvs. endast ett substrat). Om nukleotiden kan binda till både AS1- och AS2-allosteriska platser och till det katalytiska stället, kommer SAMHD1 att vara aktivt i närvaro av enbart nukleotiden, vilket visas i fallet med dGTP. Resultaten visar att alla kanoniska dNTP:er kan binda till AS2-platsen och till den katalytiska platsen. När det gäller nukleotidanaloger är klofarabintrifosfat en AS2-aktivator och ett substrat, medan cytarabintrifosfat endast kan uppta det katalytiska stället. Å andra sidan observerades ingen aktivitet med gemcitabintrifosfat, vilket tyder på att gemcitabintrifosfat under de testade betingelserna inte kan fungera som allosterisk effektor eller substrat. Även om detta resultat överensstämmer med tidigare förutsägelser9, avslöjade senare kristallisations- och kinetiska studier10 att gemcitabintrifosfat kan binda den katalytiska fickan SAMHD1 och att det verkligen är ett substrat för enzymet. I den senare studien10 visar dock författarna att hydrolyshastigheten är betydligt lägre jämfört med andra rapporterade substrat, såsom cytarabintrifosfat, vilket förklarar varför vi inte kunde observera detta med denna screeninguppställning.
Sammantaget validerar dessa representativa resultat användningen av den enzymkopplade SAMHD1-aktivitetsanalysen som en robust teknik för identifiering och karakterisering av SAMHD1-hämmare, allosteriska regulatorer och substrat. I likhet med alla experimentella metoder har denna metod dock sina förbehåll, och därför bör ortogonala analyser (t.ex. med hjälp av en annan analysteknik) användas för att ytterligare validera resultaten.
Bild 1: Schematisk översikt över protokollet som beskrivs i den här artikeln. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Enzymkopplad SAMHD1-aktivitetsanalys. A) Na3PO4 standardkurva i malakitgreenanalysen. Na3PO4 seriell utspädning (2-faldig) bereddes från 1 mM till 0,004 mM i tre exemplar och inkuberades med malakitgrönt reagens i 20 minuter. Råa absorbansvärden över hela intervallet av testade koncentrationer visas i den vänstra panelen och det linjära intervallet i den högra panelen. Representativ för två oberoende experiment som visats. B) Validering av enzymkopplad aktivitetsanalys. SAMHD1 (0,35 μM) och/eller PPas (12,5 E/ml) i närvaro eller frånvaro av aktivator/substrat-dGTP (25 μM) inkuberades i 20 minuter i den enzymkopplade aktivitetsanalysen. Fyrlingar från en representant för två oberoende experiment som visades med råa absorbansvärden plottade, staplar och felstaplar indikerar medelvärde och SD. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Utvärdering av föreningar för SAMHD1-hämning i den enzymkopplade aktivitetsanalysen. Dos-respons av lomofungin (0,78-100 μM), 2'-deoxytymidin-5'-[(α,β)-imido]trifosfat (dTMPNPP, 0,01-100 μM) och deoxiguanosin (dGuo, 10-1 500 μM) (A) eller hydroxiurea (HU) (0,78-100 μM) (B) i den enzymkopplade SAMHD1-aktivitetsanalysen med dGTP (25 μM) som aktivator/substrat. Procentuell aktivitet i förhållande till reaktionskontroller från enskilda replikat plottade (DMSO + SAMHD1/PPas + dGTP = 100 % aktivitet, DMSO + dGTP = 0 % aktivitet) med en representant för tre experiment som visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Utvärdering av nukleotidanaloger som SAMHD1-allosteriska aktivatorer och substrat i den enzymkopplade aktivitetsanalysen. Kanoniska nukleotider och utvalda trifosfatmetaboliter av cancerläkemedlen cytarabin (ara-CTP), klofarabin (Cl-F-ara-ATP) och gemcitabin (dF-dCTP) testades vid 200 μM i den enzymkopplade SAMHD1-aktivitetsanalysen i närvaro eller frånvaro av GTP eller icke-hydrolyserbart dGTP-analogt dGTPαS (12,5 μM). Normaliserade absorbansvärden från enskilda experimentella replikat plottade, medelvärde och SD indikeras. Representativ för två oberoende experiment som visats, anpassade från vår tidigare studie7. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Steg | Reagens | Utgiven volym (μL) | Slutlig reaktionsvolym (μL) | Doserad koncentration | Veckspädning i reaktion | Slutlig koncentration i reaktion |
| 1 | Hämmare | 5 | 20 | 0,4 mM | 4 | 0,1 mM |
| 2 | SAMHD1+PPas-blandning | 5 | 1,4 μM SAMHD1, 50 U/ml PPas | 4 | 0,35 μM SAMHD1, 12,5 U/ml Ppase | |
| 3 | dGTP | 10 | 50 μM | 2 | 25 μM | |
| 4 | Inkubation i 20 minuter | |||||
| 5 | EDTA-lösning | 20 | 40 | 7,9 mM | 2 | 3,95 mM |
| 6 | MG-reagens | 10 | 50 | 2,5 mM Malakitgrön, 64,4 mM Ammoniummolybdat, 0,18 % Tween-20 | 5 | 0,5 mM Malakitgrön, 12,9 mM Ammoniummolybdat, 0,036 % Tween-20 |
| 7 | Inkubation i 20 minuter | |||||
| 8 | Läs @ 630 nm | |||||
Tabell 1: Sammanfattning av de slutliga villkoren i den enzymkopplade analysen för screening av inhibitorer.
| Steg | Reagens | Utgiven volym (μL) | Slutlig reaktionsvolym (μL) | Doserad koncentration | Veckspädning i reaktion | Slutlig koncentration i reaktion |
| 1 | Allosterisk regulator | 5 | 20 | 800 μM | 4 | 200 μM |
| 2 | GTP eller dGTPαS | 5 | 50 μM | 4 | 12,5 μM | |
| 3 | SAMHD1 och/eller PPase | 10 | 0,7 μM SAMHD1, 25 U/ml PPas | 2 | 0,35 μM SAMHD1, 12,5 E/ml PPas | |
| 4 | Inkubation i 20 minuter | |||||
| 5 | EDTA-lösning | 20 | 40 | 7,9 mM | 2 | 3,95 mM |
| 6 | MG-reagens | 10 | 50 | 2,5 mM Malakitgrön, 64,4 mM Ammoniummolybdat, 0,18 % Tween-20 | 5 | 0,5 mM Malakitgrön, 12,9 mM Ammoniummolybdat, 0,036 % Tween-20 |
| 7 | Inkubation i 20 minuter | |||||
| 8 | Läs @ 630 nm | |||||
Tabell 2: Sammanfattning av de slutliga villkoren i den enzymkopplade analysen för screening av allosteriska regulatorer
Discussion
Den enzymkopplade aktivitetsanalysen som beskrivs här är en kolorimetrisk analys med hög genomströmning som möjliggör indirekt mätning av dNTP-hydrolys med SAMHD1. Denna metod utnyttjar förmågan hos oorganiskt PPas från E. coli, som när det ingår i överskott i reaktionsblandningen omvandlar varje oorganiskt trifosfat som genereras av SAMHD1 till tre individuella fria fosfater som kan kvantifieras med hjälp av det enkla och ekonomiska malakitgröna reagenset. Vi tillhandahåller denna analys i ett 384 mikrobrunnsplattformat, vilket är idealiskt för screening av föreningsbibliotek, och demonstrerar tillämpligheten och mångsidigheten av denna teknik vid identifiering och karakterisering av SAMHD1-hämmare, aktivatorer och substrat.
Som med alla in vitro biokemiska screeninganalyser finns det ett antal kritiska steg och viktiga överväganden, och många av dessa diskuteras ingående i den fritt tillgängliga Assay Guidance Manual39. Integriteten hos de renade rekombinanta enzymerna, både SAMHD1 och det kopplade enzymet oorganiskt PPas, är extremt viktig och bör bekräftas innan analysen etableras. Och följaktligen bör varje ny rening av dessa enzymer vara föremål för en viss nivå av batchtestning, eftersom batch-till-batch-variationer kan leda till inkonsekvenser i resultaten. Helst bör användning av en ortogonal direktanalys, såsom HPLC, som möjliggör detektion av både substratet och reaktionsprodukten, användas för att verifiera dNTP-trifosfohydrolasaktiviteten hos den renade rekombinanta SAMHD1 som används.
När det gäller begränsningar med denna analys är principen att den mäter dNTPas-aktiviteten hos SAMHD1 på ett indirekt sätt och utnyttjar aktiviteten hos oorganiskt PPas, vilket har ett antal implikationer. Det är viktigt att bekräfta att PPas har liten eller ingen aktivitet mot nukleotider som används i analysen, och på samma sätt att hämmande små molekyler som identifierats inte har någon aktivitet mot PPas. Således, när det gäller screening, kan en motscreening mot PPase vara en viktig faktor. Närvaron av PPas i reaktionen gör det också viktigt att använda en ortogonal analys för att bekräfta fynden. När det gäller direkta aktivitetsanalyser har ett antal av dem hittills rapporterats, inklusive TLC 9,20,23 och HPLC 9,21, som exakt detekterar substratutmattning och produktbildning. Dessutom kan b4NPP-analys21, som också har hög genomströmning, användas för att testa potentiella hämmare; Det är dock inte idealiskt att testa substrat eller allosteriska aktivatorer. Biofysikaliska analyser, såsom differentiell skanningsfluorimetri (DSF), som vi tidigare har rapporterat med SAMHD118, kan också vara särskilt kraftfulla för att identifiera och karakterisera ligander. En annan begränsning av analysen, särskilt som visas i uppställningen här för att identifiera substrat och aktivatorer, är användningen av den icke-hydrolyserbara dGTP-analoga dGTPαS som en AS1- och AS2-aktivator. Även om detta möjliggör aktivering av SAMHD1 utan observerbar aktivitet i analysen, är dGTPαS en kompetitiv hämmare av SAMHD1, och därmed kommer användningen av höga koncentrationer att inaktivera enzymet. I takt med att vår förståelse av SAMHD1 fortskrider kan framtida studier använda molekyler som uteslutande upptar varje plats i SAMHD1, vilket förnekar detta potentiella problem.
Som vi har visat här är denna metod mångsidig och kan användas för att ta itu med ett antal biokemiska frågor. Vi har beskrivit två varianter av denna analys, en för identifiering av allosteriska regulatorer och substrat för SAMHD1, och en annan för karakterisering av hämmare, men ytterligare anpassningar kan göras. När det gäller potentiella hämmare gör denna analys, som är plattbaserad på mikrobrunnar, den väl lämpad för nedströms studier av verkningsmekanismer39,40. På samma sätt, för ytterligare karakterisering av substrat och allosteriska regulatorer, kan denna teknik användas för att bestämma kinetiska parametrar för katalys, som vi utförde för den aktiva metaboliten av cytarabin och klofarabin7. En nackdel är dock att den enzymkopplade analysen som rapporteras här är en endpoint-analys, och så, även om den är väl lämpad för screening, skulle en kontinuerlig analys vara bättre lämpad för vissa mekanistiska studier. Arnold et al. rapporterade en kontinuerlig enzymkopplad analys som använder biosensorn MDCC-PBP6, som förlitar sig på användningen av det periplasmatiska fosfatbindande proteinet (PBP) märkt med kumarinfoxid (MDCC) fluorofor som kan binda till en fri fosfatgrupp. MDCC-PBP är mycket känslig och möjliggör kvantifiering av mycket låga fosfatkoncentrationer, där sensorns svarstid ligger i tidsskalan millisekund till sekund.
SAMHD1 spelar ett antal viktiga funktioner i människors hälsa och sjukdom2 , varav många kan kopplas till dess centrala roll i upprätthållandet av intracellulära dNTP-nivåer1. Således skulle identifiering av en högkvalitativ kemisk sond mot dNTPas-aktiviteten hos SAMHD1 vara ett kraftfullt verktyg för att definiera dessa länkar, och den enzymkopplade analysen som rapporteras här skulle lätt kunna användas för att identifiera sådana sonder. Dessutom, eftersom nukleosidbaserade läkemedel, av vilka många moduleras av SAMHD1, är en mångsidig och viktig grupp av terapeutiska41; kemiska prober skulle kunna vidareutvecklas till läkemedel för att rikta in sig på SAMHD1 i den kliniska miljön, i syfte att förbättra effekten av dessa terapier. Det är också viktigt att förstå den fulla omfattningen av interaktionen mellan dessa nukleosidbaserade föreningar med SAMHD1, en fråga som också kan lösas med hjälp av denna enzymkopplade analys. Sammantaget är den enzymkopplade SAMHD1-aktivitetsanalysen, som rapporteras här, en billig, mångsidig analys med hög genomströmning som kan användas för att öka vår förståelse av detta viktiga enzym.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Thomas Lundbäck och medlemmar i Thomas Helledays laboratorium för råd och stöd. En del av detta arbete har underlättats av Protein Science Facility vid Karolinska Institutet/SciLifeLab (http://ki.se/psf), och vi tackar National Cancer Institute (NCI), Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) och Developmental Therapeutics Program (DTP) (http://dtp.cancer.gov) för att ha tillhandahållit en substans. Finansieringen har skett genom anslag från Vetenskapsrådet (2018-02114), Cancerfonden (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), Barncancerfonden (PR2019-0014) och Karolinska Institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP) | Jena bioscience | NU-1001 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) | Jena bioscience | NU-1002 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) | Jena bioscience | NU-424 | Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP) | GE Healthcare | 27-1870-04 | SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay |
| 2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP) | Jena bioscience | NU-907-1 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| 2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) | Jena bioscience | NU-1004 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| 2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo) | Sigma-Aldrich | D0901 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| 384 well clear flat-bottom microplate | Thermo Fisher Scientific | 262160 | Assay plate |
| 96 well clear U-bottom polypropylene microplate | Thermo Fisher Scientific | 267245 | Compound dilution plate |
| Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A1343 | Reagent required for malachite green working reagent |
| ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP) | Jena bioscience | NU-1170 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP) | Jena bioscience | NU-874 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | VWR | 23486.297 | Solvent |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | EDTA stop solution component |
| Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP) | Jena bioscience | NU-1607 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Data analysis and visualisation |
| Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay |
| His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase (PPase) | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | - | Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green |
| His-tagged human SAMHD1 | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | - | Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate |
| Hydroxyurea | Sigma-Aldrich | H8627 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| Lomofungin | National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP) | NSC106995 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Malachite green Carbinol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 213020 | Malachite green stock component |
| Microplate Reader | Hidex | Hidex Sense Microplate reader | Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 567530 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Sodium phosphate (Na3PO4) | Sigma-Aldrich | 342483 | Required for phosphate standard curve |
| Sulphuric acid 95-97% | Sigma-Aldrich | 84720 | Malachite green stock component |
| Tris-Acetate salt | Sigma-Aldrich | T1258 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706 | SAMHD1 reaction buffer component |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component |
References
- Franzolin, E., et al. The deoxynucleotide triphosphohydrolase SAMHD1 is a major regulator of DNA precursor pools in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14272-14277 (2013).
- Coggins, S. A., Mahboubi, B., Schinazi, R. F., Kim, B. SAMHD1 functions and human diseases. Viruses. 12 (4), 382 (2020).
- Goldstone, D. C., et al. HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase. Nature. 480 (7377), 379-382 (2011).
- Powell, R. D., Holland, P. J., Hollis, T., Perrino, F. W. Aicardi-Goutieres syndrome gene and HIV-1 restriction factor SAMHD1 is a dGTP-regulated deoxynucleotide triphosphohydrolase. The Journal of Biological Chemistry. 286 (51), 43596-43600 (2011).
- Morris, E. R., Taylor, I. A. The missing link: Allostery and catalysis in the anti-viral protein SAMHD1. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1013-1027 (2019).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2015).
- Herold, N., et al. Targeting SAMHD1 with the Vpx protein to improve cytarabine therapy for hematological malignancies. Nature Medicine. 23 (2), 256-263 (2017).
- Schneider, C., et al. SAMHD1 is a biomarker for cytarabine response and a therapeutic target in acute myeloid leukemia. Nature Medicine. 23 (2), 250-255 (2017).
- Hollenbaugh, J. A., et al.
- Knecht, K. M., et al. The structural basis for cancer drug interactions with the catalytic and allosteric sites of SAMHD1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10022-10031 (2018).
- Oellerich, T., et al. Selective inactivation of hypomethylating agents by SAMHD1 provides a rationale for therapeutic stratification in AML. Nature Communications. 10 (1), 3475 (2019).
- Herold, N., et al. SAMHD1 protects cancer cells from various nucleoside-based antimetabolites. Cell Cycle. 16 (11), 1029-1038 (2017).
- Rothenburger, T., et al. SAMHD1 is a key regulator of the lineage-specific response of acute lymphoblastic leukaemias to nelarabine. Communications Biology. 3 (1), 324 (2020).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside- analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Castellví, M., et al. Pharmacological modulation of SAMHD1 activity by CDK4/6 inhibitors improves anticancer therapy. Cancers. 12 (3), 713-719 (2020).
- Rassidakis, G. Z., et al. Low-level expression of SAMHD1 in acute myeloid leukemia (AML) blasts correlates with improved outcome upon consolidation chemotherapy with high-dose cytarabine-based regimens. Blood Cancer Journal. 8 (11), 98 (2018).
- Rudd, S. G., Schaller, T., Herold, N. SAMHD1 is a barrier to antimetabolite-based cancer therapies. Molecular & Cellular Oncology. 4 (2), 1287554 (2017).
- Rudd, S. G., et al. Ribonucleotide reductase inhibitors suppress SAMHD1 ara-CTPase activity enhancing cytarabine efficacy. EMBO Molecular Medicine. 41, 10419 (2020).
- Seamon, K. J., et al. Small molecule inhibition of SAMHD1 dNTPase by tetramer destabilization. Journal of the American Chemical Society. 136 (28), 9822-9825 (2014).
- Seamon, K. J., Stivers, J. T. A high-throughput enzyme-coupled assay for SAMHD1 dNTPase. Journal of Biomolecular Screening. 20 (6), 801-809 (2015).
- Mauney, C. H., Perrino, F. W., Hollis, T. Identification of inhibitors of the dNTP triphosphohydrolase SAMHD1 using a novel and direct high-throughput assay. Biochemistry. 57 (47), 6624-6636 (2018).
- Morris, E. R., et al. Crystal structures of SAMHD1 inhibitor complexes reveal the mechanism of water-mediated dNTP hydrolysis. Nature Communications. 11 (1), 3165 (2020).
- Hansen, E. C., Seamon, K. J., Cravens, S. L., Stivers, J. T. GTP activator and dNTP substrates of HIV-1 restriction factor SAMHD1 generate a long-lived activated state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (18), 1843-1851 (2014).
- Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
- Hyun, M., Bohr, V. A., Ahn, B. Biochemical characterization of the WRN-1 RecQ helicase of Caenorhabditis elegans. Biochemistry. 47 (28), 7583-7593 (2008).
- Lin, H. -H., Huang, C. -Y. Characterization of flavonol inhibition of DnaB helicase: real-time monitoring, structural modeling, and proposed mechanism. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2012 (4), 735368 (2012).
- Yang, M., Wang, G. ATPase activity measurement of DNA replicative helicase from Bacillus stearothermophilus by malachite green method. Analytical Biochemistry. 509, 46-49 (2016).
- Allard, B., Cousineau, I., Spring, K., Stagg, J. Measurement of CD73 enzymatic activity using luminescence-based and colorimetric assays. Methods in Enzymology. 629, 269-289 (2019).
- Lee, M., et al. Structure-activity relationship of sulfonyl piperazine LpxH inhibitors analyzed by an LpxE-coupled malachite green assay. ACS Infectious Diseases. 5 (4), 641-651 (2019).
- Carreras-Puigvert, J., et al. A comprehensive structural, biochemical and biological profiling of the human NUDIX hydrolase family. Nature Communications. 8 (1), 1541 (2017).
- Valerie, N. C. K., et al. NUDT15 hydrolyzes 6-thio-deoxyGTP to mediate the anticancer efficacy of 6-thioguanine. Cancer Research. 76 (18), 5501-5511 (2016).
- Carter, M., et al. Human NUDT22 Is a UDP-glucose/galactose hydrolase exhibiting a unique structural fold. Structure. 26 (2), 295-303 (2018).
- Gad, H., et al. MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool. Nature. 508 (7495), 215-221 (2014).
- Page, B. D. G., et al. Targeted NUDT5 inhibitors block hormone signaling in breast cancer cells. Nature Communications. 9 (1), 250 (2018).
- Zhang, S. M., et al. Development of a chemical probe against NUDT15. Nature Chemical Biology. 16 (10), 1120-1128 (2020).
- Michel, M., et al. In silico druggability assessment of the NUDIX hydrolase protein family as a workflow for target prioritization. Frontiers in Chemistry. 8, 443 (2020).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67 (1999).
- Baykov, A. A., Evtushenko, O. A., Avaeva, S. M. A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Analytical Biochemistry. 171 (2), 266-270 (1988).
- Markossian, S., et al.
- Holdgate, G. A., Meek, T. D., Grimley, R. L. Mechanistic enzymology in drug discovery: a fresh perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (2), 115-132 (2018).
- Tsesmetzis, N., Paulin, C. B. J., Rudd, S. G., Herold, N. Nucleobase and nucleoside analogues: resistance and re-sensitisation at the level of pharmacokinetics, pharmacodynamics and metabolism. Cancers. 10 (7), 240 (2018).
