Summary
פרוטוקול זה מציג כיצד לכמת את יעילות התמרה של AAV ברשתית העכבר באמצעות PCR טיפה דיגיטלית (dd-PCR) יחד עם ייצור AAV בקנה מידה קטן, הזרקה תוך-ויטמינית, הדמיית רשתית ובידוד DNA גנומי ברשתית.
Abstract
מעבדות רבות לביולוגיה של תאי הרשתית משתמשות כיום באופן שגרתי בווירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) לעריכת גנים וליישומים רגולטוריים. היעילות של התמלת AAV היא בדרך כלל קריטית, אשר משפיע על התוצאות הניסיוניות הכוללות. אחד הגורמים העיקריים ליעילות התמרה הוא הסרוטיפ או הגרסה של וקטור AAV. נכון לעכשיו, סרוטיפים מלאכותיים שונים של AAV ווריאנטים זמינים עם זיקות שונות לארח קולטני פני תא. עבור טיפול גנטי ברשתית, התוצאה היא דרגות שונות של יעילות transduction עבור סוגי תאים רשתית שונים. בנוסף, מסלול ההזרקה ואיכות ייצור AAV עשויים להשפיע גם על יעילות התמסורת של רשתית AAV. לכן, חיוני להשוות את היעילות של גרסאות שונות, אצוות ומתודולוגיות שונות. שיטת ה-PCR (dd-PCR) של טיפה דיגיטלית כימתה את חומצות הגרעין בדיוק גבוה ומאפשרת ביצוע כימות מוחלט של יעד נתון ללא כל תקן או התייחסות. באמצעות dd-PCR, זה גם אפשרי להעריך את יעילות התמרה של AAVs על ידי כימות מוחלט של מספרי עותק הגנום AAV בתוך רשתית מוזרקת. כאן, אנו מספקים שיטה פשוטה כדי לכמת את קצב התמרה של AAVs בתאי רשתית באמצעות dd-PCR. עם שינויים קלים, מתודולוגיה זו יכולה גם להיות הבסיס לכימות מספר העותק של DNA מיטוכונדריאלי, כמו גם הערכת היעילות של עריכת בסיס, קריטי עבור מספר מחלות רשתית ויישומים לטיפול בגנים.
Introduction
וירוסים הקשורים אדנו (AAVs) משמשים כיום עבור מגוון רחב של מחקרים ריפוי גנטי ברשתית. AAVs מספקים דרך בטוחה ויעילה של אספקת גנים עם פחות אימונוגניות ופחות שילובי גנום. כניסת AAV לתא היעד מתרחשת באמצעות אנדוציטוזיס, אשר דורש כריכה של קולטנים וקולטנים משותפים על פני השטח התא1,2. לכן, יעילות התמסורת של AAVs עבור סוגי תאים שונים תלויה בעיקר capsid ואת האינטראקציות שלה עם קולטני התא המארח. AAVs יש סרוטיפים וכל סרוטיפ יכול להיות טרופיזם תאי / רקמה ברור ויעילות transduction. ישנם גם סרוטיפים מלאכותיים של AAV ווריאנטים שנוצרו על ידי שינוי כימי של קפסיד הווירוס, ייצור של קפידים היברידיים, החדרת פפטיד, דשדוש קפסיד, אבולוציה מכוונת, mutagenesis רציונלי3. אפילו שינויים קלים ברצף חומצות אמינו או מבנה קפיד יכול להשפיע על אינטראקציות עם גורמי תא מארח וכתוצאה מכך tropisms שונים4. בנוסף וריאנטים capsid, גורמים אחרים כמו מסלול הזרקה וריאציה אצווה לאצווה של ייצור AAV יכול להשפיע על יעילות transduction של AAVs הרשתית העצבית. לכן, שיטות אמינות להשוואת שיעורי התמסורת עבור וריאנטים שונים נחוצים.
רוב השיטות לקביעת יעילות התמרה של AAV מסתמכות על ביטוי גנים עיתונאיים. אלה כוללים הדמיה פלואורסצנטית, אימונוהיסטוכימיה, כתם מערבי, או ניתוח היסטוכימי של מוצר הגן הכתב5,6,7. עם זאת, בשל אילוץ הגודל של AAVs, זה לא תמיד אפשרי לכלול גנים עיתונאי לפקח על יעילות transduction. באמצעות מקדמים חזקים כמו משפר CMV היברידי / עוף בטא-אטין או וודצ'אק הפטיטיס לאחר אלמנט רגולטורי לאחר שעתוק (WPRE) כרצף מייצב mRNA מסבך עוד יותר את בעיית הגודל8. לכן, זה יהיה גם מועיל להגדיר את שיעור התמולה של AAVs מוזרק עם מתודולוגיה ישירה יותר.
טיפה דיגיטלית PCR (dd-PCR) היא טכניקה רבת עוצמה כדי לכמת DNA היעד מכמויות דקות של דגימות. טכנולוגיית dd-PCR תלויה אנקפסולציה של DNA היעד ותערובת תגובת PCR על ידי טיפות שמן. כל תגובת dd-PCR מכילה אלפי טיפות. כל טיפה מעובדת ומנותחת כתגובת PCR עצמאית9. ניתוח של טיפות מאפשר לחשב את מספר העותק המוחלט של מולקולות DNA היעד בכל דגימה פשוט באמצעות אלגוריתם פואסון. מכיוון שיעילות התמרה של ה- AAVs מתואמת עם מספר העותק של הגנום AAV ברשתית העצבית, השתמשנו בשיטת dd-PCR כדי לכמת גנומים AAV.
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה dd-PCR כדי לחשב את יעילות התמרה של וקטורים AAV מ- DNA גנומי רשתית6,10. ראשית, AAVs המבטאים כתב tdTomato נוצרו באמצעות פרוטוקול בקנה מידה קטן, titered על ידי שיטת dd-PCR11. שנית, AAVs הוזרקו תוך-ויטארי לרשתית העצבית. כדי להדגים את יעילות התמרה, כימתנו תחילה את ביטוי tdTomato באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ותוכנת ImageJ. לאחר מכן בידוד ה- DNA הגנומי לכימות גנומים AAV ברשתיות מוזרקות באמצעות dd-PCR. השוואה של רמות הביטוי tdTomato עם הגנום AAV transduced כימות על ידי dd-PCR הראה כי שיטת dd-PCR כימתה במדויק את יעילות התמרה של וקטורים AAV. הפרוטוקולים שלנו הדגימו תיאור מפורט של מתודולוגיה מבוססת DD-PCR כדי לכמת את יעילות התמרה של AAV. בפרוטוקול זה, אנו מציגים גם את המספר המוחלט של גנומים AAV המועברים לאחר זריקות תוך-ויטמיניות פשוט על ידי שימוש בגורם הדילול לאחר בידוד DNA גנומי ותוצאות dd-PCR. בסך הכל, פרוטוקול זה מספק שיטה רבת עוצמה, אשר תהיה חלופה לביטוי עיתונאי לכמת את יעילות התמולה של וקטורים AAV ברשתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים הניסיוניים התקבלו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת סבנסי והניסויים נערכו בהתאם להצהרת 'האגודה לחקר הראייה ורפואת העיניים' לשימוש בבעלי חיים במחקר
1. ייצור AAV בקנה מידה קטן12
- תאי HEK293T תרבות באמצעות לוחות 15 ס"מ להשלים 10 מ"ל של DMEM / 10% FBS עד 70-80% השפעה.
- הכן את תערובת transfection עם 20 מיקרוגרם של פלסמיד עוזר (pHGT1-Adeno1), 7 מיקרוגרם של plasmid קפסיד ו 7 מיקרוגרם של AAV2-CBA-tdTomato-WPRE ו 136 μL של פתרון PEI (1 מ"ג / מ"ל) ב 5 מ"ל של DMEM.
- מוסיפים את תערובת טרנספקטיון מוכן 5 מ"ל לתוך צלחת תרבית התא המכיל 10 מ"ל של מדיה תרבית ודגרה את התאים transfected עבור 48-60 שעות ב 37 °C (50 °F).
- לאסוף את המדיה ב 48-60 h לאחר transfection ולעכל אותו עם DNase I בריכוז הסופי של 250 U / mL במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F).
- צנטריפוגה את המדיה המעוכלת ב 4000 x גרם, 4 °C במשך 30 דקות ולאחר מכן לסנן אותו עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר לתוך קרום תאית מחודשת רטובה מראש עבור 100 kDa.
- צנטריפוגה קרום תאית מחודשת ב 4000 x גרם, 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות ולהשליך את המדיה.
- לשטוף צנטריפוגות קרום תאית מחודשת עם PBS המכיל 0.001% F-68 Pluronic שלוש פעמים ב 4000 x גרם,4 °C (55 °F) במשך 30 דקות. השלך את ה- PBS בכל שלב.
- לאסוף AAVs מרוכז מהחלק העליון של קרום תאית מחודשת aliquot לשימושים נוספים.
- תעכל 5 μL של AAV טרי עם DNase I (0.2U / μl) במשך 15 דקות ב 37 °C (77 °F) עבור titering. זה ואחריו 10 דקות ב 95 °C דגירה עבור הן בהשמדת DNase I והשפלה capsids ויראלי.
- הכן דילול טורי פי 10 מ- AAVs מעוכל באמצעות F-68 פלורוני 0.05%. השתמש בפריימרים AAV2-ITR ו- WPRE עבור טיטציה(טבלה 1). titers חושבו על ידי הכפלת תוצאות dd-PCR עם גורמי דילול. התוצאות הוסבו לעותק גנום/מ"ל (GC/mL).
הערה: ריכוזי AAV לייצור AAV בקנה מידה קטן צפויים להיות סביב 1 x 1012 GC / mL. פרוטוקול זה אינו ישים עבור זני AAV שאינם משחררים ביעילות AAVs למדיה כמו AAV213.
2. הזרקה תוך-ויאטרלית של AAV
-
הכנת ציוד
- לפני שתתחיל, להכין 10 מיקרו-מזרק μL עם מחט קהה 36 G. יש לשטוף חמש פעמים עם 70% EtOH, חמש פעמים ב-ddH2O ולבסוף חמש פעמים עם PBS.
- טען את הכמות המתאימה של AAV לתוך המזרק עבור כל זריקה.
- הכן את המחט הכירורגית (תות, משי, 6/0), סרט הדבקה, מלקחיים ומספריים.
-
הזרקה תוך-ויטמינית
- החל 1 טיפה של 0.5% טרופיקמיד ו 2.5% פנילפרין הידרוכלוריד (למשל, Mydfrin) המכיל טיפת עיניים לפני הרדמה כדי להרחיב את האישונים.
- עכברים מרדים עם איזופלוראן 5% (1 ליטר/דקה) ולהמשיך עם 1.5% איזופלוראן (1 ליטר / דקה) במהלך ההליך. תא איזופלוראן קטן משמש לאינדוקציה הראשונה.
- אמת את עומק ההרדמה על ידי אובדן רפלקס ההגנה, רפלקס הגמילה ותגובת צביטת הזנב.
- יש למרוח 0.3% טוברמיצין ו-0.1% תמיסה עיניים סטרילית דקסמתזון על כל עין לפני הליך ההזרקה. יישום של טיפת עיניים מונע יובש ומפעיל השפעות אנטי דלקתיות ואנטי בקטריאלית.
- השתמש וו כירורגי כדי לייצב את העפעף העליון. לסגת מעט לאחור כדי לחשוף את החלק הגבי של העין. הדביק את הקרס לספסל כדי להחזיק אותו בעמדה.
- הסר את הלחמית (פחות מ 1 מ"מ2) עם מספריים קשתית מעוקלת לחשוף את sclera של העין מתחת למיקרוסקופ לנתח. השתמש מזרק אינסולין טרי סטרילי (30 גרם) כדי לנקב את הסקלרה.
- הכנס את המחט של microsyringe דרך אותו ניקוב באמצעות מיקרו-מניפולטור. מניחים את קצה המחט מאחורי העדשה באמצע העיית.
- הזרק 1 μL של AAV2 / BP2 ו AAV2 / PHP. וקטורים S בעלי 1.63 x 1012 GC/mL ו 1.7 x 1012 GC / mL ריכוזים לאט לתוך הזגג של העין. בקרת עוצמת הזרקה נעשית באופן ידני. להשאיר את המחט במקום במשך 1 דקות לאט למשוך את המחט.
- שחררו את העפעף והחלו טיפול ג'ל אקטואלי אנטי דלקתי ואנטי בקטריאלי המכיל 0.3% טוברמיצין ו-0.1% דקסמתזון על העיית. לפקח ולהעריך את העכברים בימים הבאים על פי גיליון התוצאות במונחים של מראה (עיניים בהירות, מעיל מטופח, כיפוף), התנהגות (פעילות, השתקת, השחתה עצמית), ומשקל גוף בסולם של 0 עד 3. לכל תנאי יש ציון מ 0-3 וציון כולל של 3 ומעלה הוא קריטריון סיום.
- מניחים את החיות בכלוב לאחר ההחלמה.
3. פלואורסצנטיות והדמיה פונדוס
- מסננים את העכבר ומרחיבים את האישון על ידי הצבת טיפות של 0.5% טרופיקמיד ו 2.5% פנילפרין הידרוכלוריד לכל עין.
- להרסים את החיה עם ההליך הנ"ל עם איזופלוראן. להעריך את עומק ההרדמה בזהירות על ידי צביטת כפות הרגליים.
- הנח את העכבר על שלב ההדמיה ואמת את ההסתגלות הנכונה על-ידי בדיקה דרך מצלמת fundus. יש למרוח ג'ל אקטואלי (0.2% קרבומר 980) על פני העיניים כדי להגן על העיניים מפני התייבשות בהרדמה ולהשתמש בו כג'ל צימוד להדמיה.
- לתפעל את שלב ההדמיה כדי יישר קו עם האף של המטרה. התאם את הבמה לפי הצורך כדי למרכז את עין העכבר. ברגע שהעין מרוכזת, להזיז לאט את המטרה עד שהוא יוצר קשר עם העין.
- בצע הדמיית פונדוס ופלואורסצנטיות בשתי העיניים כדי לעקוב אחר ביטוי tdTomato בשבוע אחד ושבועיים לאחר הזרקה תוך-ויטמינית (איור 3B)14. קח תמונות פונדוס ופלואורסצנטיות בהגדרות זהות להשוואה של ביטוי עיתונאי.
4. בידוד רשתית
- המתת חסד בעלי חיים לאחר דימות פונדוס ופלואורסצנטיות על ידי שאיפת CO2 לאיסוף רשתית בנקודת זמן של שבועיים.
- הסט את גלגל העין קדימה בעזרת מלקחיים מפצלים 13.5 ס"מ.
- הסר את העדשה יחד עם הזגוז הנותר על ידי הפעלת לחץ עדין עם המלקחיים.
- חותכים את החיבור של גלגל העין לעצב הראייה עם מלקחיים מעוקלים מדויקים ולסחוט בעדינות את הרשתית עם אותם מלקחיים מעוקלים.
- מעבירים רשתיות נותחו לצינור מיקרוצנטריפוגה.
- הצמד רשתית להקפיא על ידי הצבת הצינורות לתוך החנקן הנוזלי.
5. בידוד דנ"א גנומי של רקמות
- לבודד DNA גנומי עם ערכת DNA גנומי מבוסס עיכול Proteinase K ממוסחרת.
- תעכל רשתית ב-55 °C (55 °F), 200 x גרם למשך 30 דקות עם פרוטאינאז K, שכבר מסופק בערכה.
- בצע שלב הדגירה RNase, לשטוף צעדים עם חוצץ לשטוף I ו- II, ולבסוף צעד חמק על פי פרוטוקול היצרן.
- הוסף שלב ספין נוסף לאחר הכביסה האחרונה כדי להסיר אתנול שיורית.
- למדוד את הריכוז של DNA גנומי ולאחסן דגימות ב -20 °C (50 °F).
6. ניתוח PCR דיגיטלי טיפה של דגימות רשתית עכבר לכימות של גנומים ויראליים
- לדלל DNAs גנומי מן הרשתיות מוזרק 0.05% פתרון F-68 פלורוני כדי להגיע לריכוז הסופי של 1 ng/ μL עבור כל מדגם.
- בצע תגובות נפרדות עבור WPRE ו- 18S באמצעות פריימרים ספציפיים ליעד עם ריכוז סופי של 125 ננומטר עבור כל פריימר.
- בצע ייצור טיפות בתערובת תגובה של 20 מיקרו-ליטר של PCR כולל 1 ננומטר של דנ"א גנומי, פריימרים של 125 ננומטר וסופרמיקס 2x evagreen.
- טען את תערובת המדגם בחלק האמצעי של המחסנית ליצירת טיפות.
- לאחר טעינה לדוגמה מחסנית נעשה, להוסיף 70 μL של שמן הדור טיפה לשורה התחתונה של המחסנית.
- שים את האטם על גבי המחסנית והנח אותו לתוך מחולל טיפה. ודא כי אין פער בין האטם לבין המחסנית.
- יש ליטול בעדינות כ-40 מיקרו-אל של טיפות הנוצרות בבאר העליונה. הוסף את פתרון טיפת לצלחת התגובה חצי חטופה 96 טוב PCR.
- אטמו את צלחת ה-PCR עם איטום לוחית PCR באמצעות רדיד איטום אלומיניום.
- יש להניח את צלחת ה-PCR על אופנוע תרמי אטום בחום 96.. השתמש בפרוטוקול PCR; 95 °C (5 דקות), 40 מחזורים של 95 °C (5 °F) במשך 30 °C (60 °F) למשך 1 דקות, 4 °C (5 דקות), 90 °C (5 דקות) ו -4 °C אחיזה אינסופית. החל 2 °C /s קצב הרמפה בכל מחזור כדי להבטיח כי טיפות להגיע לטמפרטורה הנכונה עבור כל צעד במהלך רכיבה על אופניים
- מקם צלחת PCR בקורא טיפות כדי לכמת טיפות באמצעות תוכנת dd-PCR. תבנית מוגדרת באמצעות הגדרות ספציפיות עבור evagreen.
- נתח נתונים באמצעות גרף התוויה חד-ממדית עם כל דגימה לעוצמת פלואורסצנטיות לעומת מספר טיפה. ערך הסף מסודר כך שהלטיפות מעל הסף מוקצות כחיוביות ואת הערך שלהלן כשלילי. לאחר מכן היישום של אלגוריתם פואסון כדי לקבוע את הריכוז ההתחלתי של DNA היעד ביחידות של עותקים / μL. היחס בין WPRE לעומת 18S מחושב למדידת יעילות התמרה של AAV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצור AAV בקנה מידה קטן הוא שיטה מהירה ויעילה המספקת וקטורים לזריקות תוך-ויטמיניות(איור 1). ייצור AAV בקנה מידה קטן בדרך כלל נותן טיטרים בטווח של 1 x 1012 GC / ml אשר מספיק כדי לזהות ביטוי כתב ברשתית (איור 2). טיטרינג של AAV באמצעות dd-PCR נותן תוצאות עקביות. פריימרים ספציפיים של ITR2 ו- WPRE נמצאים בשימוש שגרתי והריכוז ההתחלתי של כל מולקולת יעד חושב באמצעות תוכנת dd-PCR על ידי מידול כהפצת פואסון. החישובים הושלמו על ידי כפל של גורמי דילול והומרו לעותק גנום לכל מ"ל. AAVs המיוצרים עבור פרוטוקול זה היו titers של 1.63 x 1012 GC / mL ו 1.7x 1012 GC / ml עבור AAV2 / BP2 ו AAV2 / PHP.S7,15, בהתאמה. לשם השוואה, מבנים זהים של ביטוי tdTomato שימשו לשני הזנים. הזרקנו בערך טיטרים שווים של AAV לכימות של יעילות התמרה AAV. לאחר הזרקת 1 μL מן הריכוזים הנ"ל של AAVs, בעלי חיים צולמו ב 1 שבוע ו 2 שבועות נקודות זמן. מערכת הדמיית פונדוס ופלואורסצנטיות שימשה הן עבור AAV2/BP2 והן עבור AAV2/PHP. S מוזרק רשתיות יצירת פרופילי ביטוי כתב דומה למעט רשתית #1 (איור 3A,B). ביטוי TdTomato היה מכומת באמצעות תוכנת ImageJ עבור ערך אפור ממוצע (עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת) על מנת לחצות את יעילות התמרה וביטוי הכתב (איור 3A,B). זהו בעצם סכום הערכים האפורים של כל הפיקסלים בקטע הנבחר חלקי מספר הפיקסלים16. תמונות פלואורסצנטיות של רשתית #1 הראו רק שטח קטן של ביטוי tdTomato, ככל הנראה עקב זרימה אחורית או דליפה לאחר זריקות תוך-ויטמיניות. בהתאם לממצא זה, עוצמת הפלואורסצנטיות של הרשתית #1 הייתה 0.9 שהייתה הנמוכה ביותר בהשוואה לכל הרשתיות שהוזרקו וצווימו באופן תוך-ויטאלי. עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת הייתה בין 4 ל -11. זה הראה כי הכימות של תמונות פלואורסצנטיות של ביטוי tdTomato היה מוצלח בקורלציה עם התמונות שהוצגו (איור 3A,B).
לאחר הדמיה של רשתיות, DNA גנומי היה מבודד רשתיות מוזרק בנקודת זמן של שבועיים. dd-PCR בוצע באמצעות פריימרים WPRE לכימות גנום AAV. עכבר 18S שימש לנורמליזציה של גנומי AAV לגנום העכבר (איור 3C)17. בהתאם לעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת ולתמונות, לרשית #1 היה מספר עותק גנום AAV נמוך מאוד ביחס ל- 18S, פי 0.011 נמוך יותר בהשוואה לרשת #2. יתר על כן, רשתיות #2, 3, 4 ו- 5 מעניקות הבדלים דומים ברמת הקיפול. הבדלי הקיפול בהשוואה ל רשתית #2 עבור רשתית #3, 4 ו- 5 היו 1.75, 0.55 ו- 0.99, בהתאמה. בין אלה, רשתית #3 שניהם נתנו את העוצמה הפלואורסצנטית הגבוהה ביותר ואת מספר עותק הגנום AAV. זה כבר הראה כי כימות של גנומים AAV transduced עם dd-PCR מתאם עם עוצמת הפלואורסצנטיות ובכך ביטוי tdTomato כי הוא ציין. שיטת dd-PCR גם אפשרה לנו לעשות כימות מוחלט של AAVs transduced. כימות מוחלט של הגנום הכולל AAV לכל רשתית חושב פשוט על ידי הכפלת המספר הכולל שזוהה מ- dd-PCR ואת גורם הדילול של DNA גנומי. זה הניב תוצאות דומות בהשוואה ליעילות טרנסדוקציה של גנום AAV מנורמלת של 18S (איור 3D).
איור 1: תרשים זרימה של הליכי הניסוי. ייצור AAV בקנה מידה קטן מלווה titering מבוסס DD-PCR. AAVs מוזרקים תוך-ויטמינית לרשתית הבוגרת. מעקב אחר בעלי חיים בוצע באמצעות מערכת הדמיה פונדוס ופלואורסצנטית על מנת לנתח את הביטוי העיתונאי. תמונות פונדוס ופלואורסצנטיות צולמו בנקודות זמן של שבוע ושבועיים. DNA גנומי מבודד רשתיות מוזרקות לניתוח עם dd-PCR כדי לכמת את הגנום הכולל AAV כי הוא נוכח ברשתיות מוזרק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: TITERING AAV בשיטת dd-PCR. (A)שיטת Dd-PCR נהנית מתגובות PCR עטופות בתוך טיפה. לאחר תגובת PCR באמצעות כימיה evagreen, טיפות חיוביות ושליליות עבור גן היעד נותחו כדי לקבוע את המספר המוחלט של DNAs היעד בתוך פתרון. (קופסאות אדומות בטיפות ירוקות). (B)נתוני dd-PCR מייצגים עבור Titering AAV. מספר אצוות של AAVs היו titered באמצעות פריימרים ITR2. טיפות חיוביות ושליליות מופרדות מעל ומתחת לסף (הקו הסגול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות הגנום של AAV המועבר בנטונית על ידי dd-PCR. חיות בר בנות 16 שבועות הוזרקו תוך-ויטרלית עם AAV2/BP2 ו-AAV2/PHP. וקטורים S בעלי ריכוזי GC/mL 1.63 x10 12 GC/mL ו-1.7x 1012 GC/mL, בהתאמה. שני AAVs היה מבנה ביטוי tdTomato זהה נפח הזרקה עבור כל AAVs היה 1 μL. רשתיות מוזרקות (1-7) היו במעקב עם קרנות והדמיה פלואורסצנטית. תמונות שצולמו כותמו באמצעות תוכנת Image J. למרות ההבדל capsid, כל בעלי החיים היו פלואורסצנטיות ממוצע ערך עוצמה(ערך אפור ממוצע)הנע בין 4 ל 11 למעט רשתית #1 אשר היה בעוצמה הנמוכה ביותר, 0.9, וביטוי tdTomato חלש. עמודות אדומות ואפורות הן AAV2/BP2 ו- AAV2/PHP. S מוזרק רשתיות, בהתאמה(A-B). dd-PCR בוצע באמצעות פריימרים WPRE עבור גנום AAV 18S פריימר לנורמליזציה בנקודת זמן של שבועיים. רשתית # 1 גם הראה מספרי עותק AAV נמוכים באופן ייחודי לכל 18S עותקים (C). סך הגנומים של AAV לכל רשתית חושבו גם באמצעות מספר עותק WPRE ומקדם דילול לבידוד DNA גנומי (D). ריבועים אדומים ואפורים הם AAV2 / BP2 ו- AAV2 / PHP. S מוזרק רשתיות, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פריימרים של ddPCR | |
| ITR2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
טבלה 1: רצפי פריימר dd-PCR. רצפים של פריימרים קדימה ואחורה עבור WPRE, ITR2 ועכבר 18S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, יצרנו שני וקטורים AAV שיש להם חלבונים קפדיים שונים ולאחר מכן titered אותם בהתאם. אחד הצעדים המכריעים ביותר של פרוטוקול זה הוא לייצר כמויות מספיקות של AAVs שיניב ביטוי עיתונאי לגילוי לאחר התמרה12,13.
Titering של AAVs הוא גם גורם חשוב כדי להתאים את המינונים של AAV עבור זריקות תוך-ויטמיניות. ברגע שקריטריונים חשובים אלה מושגים, זה אפשרי לכמת את יעילות התמרה של AAVs על ידי מתודולוגיית dd-PCR.
מעבדות רבות משתמשות בשיטת PCR הכמותית (qPCR) עבור TITERing AAV. שיטת כימות מוחלטת מבוססת qPCR דורשת עקומה סטנדרטית הכוללת דילול של כמויות ידועות של DNA היעד18. עם זאת, dd-PCR אינו דורש עקומה סטנדרטית כפי שהוא כימת ישירות את המספר הכולל של מולקולות היעד בתוך מדגם נתון על ידי זיהוי טיפות חיוביות שיש להם לפחות עותק אחד של DNA היעד. מאז dd-PCR הוא ניתוח נקודת קצה ולא נדרשת עקומה סטנדרטית, בעיות היעילות שהתרחשו במהלך תגובת qPCR הן פחות דאגה עבור dd-PCR כמו PCRs יעילות נמוכה או איכות עקומות סטנדרטיות 9. ניתן להחיל את מתודולוגיית dd-PCR על דוגמאות שכבר מוכנות ל- qPCR. כפי שכבר הוזכר בסעיף שיטות עבור titering AAV, dd-PCR דורש דגימות מדוללות. זהו צעד קריטי שכן ריכוז המדגם צריך להיות מותאם באופן שיש מספיק טיפות שליליות כדי לבצע את האלגוריתם Poisson. במילים אחרות, לא ניתן לבצע את תגובת dd-PCR עם דגימות עם ריכוזים גבוהים מדי של DNA היעד שאינם מניבים טיפות שליליות.
הן עבור מדידות טיטר של AAV והן עבור מדידות יעילות טרנסדוקציה, ניתן להשתמש בערכות יעד שונות. עבור TITERING AAV, אנו משתמשים בעיקר בפריימרים ספציפיים של AAV2 ITR בשל עמוד השדרה של AAV2 במבנים שלנו. ניתן גם להשתמש WPRE ויעדים ספציפיים לגנים אחרים בהתאם למבנה AAV שנותח.
כדי להעריך את יעילות התמרה של AAVs ברשתית העצבית, יישמנו את שיטת dd-PCR באמצעות דגימות רשתית שלמות כדי לכמת את הכמות הכוללת של גנומים AAV לכל רשתית. הערכנו את הדיוק של המתודולוגיה באמצעות וקטור AAV המבטא כתב tdTomato. השוואה בין תוצאות dd-PCR עם רמות הביטוי tdTomato מתואמות למעט שתי החששות החיצוניות. רשתיות #6 ו #7 הניבו עודף עותקי גנום AAV למרות שהראה עוצמות פלואורסצנטיות דומות בהשוואה לרשיתות #2,3 4 או 5. ייתכן שהסיבה לכך היא שלריתות אלה יש שיעורי טרנסדוקציה גבוהים יותר עם רמות ביטוי מוגבלות או עשויות להיות קשורות בחלקן לחלקיקי AAV מתמשכים או לדנ"א וקטורי בתוך הרשתית הזגג או העצבית19,20. בסך הכל, זה היה הגורם המגביל היחיד לשיטה שלנו וניתן לזהות אותו בקלות בין דגימות אחרות. כמו כן כימתנו את המספר הכולל של גנומי AAV לכל רשתית שהיה אחד החוזקות של מתודולוגיה זו. זה מאפשר השוואה של נתונים בין מעבדות שונות וקבוצות של בעלי חיים. לכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות כדי להעריך את יעילות התמרה של סרוטיפ חדש, גרסה או אצווה כדי וריאציה אצווה עבור וקטורים AAV שאין להם ביטוי כתב ולעזור לנו להצליב נתונים בהגדרות שונות. הדבר קריטי עבור וקטורים AAV שאינם מאפשרים ביטוי של כתב עקב אילוצי גודל.
שיטה זו מספקת גם בסיס לסוגים אחרים של בדיקות רגישות המשתמשות בדנ"א היעד. באמצעות הפרוטוקולים הזהים, אנו יכולים לכמת מספרי העתקת גנום מיטוכונדריאליים עם פריימרים מתאימים. שיפורים נוספים אפשריים גם כולל ניתוק של רשתית ושלבי מיון ציטומטריית זרימה כדי לכמת את ה- DNA היעד בתאים בודדים או בקבוצות של תאים. יתר על כן, זה גם אפשרי להעריך את יעילות התיקון של עריכת בסיס בשיטה זו21,22, שהוא גם קריטי עבור מספר מחלות רשתית טיפולים גנטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לאוזקאן קיילס, ג'וזפין יוטנר ופרופ' בוטנוד רוסקה, המכון לרפואת עיניים מולקולרית וקלינית באזל, פלטפורמת וירוסים מורכבים על עזרתם והתמיכה בייצור AAV. ברצוננו גם להודות לפרופ' ז'אן בנט, בית הספר לרפואה פרלמן, אוניברסיטת פנסילבניה על זן AAV8/BP2. עבודות בעלי חיים מבוצעות במתקן בעלי החיים של האוניברסיטה הטכנית גבזה. על כך אנו מודים ליילה דיקמטס ופרופ' אויגר חליס טזבאי על הסיוע הטכני והתמיכה בבעלי חיים. ברצוננו גם להודות לד"ר פאטמה אוזדמיר על הערותיה על כתב היד. עבודה זו נתמכת על ידי TUBITAK, מספרי מענק 118C226 ו 121N275, ומענק שילוב אוניברסיטת סאבאנסי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al.
