昆虫農業と無脊椎動物の生理学のための汎用性の高いオルソプテランモデルである Gryllus bimaculatusの実験室培養の維持

Summary

この論文では、食用クリケット Gryllus bimaculatusの実験室培養物の長期飼育のための密度、飼料の入手可能性、水分補給源、環境制御などの重要な要素を標準化するための基本的な方法を概説する。

Abstract

Gryllus bimaculatus (De Geer)は、アフリカとユーラシア南部に分布する大きな体のクリケットで、人間の食物として野生で収穫されることがよくあります。その天然の範囲外では、 G. bimaculatusの 培養は、その食事可塑性、急速な生殖サイクル、休眠要件の欠如、高密度飼育に対する耐性、および病原体に対する堅牢性のために実行可能である。したがって、 G. bimaculatusは 、昆虫の生理学、行動、発生学、または遺伝学の研究のための汎用性の高いモデルとなり得る。

ストッキング密度、ケージ内のリフギア、光周期、温度、相対湿度、および食事などの文化的パラメータは、クリケットの成長、行動、および遺伝子発現にすべて影響を与え、標準化されるべきである。人間の消費のための農業昆虫に関する急成長している文献では、これらのクリケットは、作物残渣、食品加工副産物、およびその他の低コストの廃棄物の流れに由来する候補飼料混和剤を評価するために頻繁に使用されている。

G. bimaculatusの成長性能と栄養品質を可変飼料基質に応答して評価する進行中の実験を支援するために、実験室での繁殖、維持、取り扱い、測定、および安楽死のための包括的な標準プロトコルのセットが開発され、ここに提示される。業界標準のクリケット飼料は、クリケット繁殖株の長期維持や実験的対照飼料としての使用に栄養的に適切で機能的に適切であることが証明されています。これらのコオロギを、12の光(L)/12の暗い(D)の光周期で27°Cの平均温度でスクリーントップの29.3Lポリエチレンケージで0.005コオロギ/ cm³の密度で飼育し、湿らせたココナッツコイアを水分補給源と産卵媒体の両方として使用することで、2年間にわたって健康なクリケットを維持することに成功しました。これらの方法に従って、対照実験におけるコオロギは、収穫時に0.724g 0.190gの平均質量を生じ、ストッキング(22日)と収穫(65日)の間に89%の生存率および68.2%の性的成熟をもたらした。

Introduction

象徴的な昆虫、ショウ ジョウバエメラノガスター に代表されるように、実験室モデル生物としての昆虫の使用は、遺伝学、毒物学、および生理学における研究に明確な利点を提供する¹。昆虫のサイズが小さいため、培養に必要なスペースと、必要な飼料や消耗品の量が減少します。多くの昆虫は迅速に繁殖し、特殊な遺伝子系統の作成や、複数の連続した世代の評価を必要とする研究にユニークに適しています。

多くの研究は、ショウ ジョウバエのようなホロメタボラ昆虫に焦点を当てており、完全な変態と蛹化を示す。しかし、 Gryllus bimaculatus (De Geer)、2つの斑点を付けられたフィールドクリケットを含む他のモデルも利用可能です。 G. bimaculatus は、性的成熟に達する前に7〜11個のニンファルインスターを受けるパウロ代謝昆虫^である2。このクリケットは、性淘汰、領土表示、メイトガード3など、性的選択に関連する幅広い行動^{を表示します。}未熟なコオロギは、多くの幽門代謝性の幼体と同様に、恍惚症の間に失われた四肢および損傷した四肢を再生することができるという点で、ホロ代謝昆虫種の幼虫とは異なります⁴。さらに、 G. bimaculatus の完全配列決定ゲノムは2021年に公開されました⁵.これらの特徴により、これらのクリケットは基礎研究の対象として魅力的です。

2つの斑点のあるフィールドクリケットは、人間の食物や動物飼料のために広く飼育されています。これらの操作の規模は、実験室研究よりもはるかに大きいことがよくあります^6,7。規模の違いにもかかわらず、研究者が直面する課題は、商業クリケット農家が直面する課題と大きく重なります。これらの考慮事項は、食用昆虫の生産を改善することを目的としたラボベースの研究の文脈で収束する。食用昆虫産業が進化し成長し続けるにつれて、飼料投入量と生産の無数の他の側面を最適化することが主な目標です⁸。これらのクリケットの飼育効率、生存率、または生成時間の測定された改善を実証する実験室研究は、クリケット養殖事業の収益性を長期的に高めるのに役立つ可能性があります。

標準化された飼育プロトコルにより、飼育の最適化を調査する研究間のより詳細な比較が可能になります。現在までに、実験室でG. bimaculatusを飼育するための詳細なプロトコルはほとんど発表されていない。理想的なプロトコルは、実際のクリケット養殖事業で遭遇する条件を反映しながら、実験的治療から生じる成長パフォーマンスの変化を正確に測定し、リスク軽減戦略を強調するために必要な厳密に制御された条件を維持する。この論文に記載されている方法は、広範囲の実験室および商業生産規模2、⁹、^10、11、¹²で様々なクリケット種を飼育するために使用される公開されたプロトコル^、技術、および装置に基づいて^{開発された。}これらの方法は、未発表の技術速報や北米の商業クリケット農家との個人的なコミュニケーションなど、いくつかの査読されていない情報源によっても通知されています。このプロトコルは、特に昆虫農業に関連する試験に使用するために、G. bimaculatusの実験室培養の確立を促進することを目的として開発されました。

Protocol

産卵基板の準備

注:ココナッツコイアは 、G. bimaculatusにとって理想的な産卵基質です。圧縮コイアレンガからコイアを分離する方法に関する詳細な方法と呼吸安全性に関する注記については、 補足資料 ステップ1.1を参照してください。

1. 石鹸と水で手を洗う。
2. 天秤にきれいな容器を風袋に入れ、人間の拳ほどの大きさの乾燥ココナッツコイアの塊を量る。
3. コイアを密閉可能な清潔な容器に入れ、元の体積の6倍までの拡張に対応できます。
4. きれいな手で、大きなブロックから取り出した部分からコイアの塊を静かに分解します。
5. 50 mL メスシリンダーを使用して、脱イオン (DI) 水の正しい体積を測定し、水 5 部と乾式コイア 1 部の質量比を 5:1 にしました。
6. 測定されたDI水をゆっくりと加え、すべてのコイア粒子を均等に水和します。手動で凝集塊を浸軟して、均一な水分補給を確保します。
7. コイアが以前に計量された容器を再皮塗りする。
8. 75gの濡れたコイアの重さを量る。
9. 濡れたコイア75gを清潔なプラスチックスプーンを使用して100 mm x 15 mmのペトリ皿に移し、コイアが皿の底に均等に広がり、塊がないことを確認します。
10. ペトリ皿の側面に、出生時のコロニーと採卵イベントの日付を示すラベルを貼ったラボテープでラベルを付けます。
11. メスシリンダーでさらに45 mLのDI水を測定します。
12. ペトリ皿のパックされたコイアの表面に均等に水を加えて、均一な水分補給を確保します。コイアが、容器の側面から約1/4の深さまで水が溜まるまで飽和していることを確認してください。
13. シャーレが梱包されたら、残りの濡れたコイアを気密容器に密封し、-20°Cで保存する。
    注:この記事で規定されている方法に従って、 G. bimaculatusの 個体は産卵後平均58日後に性的成熟に達する。
14. 卵の収集
    1. 含水した産卵基質を、コオロギが飼料の顆粒を産卵基質上に機械的に移す可能性があるため、飼料からできるだけ離れたところに、所望の親ストックを含むケージに入れる。
    2. 日付と時刻を文書化します。
       注:これらの方法に従って飼育された生殖クリケットコロニーの標準化された作業密度は、n = 150成人である。その密度では、24時間の産卵窓は、コロニー年齢、以前の産卵努力、および親ケージの性比に応じて、800〜1,500個の卵を産出する。
    3. 作業面に小さなオートクレーブ可能なごみ容器を置き、卵が豊富な産卵基板の取り扱いと洗浄によってもたらされる封じ込めリスクを考慮します。
    4. 清潔で空の29.3Lのプラスチックケージをゴミ箱の隣のベンチに置き、卵が豊富な産卵基材の受取人ケージとして機能します。
    5. 親クリケットストックと産卵基板を入れた29.3Lケージを、空のケージからゴミ箱の反対側に置きます。
    6. 24時間後、親クリケットケージから産卵基質を取り出し、オートクレーブ可能な廃棄物容器の上に配置します。
    7. 産卵基板の上部に、コオロギがコイアの表面に蹴りつけた可能性のあるフラスまたは飼料の粒子がないか調べます。
       注:卵塊やコイアではない物質は、孵化中に基板上にカビを形成する可能性があります。
    8. コイア汚染物質を清潔なスクープラまたはプラスチックスプーンで廃棄物容器に除去します。
    9. プラスチックスプーンを廃棄物容器に入れます。
    10. 洗浄した産卵基板を清潔な29.3Lケージに入れます。
    11. ケージを27°C、相対湿度60%の12時間/12時間Lの光周期で設定したインキュベーターに入れます。
    12. 繁殖用ストックを入れたケージを元の場所に戻し、作業台からすべてのアイテムを取り除きます。
    13. 廃棄物容器を、クリケットの卵で汚染された可能性のあるアイテムを保管するための施設内の冷凍庫に入れます。
    14. 作業面を10%漂白剤で消毒し、60秒間放置します。
    15. 作業面を清潔なペーパータオルで拭き取ってください。冷凍庫を開け、ペーパータオルをゴミ受けに捨てます。
15. 毎日卵の基質を霧吹きし、監視する
    注: スプレーボトルから供給されるミストの量を校正するために使用される方法については、「 補足資料 のステップ 1.2」を参照してください。
    1. 発現した水が基板の表面上に均等に分布するように、産卵基板の上にスプレーボトルを配置する。
    2. 補足材料ステップ1.2で計算されたポンプ作動回数を、各産卵基質について毎日11日間連続して実行します。
    3. 各産卵基質を毎日チェックし、コイアの表面上の糸状カビの成長を監視します。
    4. 真菌の増殖が観察された場合は、きれいなスプーンまたはスクプーラを使用して表面のカビの斑点を取り除きます。
    5. 道具と取り出したコイアは、施設の冷凍庫に保管されているオートクレーブ可能な廃液容器に捨ててください。
       注:金型がクリケットの発展に悪影響を及ぼすかどうかは不明です。
    6. 産卵後11日目に、幼いクリケットの基質を詳しく見始めます。
       注:27°Cでは、 G. bimaculatus の卵は孵化するのに11〜13日かかります。
16. ナタールケージのセットアップ
    1. 未使用の30.8 cm x 30.8 cm(12インチ x 12インチ)の市販の卵箱フラットを2つ選択します。ユーティリティナイフまたは強力なはさみで、これらを同じサイズの幅10.1cm(4インチ)の6つの別々のストリップに切ります。切り取られた端を手で拭き取り、ダンボールのぶら下がっている粒子を取り除きます。
    2. 10.1 cm x 30.8 cm (4 インチ x 12 インチ) のカートンを 6 個ずつケージの底に垂直に置き、カートンの長軸が 29.3L ケージの狭い水平軸にまたがります。7枚目のカートンを6枚の直立した部分の上に平らに置きます。
    3. 約25cm×25cmの粗い茶色のペーパータオルを3枚選びます。それぞれを半分に折ります。カートン構造の近位側の上部を覆うように2つを置きます。遠位側のカートンスタックの上に1つを置きます。
    4. 産卵後11日目に、産卵基質をケージの近位右隅に移動する。
17. 初期のインスターの世話
    注:産卵後14日目に、ほとんどの生存可能な卵は孵化し、初期段階のクリケットニンフは飼料と水を必要とします。若いコオロギは水滴の表面張力を壊すことができず、環境に水が溜まると溺れることがあります。しかし、それらはまた乾燥に敏感です。開発のこの段階で約60%の一貫した相対湿度を提供することは、生存を確実にするために重要です。
    1. ハッチングが観察されたら、ステップ1.4.3でカートンの上部に置かれたペーパータオルを、濡れるまで霧をかけますが、積極的に水を流しません。
    2. 100mmのペトリ皿の蓋の両側を70%エタノールで十分に拭き取り、乾燥させます。クリケットの飼料が配達される容器としてそれを使用してください。
       注:初齢のクリケットは、開発の次の段階でクリケットよりも小さな飼料粒子を必要とします。このより細かい飼料は、出現後最初の20日間、クリケットに投与されるべきです。
    3. 50 g のフィードを 60 ワットのシングルサービングブレンダーにすくい込み、10,000 rpm で 1 分間ミルします。
    4. 飼料1gを測定し、ケージ内のペトリ皿の蓋の上に振る。スプーンまたはスクープラのきれいな端を使用して、皿の底にできるだけ均一に飼料を広げます。
    5. フィードは2日ごとに交換してください。スプーンの端を使って、餌皿からクリケットをブラッシングしてから取り除きます。オートクレーブ可能な廃棄物容器内の古い飼料を廃棄する。
    6. 飼料中のカビの成長を監視します。飼料が白または緑がかった色に見え始めたら、ペトリ皿を捨ててすぐに給餌してください。
    7. 産卵後14日目に、2.54cm(1インチ)の絵筆を使用して、コイア表面およびペトリ皿の側面からケージにすべてのコオロギをブラッシングすることによって、出生用コイア基材にしがみついているコオロギを除去します。
    8. 取り出した産卵基板をオートクレーブ可能な廃棄物容器に入れ、オートクレーブ処理するまで冷凍庫に保管します。
    9. 出生用基質を、ステップ1.1.5-1.1.9に従って調製された水和のための新鮮なコイア皿と交換する。
    10. DIウォーターウォッシュボトルを使用して、コイアの表面が光るまで水を加えますが、プールされません。
        注:クリケットの密度は 、G. bimaculatus¹³の成長パフォーマンスに強く影響します。繁殖株を過剰な密度に維持することは、その子孫が使用される実験に望ましくない混雑誘発エピジェネティック効果をもたらす危険性がある⁹。クリケットは、産卵基質から出現する高密度から「間伐」され、0.005コオロギ/ cm³ の空間の基準に準拠する密度に分布しなければならない。

2.インスター3〜大人の世話

1. ケージのセットアップ
   メモ: スクリーン付き蓋を構築する手法の詳細については、「 補足資料」 のステップ 1.3.1 を参照してください。
   1. 手順 1.4.1 を繰り返します。
   2. ケージの遠位端に5つのカットされた卵カートンピースを設置して、卵形の凹部が外側を向くようにします。短い端がケージの側面の周りにあり、長い側が底に対して平らに座り、各カートンの間に約3cmのスペースがあることを確認します。
   3. 最後にカットしたカートン片を、 補足図S1に示すように、屋根などの直立したカートン片の上に置きます。
   4. ステップ1.1.8-1.1.13に従って、水和基質を調製する。
   5. 補足図S2に示すように、クリケットケージの近位右隅に水和基板を置きます。
   6. 洗浄ボトルを使用して、コイア表面が濡れて反射的に見えるまで6〜10mLのDI水を加えますが、コイアは完全には水没しません。
      注:表面は軽くくぼんで見え、表面張力により水がコイアの輪郭をたどります。
   7. 100mmのペトリ皿の蓋をひっくり返し、ケージの近位左側に置きます。 補足図S2に示すように、2〜3gの標準クリケット飼料を加える。
2. コロニー密度の変更
   注:この手順は、孵化後20日後、またはクリケットの平均質量が0.01 gに達したときに行ってください。
   1. 作業面には、29.3Lケージ3個を並べて置く間取りを収納できる大きな容器を置きます。
      注:これは二次封じ込めであり、あるコロニーから別のコロニーへの移動中に逃げるクリケットを制御します。
   2. 飼育ラックから元のコロニーを取り出し、作業台に置きます。
   3. 元のコロニーの右側に、同じサイズの空のケージを置きます。
   4. 空のケージの右側に、手順2.1.1~2.1.7で設定したケージを置きます。
   5. クリケットがコオロギを入れたケージのふたの下側にしがみついていないことを確認してください。観察された場合は、ケージの上部をタップして取り外します。
   6. クリケットを入れたケージの蓋を開けます。
   7. 1つの穏やかで滑らかな動きで、「屋根」カートンとその輪郭に付着しているすべてのクリケットを中央のケージに移します。
   8. カートンが中央のケージに入ったら、段ボールを側面にそっとかき混ぜて、すべてのクリケットを外します。
   9. すべてのクリケットが自由に振られたことを視覚的に検査してから、カートンピースを元のケージの近位側に戻し、残りのクリケットがカートンに付着できるようにします。
   10. ケージ内のすべてのカートンピースで手順2.2.8-2.2.9を繰り返し、すべてのクリケットが中央ケージに移されるまで、元のケージの前面から背面に順番に作業します。
   11. コオロギを入れている中央のケージを静かに傾けて、含まれているすべてのクリケットが下隅に向けられるようにします。
   12. クリケットの入ったケージを受取人のケージの上に持ち上げます。
   13. ドナーケージをゆっくりと傾けて、クリケットが側面で購入し始め、 補足図S3に示すように、下隅の塊から制御された方法で移動できるようにします。
   14. クリケットの前進が速すぎる場合は、中央のケージを保持する角度を調整して、クリケットを後退させます。
   15. ケージが傾いている間、2.54cm(1インチ)のペイントブラシを使用してクリケットを受取人のケージに誘導し、合計数が150人になるまでそれぞれを数えます。ブラシを使用して、正確なカウントのためにあまりにも速く前進する人を阻止します。
   16. 新しくストックされたクリケットケージに、日付、親のストック、および含まれているクリケットの数をラベル付けします。
   17. 中央と元の容器の底に残っている余分なコオロギを人道的に安楽死させるには、容器全体を-20°Cの冷凍庫に最低30分間入れます。
   18. 原産地のケージを調べて、すべてのクリケットが移送されたことを確認します。
   19. クリケットケージを、12時間のL / D光周期を維持するようにプログラムされた住宅グレードの屋外タイマーに設定されたフルスペクトル蛍光灯を備えたライトフードの25cm下の植物栽培ラックに置きます。 補足図 S4 を参照してください。
   20. すべてのフラス、使用済みの水分補給基材と飼料の皿、ペーパータオル、排液、および原産地のケージに残っている死んだクリケットをオートクレーブ可能な廃棄物容器に移します。
   21. 廃棄物を直ちにオートクレーブ処理する場合を除き、-20°Cの施設内冷凍庫に保管してください。
   22. 床、作業服、二次格納容器ケージ、および作業面を検査して、逃げたクリケットがないか調べます。
   23. 作業面と二次格納容器ケージを10%漂白剤溶液で消毒し、ペーパータオルをオートクレーブ可能な廃棄物容器に捨てます。
3. 給餌と散水
   1. 気密飼料貯蔵容器を開き、空の100mLサンプルカップにクリケット飼料を入れます。各コロニーに手を伸ばし、カップに保持された飼料の4分の1を飼料を保持するペトリ皿の蓋に預ける。
   2. コオロギに水をやるには、手順1.1.9-1.1.13に従ってコイアのペトリ皿を準備します。
   3. 消費速度に見合った飼料速度を増やして、自由摂取の飼料の入手可能 性を確保します 。
      注:クリケットのフィード需要は開発中に変化します。
4. クリケットを清潔なケージに移す
   1. クリケットを2週間ごとにケージをきれいにする。ケージの配置を手順 2.2.1 ~ 2.2.4 で再現します。
      注:かなりの量のフラスが卵のカートンの凹部に蓄積しているでしょう。
   2. コオロギを清掃ケージに移し、手順2.2.5-2.2.23に従います。
   3. ステップ2.2.7-2.2.10の繰り返し中にクリケットがカートンにしがみつくのを許しながら、フレースの大部分が元のケージに落ちるようにカートンを優しく操縦します。
   4. ブラシまたはプラスチックスプーンを使用して、フレースに閉じ込められたクリケットが中央のケージからきれいなケージに移動するように促します。
   5. 原産地のケージを調べて、すべてのクリケットが移送されたことを確認します。
   6. すべてのフラス、使用済みの水分補給基材と飼料の皿、ペーパータオル、排液、および原産地のケージに残っている死んだクリケットをオートクレーブ可能な廃棄物容器に移します。
   7. 廃棄物を直ちにオートクレーブ処理する場合を除き、-20°Cの施設内冷凍庫に保管してください。
   8. 床、作業服、二次格納容器ケージ、および作業面を検査して、逃げたクリケットがないか調べます。
   9. 作業面と二次格納容器ケージを10%漂白液で消毒し、ペーパータオルをオートクレーブ可能な廃棄物容器に廃棄します。
5. 実験ケージのセットアップ
   注:実験ケージは、より少ないコオロギを収容するプラスチック容器です。それらのセットアップは、繁殖用ストックを含む29.3 Lケージと同じですが、水、飼料、および減少した卵カートン表面積を含む小さな皿をストックした7.1 L容器に依存しています。
   1. 10.1 cm x 15.4 cm(4 インチ x 6 インチ)のカートン片を6個、ケージの狭い寸法の幅にまたがるカートンの長軸と、蓋と床に向いたカートンの短軸を、各実験ケージの先端に置きます。
   2. 水和コイア作業ミックス10gをペトリ皿に詰めます。
   3. DI水を入れた洗浄ボトルを使用して、約15mLのDI水を加えるか、コイアの表面にメニスカスが形成されるまで使用します。
   4. 60 mm x 15 mm のペトリ皿の蓋をひっくり返して、飼料を保持します。
      注:摂食率は試験期間中変化する可能性があります。実験的なケージクリケットのランダム化とストッキングの手順については、 補足資料 のステップ1.4を参照してください。
6. 昆虫を終わらせる
   1. クリケットが繁殖や実験的な使用に必要なくなったら、ステップ2.2.17に従ってください。
   2. クリケットが死んだら、冷凍庫からケージを取り出します。蓋を取り外し、含まれているすべての材料をオートクレーブ可能な廃棄物容器に移します。オートクレーブ処理まで廃棄物を冷凍庫に戻します。
   3. 空のケージを10%漂白剤溶液に浸し、最低5分間放置します。
   4. 容器の底にあるチャネルに特に注意を払って、漂白剤の残留物を除去するために、冷たい水道水で空のケージをトリプルすすいでください。

Representative Results

孵化から生後65日までのクリケットの飼育が成功したことを示すデータは、2021年9月の飼料試験中に収集されました。クリケットは、これらのプロトコルのステップ1.1.1〜2.6.1に従って卵から成長し、6つの複製ケージには、上記のステップ2.7に従って24匹のランダムな22日齢(3齢)のコオロギがストックされた。その後、クリケットは周囲の室内条件で飼育されました。しかし、設備の空気処理ユニットの誤動作により、平均室温は、提案された27°Cではなく、相対湿度20%で25±1°Cでした。 クリケットの質量は、孵化後22〜65日の間に週2回測定された。この実験の結果を以下に概説し、標準偏差をプラスまたはマイナスの平均として示します。

図1および図2に示されるデータは、このプロトコールに記載される標準飼料を投与された6つの複製ケージを表す。クリケットは、平均質量が21〜9mgの集団から貯蔵±れた。実験終了時、幼体と成体のクリケットを合わせたすべての平均質量は0.724g±0.190gであった(図1)。G. bimaculatusは性的に二形性であるため、成人の質量も性別別に報告します。収穫時の性比は51%の女性であった。実験が終了した時点で生後65日で生存していた成人男性30人のうち、平均質量は0.721g±0.123gであった。65日齢で存在する58人の成人女性のうち、平均質量は0.841g±0.112gであった(図2)。飼育と収穫の間の生存率は89%であり、すべてのケージ内のすべての個々のクリケットの総数によって毎週測定されました。65日目には、すべてのクリケットの68.2%が成人齢に達していました(図2)。

図1:孵化後22〜65日目の個々のクリケットの平均質量。 バーはケージによる平均クリケット質量の四分位数を表し、n = 6ケージです。すべてのクリケットを数え、週に2倍の体重を量ったが、実験の1週間で1回だけ計量された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:実験終了時の性別別の成人クリケット質量の平均。 オスのクリケット n = 30、メスのクリケット n = 58。バーは平均質量の分位数を表します。「x」は性別による平均クリケット質量を表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足材料: (1)ココナッツコイアと呼吸の安全性、(2)ココナッツコイア材料の除去、(3)ミスト送達の較正、(4)スクリーニング蓋構造、(5)実験ケージストッキング、(6)ケージへのコオロギのランダム化、(7)飼料分析に使用される方法。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S1:段ボールカートンレフュジア、飼料、およびココナッツコイアの正しい配置を含むクリケットケージの側面図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S2:ケージの底部に位置するココナッツコイアおよびクリケット飼料を含むペトリ皿の上面図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:ステップ2.2.11-2.2.13で説明されているように、ゆっくりと傾けることによってケージの底から新しいケージに移されるクリケット。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S4:照明付きの飼育ラックに置かれたコオロギを入れたケージ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S1:(1)市販飼料の栄養分析、(2)飼料成分の製造者リスト。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

クリケットの飼育に対するこのアプローチのシンプルさは、幅広い研究分野に利益をもたらし、さまざまな実験ニーズに容易に適応できるクリケットの飼育を成功させるための一般的なテンプレートを表しています。 G. bimaculatus の他のいくつかの研究と比較して、個々の体の成人サイズは小さく、成熟は遅く¹⁴、これは状況によって私たちに課せられた最適でない飼育温度に起因する。上記の方法は、2年間にわたって使用され、洗練されてきました。堅固な培養物は、古典的な臨床徴候を有する病原体による広範な死亡率(例えば、 Acheta domesticusのデンソウイルスによる内部液化)または過度の共食いを含む、商業クリケット養殖において時々観察される問題の証拠なしに維持されてきた¹⁵。コロニー設立後のクリケットの導入の欠如は、病気の負担の可能性を大幅に減少させた可能性が高い。

混雑を防ぐことは、クリケットの健康を確保するために重要です。野生のG. bimaculatusは孤独であり、男性は攻撃的な展示と戦いを通して彼らの領土を守ります¹⁶.飼育下ケアを成功させるには、コロニー密度を適切な範囲内に保ち、拮抗行動および全体的なストレス反応を減少させることが必要である¹³。これは、コオロギにケージ内の豊富な避難所を提供し、孵化後20日目にコオロギの繁殖ストックを29.3 Lケージあたり150個体に間引くことによって達成されます。この飼育密度は、Sorjonen et ^al.14のG. bimaculatus飼料最適化試験で使用されたものと同じである。あるコンテナから別のコンテナへのクリケットの移動中の特に関連性の考慮事項は、高度の脱出リスクです。二次封じ込め、制御された動き、逃亡者を逮捕するための準備、および警戒は、このプロセス中にクリケットの逃亡を防ぐための重要なツールです。このような措置は、米国農務省によるGryllus sppの指定を反映しています。潜在的な作物害虫としてのクリケットは、米国で飼育するために連邦および州の許可を必要とする¹⁷.

卵子および初期ニンファル段階における環境管理および飼料品質は、 G. bimaculatusを含むすべての飼育下クリケット培養物の健康にとって重要である。生存可能な卵を産むために、雌 のG. bimaculatusは 産卵する湿った基質を必要とする¹⁸。ココナッツコイアは、産卵のための媒体として商業クリケット生産業界で広く使用されています。これらの方法は、ライフサイクルを通してクリケットの産卵と水分補給の両方の基質としてDI水で湿らせたココナッツコイアに依存しています。同様に、幼いケージで湿ったペーパータオルを使用して過剰な水滴を吸収し、出生環境内の湿度勾配を提供することは、ケージの底に死亡した幼いコオロギの有無によって示されるように、脱水または溺死に屈する<生後1週間のコオロギの数を減らすのに非常に有効であることが証明されている。若年栄養は、クリケットの成長パフォーマンスを予測する上で非常に大きな役割を果たすことが知られています。新鮮なフル栄養飼料が<0.01gのコオロギに適した粒径であることを保証することは、若いコオロギが飼料品質の変動の影響をより受けやすいため、より高い生存率につながります¹⁹。

この研究で使用された市販のクリケット飼料は、北米のクリケット農業業界で広く使用されているため、選択されました。まず、3人の商業クリケット農家、2人は米国中西部北部、1人は米国南部との個人的なコミュニケーションから、この飼料(Mazuri)が今日まで食用昆虫産業に広く適用されていることは明らかです。クリケット農家は、望ましい成長性能、繁殖力、発達、および体重増加の指標に適していると感じています。第二に、実験室の設定で多数のクリケットに飼料を投与することを任されている技術者にとって、昆虫の寿命を通して1つの粉末状の予め混合飼料を利用することは便利である。第三に、タンパク質需要はクリケットの発達において重要な要素であることが知られており、G. bimaculatusに対する他の多くの特定の栄養ニーズは完全には理解されていないが、この予め処方された混合物は粗タンパク質の割合を含み、これは報告された最適範囲内の22%〜30%^14,20である。

インキュベーター内のスペースはしばしば限られています。クリケット農場は通常、インキュベーターで早期齢のクリケットを開始し、施設全体のエアハンドリングシステムが温度と湿度を調節する野外環境に成熟したストックを移します。これらの理由から、これらの方法は、そのような配置をより小さなスケールでエミュレートするように設計されている。インキュベーター内で20日後、密度が低下し、クリケットは実験的処置または繁殖ストックとして使用するための周囲条件のいずれかに移される。エアハンドリングシステムが適切に機能する場合、飼育施設の温度は27±1°C、相対湿度は20%~25%と安定している必要があります。クリケットは水と飼料への自由アクセスを許可されています。これらの方法を通じて参照される飼料は、北米のクリケット農家によって広く使用されているMazuri Cricket Feedです。完全な栄養分析については、補足表S1を参照してください。

Donoughe and Extavour (2016)の方法によれば、ココナッツコイアの代わりに、産卵媒体として、またはコイアの上のケーシング材料として、コットンウールを使用して、フラスまたは飼料の粒子が産卵培地¹⁸の表面を汚染するのを防止することができる。彼らは、産卵期間中に綿毛の薄い層を基材の上に置き、産卵が完了したら、蓄積されたフラスとデトリタスとともに除去することを勧めている。卵の生存率またはクリケットの発達に対する基質汚染の影響を測定するデータは入手できないが、ここで概説したプロトコルは、幼いコオロギの生産と成長の両方において満足のいく結果をもたらす。これは、ココナッツコイアの推定される抗菌性に起因する可能性があり、食用昆虫生産²¹の分野における将来の研究の根拠である。

これらの方法が開発されたクリケット飼育施設の温度を調節するユニットの誤動作のために、我々がデータを報告している試験は、これらのプロトコルが指示するよりも2°C低い20%の相対湿度で25°Cで実施された。さらに、これらの狭義の飼料ベースの研究は、繁殖力、内分泌応答、病原体負荷、遺伝子発現などの関心のある特定の測定基準に関するデータの入手が限られているという結果をもたらします。クリケットの繁殖が一貫して豊富な生存可能なクリケットの卵を生産し、若年死亡率がごくわずかであることが観察されると、努力は主に研究課題に直接関連する実験に集中しました。したがって、このレポートは、>10世代にわたるこれらの方法の長期的な成長パフォーマンスへの影響に関する逸話的な説明のみを提供しています。最後に、実験ケージでのコイアや段ボールなどの植物由来の材料の使用は、クリケットによる偶発的な摂取につながる可能性があります。これは、これらの研究のデザイン内では許容できるが、所見が摂取されたバイオマス全体の正確な測定値に依存する研究デザインの有効性を損なう可能性がある。

ここで説明するプロトコルは、基本的かつ徹底的なものであり、市販の標準飼料を与えられた実験室環境でクリケットを実現可能に飼育するための明確でわかりやすい手順を備えています。最適な洗浄、ストッキング密度、および環境制御を備えたこのような標準化された手順を利用することで、均一で健康なクリケットコロニーを長期間維持することができます。さらに、人間の健康に影響を与える農業可能な食用昆虫としての G. bimaculatus の研究の発展に貢献するでしょう。また、昆虫の生理学、成長の最適化、遺伝学の研究にも役立つ可能性があります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid	HOMZ	3430CLBL	Used to house breeding stock
3-tier/12-tray Grow Light Stand	Fischer Scientific	NC1938548
50-gal (189.27L) tote bin with lid	Sterilite	#14796603	Used as secondary containment when handling crickets
50 mL polypropylene graduated cylinder	Fischer Scientific	S95171
7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid	HOMZ	3410CLBL	Used to house exprimental stock
Accuris 500 g x 0.01 g Balance	Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific	W3300-500	Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+"
Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush	Ace Hardware	#1803261
Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle	Fischer Scientific	03-421-160
Bright aluminum window screen	Phifer	UNSPSC# 11162108	Mesh size 18 x 16"
Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids	Wal-Mart	N/A
Deionized water
Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade	Home Depot	#313114935
Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12"	Uline	S-5189
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm	Fischer Scientific	FB0875714
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm	Fischer Scientific	FB0875713A
Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels	Home Depot	#205675843
Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks	Infinity Bond	Infinity IM-Tough-Guy-12
Mazuri Cricket Diet	Land O' Lakes International	SKU#  3002219-105
Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer	Wal-Mart	N/A
Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block	Home Depot	#300679904