Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Обогащенный тромбоцитами плазменный лизат для лечения заболеваний глазной поверхности

Published: August 2, 2022 doi: 10.3791/63772
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3, 1, 1, 1
1Transfusion Medicine Unit, AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, 2Interdepartmental Centre for Regenerative Medicine “Stefano Ferrari”, University of Modena and Reggio Emilia, 3Clinical and Experimental Medicine PhD Program, University of Modena and Reggio Emilia

Summary

Лизаты тромбоцитов представляют собой новое средство для лечения заболеваний глазной поверхности. Здесь мы предлагаем способ приготовления, дозирования, хранения и характеристики лизата тромбоцитов, собранного у доноров тромбоцитов.

Abstract

Различные заболевания глазной поверхности лечатся глазными каплями, полученными из крови. Их применение введено в клиническую практику из-за содержания в них метаболита и фактора роста, что способствует регенерации поверхности глаза. Глазные капли на основе крови могут быть приготовлены из разных источников (например, донорство цельной крови или афереза тромбоцитов), а также с различными протоколами (например, различные разведения и циклы замораживания / оттаивания). Эта изменчивость препятствует стандартизации клинических протоколов и, следовательно, оценке их клинической эффективности. Детализация методологических процедур и обмен ими могут способствовать определению общих руководящих принципов. В последние годы аллогенные продукты распространяются в качестве альтернативы аутологичным методам лечения, поскольку они гарантируют более высокие стандарты эффективности; среди них глазные капли, богатые тромбоцитами лизат плазмы (PRP-L), готовятся с помощью простых производственных процедур. В отделении трансфузионной медицины в AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Италия, PRP-L получают из донорства тромбоцитарного афереза. Этот продукт первоначально разбавляют до 0,3 х 109 тромбоцитов/мл (начиная со средней концентрации 1 х 109 тромбоцитов/мл) в 0,9% NaCl. Разбавленные тромбоциты замораживают/размораживают и, впоследствии, центрифугируют для удаления мусора. Конечный объем расщепляют на 1,45 мл аликвот и хранят при −80 °C. Перед выдачей пациентам глазные капли проверяются на стерильность. Пациенты могут хранить лизаты тромбоцитов при −15 °C в течение 1 месяца. Состав фактора роста также оценивается по случайно выбранным аликвотам, а средние значения сообщаются здесь.

Introduction

Продукты, полученные из крови, широко используются в уходе за ранами1, челюстно-лицевой и ортопедической хирургии, а также для лечения различных заболеваний глазной поверхности2, таких как болезнь сухого глаза (DED)3. При DED гомеостаз слезной пленки нарушается вследствие аномального функционирования различных факторов, участвующих в образовании разрыва и целостности поверхности глаза 4,5.

DED характеризуется неоднородностью причин итяжести 6,7,8 и может быть следствием различных факторов, таких как старение, пол9, контактные линзы, актуальные или системные лекарства10 или ранее существовавшие состояния, такие как синдром Шегрена10. Несмотря на легкие симптомы, DED поражает миллионы людей во всем мире, влияя на качество их жизни и систему здравоохранения, а также6.

Сообщалось о многих методах лечения этой патологии, но до сих пор нет единого мнения о наиболее эффективном решении12. На сегодняшний день искусственные слезы являются первым направлением терапии, направленной на восстановление водного состава слезной пленки, хотя эти заменители не содержат основных биологически активных растворенных веществ природных слез 6,11. Продукты на основе тромбоцитов считаются действительной альтернативой 12,13 искусственным слезам, хотя их клиническая эффективность, рекомендации по применению и методы приготовления все еще являются предметом споров 3.

Продукты на основе крови имеют схожий состав с точки зрения метаболитов14, белков, липидов, витаминов, ионов, факторов роста (ГФ), антиоксидантных соединений11 и осмолярности (300 мОсм/л)11. Благодаря синергетической активности своих компонентов они способствуют регенерации эпителия роговицы, ингибируют высвобождение воспалительных цитокинов, увеличивают количество бокаловидных клеток и экспрессию муцинов в конъюнктиве 2,3.

До сих пор гетерогенность в офтальмологических продуктах на основе крови была задокументирована в литературе; эти продукты могут быть классифицированы в соответствии с происхождением доноров крови, то есть аутологичными или аллогенными, а также источником крови, то есть периферической кровью, пуповинной кровью, сывороткой или тромбоцитами.

Хотя аутологичные продукты были наиболее распространенными3, аллогенные в настоящее время становятся предпочтительным выбором, поскольку они обеспечивают более высокие стандарты эффективности и безопасности15, а также значительное снижение затрат16,17. Предыдущие исследования, действительно, доказали, что продукты на основе крови, полученные от пациентов с аутоиммунными и/или системными заболеваниями, могут демонстрировать измененное качество и функциональность 6,16,17. Несмотря на то, что глазные капли на основе сыворотки являются наиболее распространенными, продукты на основе тромбоцитов в последнее время утверждаются в качестве действительной альтернативы, поскольку их можно легко приготовить, сохраняя при этом значительный уровень эффективности 3,11. Доступные в настоящее время продукты на основе тромбоцитов можно разделить на обогащенную тромбоцитами плазму (PRP), обогащенную тромбоцитами плазменный лизат (PRP-L) и плазму, богатую факторами роста (PRGF)3.

Среди них PRP-L имеет то преимущество, что является замороженным продуктом с длительным сроком службы. PRP-L может быть получен из афереза, баффи-шерсти или даже из истекающих тромбоцитов (PLTs)18,19, что значительно снижает их потери. Аликвоты могут храниться в течение нескольких месяцев в центрах переливания крови при -80 ° C или даже в домах пациентов при -15 ° C в течение более коротких периодов времени.

PRP-L сильно обогащены ГФ, которые, как было доказано, стимулируют регенерацию поверхности глаза 12,20,21. Тем не менее, есть только несколько сообщений о клинических исследованиях в этой области, и все они использовали аутологичные источники 3,22. PRP-L по-прежнему нуждается в дальнейшей валидации и характеристике, прежде чем его можно будет регулярно использовать для лечения заболеваний глазной поверхности, поскольку нет стандартизированных руководящих принципов для его приготовления, дозирования и хранения3.

Здесь используется подробный протокол для производства PRP-L, используемого в отделении трансфузионной медицины в AUSL-IRCCS di Reggio Emilia, Италия, и диспенсации пациентам с DED. Мы стремимся помочь научному сообществу разработать стандартные методы приготовления, которые могут повысить однородность и согласованность во всемирных исследованиях и клинических подходах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PRP-L, используемый для количественной оценки факторов роста, был собран в рамках более широкого исследования по характеристике продуктов PRP для регенеративных целей, проведенного в AUSL-IRCCS di Reggio Emilia и одобренного Этическим комитетом Area Vasta Emilia Nord 10 января 2019 года (протокол No 2019/0003319). Доноры дали свое информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией. Для сбора агрегированных анонимных данных индекса глазных поверхностных заболеваний (OSDI) не требовалось никакого этического одобрения, который обычно используется клиницистами для мониторинга симптомов синдрома сухого глаза. На рисунке 1A показан контур используемого протокола, в то время как на рисунках на рисунке 1B показаны основные этапы процедуры.

1. Коллекция обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP)

  1. PRP аферез
    1. Для этого протокола выбирают доноров тромбоцитов согласно итальянским законам: донорам тромбоцитов должно быть 18-65 лет, с нормальным давлением и показателями анализа крови и количеством тромбоцитов не менее 180 х 109 тромбоцитов/л23. Правомочные доноры не могут принимать антиагрегантные или антикоагулянтные препараты в течение 1 недели до донорства.
    2. Выполняют плазмо-тромбоцитарный аферез с использованием автоматизированной системы забора крови, в соответствии с инструкциями производителей и национальным законодательством23, для получения 1 единицы однодонорской плазмы, богатой тромбоцитами (PRP). Собирают PRP в растворе антикоагулянта аденина цитрата декстрозы А (ACD-A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тромбоцитарный аферез проводится с непрерывной процедурой; время сбора находится в диапазоне от 40 мин до 90 мин. Количество ACD, доставленного донорам, и время процедур зависят от характеристик донора, например, гематокрита и иглы.
  2. Характеристики блоков PRP
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий этап обычно выполняется автоматически автоматизированной системой сбора крови во время процедуры плазма-тромбоцит-аферез. Пожалуйста, ознакомьтесь с инструкцией производителя.
    1. Повторно суспендировать собранные аферезом блоки PRP в достаточном количестве консервирующего раствора с минимальным количеством остаточной плазмы, необходимой для поддержания рН > 6,4 в течение всего времени хранения, до среднего конечного объема 180 мл нетто раствора антикоагулянта (около 40 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно итальянскому законодательству, контроль качества должен оценивать, что количество тромбоцитов (PLT) составляет не менее 2,0 х 1011 PLT / единица, в то время как остаточные лейкоциты должны быть менее 1 х 106 клеток / единица.
    2. Храните лейкодерный и облученный PRP в течение максимум 5 дней при температуре 22 °C ± 2 °C на тромбоцитарном шейкере перед дальнейшими манипуляциями23.
  3. Разбавление PRP
    1. Непосредственно перед началом разведения PRP выполните подсчет PLT с помощью гемоцитометра, используя образец, собранный из основного мешка через пронзительный шип.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги по стерильности под капотом биологической опасности класса II. Носите средства индивидуальной защиты (лабораторное пальто, перчатки и защитные очки) во время процедуры.
    2. Разбавляют PRP достаточным количеством стерильного 0,9% NaCl до конечной концентрации 0,32 х 109 ± 0,03 х 109 PLTs/мл, что имитирует среднюю концентрацию PLT в периферической крови.
    3. Используя колющий шип для мешков с кровью, разделите разбавленный PRP на пустые мешки для сбора по 300 мл, чтобы достичь чистого объема 190 мл / мешок.
    4. Используйте аликвоту остаточного разбавленного PRP (обычно 1 мл) для проведения контроля качества, оценивая возможные микробные загрязнения. Выполните анализ стерильности в соответствии с инструкциями производителя в микробиологической лаборатории (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используют культуральные флаконы, специфичные для аэробных культур крови, которые способны выполнять качественную культивацию и восстановление аэробных микроорганизмов (в основном бактерий и дрожжей) из небольших объемов образцов крови.
    5. Храните разбавленные мешки PRP при температуре −80 °C в течение максимум 2 месяцев перед размораживанием.

2. Препарат лизата плазмы, богатого тромбоцитами (PRP-L)

  1. Таяние
    1. Перед началом процедуры оттаивания убедитесь, что теплая ванна установлена при температуре 37 °C. Положите мешки PRP в теплую ванну и подождите, пока полностью не разморозитесь.
  2. Коллекция PRP-L
    1. Центрифугируйте мешки PRP по 3000 х г в течение 30 мин при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги должны быть выполнены в стерильности под капюшоном биологической опасности класса II.
    2. Используя пронзительный шип трансферного мешка, соедините центрифугированный мешок с пустым стерильным мешком для переноса 300 мл. Осторожно перенесите супернатант PRP-L, избегая мусора, в новый мешок. По возможности используйте пресс для пакетов.
    3. Запечатайте соединительную трубку блока PRP-L с помощью запайщика мешков.
  3. Аликвотация PRP-L
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пусковой блок, содержащий 190 мл PRP (см. шаг 1.3.3.), достаточен для заполнения двух наборов глазных капель (подробную информацию о конкретных медицинских устройствах, используемых для применения и сохранения глазных капель из компонентов крови, см. в Таблице материалов). Наборы глазных капель должны открываться под капюшоном класса II, при этом все пузырьки струны расположены над предварительно соединенным шприцем, а центральная стрелка запорного крана направлена влево, чтобы исключить антибактериальный фильтр.
    1. Соберите 30-60 мл PRP-L стерильным шприцем и свяжите шприц с соединением Luer/lock на линии розлива.
    2. Согласно инструкции производителя, поверните запорный кран на половину оборота, чтобы открыть линию между PRP-L-содержащим шприцем и предварительно соединенным шприцем. Заполните предварительно подключенный шприц PRP-L.
    3. Отсоедините шприц PRP-L, закройте крышку трубки соединения luer/lock и поверните запорный кран в исходное положение. Используйте шприц для набора глазных капель, чтобы заполнить флаконы PRP-L.
    4. Повторите процедуру, описанную в шагах 2.3.1.-2.3.3. до тех пор, пока не будут заполнены все флаконы аппликатора. Убедитесь, что каждый аппликатор правильно заполнен, а затем индивидуально запечатайте их с помощью запайщика пакетов.
    5. Повторите процедуру с новым набором глазных капель.
    6. Используйте небольшую аликвоту остаточной разбавленной PRP-L для оценки возможного микробного загрязнения (см. этап 1.3.4.).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если жидкость случайно попадает в антибактериальный фильтр на конце струны, всасывающий шприц может противостоять сопротивлению, препятствуя наполнению. Чтобы продолжить цикл заполнения, поднимите конец струны примерно на 5/6 аликвот от антибактериального гидрофобного фильтра на конце струны. В таком положении используйте новый стерильный шприц (объемом 30 мл), который уже заполнен воздухом. Подключите женский люер/замок антибактериального фильтра и нажмите сильно и многократно на плунжер шприца, чтобы удалить все остатки компонента крови и сделать мембрану антибактериального фильтра свободной от жидкости. Снимите шприц и заполните оставшиеся флаконы.
  4. Хранение PRP-L
    1. Правильно маркируйте каждый аппликатор и положите их в полиэтиленовый пакет. Также пометьте пластиковый пакет, позаботившись о том, чтобы подчеркнуть группу крови донора.
    2. Хранить при температуре −80 °C в течение максимум 24 месяцев до назначения пациента, в соответствии с итальянским законом23 и руководящими принципами24.

3. Диспенсация PRP-L

  1. Выполнять назначение пациенту предпочтительно путем сопоставления группы крови PRP-L. Доставьте флаконы с аппликатором PRP-L, используя холодную коробку, и убедитесь, что каждый флакон аппликатора содержит 1,45 мл PRP-L, что соответствует примерно 45 каплям. Проинструктируйте пациента о том, что флаконы-аппликаторы могут храниться на дому у пациентов до 1 месяца при температуре −15 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Обоснование использования глазных капель сывороточного происхождения (которые являются продуктом на основе крови, наиболее часто используемым для лечения заболеваний поверхности глаза) заключается в содержании в них ГФ, которые почти полностью получены из циркулирующих тромбоцитов. PRP содержит значительно большее количество тромбоцитов (и, следовательно, ГФ, полученных из тромбоцитов) по сравнению с сывороткой периферической крови, в диапазоне от 0,15 х 10до 9-0,45 х 109 PLT / мл. Согласно итальянским законам, количество тромбоцитов в единицах PRP должно составлять не менее 0,9 x 109-1 x 109 PLT/мл. Поэтому для получения продукта, имитирующего эффективность сывороточных глазных капель, PRP следует разбавить до физиологического содержания тромбоцитов перед препаратом лизата.

Тем не менее, поскольку восстановление тканей в основном обусловлено ГФ, полученными из тромбоцитов, один только подсчет PLT может вводить в заблуждение для эффективной терапии заболеваний глазной поверхности. При DED, который является заболеванием глаз, наиболее часто лечащимся глазными каплями, полученными из крови, нарушается производство слезной пленки и гомеостаз. Продукты на основе тромбоцитов для лечения DED, следовательно, также должны имитировать физиологическое содержание слез.

Определить наиболее подходящий PRP-L для лечения заболеваний глазной поверхности, описанный на этапе 1.3.2. настоящего протокола мы предварительно оценили различные разведения PRP в соответствии с их содержанием PLT (от 0,7 x 109/мл до 0,3 x 109/мл) и некоторые репрезентативные ГФ из тех, которые, как известно, участвуют в восстановлении тканей глаза 12,20,21.

Подсчет тромбоцитов проводили с помощью гемоцитометра, в то время как ГФ оценивали с помощью мультиплексного количественного анализа белка. Анализ проводили так, какописано ранее 25 в соответствии с инструкциями производителя. ГФ, показанные в этой рукописи, были отобраны для количественной оценки после предварительного скрининга 36 ГФ и ГФР, выполненного на лизате PRP с полуколичественным белковым массивом. Количественная оценка Luminex была выполнена на 3 из 36 просеянных ГФ: EGF и PDGF (которые оказались наиболее распространенными в наших лизатах PRP) и изоформах TGFβ-1,2,3 (для которых содержание важно для обработки поверхности глаза21). Содержание EGF и PDGF измеряли, поскольку они могут влиять на эффективность PRP-L22, в то время как изоформы TGFβ были выбраны для их известной роли в иммунной сигнальной регуализации21.

Поскольку белковые массивы являются частью другого исследования in vitro по характеристике различных PRP26, эти данные не представлены в этой рукописи.

Мы количественно оценили EGF, PDGF и TGFβ в лизатах PRP от двух разных доноров (D1 и D2), ранее разбавленных между 0,7 x 10 9-0,3 x 109 PLT/мл в 0,9% NaCl. На рисунке 2 показаны результаты разбавления 0,3 х 109 PLT/мл, которое оказалось наиболее похожим на слезный состав.

Разбавление 0,3 х 109 PLT/мл было выбрано на основе литературных данных о составе слез. Было обнаружено, что значения EGF довольно низки по сравнению со средним значением разрыва, но все еще находятся в диапазоне нормальности27. Даже PDGF, несмотря на то, что он сильно варьировался между двумя рассмотренными донорами, всегда был сопоставим с концентрацией, обнаруженной в нормальных слезах20. Наконец, было обнаружено, что TGFβ-1 является наиболее распространенной изоформой в PRP-L, аналогичной слезам21.

После того, как было определено наиболее подходящее разведение PLT для приготовления афереза PRP-L, отделение трансфузионной медицины начало распространять эти продукты среди пациентов, страдающих заболеваниями поверхности глаза в 2015 году. Офтальмологи регулярно собирали анкеты OSDI для мониторинга симптомов DED; тест OSDI оценивает показатели качества жизни, такие как восприятие глазного раздражения и то, как оно влияет на функционирование, связанное со зрением. Анкета, созданная Исследовательской группой по результатам в Allergan Inc. в 1995 году и в настоящее время принятая в качестве действительного инструмента для мониторинга DED, представляется пациентам и анализируется, какописано ранее 28,29.

Здесь мы показываем совокупные результаты osDI-тестов пациентов с DED, получавших лечение в период с января 2020 года по январь 2021 года (n = 27). После 6-месячной терапии PRP-L показатели OSDI снизились с 56 ± 21 до 45 ± 21, что указывает на улучшение качества жизни пациентов (рисунок 3).

Несмотря на то, что эти данные все еще находятся в тяжелом диапазоне и не относятся к клиническим исходам эффективности, они предполагают, что пациенты с DED считают PRP-L полезным продуктом, который улучшает глазной дискомфорт; этот аспект должен быть дополнительно исследован в проспективных клинических испытаниях, направленных на оценку его эффективности в лечении заболеваний глазной поверхности.

В таблице 1 приведено сравнение настоящего способа получения с другим способом получения аллогенного PRP-L для глазных капель30 и для других целей22. Насколько нам известно, протоколЧжана 30 и текущий протокол являются единственными опубликованными методами получения PRP-L для поверхности глаза. В обоих случаях PRP-L получают из афереза; различия между этими двумя протоколами, главным образом касающиеся числа циклов замораживания и оттаивания и стадий центрифугирования, следует сопоставить, с тем чтобы улучшить производство PRP-L. Тем не менее, не было доказано, что эти методологические различия наносят ущерб регенеративной способности PRP-L, протестированной на других тканях22.

Figure 1
Рисунок 1: Основные этапы протокола по подготовке PRP-L. (A) Схема протокола, от сбора PRP до подготовки и дозирования PRP-L. B) репрезентативные фотографии основных этапов протоколов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Количественная оценка Luminex тромбоцитарных факторов роста для разбавления 0,3 x 109/мл PRP-L. (A) эпидермального фактора роста (EGF); (B) тромбоцитарный фактор роста (PDGF); (C) трансформирующая фактор роста бета-изоформа 1 (TGFβ1); (D) трансформация фактора роста-бета-изоформы 2 (TGFβ2); (E) трансформирующий фактор роста - бета-изоформа 3 (TGFβ3). Значения выражаются в виде пг/мл, среднего ± стандартного отклонения трех независимых измерений. D1 и D2 являются двумя разными донорами тромбоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Совокупные баллы OSDI пациентов с DED, получавших PRP-L в период с января 2020 года по январь 2021 года в офтальмологическом отделении AUSL-IRCCS di Reggio Emilia. N = 27 пациентов. Агрегированные результаты оценки OSDI представлены как среднее ± стандартной погрешности, p-значение было рассчитано с помощью парного t-теста с программным обеспечением для анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Эта статья PRP-L для глаз (исследование in vitro )29 ОТР-Л для других целей21
Источник АФЕРЕЗ PLTs АФЕРЕЗ PLTs Аферез и цельная кровь
Циклы замораживания и оттаивания 1 (при -80 °C) 2 (при -80 °C) 1-3 (при -20 °C и -80 °C)
Температура хранения при -80 °C при -80 °C при -20 °C и -80 °C
Скорость центрифугирования перед хранением 3000 x г/30 мин 3500 x г/30 мин 400-3000 x г/6 мин -30 мин
Фильтрация перед хранением Нет Да Нет/Да

Таблица 1: Сравнение протоколов получения аллогенного PRP-L из продуктов на основе тромбоцитов, собранных методом афереза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В последние годы увеличилось клиническое применение препаратов на основе тромбоцитов при патологиях глазной поверхности, но их диффузии препятствует отсутствие научной достоверности. Это в основном вызвано широкой неоднородностью донорских источников и протоколов подготовки, которые часто не полностью раскрываются или специально не предназначены для целей, для которых они распределяются. В частности, информация о продуктах на основе тромбоцитов, собранных методом афереза, по-прежнему отсутствует. Поэтому целью настоящей работы было описание поэтапной обработки богатых тромбоцитами лизатов плазмы (PRP-L), полученных методом афереза для лечения DED.

PRP-L является оптимальным источником для производства глазных капель, поскольку он содержит больше ГФ, чем другие продукты на основе крови22, и, по сравнению с сывороткой или PRP, его производство или хранение являются недорогими и простыми. Для получения PRP-L тромбоциты подвергают лизису (обычно через один или несколько циклов замораживания и оттаивания) для высвобождения их содержимого. Этот процесс гарантирует раствор, обогащенный активными молекулами, которые стимулируют регенерациютканей 22,26. Все большее число заболеваний лечится PRP-L22, но показания к применению в офтальмологии все еще слабы из-за низких критериев стандартизации в сборе тромбоцитов и производстве PRP-L 3,22.

Следует отдавать предпочтение аллогичным препаратам на основе тромбоцитов, поскольку они более стандартизированы, чем аутологичные, как с точки зрения донорских характеристик, так и способа приготовления. Состояние здоровья пациента может влиять на качество продукта 6,16,17, в то время как собственные наборы для сбора аутологичных тромбоцитов из цельной крови, когда услуги по переливанию напрямую недоступны, не соответствуют стандартному качеству, требуемому в переливающем лекарстве31.

Насколько нам известно, нет клинических исследований, характеризующих использование аллогенного PRP-L в офтальмологии3, в то время как есть несколько сообщений об аутологичных глазных каплях PRP-L 3 и только одно исследование с использованиемаллогенного PRP-L, полученного из пуповинной крови, для лечения пациентов с заболеваниями глазной поверхности32. Хотя аллогенный PRP-L указан в клинических рекомендациях24 и его использование было предложено 3,30, все еще нет доказательств его эффективности по сравнению с другими методами лечения и другими продуктами на основе крови (например, сывороткой). Представленный протокол призван помочь научному сообществу разработать общие методы производства и пролить свет на методологические различия.

Здесь мы описали производство PRP-L, начиная с аллогенного PRP, собранного путем афереза. Аллогенные продукты на основе тромбоцитов для получения лизатов тромбоцитов также могут быть собраны из баффи-шерсти (BC), и оба источника были одинаково сообщены31. БК получают от объединенных доноров (обычно четырех или пяти), что сводит к минимуму межиндивидуальные различия. И наоборот, объединение увеличивает риск передачи инфекционных агентов или прионов или стимуляцииаллогенного ответа 31,33. Аферез является сложной и инвазивной процедурой, и только меньшинство доноров имеют право или соответствуютей 34. Тем не менее, продукты на основе тромбоцитов, полученные путем афереза, свободны от других остаточных циркулирующих клеток крови и содержат большее количество PLT35. По этим причинам текущая работа сосредоточена на разработке клинических исследований для сравнения PRP-L из этих двух разных источников.

В этом протоколе начальная концентрация PLT в единицах PRP, собранных методом афереза, составляла в среднем 1 х 109/мл, что согласуется с сообщенными концентрациями для других продуктов на основе тромбоцитов22. В этом методе PLT разбавляют после этого 0,9% раствором NaCl до 0,3 х 109/мл. Другие протоколы сообщают об использовании плазмы для разведения22.

В немногих исследованиях сообщалось об использовании PRP-L в офтальмологии; в этих случаях аутологичные глазные капли готовили в концентрациях PLT в диапазоне от 0,5 х 109/мл-1 х 109/мл 36,37,38. Как обсуждалось ранее, маркеры стандартизации являются желательными и также помогут определить правильное разбавление. Здесь, например, мы сообщаем о концентрации некоторых ключевых ГФ в PRP-L. Содержание EGF и PDGF влияет на эффективность PRP-L22, в то время как изоформы TGFβ участвуют в регуляции иммунной сигнализации 21,39, и их концентрация точно регулируется. Таким образом, концентрация TGFβ в глазных каплях на основе тромбоцитов может влиять не только на эффективность, но и вызывать потенциальные пагубные эффекты39; таким образом, его следует тщательно изучить, прежде чем определять правильное разбавление. Тем не менее, выбранное разбавление - 0,3 х 109 PLT/мл - было основано на содержании ГФ в слезах21,25. Zhang et al. ранее сравнивали глазные капли на основе сыворотки, как аутологичные, так и аллогенные, и лизаты на основе тромбоцитов для их содержания в ГФ и для их способности способствовать регенерации клеток роговицы in vitro30. Исследование показало, что эти продукты имеют сопоставимые характеристики, причем PRP-L имеет более высокую концентрацию EGF, но более низкую фибронектин. В их протоколе процесс замораживания/оттаивания повторяли дважды, центрифугу выполняли при 3500 х г в течение 30 мин, а лизат тромбоцитов хранили при -80 °C30.

Замораживание и оттаивание действительно является критически важным шагом; большинство протоколов (включая этот) были разработаны с замораживанием -80 ° C и оттаиванием 37 ° C, но замораживание также сообщалось при -24 ° C, -196 ° C и -150 ° C22,33 Даже количество выполненных циклов замораживания / оттаивания варьируется в диапазоне от 1 до 522,33. В ограниченном числе исследований также сообщалось о обработке ультразвуком или растворителем/моющим средством для получения лизатов тромбоцитов22,33. Другие методологические переменные, о которых сообщалось ранее при подготовке PRP-L, касаются стадии центрифугирования - между 300 х г и 10000 х г, от 2 мин до 60 мин - и длительного хранения, которое в большинстве случаев составляет при -80 °C, хотя аналогичные продукты также непосредственно хранились при -20 °C22. Условия хранения, в частности, должны тщательно контролироваться, поскольку они могут повлиять на наличие и активность ГФ, содержащихся в лизатах. В этом весьма неоднородном контексте следует срочно оценить контроль качества и клинические исследования с учетом высвобождения биогенных факторов и различий в терапевтическом эффекте.

Наконец, здесь мы показываем, как этот метод был достоверно оценен с положительным результатом из совокупного анализа пациентов с болезнью сухого глаза, получавших PRP-L в течение 6 месяцев (опросник OSDI3). Несмотря на многообещающие перспективы, одного OSDI недостаточно для определения эффективности PRP-L в лечении DED и других заболеваний глазной поверхности, и клинические исследования по использованию аллогенного PRP-L оправданы. Кроме того, для оптимизации методологической процедуры следует сравнивать возможные различия в составе продукта, обусловленные альтернативными методологическими этапами (т.е. замораживание и оттаивание, центрифугирование, хранение).

В заключение, высокая гетерогенность источников крови и протоколов по-прежнему препятствует окончательному переводу продуктов на основе крови для клинического лечения заболеваний глазной поверхности. Хотя PRP-L является новым продуктом с некоторыми преимуществами, необходимы дальнейшие исследования для подтверждения его использования и разработки общих руководящих принципов. Совместное использование и детализация протокола подготовки может расширить удобство использования и пролить свет на критические шаги.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить "Casa del Dono di Reggio Emilia" за предоставление концентратов тромбоцитов донорского происхождения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipments
CompoSeal Mobilea II Fresenius Kabi, Germany bag sealer
HeraSafe hood Heraeus Instruments, Germany Class II biohazard hood
MCS+ 9000 Mobile Platelet Collection System Haemonetics, Italy automated plasma and multicomponent collection equipment for donating platelet, red cell, plasma, or combination blood components
Platelet shaker, PF396i Helmer, USA Platelet shaker
Raycell X-ray Blood Irradiator MDS Nordion, Canada X-ray Blood Irradiator
ROTIXA 50RS Hettich Zentrifugen, Germany High speed entrifuge
Sysmex XS-1000i Sysmex Europe GMBH, Germany haemocytometer for platelet count
Warm bath, WB-M15 Falc Instruments, Italy Warm bath
Materials
ACD-A anticoagulant solution A Fenwal Inc., USA DIN 00788139 anticoagulant solution for platelet apheresis (1000 ml)
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials BD Biosciences, USA BD 442020 Sterility assay
BD BACTEC Peds Plus/F Culture vials BD Biosciences, USA 442020 At least 2 vials for sterility assay
BD Luer Lok Syringe BD Plastipack, USA 300865 At least 4 sterile syringes (50 ml)
Bio-Plex Human Cancer Panel 1 BioRad Laboratories, USA 171AC500M Standard panel for PDGF isoforms assessment
Bio-Plex Human Cancer Panel 2 BioRad Laboratories, USA 171AC600M Standard panel for EGF assessment
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader BioRad Laboratories, USA Magpix This instrument allows multiple immunoassays using functionalized magnetic beads.
Bio-Plex Pro TGF-b Assay BioRad Laboratories, USA 10024984 Set and standards for TGFb isoforms assessment
BioRet ARIES s.r.l., Italy A2DH0020 At least 4 piercing spike for blood bags
Blood collection tube BD Vacutainer, USA 367835 1 tube, necessary to perform platelet counts
Eye drops kit. COL Medical Device for the application and preservation of eye drops from haemocomponents Biomed Device s.r.l., Italy COLC50 Eye drops kit. At least 2 kits for each PRP unit collected
Human Cancer PDGF-AB/BB Set 1x96well BioRad Laboratories, USA 171BC511 Set for PDGF isoforms assessment
Human Cancer2 EGF Set 1x96well BioRad Laboratories, USA 171BC603M Set for EGF assessment
NaCl 0.9% sterile solution Baxter S.p.A., Italy B05BB01 1000 ml
OSDI Questionnaire Allergan Inc., USA OSDI Ocular Surface Disease Index Questionnaire
Piercing spike BioRet ARIES s.r.l., Italy BS051004 Spike
Platelet Additive Solution A+ T-PAS+ TERUMO BCT Inc., Italy 40842 preservative solution for platelet concentrates (1000 ml)
Software Excel Microsoft, USA Excel Data analysis software
Teruflex Transfer bag 1000 ml TERUMO BCT Inc., Italy BB*T100BM 1 for PRP dilution
Teruflex Transfer bag 300 ml TERUMO BCT Inc., Italy BB*030CM At least 6 for each PRP unit collected

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Everts, P. A., et al. Platelet-rich plasma and platelet gel: A review. The Journal of Extra-Corporeal Technology. 38 (2), 174 (2006).
  2. Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
  3. Bernabei, F., et al. Blood-based treatments for severe dry eye disease: The need of a consensus. Journal of Clinical Medicine. 8 (9), 1478 (2019).
  4. Findlay, Q., Reid, K. Dry eye disease: When to treat and when to refer. Australian Prescriber. 41 (5), 160-163 (2018).
  5. Clayton, J. A. Dry eye. New England Journal of Medicine. 378 (23), 2212-2223 (2018).
  6. Jones, L., et al. TFOS DEWS II management and therapy report. The Ocular Surface. 15 (3), 575-628 (2017).
  7. Holland, E. J., Darvish, M., Nichols, K. K., Jones, L., Karpecki, P. M. Efficacy of topical ophthalmic drugs in the treatment of dry eye disease: A systematic literature review. The Ocular Surface. 17 (3), 412-423 (2019).
  8. Shih, K. C., Lun, C. N., Jhanji, V., Thong, B. Y. H., Tong, L. Systematic review of randomized controlled trials in the treatment of dry eye disease in Sjogren syndrome. Journal of Inflammation. 14, 26 (2017).
  9. Rusciano, D., et al. Age-related dry eye lactoferrin and lactobionic acid. Ophthalmic Research. 60 (2), 94-99 (2018).
  10. Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. The Ocular Surface. 15 (3), 276-283 (2017).
  11. Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. Reflections on dry eye syndrome treatment: Therapeutic role of blood products. Frontiers in Medicine. 5, 33 (2018).
  12. Giannaccare, G., et al. Blood derived eye drops for the treatment of cornea and ocular surface diseases. Transfusion and Apheresis Science. 56 (4), 595-604 (2017).
  13. Acebes-Huerta, A., et al. Platelet-derived bio-products: Classification update, applications, concerns and new perspectives. Transfusion and Apheresis Science. 59 (1), 102716 (2020).
  14. Quartieri, E., et al. Metabolomics comparison of cord and peripheral blood-derived serum eye drops for the treatment of dry eye disease. Transfusion and Apheresis Science. 60 (4), 103155 (2021).
  15. Badami, K. G., McKellar, M. Allogeneic serum eye drops: Time these became the norm. British Journal of Ophthalmology. 96 (8), 1151-1152 (2012).
  16. Hwang, J., et al. Comparison of clinical efficacies of autologous serum eye drops in patients with primary and secondary Sjögren syndrome. Cornea. 33 (7), 663-667 (2014).
  17. Chiang, C. C., Lin, J. M., Chen, W. L., Tsai, Y. Y. Allogeneic serum eye drops for the treatment of severe dry eye in patients with chronic graft-versus-host disease. Cornea. 26 (7), 861-863 (2007).
  18. Jonsdottir-Buch, S. M., Lieder, R., Sigurjonsson, O. E. Platelet lysates produced from expired platelet concentrates support growth and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 8 (7), 68984 (2013).
  19. Altaie, A., Owston, H., Jones, E. Use of platelet lysate for bone regeneration - Are we ready for clinical translation. World Journal of Stem Cells. 8 (2), 47-55 (2016).
  20. Vesaluoma, M., Teppo, A. M., Grönhagen-Riska, C., Tervo, T. Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) in tear fluid: A potential modulator of corneal wound healing following photorefractive keratectomy. Current Eye Research. 16 (8), 825-831 (1997).
  21. Zheng, X., et al. Evaluation of the transforming growth factor β activity in normal and dry eye human tears by CCL-185 cell bioassay. Cornea. 29 (9), 1048 (2010).
  22. Zamani, M., et al. Novel therapeutic approaches in utilizing platelet lysate in regenerative medicine: Are we ready for clinical use. Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17172-17186 (2019).
  23. Ministro della Salute. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli emocomponenti. Italian Ministry of Health. , DECRETO 2 Novembre 2015 (2015).
  24. Aprili, G., et al. Raccomandazioni SIMTI sugli emocomponenti per uso non trasfusionale. Società Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia. , (2012).
  25. Schiroli, D., et al. Comparison of two alternative procedures to obtain packed red blood cells for β-thalassemia major transfusion therapy. Biomolecules. 11 (11), 1638 (2021).
  26. Pulcini, S., et al. Apheresis platelet rich-plasma for regenerative medicine: An in vitro study on osteogenic potential. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8764 (2021).
  27. Ohashi, Y., et al. Presence of epidermal growth factor in human tears. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (8), 1879-1882 (1989).
  28. Vitale, S., Goodman, L. A., Reed, G. F., Smith, J. A. Comparison of the NEI-VFQ and OSDI questionnaires in patients with Sjögren's syndrome-related dry eye. Health Quality of Life Outcomes. 2, 44 (2004).
  29. Schiffman, R. M., Christianson, M. D., Jacobsen, G., Hirsch, J. D., Reis, B. L. Reliability and validity of the Ocular Surface Disease Index. Archives of Ophthalmology. 118 (5), 615-621 (2000).
  30. Zhang, J., et al. Characteristics of platelet lysate compared to autologous and allogeneic serum eye drops. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), 24 (2020).
  31. Henschler, R., Gabriel, C., Schallmoser, K., Burnouf, T., Koh, M. B. Human platelet lysate current standards and future developments. Transfusion. 59 (4), 1407-1413 (2019).
  32. Samarkanova, D., et al. Clinical evaluation of allogeneic eye drops from cord blood platelet lysate. Blood Transfusion. 19 (4), 347-356 (2021).
  33. Strunk, D., et al. International Forum on GMP-grade human platelet lysate for cell propagation: Summary. Vox Sanguinis. 113 (1), 80-87 (2018).
  34. Schiroli, D., et al. The impact of COVID-19 outbreak on the Transfusion Medicine Unit of a Northern Italy Hospital and Cancer Centre. Vox Sanguinis. 117 (2), 235-242 (2021).
  35. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: An in vitro study. International Journal of Molecular Science. 19 (1), 212 (2018).
  36. Fea, A. M., et al. The effect of autologous platelet lysate eye drops: An in vivo confocal microscopy study. BioMed Research International. 2016, 8406832 (2016).
  37. Abu-Ameerh, M. A., et al. Platelet lysate promotes re-epithelialization of persistent epithelial defects: A pilot study. International Ophthalmology. 39 (7), 1483-1490 (2019).
  38. Geremicca, W., Fonte, C., Vecchio, S. Blood components for topical use in tissue regeneration: evaluation of corneal lesions treated with platelet lysate and considerations on repair mechanisms. Blood Transfusion. 8 (2), 107-112 (2010).
  39. De Paiva, C. S., et al. Disruption of TGF-β signaling improves ocular surface epithelial disease in experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca. PLoS One. 6 (12), 29017 (2011).

Tags

Медицина выпуск 186
Обогащенный тромбоцитами плазменный лизат для лечения заболеваний глазной поверхности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Merolle, L., Iotti, B., Berni, P.,… More

Merolle, L., Iotti, B., Berni, P., Bedeschi, E., Boito, K., Maurizi, E., Gavioli, G., Razzoli, A., Baricchi, R., Marraccini, C., Schiroli, D. Platelet-Rich Plasma Lysate for Treatment of Eye Surface Diseases. J. Vis. Exp. (186), e63772, doi:10.3791/63772 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter