Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Экстракция небелковых аминокислот из цианобактерий для жидкостной хроматографии-тандемного масс-спектрометрического анализа

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/63779
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Hyphenated Mass Spectrometry Laboratory (HyMaS), University of Technology Sydney, 2School of Life Sciences, University of Technology Sydney

Summary

Настоящий протокол описывает экстракцию небелковых аминокислот из биологических матриц посредством осаждения белка трихлоруксусной кислотой (ТЦА) и кислотного гидролиза перед анализом с использованием жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии.

Abstract

Небелковые аминокислоты (NPAA) представляют собой большой класс аминокислот (AAs), которые генетически не кодируются для трансляции в белки. Анализ NPAA может предоставить важную информацию о поглощении и/или функции клеток, метаболических путях и потенциальной токсичности. β-метиламино-L-аланин (BMAA) является нейротоксичным NPAA, продуцируемым различными видами водорослей и связанным с повышенным риском нейродегенеративных заболеваний, что привело к значительному исследовательскому интересу. Существует множество способов извлечения АА для анализа, причем жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия является наиболее распространенной, требующей осаждения белка с последующим кислотным гидролизом белковой гранулы. Исследования присутствия BMAA у видов водорослей дают противоречивые результаты, при этом основной причиной является использование непроверенной пробоподготовки/экстракции и анализа. Как и большинство НПДА, осаждение белка в 10% водном ТЦА и гидролиз с дымящимся HCl является наиболее подходящей формой экстракции для BMAA и его изомеров аминоэтилглицина (AEG) и 2,4-диаминомасляной кислоты (2,4-DAB). Настоящий протокол описывает этапы валидированного метода экстракции NPAA, обычно используемого в исследовательских и учебных лабораториях.

Introduction

Аминокислоты представляют собой химические соединения, которые содержат, по меньшей мере, один амин и карбоновую функциональную группу. Некоторые аминокислоты также содержат иминогруппу, функциональную кислотную группу, отличную от карбоновой; другие аминокислоты имеют аминные группы, которые не присоединены к α-углеродной группе1. Существует более 500 аминокислот2, 22 из которых известны как белковые аминокислоты, используемые для генетического кодирования в синтезе рибосомного белка3. Эти 22 аминокислоты могут быть далее подразделены на незаменимые и несущественные. Незаменимые аминокислоты необходимы для правильного функционирования организма и могут быть приобретены только внешними источниками. Заменимые аминокислоты могут синтезироваться в организме. Классификация 22 аминокислот на незаменимые / несущественные является уникальной для отдельных видов. Все остальные аминокислоты являются небелковыми аминокислотами (НПДА), которые не кодируются для синтеза белка. Аминокислоты, будь то белковые или небелковые, также могут играть сигнальную роль в организме и выступать в качестве метаболических посредников4. Из-за их важных и различных ролей, уровни аминокислот могут дать представление о состоянии организма, функциональности и метаболических путях и т. Д. Существует два основных механизма, с помощью которых аминокислоты могут быть включены в полипептидную цепь: синтез рибосомного белка, который использует 22 аминокислоты в кодировании, и синтез нерибосомных пептидов, который, наряду с белковыми аминокислотами, позволяет использовать некоторые НПДА в синтезе. Некоторые NPAA могут имитировать белковые аминокислоты, что потенциально приводит к их неправильному включению в пептиды и белки. Неправильная инкорпорация вызывает неправильное сворачивание белков, что, в свою очередь, оказывает пагубное воздействие5, такое как неправильное включение NPAA L-3,4 дигидроксифенилаланина (L-DOPA) вместо тирозина, негативно влияя на клеточную функцию и здоровье 6,7. Дополнительным источником инкорпорированных НПДА является посттрансляционная модификация (ПТМ) аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки модифицируются по различным причинам, включая изменения пептидной или белковой конформации, стабильности и функциональности. При гидролизе ПТМ-содержащего белка или пептидов эти модифицированные аминокислотные остатки высвобождаются в их свободную NPAA-форму 8,9.

NPAA β-метиламино-L-аланин (BMAA), продуцируемый цианобактериями, диатомовыми водорослями и динофлагеллятами10, является подозреваемым нейротоксином, который участвует в качестве фактора, способствующего различным нейродегенеративным заболеваниям, таким как боковой амиотрофический склероз / паркинсонизм-деменция (ALS-PDC) 11,12, боковой амиотрофический склероз и болезнь Альцгеймера 13 . Предполагается, что BMAA ошибочно включается в полипептидную цепь белков вместо L-серина14 и/или других белковых аминокислот. Неправильное включение BMAA может привести к неправильному сворачиванию белков, что приводит к отложению белковых агрегатов в нейронах14. В последнее десятилетие интерес к BMAA значительно возрос. Было обнаружено, что широкий спектр видов цианобактерий из пресноводных, морских и солоноватых сред производит BMAA15, что приводит к их широкому распространению в различных экосистемах 16,17. Кроме того, было показано, что BMAA биоусиляет через пищевую цепь человека18,19. Из-за потенциальных последствий для здоровья, отсутствия понимания и несоответствия токсичности BMAA крайне важно продолжать дальнейшие исследования до тех пор, пока токсичность BMAA не будет в конечном итоге понята или BMAA не будет признана безопасной20,21.

Анализ аминокислот в биологических образцах можно разделить на четыре основных этапа: подготовка образца, дериватизация аминокислот, разделение и обнаружение, а также идентификация и количественная оценка. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS) является предпочтительным методом анализа, поскольку она обеспечивает целенаправленное и воспроизводимое разделение и анализ аминокислот.

Методы пробоподготовки для анализа цианобактериальных и других образцов водорослей преимущественно включают метод экстракции аминокислот в их свободной и связанной с белком формах. На протяжении многих лет методы экстракции оставались относительно совместимыми с общими элементами, включая растворение образца для отделения свободных аминокислот от их связанной формы, с последующим осаждением белка и высвобождением связанных аминокислот путем гидролиза соляной кислотой (HCl) при повышенных температурах22 . Эта экстракционная форма была оптимизирована для белковых аминокислот и использована для NPAA. Однако обнаружение и количественная оценка BMAA и его изомеров (рисунок 1), аминоэтилглицина (AEG) и 2,4-диаминомасляной кислоты (2,4-DAB) у одних и тех же видов цианобактерий показали противоречивые результаты в литературе, с возможным объяснением, лежащим в различиях в условиях роста и / или штамме водорослей, производящих различные или отсутствующие количества BMAA23 . Утверждалось, что более вероятное объяснение несоответствий в обнаружении и количественной оценке BMAA и его изомеров связано с непроверенными экспериментальными протоколами, использованием широкого спектра аналитических методов и недостаточной экспериментальной детализацией в представленных методах 16,24, что приводит к невоспроизводимым межлабораторным данным. Тем не менее, Glover et al.25 и Banack26 недавно разработали и проверили аналитический метод обнаружения и количественной оценки BMAA и его изомеров с использованием сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC)-MS / MS в соответствии с Международным обществом химиков-аналитиков (AOAC), Фармакопеей США и руководящими принципами FDA, необходимыми для однолабораторной валидации.

Эти валидационные эксперименты были сосредоточены на разделении и обнаружении BMAA и его изомеров и не были направлены на устранение несоответствий в протоколах подготовки образцов. Lage et al.27 сравнили эффективность трех распространенных методов экстракции для количественной оценки BMAA и его изомеров в цианобактериальных образцах с помощью LC-MS/MS: твердофазная экстракция (SPE) свободных аминокислот28,29; метод осаждения белка, включающий экстракцию метанола и осаждение ацетона30; и наиболее часто используемый метод экстракции для BMAA, осаждение белка трихлоруксусной кислотой (TCA)31. Они пришли к выводу, что осаждение белка TCA является оптимальным протоколом, дающим более высокие концентрации BMAA в тестовых образцах по сравнению с другими методами экстракции. Их исследование подтвердило экстракцию TCA с дериватизацией BMAA с использованием 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбамата (AQC) в матрице цианобактерий, обеспечивая установленное руководство для достижения надежных и воспроизводимых данных BMAA. Экстракция аминокислот TCA является общепринятым и распространенным методом подготовки образцов, который также может быть применен к другим матрицам. Однако стабильность аминокислоты во время гидролиза необходимо учитывать для предотвращения деградации или окисления, которое может быть преодолено с использованием химических модификаторов и восстановителей32. Извлечение TCA регулярно используется и преподается новым студентам-исследователям, и хотя протокол широко освещается, визуальное пособие в применении этого метода является ценным ресурсом, обеспечивающим правильное и последовательное выполнение.

Обратная фазовая хроматография обычно используется для разделения аминокислот, требуя этапа дериватизации перед анализами. Дериватизация аминокислот, таких как BMAA, обеспечивает хроматографическое удержание и может увеличить разрешение между изомерами. Он также увеличивает молекулярную массу и улучшает ионизацию в масс-спектрометре. Несколько производных реагентов были использованы для анализа аминокислот через LC-MS/MS, включая пропилхлорформиат (PCF)33, 6-аминохинолил-N-гидросукцинимидилкарбамат (AQC)27, 9-фторфенилметилхлорформиат (FMOC)34 и дансилхлорид (DC)35. Однако единственными проверенными методами анализа BMAA в качестве дериватизирующего реагента использовались либо PCF36, либо AQC 24,26,37.

Сфера применения этого протокола сосредоточена на извлечении TCA NPAA из цианобактериальных матриц. Это трудоемкий метод, который обычно используется и преподается в академических и отраслевых исследовательских лабораториях на основе рукописей, которые могут быть короткими в деталях; поэтому этот протокол содержит подробную информацию о процедуре и методах, используемых при подготовке образцов для анализа свободного и связанного BMAA в качестве модельной аминокислоты.

Protocol

Вид цианобактерий Merismopedia был использован для настоящего исследования38.

1. Необработанная пробоподготовка

  1. Соберите накипь водорослей из интересующего водного источника или из колбы, культивируемой цианобактериями, и поместите ее в 50 мл центрифужной трубки38.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образец должен быть заморожен при температуре −20°С для последующей экстракции и разморожен до следующего этапа.
  2. Центрифугирование пробирок, содержащих образец при 3 500 х г, в течение 10 мин при 25 °С. Декантируйте супернатант в контейнер для отходов и выбрасывайте его в биологические отходы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант может быть зарезервирован для будущего анализа экзосомы.
  3. Плотно накройте трубку, содержащую гранулу образца, уплотнительной пленкой (см. Таблицу материалов) и проткните несколько отверстий в пленке с помощью острого длинного носового пинцета. Храните трубку в вертикальном положении при температуре −80 °C в течение 30 мин.
  4. Включите и уравновешивайте сублимационную сушилку при 0,1 мбар и −80 °C (~30 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры (этап 1.4) оптимизированы для сублимационной сушилки, используемой для настоящего исследования (см. Таблицу материалов). Следуйте стандартным рабочим процедурам в соответствии с моделью сублимационной сушилки, доступной в лаборатории, или установите минимально возможную температуру, если модель сублимационной сушилки не опускается до -80 ° C.
    1. Поместите трубку (трубки) центрифуги вертикально в стеклянный контейнер сублимационной сушилки и поместите ее в морозильную камеру при температуре −80 °C на 5 минут, чтобы охладить банку.
    2. Извлеките стеклянную емкость из морозильной камеры и прикрепите резиновую крышку.
    3. Убедитесь, что ручка на выходе резинового клапана сублимационной сушилки выветривается в атмосферу (направлена вверх) и прочно прикрепите стеклянную емкость.
    4. Поверните ручку выходного отверстия резинового клапана очень медленно в положение, направленное вниз, чтобы подвергнуть банку вакууму и дать до 24 часов сублимационной сушки, чтобы обеспечить сублимацию всей жидкости.
    5. Чтобы освободить вакуум в банке, поверните ручку в положение, направленное вверх, отсоедините стеклянную емкость и удалите сублимированные образцы.
  5. Используйте аналитические весы для взвешивания 15-50 мг высушенных гранул образца в центрифужной трубке объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть помещены в хранилище при температуре −80°С, если они не будут обработаны далее на данном этапе.

2. Лизирование клеток и фракционирование свободных НПА

  1. Добавьте 100 мкл стандарта D5-2,4-DAB (см. Таблицу материалов) с помощью микропипетки в пробирку (необязательно).
  2. Добавьте 300-600 мкл 10% мас./v водного трихлоруксуса (ТЦА, см. Таблицу материалов) или 300-600 мкл 11,7%-13,3% ТЦА, соответственно, если добавляется стандарт D5-2,4-DAB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите объем водного ТЦА, который полностью покрывает гранулу.
  3. Поместите пробоотборники в контейнер, наполненный измельченным льдом.
  4. Используйте зондовый ультразвуковой аппарат (см. Таблицу материалов) со средней и высокой мощностью (70%) и разрисуйте образец в течение 1 мин, следуя приведенным ниже шагам.
    ВНИМАНИЕ: Обеспечьте надлежащие СИЗ с использованием шумоподавляющих наушников.
    1. Следуйте соответствующим протоколам безопасности при подготовке к использованию зондового ультразвукового устройства, размещая на двери используемые вывески, выполняя обработку ультразвуком в вытяжном шкафу и используя шумоподавляющие наушники.
    2. Включите ультразвуковой аппарат и введите следующие параметры: амплитуда, 70%; время, 1 мин.
    3. Распылите 70% этанола на безворсовую бумажную салфетку (см. Таблицу материалов) и протрите зонд.
    4. Полностью погрузите конец зонда в образец и нажмите кнопку пуск.
    5. Когда зондовый ультразвуковой аппарат остановится, поместите трубку центрифуги, содержащую образец, на лед на 1 мин.
    6. Чтобы обеспечить лизирование клеток, повторите шаги 2.4.3-2.4.5 еще раз.
  5. Поместите образец в холодильник при температуре 4 °C в течение 12-24 ч, чтобы обеспечить осаждение белка.
  6. Центрифугировать 10% водный образец TCA при 3 500 х г в течение 15 мин при 8 °C.
  7. Используйте микропипетку для переноса супернатанта в трубку объемом 2 мл с надписью «Свободная фракция».
  8. Микропипетка 400 мкл 10% водного ТЦА попадает в центрифужную трубку, содержащую оставшуюся гранулу образца, и разбивает гранулу либо вихревым перемешиванием, либо наконечником микропипетки.
  9. Повторите шаги 2.6-2.7, перенеся супернатант в ту же 2 мл пробирку «Свободной фракции».
  10. Микропипетка 400 мкл 10% TCA/ацетона попадает в центрифужную трубку с оставшейся гранулой и разбивает гранулу вихрем или наконечником микропипетки.
  11. Центрифугировать 10% пробу TCA/ацетона при 3 500 х г в течение 15 мин при 8 °C. Используйте микропипетку для переноса супернатанта в трубку объемом 2 мл с надписью «Свободная фракция».
  12. Поместите трубку «Свободная фракция» с открытой крышкой в центробежный испаритель (см. Таблицу материалов) до тех пор, пока все летучие жидкости не будут удалены (не менее 1 ч).
  13. Как только образец освободится от летучих жидкостей, надежно накройте трубку герметизирующей пленкой и проткните пленку несколькими отверстиями с помощью острого длинного носового пинцета. Поместите образец в морозильную камеру с температурой −80 °C.
  14. Сублимационная сушка образца "Свободная фракция", повторив все шаги на шаге 1.4.
  15. Микропипетка 200 мкл соляной кислоты (HCl) 20 мМ в пробирку «Свободной фракции» для восстановления лиофилизированного образца и помещения его в морозильную камеру с температурой −80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: "Свободная фракция" образца готова к фильтрации на этапе 4. Оставшаяся гранула будет дополнительно обработана на следующих этапах для фракционирования белка.

3. Фракционирование связанных с белком НППА

  1. Используйте стеклянный гравер для маркировки флаконов со стеклянной оболочкой с деталями образца для идентификации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сильная кислота может рассеивать чернильную маркировку; поэтому рекомендуется гравировать этикетки на стекле.
  2. Микропипетка 100 мкл 100 нг/мл стандарта D5-2,4-DAB на гранулу образца (опционально).
  3. Микропипетка 400 мкл 100% ацетона на гранулу образца и разбить гранулу с помощью либо вихревого перемешивания, либо наконечника микропипетки.
  4. Используйте микропипетку объемом 1 мл на 1000 мкл для переноса промытой и повторно суспендированной гранулы в соответствующий флакон со стеклянной оболочкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Еще 400 мкл 100% ацетона могут быть добавлены к перемешиваемой грануле, чтобы помочь в полном переносе гранулы во флакон со стеклянной оболочкой. При необходимости это можно повторить в третий раз.
  5. Центрифуга при 8 000 х г в течение 5 мин при 25 °C и декантирование жидкости в биологические отходы.
  6. Поместите оставшуюся гранулу в центробежный испаритель до тех пор, пока вся жидкость не будет удалена и гранула не высохнет (~1 ч).
  7. Подготовьте флакон для вакуумного гидролиза, добавив 1 мл 6 M HCl на дно флакона для гидролиза.
  8. Используйте пинцет, чтобы аккуратно вставить меченые флаконы с оболочкой, содержащие высушенные образцы, во флакон для гидролиза, обеспечивая вертикальное, стабильное положение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые флаконы с оболочкой могут использоваться для поддержания флаконов с образцами в вертикальном положении, если количество образцов меньше емкости флакона для гидролиза.
  9. Прикрепите крышку к флакону для гидролиза и нажмите красную ручку на крышку, чтобы закрыть клапан.
  10. Включите вакуумный насос, прикрепите вакуумную трубку к головке крышки флакона для гидролиза и нажмите зеленую ручку на крышке, чтобы открыть клапан.
  11. Дайте вакуумному насосу (см. Таблицу материалов) удалить воздух из флакона в течение 1 мин.
  12. Закройте флакон, нажав на красную ручку на крышке флакона для гидролиза, выключите вакуумный насос и извлеките вакуумную трубку.
  13. Прикрепите резиновую трубку к крану газообразного азота на лабораторном стенде и слегка приоткройте кран. Поместите большой палец на конец трубки, запечатайте его и считайте, пока газ не начнет выходить по мере повышения давления. Это будут временные рамки для следующего шага. Отрегулируйте расход газа до подходящего таймфрейма.
  14. Прикрепите другой конец резиновой трубки к головке крышки флакона для гидролиза, а затем немедленно нажмите зеленую ручку крышки. Отсчитайте время, определенное на шаге 3.13, и быстро нажмите красную ручку на крышку и снимите резиновую трубку.
  15. Повторите шаги 3.10-3.14 дважды, чтобы убедиться, что стеклянный гидролизный флакон свободен от воздуха и заполнен газообразным азотом.
  16. Поместите флакон с гидролизом в разогретую духовку при 110 °C в течение 16-18 ч.
  17. Используйте перчатки для духовки, чтобы извлечь флакон с гидролизом стекла из духовки и дать ему остыть внутри вытяжного шкафа в течение 10 минут. Внутри вытяжного капота, лицом к нему, нажмите зеленую ручку, чтобы выпустить давление и газ.
  18. Используйте пинцет, чтобы удалить флаконы оболочки из флакона гидролиза.
  19. Восстановите гидролизованные гранулы образца путем микропипетки 200 мкл 20 мМ HCl во флакон оболочки. Убедитесь, что гранула повторно суспендирована либо вихрем, либо с помощью наконечника пипетки.
  20. Центрифугируйте оболочку флаконов, содержащих восстановленный образец гранул, в течение 2 мин при 5,300 х г и 25 °C.

4. Фильтрация образцов

  1. Этикетка 2 мл фильтрующих трубок (см. Таблицу материалов), содержащая 0,2 мкм поровых мембранных фильтров как "Свободная фракция" и "Белковая фракция".
  2. Перенесите восстановленные образцы со стадии 2.15 (свободная фракция) и стадии 3.20 (белковая фракция) в соответствующие фильтрующие трубки.
  3. Поместите их в центрифугу на 30 мин при 5 000 х г и 25 °C.
  4. Извлеките фильтры из фильтрующих трубок и закройте их крышкой. Образцы теперь готовы к дериватизации аминокислот на этапе 5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть помещены в морозильную камеру с температурой −80 °C для хранения для последующей дериватизации и анализа.

5. Выведение аминокислот

  1. Выводите образцы с использованием пропилхлорформиата (PCF)39 или 6-аминохинолил-N-гидросисукцинимидилкарбамата (AQC)40 в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).

Representative Results

Иллюстрация протокола извлечения приведена на рисунке 2 в виде сводного справочного руководства. Результаты, полученные Violi et al.38 , были выбраны для представления положительного результата этого протокола экстракции для анализа изомеров BMAA из цианобактерий. Девятнадцать видов цианобактерий были культивированы из 11 пресноводных участков восточной австралии. Используя тот же протокол, изомеры BMAA экстрагировали в свободные и белковые фракции, дериватизировали с PCF и анализировали с использованием LC-MS / MS. Семнадцать цианобактериальных изолятов были положительными для BMAA, и все 19 содержали изомер 2,4-DAB. Положительный результат подтверждается использованием валидированного метода LC-MS/MS и наблюдением по меньшей мере трех переходов множественного мониторинга реакций (MRM), один в качестве иона квантора и два в качестве ионов-квалификаторов в ожидаемое время удержания. Репрезентативная Хроматограмма МРМ стандарта, содержащего BMAA и его изомеры, обозначенная цветными линиями, показана на рисунке 3. Наличие и концентрация BMAA и изомеров во всех 19 образцах, разделенных для демонстрации концентрации BMAA и изомеров в свободных и связанных фракциях, обобщены в таблице 1. Положительное обнаружение всех трех изомеров наблюдалось в свободной фракции видов Merismopedia , собранных в озере Лидделл (Новый Южный Уэльс, Австралия), где свободная фракция содержала концентрацию BMAA 68,38 мкг/г сухого веса (DW) ± 2,25 мкг/г DW, 2,4-DAB с концентрацией 1 223,98 мкг/г DW ± 20,7 мкг/г DW, и ЭЭГ с концентрацией 125,27 мкг/г DW ± 4,19 мкг/г DW. Хроматографические МРТ показаны на рисунке 4. Чтобы проиллюстрировать отрицательный результат для BMAA и его изомеров в образце, связанная фракция видов Microcystis flos-aquae , собранная с Walka Water Works (Новый Южный Уэльс, Австралия), хроматографически представлена на рисунке 5. В то время как связанная фракция не содержала BMAA, 2,4-DAB и/или AEG, ее свободная фракция содержала все три изомера с концентрациями 79,86 мкг/г DW ± 1,59 мкг/г DW, 1 156,15 мкг/г DW ± 8,46 мкг/г DW и 433,83 мкг/г DW ± 8,92 мкг/г DW соответственно.

Таким образом, используя этот протокол, Violi et al.38 подтвердили наличие изомеров BMAA в пресноводных цианобактериях восточной Австралии и определили, какие цианобактерии обладают токсин-продуцирующей способностью.

Figure 1
Рисунок 1: Химическая структура BMAA и его изомеров 2,4-DAB и AEG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сводная справочная схема протокола извлечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Хроматограмма LC-MS/MS калибровочного стандарта, содержащего D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA и AEG для идентификации изомеров на основе удержания, обозначенного выделенными пиками. Ключ: D5-2,4-DAB 338,01 м/з > 278,10 м/з при 6,4 мин (красный), 2,4-DAB 333,01 м/з > 273,10 м/з при 6,4 мин (зеленый), AEG 333,01 м/з > 88,00 м/з при 7,4 мин (оранжевый) и BMAA 333,01 м/з > 187,10 м/з при 7,8 мин (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Хроматограмма LC-MS/MS для обнаружения D5-2,4-DAB, 2,4-DAB, BMAA и AEG у видов Merismopedia , собранных в озере Лидделл (Новый Южный Уэльс, Австралия), на которые указывают выделенные пики. Ключ: D5-2,4-DAB 338,01 м/з > 278,10 м/з при 6,4 мин (красный), 2,4-DAB 333,01 м/з > 273,10 м/з при 6,4 мин (зеленый), AEG 333,01 м/з > 88,00 м/з при 7,4 мин (оранжевый) и BMAA 333,01 м/з > 187,10 м/з при 7,8 мин (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Хроматограмма LC-MS/MS отрицательного контроля для 2,4-DAB, BMAA и AEG в связанной фракции видов Microcystis flos-aquae, собранных на Walka Water Works (Новый Южный Уэльс, Австралия). Ключ: D5-2,4-DAB 338,01 м/з > 278,10 м/з при 6,4 мин (красный - пик выделен), 2,4-DAB 333,01 м/з > 273,10 м/з при 6,4 мин (зеленый), AEG 333,01 м/з > 88,00 м/з при 7,4 мин (оранжевый) и BMAA 333,01 м/з > 187,10 м/з при 7,8 мин (синий). Пунктирные линии представляют время удержания отсутствующих 2,4-DAB, AEG и BMAA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Концентрации BMAA, AEG и 2,4-DAB в цианобактериальных изолятах. Концентрации ± стандартной погрешности среднего значения (n = 3). ND обозначает не обнаруженный. Самая высокая концентрация каждого обнаруженного изомера выделена зеленым цветом. Таблица является модифицированной версией из Violi et al.38. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

Протокол экстракции, описанный здесь для анализа NPAA, применяется к анализу любых аминокислот в биологических образцах. Для получения руководств по выделению и культивированию цианобактериальных штаммов можно обратиться к методам, представленным в исследовании Violi et al.38. Первый шаг в протоколе доводит образец до точки, где может быть достигнута нормализация между образцами по отношению к сухому весу. Второй этап представляет собой лизис клеток для высвобождения аналитов и может быть выполнен с использованием множества методов, включая механические сбои/лизы, такие как зондовая обработка ультразвуком, как описано в настоящем протоколе, циклы замораживания/оттаивания, измельчение и измельчение шариков, а также немеханические нарушения, такие как ферментативный, моющий и/или химический лизис. Известно, что механическое разрушение является преимуществом по сравнению с немеханическим, поскольку оно позволяет увеличить способность образца лизироваться, позволяя внутриклеточным связям и белкам оставатьсянетронутыми 41, хотя матрица образца может диктовать оптимальный метод лизирования клеток.

Осаждение белка является критическим третьим этапом этого протокола при извлечении аминокислот для анализа. ТЦА является наиболее часто используемым растворителем; однако также использовались хлорная кислота, ацетон, метилтрет-бутиловый эфир (МТБЭ), метанол и/или ацетонитрил 8,42, где каждый экстракционный растворитель предназначен для извлечения и осаждения различных субстратов. Модель, описанная здесь, извлекает NPAA BMAA и его изомеры из цианобактериальной матрицы, и, хотя был использован ряд различных растворителей, двумя наиболее распространенными являются 10% TCA в воде (водный) и 10% TCA в ацетоне. В общем, осаждение белка с TCA обычно используется для извлечения аминокислот для фракционирования свободных аминокислот из аминокислот, связанных с белком. Кроме того, экстракция TCA позволяет определить общее содержание белка, уменьшая загрязняющие вещества для свободной фракции и снижая активность протеаз с минимальной деградацией белка43. Экстракция свободной фракции TCA работает путем первоначального промывания органически-растворимых веществ, оставляя после себя белки и нерастворимые соединения, такие как остатки клеточной стенки в осадке, за которым затем следует термическая гидролизная экстракция связанных с белком аминокислот (связанная фракция) с использованием сильной кислоты.

Фракционирование свободной фракции с 10% водным TCA плюс обработка ультразвуком приводит к наиболее обширному осаждению белка по сравнению с другими органическими растворителями44 и наилучшему восстановлению аминокислот42. Некоторые исследования предпочитают использовать кислоту в сочетании с органическим растворителем (т.е. 10%-20% TCA в ацетоне43) для осаждения большего количества молекул, включая меньшие пептиды / биомолекулы, минимизации деградации белка и уменьшения загрязняющих веществ, таких как соли43. Еще одним преимуществом 10% TCA в ацетоне является его более высокая скорость высыхания при подготовке гранул к гидролизу, минимизация остатков влаги для предотвращения модификации аминокислот. Тем не менее, 10% водный TCA плюс обработка ультразвуком имеют лучшую эффективность экстракции свободных аминокислот по сравнению с 10% TCA только в ацетоне44. Кроме того, 10% водное осаждение ТЦА имеет ограничения, такие как длительное время высыхания, неспособность осаждать все белки или небольшие пептиды/биомолекулы, и в зависимости от интересующего аналита (т.е. белков или аминокислот), требующих добавок и восстановителей для предотвращения окисления и деградации45,46.

Этот протокол использует комбинацию 10% водного ТЦА и 10% ТЦА в ацетоне для увеличения осаждения белка, обеспечения осаждения меньших пептидов / биомолекул, обеспечения более быстрого времени сушки гранул и повышения эффективности экстракции, используя преимущества обоих свойств экстракции растворителем. Однако комбинация 10% водного ТЦА и 10% ТЦА в ацетоне может осаждать небольшие пептиды/биомолекулы в свободной фракции после того, как 10% ТЦА в ацетоновом супернатанте сочетается с водной свободной фракцией. В этом случае осадки следует перенести в связанную фракцию для гидролиза.

Вторая половина этого протокола включает высвобождение аминокислот (т.е. BMAA) из белковой гранулы посредством кислотно-парового гидролиза при повышенных температурах в бескислородной среде. Преобладающим ограничивающим фактором для стадии гидролиза является то, что подготовка к ней трудоемка и трудоемка. Ночная инкубация предотвращает быструю и эффективную по времени подготовку и анализ проб. Кроме того, количественный перенос гранулы из трубки центрифуги во флакон скорлупы (этап 3.4) является трудным процессом, который требует усердия и терпения для обеспечения точной точки нормализации до сухого веса. Возможными проблемами, с которыми может столкнуться пользователь, являются неполный перенос гранулы, влажные осажденные белки, прилипшие к наконечникам пипетки и оригинальной трубке, и твердые частицы гранулы, блокирующие наконечник пипетки. Практическим предложением для облегчения переноса гранулы является удаление около 0,3-0,5 мм с конца кончика пипетки ножницами, что позволит более крупным частицам гранул быть втянутыми и выпущенными во флакон оболочки. Этот метод переноса является обычной практикой для экстракции белка для всех аминокислотных анализов. Однако следует исследовать модификации для повышения эффективности и точности количественного переноса гранулы во флакон оболочки.

Для высвобождения аминокислот из их связанного с белком состояния могут быть использованы две формы методов гидролиза: гидролиз жидкой фазы и гидролиз паров кислоты. Жидкофазный гидролиз, который включает добавление 6 M HCl к образцу, который затем помещают в печь с температурой 110 °C на ночь, является альтернативой гидролизу паров кислоты, описанному в настоящем протоколе. Методы экстракции, использующие жидкофазный гидролиз, могут потребовать дальнейшей обработки, такой как опреснение, особенно если выбрана дериватизация AQC, поскольку она требует основных условий для маркировки40. Кислотно-паровой гидролиз позволяет избежать опреснения и дает пользователю свободу выбора метода дериватизации при восстановлении конечной гранулы перед фильтрацией. Кроме того, независимо от выбранного метода гидролиза, образцы могут потребовать дальнейшей обработки, такой как SPE для очистки матрицы и концентрации 29,47,48, в зависимости от выбора метода дериватизации и/или аналитического анализа (например, обратная фаза LC-MS/MS против гидрофильной взаимодействия жидкостной хроматографии [HILIC] LC-MS/MS37 ). Восстановление конечной гранулы в 20 мМ HCl в настоящем протоколе целесообразно для дериватизации с использованием реагентов48 PCF через коммерчески доступный набор39 для гидролиза аминокислот (см. Таблицу материалов). Как AQC, так и PCF будут дериватизировать все аминокислоты, белки и небелки в происхождении, присутствующие в образце, а селективность аналитов будет получена путем использования LC-MS/MS и его комбинации согласования времени удержания и тщательного выбора квантора и квалификатора MRM38. 

Современные протоколы гидролиза оптимизированы не для высвобождения BMAA, 2,4-DAB и AEG, а для 22 белковых аминокислот, основанных на существующих методах гидролиза белка32, где инкубация в течение более 18 ч приводит к деградации и модификации определенных аминокислот, влияя на анализ LC-MS/MS и, таким образом, на полученные концентрации32. Beach et al.49 исследовали гидролиз с течением времени (0,5-120 ч) для оптимизации гидролиза для анализа BMAA и протеиногенных аминокислот. Они обнаружили, что, хотя в течение первых 0,5 ч гидролиза наблюдалось раннее быстрое высвобождение BMAA, уровни BMAA продолжали увеличиваться по мере увеличения времени гидролиза, без деградации, даже через 5 дней49. Существуют также различные взгляды и вопросы об истинной природе связанного BMAA и его изомеров, причем некоторые исследования предполагают, что вместо BMAA, связывающего50,51 или неправильного включения в белки14, BMAA-белковая ассоциация является поверхностной52. Тем не менее, текущий консенсус в анализе «связанного» BMAA требует проверенной и широко принятой стадии гидролиза, которая расщепляет пептиды / белки для высвобождения аминокислот и, таким образом, BMAA и его изомеров.

Скорость восстановления 20 белковых аминокислот была определена в исследовании Sedgwick et al.42 с использованием экстракции TCA, что привело к примерно 100% восстановлению. В случае BMAA и его изомеров из матриц водорослей исследования, сравнивающие эффективность экстракции BMAA с использованием различных экстракционных растворителей, показали, что 10% TCA является наиболее эффективным для свободного BMAA27. Скорости восстановления для связанного с белком BMAA, извлеченного с использованием жидкофазного гидролиза, были установлены в исследованиях Glover et al.25 и Faassen et al.53, где точность определялась методами шипованного восстановления со средней скоростью восстановления BMAA 108,6% и 70% соответственно. Faassen et al. описали процедуры экспериментов по восстановлению шипов и проиллюстрировали, как восстановление отличается в зависимости от стадии процесса экстракции, в котором шип был сделан53. Faassen et al. дополнительно определили эффективность протокола кислотных паров, представленного здесь, со скоростью извлечения 83,6% для изомеров BMAA, полученных до экстракции, и 68,6% для тех, которые были повышены до гидролиза24. Эти извлечения, методы экстракции и анализы были дополнительно подтверждены Banack26, с коэффициентом восстановления 94%-106% для BMAA в цианобактериальной матрице и %относительным стандартным отклонением (%RSD) между 5,6% и 20%, что соответствует критериям точности FDA54. Рекомендуется, чтобы каждая лаборатория первоначально установила свои скорости и точность восстановления, прежде чем использовать этот протокол с помощью экспериментов по восстановлению шипов. Методы восстановления, представленные в Faassen et al.53 и Glover et al.25, могут использоваться в качестве руководства.

Альтернативные формы методов гидролиза могут быть использованы вместо ночного гидролиза в печи для более быстрой экстракции анализируемого вещества, связанного с белком. Например, микроволновая экстрактор может значительно сократить время гидролиза с 24 ч до 10 мин55. Микроволновый гидролиз аминокислот использует те же принципы, что и обычный термический метод, используя перчаточный ящик для подготовки и сборки микроволнового сосуда в бескислородной среде и добавляя 6 M HCl. После герметизации сосуд, содержащий образец, подвергается микроволновому излучению. Микроволновый гидролиз был использован для извлечения аминокислот из различных матриц образцов 56,57,58; однако микроволновый гидролиз еще предстоит разработать и проверить для анализа BMAA.

В заключение, 10% водное осаждение белка TCA является оптимальным методом извлечения свободных небелковых аминокислот из цианобактериальных матриц27, а термический гидролиз обеспечивает надежную и воспроизводимую экстракцию связанной с белком фракции. Этот протокол для извлечения NPAA BMAA и его изомеров из цианобактерий валидирован и широко принят. Будущие направления по дальнейшей оптимизации экстракции BMAA будут сосредоточены на стадии гидролиза, которая выполняется в соответствии со спецификациями 22 белковых аминокислот. Тем не менее, представленный здесь протокол извлечения по-прежнему следует считать эффективным и действенным для анализа BMAA и его изомеров через LC-MS/ MS.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

D.P.B., K.J.R. и S.M.M. поддерживаются Фондом Яна Поттера, а J.P.V. является получателем австралийской правительственной исследовательской учебной программы Stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL glass shell vials SHIMADZU REST-24663
10% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 10% aqueous TCA 
100% TCA solution Dissolve TCA in water according to the following ratio 2.2 g:1 mL (TCA:H2O)
1000 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z683809
13.3% TCA solution Dilute 100% (w/v) to 13.3% aqueous TCA 
2 mL tubes MERCK BR780546-500EA
20 mM HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
20-200 µL micropipette Ependorf/Sigma-Aldrich Z740441
6 M HCl Chem-Supply Pty Ltd 7647-01-0 Made from stock
70% ethanol Supelco 1.11727 Dilute 70:1 Ethanol:water
-80 °C Freezer Martin CHRIST 102142 Alpha 2-4 Ldplus
AccQ-Tag Ultra Derivatisation Kit  Waters 186003836
Acetone Chem-Supply Pty Ltd 34967-2.5L
Analytical Scale Balance
Centrifugal evaporator Thermo Scientific 13442549 DNA120-115 SpeedVac Concentrator
Centrifuge MERCK EP022620100-1EA
D5-2,4-DAB standard CDN Isotopes D-7568
Drying Oven
Ez:faastTM Amino Acid Analysis Kit Phenomenex CEO-8492
Falcon tube holder
Falcon Tubes MERCK T2318-500EA Greiner centrifuge tubes
Filter Tubes Sigma-Aldrich CLS8161-100EA Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (pore size 0.22 μm)
Glass engraver
Hydrolysis vial & Lid Eldex Laboratories/Waters WAT007568 & WAT007569
Ice and container
Lint-free paper wipe Kimwipes/Sigma-Aldrich Z188956
Milli-Q water 18.2 MΩ.cm
Nitrogen tap with hose
P1000 Micropipette MERCK EP3123000063
P1000 pipette tips MERCK Z740127
P200 Micropipette MERCK EP3123000055-1EA
P200 pipette tips MERCK Z740125
Parafilm MERCK P7793 Sealing film
PPE - noise cancelling headphones
PPE - oven gloves
Probe sonicator QSONICA Sonicators Q125 Sonicator Please ensure all appropriate PPE (i.e. noise cancelling headphones)
Sample transfer spatula
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma-Aldrich T6399-1KG
Tweezers
Vacuum Pump with hose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, P. O. Physical and Chemical Properties of Amino Acids. Amino Acids and Derivatives. Miflin, B. J. , Academic Press. Cambridge, MA. 225-269 (1980).
  2. Wagner, I., Musso, H. New naturally occurring amino acids. Angewandte International Edition in English. 22 (11), 816-828 (1983).
  3. Reeds, P. J. Dispensable and indispensable amino acids for humans. The Journal of Nutrition. 130 (7), 1835-1840 (2000).
  4. Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. Amino Acids. Essentials of Medical Biochemistry (Second Edition). Bhagavan, N. V., Ha, C. -E. , Academic Press. Cambridge, MA. 21-29 (2015).
  5. Rubenstein, E. Misincorporation of the proline analog azetidine-2-carboxylic acid in the pathogenesis of multiple sclerosis: A hypothesis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67 (11), 1035-1040 (2008).
  6. Chan, S., Dunlop, R., Rowe, A., Double, K., Rodgers, K. l-DOPA is incorporated into brain proteins of patients treated for Parkinson's disease, inducing toxicity in human neuroblastoma cells in vitro. Experimental Neurology. 238 (1), 29-37 (2012).
  7. Rodgers, K. J., Hume, P. M., Morris, J. G., Dean, R. T. Evidence for L-dopa incorporation into cell proteins in patients treated with levodopa. Journal of Neurochemistry. 98 (4), 1061-1067 (2006).
  8. Violi, J. P., Bishop, D. P., Padula, M. P., Steele, J. R., Rodgers, K. J. Considerations for amino acid analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: A tutorial review. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 131, 116018 (2020).
  9. Hashiguchi, A., Komatsu, S. Posttranslational Modifications and Plant-Environment Interaction. Methods in Enzymology., Volume 586. Shukla, A. K. , Academic Press. Cambridge, MA. 97-113 (2017).
  10. Berntzon, L., Ronnevi, L. O., Bergman, B., Eriksson, J. Detection of BMAA in the human central nervous system. Neuroscience. 292, 137-147 (2015).
  11. Cox, P. A., Banack, S. A., Murch, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13380-13383 (2003).
  12. Cox, P. A., et al. Cyanobacteria and BMAA exposure from desert dust: A possible link to sporadic ALS among Gulf War veterans. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 109-117 (2009).
  13. Pablo, J., et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer's disease. Acta Neurologica Scandinavica. 120 (4), 216-225 (2009).
  14. Dunlop, R. A., Cox, P. A., Banack, S. A., Rodgers, K. J. The non-protein amino acid BMAA is misincorporated into human proteins in place of l-serine causing protein misfolding and aggregation. PLoS One. 8 (9), 75376 (2013).
  15. Cox, P. A., et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, a neurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (14), 5074-5078 (2005).
  16. Faassen, E. J. Presence of the neurotoxin BMAA in aquatic ecosystems: What do we really know. Toxins. 6 (3), 1109-1138 (2014).
  17. Al-Sammak, M. A., Hoagland, K. D., Cassada, D., Snow, D. D. Co-occurrence of the cyanotoxins BMAA, DABA and anatoxin-a in Nebraska reservoirs, fish, and aquatic plants. Toxins. 6 (2), 488-508 (2014).
  18. Wang, C., et al. Food web biomagnification of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine in a diatom-dominated marine ecosystem in China. Journal of Hazardous Materials. 404, 124217 (2021).
  19. Banack, S. A., Johnson, H. E., Cheng, R., Cox, P. A. Production of the neurotoxin BMAA by a marine cyanobacterium). Marine Drugs. 5 (4), 180-196 (2007).
  20. Jiang, L., Johnston, E., Åberg, K. M., Nilsson, U., Ilag, L. L. Strategy for quantifying trace levels of BMAA in cyanobacteria by LC/MS/MS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (4), 1283-1292 (2013).
  21. Jonasson, S., Eriksson, J., Berntzon, L., Rasmussen, U., Bergman, B. A novel cyanobacterial toxin (BMAA) with potential neurodegenerative effects. Plant Biotechnology. 25 (3), 227-232 (2008).
  22. Cohen, S. Analytical techniques for the detection of α-amino-β-methylaminopropionic acid. Analyst. 137 (9), 1991-2005 (2012).
  23. Main, B. J., Rodgers, K. J. Assessing the combined toxicity of BMAA and its isomers 2,4-DAB and AEG in vitro using human neuroblastoma cells. Neurotoxicity Research. 33 (1), 33-42 (2018).
  24. Faassen, E. J., Gillissen, F., Lürling, M. A comparative study on three analytical methods for the determination of the neurotoxin BMAA in cyanobacteria. PLoS One. 7 (5), 36667 (2012).
  25. Glover, W. B., Baker, T. C., Murch, S. J., Brown, P. N. Determination of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2-aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobutyric acid in food products containing cyanobacteria by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry: Single-laboratory validation. Journal of AOAC International. 98 (6), 1559-1565 (2015).
  26. Banack, S. A. Second laboratory validation of β-N-methylamino-L-alanine, N-(2aminoethyl)glycine, and 2,4-diaminobuytric acid by ultra-performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. Neurotoxicity Research. 39 (1), 107-116 (2021).
  27. Lage, S., et al. BMAA extraction of cyanobacteria samples: Which method to choose. Environmental Science and Pollution Research. 23 (1), 338-350 (2016).
  28. Jonasson, S., et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquatic ecosystem suggests pathways for human exposure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9252-9257 (2010).
  29. Spáčil, Z., et al. Analytical protocol for identification of BMAA and DAB in biological samples. Analyst. 135 (1), 127-132 (2010).
  30. Jiang, L., et al. Diatoms: A novel source for the neurotoxin BMAA in aquatic environments. PLOS One. 9 (1), 84578 (2014).
  31. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A., Steele, J. C., Sacks, O. W. Occurrence of β-methylamino-l-alanine (BMAA) in ALS/PDC patients from Guam. Acta Neurologica Scandinavica. 110 (4), 267-269 (2004).
  32. Davidson, I. Hydrolysis of Samples for Amino Acid Analysis. Protein Sequencing Protocols. Smith, B. J. , Humana Press. Totowa, NJ. 111-122 (2003).
  33. Esterhuizen-Londt, M., Downing, S., Downing, T. Improved sensitivity using liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) for detection of propyl chloroformate derivatised -N-methylamino-L-alanine (BMAA) in cyanobacteria. Water SA. 37 (2), 133-138 (2011).
  34. Kisby, G. E., Roy, D. N., Spencer, P. S. Determination of β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in plant (Cycas circinalis L.) and animal tissue by precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate (FMOC) and reversed-phase high-performance liquid chromatography. Journal of Neuroscience Methods. 26 (1), 45-54 (1988).
  35. Lampinen Salomonsson, M., Hansson, A., Bondesson, U. Development and in-house validation of a method for quantification of BMAA in mussels using dansyl chloride derivatization and ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (18), 4865-4874 (2013).
  36. Main, B. J., et al. Detection of the suspected neurotoxin β-methylamino-l-alanine (BMAA) in cyanobacterial blooms from multiple water bodies in Eastern Australia. Harmful Algae. 74, 10-18 (2018).
  37. Combes, A., et al. Validation of the analytical procedure for the determination of the neurotoxin β-N-methylamino-l-alanine in complex environmental samples. Analytica Chimica Acta. 771, 42-49 (2013).
  38. Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Colville, A., Main, B. J., Rodgers, K. J. Prevalence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) and its isomers in freshwater cyanobacteria isolated from eastern Australia. Ecotoxicology and Environmental Safety. 172, 72-81 (2019).
  39. Phenomenex. EZ:faast For Amino Acid Analysis of Protein Hydroysates by LC-MS. User's Manual. , Available from: http://phx.phenomenex.com/lib/3882_L6_LC_MS.pdf (2005).
  40. AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit Care and. Waters. , Available from: https://www.waters.com/waters/support.htm?lid=10008559 (2014).
  41. D'Hondt, E., et al. Cell Disruption Technologies. Microalgae-Based Biofuels and Bioproducts. Gonzalez-Fernandez, C., Munoz, R. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 133-154 (2017).
  42. Sedgwick, G. W., Fenton, T. W., Thompson, J. R. Effect of protein precipitating agents on the recovery of plasma free amino acids. Canadian Journal of Animal Science. 71 (3), 953-957 (1991).
  43. Niu, L., et al. Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis. PLOS One. 13 (12), 0202238 (2018).
  44. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31 (21), 3573-3579 (2010).
  45. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  46. Novák, P., Havlíček, V. Protein Extraction and Preparation. Proteomic Profiling and Analytical Chemistry (Second Edition). Ciborowski, P., Silberring, J. , Elsevier. 51-62 (2016).
  47. Li, A., et al. Elucidation of matrix effects and performance of solid-phase extraction for LC-MS/MS analysis of beta-N-methylamino-L-alanine (BMAA) and 2,4-diaminobutyric acid (DAB) neurotoxins in cyanobacteria. Analyst. 137 (5), 1210-1219 (2012).
  48. Baker, T. C., Tymm, F. J. M., Murch, S. J. Assessing environmental exposure to β-N-methylamino-l-alanine (BMAA) in complex sample matrices: A comparison of the three most popular LC-MS/MS methods. Neurotoxicity Research. 33 (1), 43-54 (2018).
  49. Beach, D. G., Kerrin, E. S., Giddings, S. D., Quilliam, M. A., McCarron, P. Differential mobility-mass spectrometry double spike isotope dilution study of release of β-methylaminoalanine and proteinogenic amino acids during biological sample hydrolysis. Scientific Reports. 8, 117 (2018).
  50. Murch, S. J., Cox, P. A., Banack, S. A. A mechanism for slow release of biomagnified cyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12228-12231 (2004).
  51. Banack, S. A., Murch, S. J., Cox, P. A. Neurotoxic flying foxes as dietary items for the Chamorro people, Marianas Islands. Journal of Ethnopharmacology. 106 (1), 97-104 (2006).
  52. van Onselen, R., Cook, N. A., Phelan, R. R., Downing, T. G. Bacteria do not incorporate β-N-methylamino-l-alanine into their proteins. Toxicon. 102, 55-61 (2015).
  53. Faassen, E. J., Gillissen, F., Zweers, H. A. J., Lürling, M. Determination of the neurotoxins BMAA (β-N-methylamino-L-alanine) and DAB (α-,γ-diaminobutyric acid) by LC-MSMS in Dutch urban waters with cyanobacterial blooms. Amyotrophic Lateral Sclerosis. 10, 79-84 (2009).
  54. Food and Drug Administration. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. U.S. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Veterinary Medicine. , (2018).
  55. Reichelt, M., Hummert, C., Luckas, B. Hydrolysis of microcystins and nodularin by microwave radiation. Chromatographia. 49 (11), 671-677 (1999).
  56. Marconi, E., Panfili, G., Bruschi, L., Vivanti, V., Pizzoferrato, L. Comparative study on microwave and conventional methods for protein hydrolysis in food. Amino Acids. 8 (2), 201-208 (1995).
  57. Chen, S. -T., Chiou, S. -H., Chu, Y. -H., Wang, K. -T. Rapid hydrolysis of proteins and peptides by means of microwave technology and its application to amino acid analysis. International Journal of Peptide and Protein Research. 30 (4), 572-576 (1987).
  58. Aviram, L. Y., McCooeye, M., Mester, Z. Determination of underivatized amino acids in microsamples of a yeast nutritional supplement by LC-MS following microwave assisted acid hydrolysis. Analytical Methods. 8 (22), 4497-4503 (2016).

Tags

Химия Выпуск 190 Аминокислота осаждение белка трихлоруксусная кислота (TCA) небелковая аминокислота BMAA цианобактерии
Экстракция небелковых аминокислот из цианобактерий для жидкостной хроматографии-тандемного масс-спектрометрического анализа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P.,… More

Pravadali-Cekic, S., Violi, J. P., Mitrovic, S. M., Rodgers, K. J., Bishop, D. Extraction of Non-Protein Amino Acids from Cyanobacteria for Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (190), e63779, doi:10.3791/63779 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter