Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kemisk triphosphorylation af oligonukleotider

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63877
Automatic Translation
1, 1
1The Salk Institute

Summary

Oligonukleotid 5′-trifosfater er allestedsnærværende komponenter i essentielle biologiske veje og har oplevet stigende anvendelse i bioteknologiske applikationer. Her beskriver vi teknikker til rutinemæssig syntese og oprensning af oligonukleotid-5′-triphosphater, startende fra oligonukleotider fremstillet ved standard automatiserede synteseteknikker.

Abstract

5′-triphosphatet er en essentiel nukleinsyremodifikation, der findes gennem hele livet og i stigende grad anvendes som en funktionel modifikation af oligonukleotider inden for bioteknologi og syntetisk biologi. Oligonukleotid 5′-trifosfater er historisk blevet fremstillet in vitro ved enzymatiske metoder. Disse metoder er imidlertid begrænset til naturlige RNA-oligonukleotider, har stærke sekvenspræferencer og har tendens til at producere heterogene produkter. Nye metoder til kemisk triphosphorylation supplerer både de reducerede omkostninger ved automatiseret oligonukleotidsyntese ved phosphoramiditkemi og det mangfoldige udvalg af nukleotidmodifikationer, der nu er tilgængelige. Således er syntesen af oligonukleotidtrifosfater af vilkårlig sekvens og længde og eventuelt indeholdende forskellige ikke-naturlige modifikationer nu tilgængelig.

Dette papir præsenterer de passende metoder og teknikker til kemisk triphosphorylation af oligonukleotider under anvendelse af salicylphosphorochloridit og pyrophosphat. Denne metode anvender kommercielt tilgængelige reagenser, er kompatibel med de fleste oligonukleotider fremstillet ved standard syntesemetoder med fast fase og kan afsluttes i 2 timer efter oligonukleotidsyntese inden debeskyttelse og oprensning. To anvendelser af kemisk triphosphorylaterede oligonukleotider som substrater for katalytiske RNA-enzymer er demonstreret, herunder syntesen af en spejlbilledversion af hammerhead-ribozymet fra ikke-biologiske L-RNA-trifosfater.

Introduction

Den 5′-triphosphorylaterede form af RNA er allestedsnærværende i biologi, da den genereres af RNA-transkription i alle livets domæner og ved RNA-replikation i livscyklussen for mange RNA-vira. Disse trifosfater tjener som substrat for dannelsen af 7-methylguanylat-capped mRNA i eukaryoter og spiller derfor en væsentlig rolle i proteinekspression1. I modsætning hertil bevares trifosfatet i bakterier og vira; RNA 5′-trifosfater genkendes således af medfødte immunitetsresponsregulatorer i eukaryoter 2,3,4,5,6,7. Uden for biologi er en række RNA-ligase-ribozymer blevet udviklet til at anvende 5′-triphosphat in vitro8 og modificeret til brug i diagnostiske assays 9,10,11,12,13,14,15. Et sådant ribozym kan anvendes til skabelonafhængig syntese af L-RNA, den ikke-biologiske "spejlbillede" enantiomer af naturlig D-RNA, fra små L-RNA oligonukleotid 5′-trifosfater 16,17,18. Den rutinemæssige fremstilling af triphosphorylaterede oligonukleotider af varierende sekvens og rygradssammensætning er afgørende for at undersøge disse systemer.

Den mest almindelige og tilgængelige metode til fremstilling af RNA 5′-trifosfater i laboratoriet er ved in vitro transkription. RNA produceret ved denne metode er imidlertid begrænset i sekvens og størrelse ved promotor- og substratkrav til RNA-polymeraseenzymet. T7 RNA-polymerase og specialiserede derivater er de mest almindelige polymeraser, der anvendes til dette formål 19,20,21,22. In vitro transkriberet RNA fremstillet med disse enzymer skal initieres med en 5′-terminal purin og er stærkt forudindtaget mod puriner i de første 10 nukleotider23,24. Desuden er enzymatisk inkorporering af base- eller rygradsmodificerede nukleotider i bedste fald ineffektiv og oftere umulig med naturlige polymeraser, hvilket begrænser muligheden for at producere oligonukleotid 5′-triphosphater sammensat af alt andet end naturligt D-RNA. En anden begrænsende faktor er, at RNA genereret af in vitro transkription kan indeholde betydelig 5′- og 3′-heterogenitet og produceres som ekstremt heterogene produkter, når de er kortere end 20 nt 23,24,25,26,27.

I modsætning hertil kan kemisk triphosphorylation af oligonukleotider fremstillet ved fastfaset phosphoramiditsyntese 28,29,30,31,32,33,34,35 anvendes til fremstilling af oligonukleotid 5′-trifosfater 3-50 nt lange, af enhver sekvens. Derudover kan et stort udvalg af nukleinsyremodifikationer, der er tilgængelige for phosphoramiditsyntese, tilsættes til oligonukleotider før 5′-triphosphorylation 14,15,16,17,18,29,36. Mange af disse metoder anvender phosphitylationsreagenset salicylphosphanochloridit, som blev udviklet af Ludwig og Eckstein til opløsningsfasetriphosphorylation af mononukleosider37. Triphosphorylation af oligonukleotider med dette reagens opnås på den faste fase ved phosphitylation af oligonukleotid 5′-hydroxyl, omdannelse til triphosphat ved reaktion med pyrophosphat og oxidation efterfulgt af standardprocedurer for spaltning af oligonukleotid fra den faste understøtning, debeskyttelse og oprensning (figur 1)28.

Figure 1
Figur 1: Skema for triphosphorylation af syntetiske oligonukleotider. I det første trin er oligonukleotid-5ʹ-hydroxylphosphitylateret med SalPCl. I det næste trin omsættes 5ʹ-salicylphosphit med TBAP for at danne den cykliske metaphosphit, derefter i det tredje trin oxideres for at generere det cykliske 5ʹ-trimetaphosphat i DNA / RNA-synthesizeroxidationsopløsning (0,1 M jod / pyridin /H2O / THF), som hurtigt hydrolyseres for at give det lineære 5ʹ-triphosphat i samme opløsning28,33, 37. Efterfølgende alkalisk spaltning fra den faste CPG-understøtning og debeskyttelse af oligonukleotid i vandig MeNH2/ammoniak vil hydrolysere ethvert resterende cyklisk trimetaphosphat til den lineære form. Forkortelser: SalPCl = salicylphosphorchloridit; TBAP = tributylammoniumpyrophosphat; THF = tetrahydrofuran; CPG = kontrolleret poreglas; MeNH2 = methylamin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Selvom tidligt offentliggjorte rapporter, der bruger denne metode, ofte led af dårlige udbytter og uønskede sideprodukter 28,37,38, er omhyggelig vedligeholdelse af vandfri forhold alt, hvad der er nødvendigt for rutinemæssigt at opnå høje udbytter. Dette kan opnås ved omhyggelig fremstilling af reagenser og anvendelse af en simpel reaktionsanordning samlet fra standard plastkomponenter. Her demonstrerer vi de passende trin til kemisk triphosphorylation af oligonukleotider, herunder fremstilling af reagenser, samling af reaktionskammeret, triphosphorylationsreaktionen og efterfølgende debeskyttelse og oprensning af de triphosphorylaterede oligonukleotider. Også inkluderet er den repræsentative anvendelse af 5′-triphosphorylaterede oligonukleotider som substrater for ligase ribozymer til syntese af større nukleinsyreprodukter med naturlige D-RNA og abiotiske L-RNA-rygrader.

Protocol

1. Automatiseret fastfasesyntese af 5′-hydroxyl oligonukleotider på en fast understøtning

  1. Forbered den automatiserede DNA / RNA-synthesizer med reagenser og phosphoramiditter i henhold til måloligonukleotidsammensætningen og instrumentinstruktionerne.
  2. Indlæs en syntesekolonne indeholdende solid-support på synthesizeren og syntetisere oligonukleotider i henhold til synthesizerinstrumentprotokollerne.
    BEMÆRK: Triphosphorylationsproceduren er optimeret for oligonukleotider fremstillet på 1 μmolskalaen.
  3. Fjern 5′-dimethoxytritylbeskyttelsesgruppen for at give det fastunderstøttede oligonukleotid 5′-hydroxyl som en del af oligonukleotidsyntesen i det foregående trin eller ved at udføre et terminalt detritylationstrin i henhold til synthesizerinstrumentprotokollerne.
  4. Kolonnen indeholdende 5′-hydroxyl oligonukleotid fjernes på fast støtte fra synthesizeren, tørres under et husvakuum i 10 minutter for at fjerne resterende opløsningsmiddel, og der fortsættes til triphosphorylation (afsnit 3 og 4), når der er fremstillet materialer til triphosphorylation (afsnit 2).
    BEMÆRK: Hvis den tørrede søjle ikke anvendes med det samme, kan den opbevares i normal atmosfære i en forseglet plastbeholder med tørremiddel ved -20 °C. Yderligere tørring er ikke nødvendig på dette stadium, da søjlen tørres grundigt inden trifosforylering i afsnit 3.

2. Forberedelse af materialer til triphosphorylation

  1. Fastgør en tør argonkilde med justerbart tryk til en gasmanifold med mindst to linjer, og tilslut til en bobler. Sørg for, at linjerne ender i 1 ml plastsprøjter for at lette forbindelsen til reaktionsapparatet.
  2. Saml udstyr, der skal bruges under triphosphorylation, herunder 1 ml plastsprøjter, en trevejs polypropylen stophane, noncoring nåle, 1,5 ml polypropylenrør og en lille metalspatel. Opbevar dem i en forseglet beholder eller tørremaskine med tørremiddel ved stuetemperatur i mindst 1 dag før brug.
  3. Der fremstilles 30 ml vandfri 1,4-dioxan, 3:1 dioxan:pyridin i volumen, N,N-dimethylformamid (DMF) og acetonitril (ACN) i tørrede 30 ml glasflasker med tørrefælder (4 Å molekylsigter i forseglede membranpakninger) mindst 1 dag før brug. Forsegl med gummisepta, og opbevar i en eksikator med tørremiddel.
  4. Fast 2-chlor-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-on (salicylphosphorchloridit, SalPCl) opbevares i den oprindelige beholder i en forseglet beholder med tørremiddel ved 4 °C. Skyl altid beholderen med argon mellem brug.
  5. Forbered en tributylammoniumpyrophosphatopløsning (TBAP) mindst 5 dage før triphosphorylationsreaktionen:
    1. Væg 1-5 g fast TBAP i en tørret 30 ml glasflaske og opløs i 1 ml DMF og 0,5 ml tributylamin pr. G TBAP.
    2. Tilsæt tre tørrefælder, forsegl flasken med en gummiseptum under argon, og boble med argon i 30 minutter for at afgasse.
    3. Opbevares inde i en forseglet krukke med tørremiddel ved 4 °C i 5 dage, så molekylsigterne kan absorbere alt sporvand. Opbevar krukken ved -20 °C og tilbered frisk efter 6 måneder.

3. Montering og anvendelse af triphosphorylationsapparatet

  1. Syntesekolonnen opvarmes til stuetemperatur, hvis den hentes fra lager ved -20 °C.
  2. Reaktionskammeret vist i figur 2 samles:
    1. Forbered forkammeret: Fjern stemplet fra en tør 1 ml sprøjte, skær toppen af sprøjten af med en saks eller et barberblad, og fastgør sprøjten til syntesekolonnen. Fastgør trevejs stophanen til toppen af sprøjten, og fastgør stophanens sideindgang til den tørre argonkilde med bobleren, så stophanens øverste indløb er reagensinjektionsporten.
    2. Fastgør dette apparat til et stativ med klemmer og forsegl alle opstrøms samlinger med voksforseglingsfilm. Juster stophanen, så injektionsporten er lukket, og apparatet er åbent for argonkilden. Luk bobleren, og lad argon ved lavt tryk (<10 psi) strømme gennem reaktionskammeret i 5 minutter.
      BEMÆRK: Flere reaktionskamre kan indstilles parallelt med triphosphorylat 2-4 oligonukleotider. Imidlertid bør en linje fra manifolden reserveres til levering af argon til reagensflaskerne.
    3. Åbn bobleren igen og fastgør en sprøjte til bunden af syntesekolonnen, som vil være affaldssprøjten. Træk argon gennem søjlen gentagne gange ved hjælp af affaldssprøjten; Sæt derefter sprøjten på igen med stemplet skubbet helt ind.
      BEMÆRK: Medmindre der lægges reagenser, skal stophanen indstilles således, at injektionsporten er lukket og apparatet åbent for argonkilden, som vist i figur 2A. På samme måde skal affaldssprøjten fastgøres og samlingen til syntesekolonnen forsegles med voksforseglingsfilm, medmindre reagenser fjernes aktivt.
  3. Sådan tilsættes et reagens eller opløsningsmiddel:
    1. Fastgør en nål til den tørre argonkilde, og indsæt den i reagens- eller opløsningsflaskeseptumet, og pas på ikke at nedsænke nålen i flaskens indhold.
    2. Saml en tør sprøjte med en nål og indsæt den i reagens- eller opløsningsmiddelflaskeseptum uden at nedsænke den i flaskeindholdet. Fyld sprøjten med argon, træk nålen ud af septumet, og udvis argonen. Fyld sprøjten med argon og udstød igen; Fyld derefter sprøjten med det krævede volumen opløsningsmiddel eller reagens under argontryk.
    3. Stophanen på apparatet justeres, så argonkilden er lukket, og injektionsporten er åben (figur 2B). Fjern hurtigt den fyldte sprøjte og kanylen fra kildeflasken, tør eventuelt opløsningsmiddel, der sidder fast på siden eller spidsen af nålen, væk, og sæt kanylen i injektionsporten. Udstød reagenset i apparatets forkammer, fjern nålen, og luk injektionsporten, og genåbn apparatet til argonkilden.
    4. Træk forsigtigt væsken fra forkammeret hele vejen gennem syntesekolonnen ved hjælp af affaldssprøjten, så al væske nu holdes i affaldssprøjten. Skub nu langsomt opløsningen op i syntesekolonnen igen, så du sikrer, at der ikke er gasbobler i søjlen. For at blande eller agitere skal du forsigtigt trække opløsningen op og ned over søjlen med affaldssprøjten.
      BEMÆRK: Flyt altid væske langsomt og forsigtigt gennem reaktionskammeret for at sikre, at ingen tætninger brydes, hvilket tillader luft at komme ind i apparatet.
  4. Sådan fjernes et reagens eller opløsningsmiddel fra søjlen:
    1. Træk langsomt opløsningen ind i affaldssprøjten. Når størstedelen af opløsningen er passeret ind i affaldssprøjten, trækkes argon igennem for at skylle det resterende opløsningsmiddel fra søjlen.
    2. Fjern voksforseglingsfilmen omkring affaldssprøjteleddet, fjern derefter sprøjten og kassér affaldsopløsningen. Udskift affaldssprøjten med en ny, tør sprøjte, og gense leddet med voksforseglingsfilm.

Figure 2
Figur 2: Triphosphorylation apparatur. Under blanding eller reaktioner er enheden (A) åben for argonkilden (i) og lukket for luften ved at justere trevejsstophanen (ii). Reagenser trækkes fra forkammeret (iii) ind i syntesekolonnen (iv) ved hjælp af affaldssprøjten (v). Reagenser fjernes ved at trække al væske ind i affaldssprøjten (v) og kassere den. Ved ilægning af reagenser (B) er trevejsstophanen (ii) åben for atmosfæren, og reagenset lægges i forkammeret (iii) ved hjælp af en sprøjte og nål (vi). (C) Et fotografi af det samlede apparat, der er indstillet som i (A) til reagensblanding og reaktion. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Triphosphorylation i kolonnen af syntetisk 5′-hydroxyl oligonukleotid

  1. Fjern SalPCl- og TBAP-opløsningen fra lageret ved -20 °C, og lad dem varme op til stuetemperatur før brug.
  2. Der tilsættes 200 μL pyridin/dioxan til forkammeret i henhold til trin 3.3.1-3.3.3. Der må dog ikke hældes solvens på syntesekolonnen før trin 4.4.
  3. Brug en tør metalspatula til at veje 6-12 mg SalPCl i et tørt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og opløs i 100 μL dioxan ved forsigtigt at syre opløsningsmidlet op og ned i mikrocentrifugerøret.
  4. Den opløste SalPCl føjes til forkammeret, og den lægges på syntesekolonnen i trin 3.3. Lad det reagere i 15 minutter, og omrør opløsningen hvert 5. minut. Fjern og kassér SalPCl-opløsningen i henhold til trin 3.4.
    BEMÆRK: SalPCl tilsættes i stort overskud og vil rense alt vand, der absorberes under klargøring og indlæsning i reaktionskammeret. Indførelsen af fugt under trin 4.5 og 4.6 vil imidlertid kompromittere det endelige oligonukleotid 5′-triphosphatudbytte.
  5. Der tilsættes 250 μL TBAP-opløsning til forkammeret, og det lægges på syntesekolonnen i trin 3.3. Lad den reagere i 20 min, agitere hvert 5. minut. Tbap-opløsningen fjernes og kasseres i henhold til trin 3.4.
  6. Kolonnen vaskes med 0,5 ml DMF og derefter 0,5 ml ACN, og opløsningsmidlet fjernes efter hver tilsætning i henhold til trin 3.3 og 3.4.
  7. Der tilsættes 250 μL oxidationsmiddelopløsning (0,1 M jod i tetrahydrofuran (THF)/pyridin/vand, 88:10:2) til forkammeret, og det anbringes på syntesekolonnen efter trin 3.3. Lad den reagere i 30 min, agitere hvert 10. minut. Oxidationsopløsningen fjernes og kasseres i henhold til trin 3.4.
  8. Vask søjlen med 0,5 ml ACN og fjern den i henhold til trin 3.3 og 3.4.
  9. Demonter reaktionsapparatet. Syntesekolonnen vaskes med 5 ml ACN og tørres.

5. Spaltning fra fast støtte, beskyttelse og oprensning

  1. Fjern den tørrede faste støtteharpiks fra syntesekolonnen, og overfør den til et 1,5 ml polypropylen skruelåg, der kan forsegles, med en silikone o-ring.
  2. Suspender harpiksen i 1 ml af en 1: 1 blanding af 28% -30% vandig ammoniak og 40% vandig methylamin (AMA) og forsegl røret tæt. Inkuberes ved 65 °C i 10 minutter med intermitterende blanding ved blid inversion39. Brug en mildere behandling ved stuetemperatur i 2 timer for oligonukleotider længere end 40 nt.
    FORSIGTIG: Opvarmning af AMA-opløsningen sætter røret under højt tryk. Hvis røret ikke er forseglet tæt eller ikke bruger en ammoniakkompatibel (silikone) o-ring, kan røret udlufte gas eller lække opløsningsmiddel, hvilket potentielt kan kompromittere sikkerheden eller slutproduktets udbytte. Åbn aldrig røret, mens det er over omgivelsestemperaturen, da varm AMA-opløsning kan udvikle gas voldsomt.
  3. Afkøl røret på is og centrifuger det kortvarigt (6.000-12.000 × g i 10 s). Fjern supernatanten fra harpiksen, filtrer gennem en sprøjte udstyret med et 0,2 μm filter, og overfør til et nyt, sterilt polypropylenrør. Opløsningen inddampes til tørhed ved hjælp af en vakuumcentrifuge forsynet med en ammoniakneutraliserende kemisk fælde.
    BEMÆRK: Hvis det syntetiske oligonukleotid ikke indeholder RNA-nukleotider med 2′-silylbeskyttende grupper, skal du springe til trin 5.8.
  4. Silylbeskyttende grupper fjernes ved at opløse det tørrede materiale i 1 ml 1 ml tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) i THF, opvarmes til 55 °C, omrystes om nødvendigt for at opløse oligonukleotidet helt, og der inkuberes ved stuetemperatur i 16-24 timer40,41.
  5. Sluk TBAF-opløsningen med 1 ml 1 M Tris-buffer, pH 7,5, og THF fjernes ved hjælp af en vakuumcentrifuge.
  6. Fjern TBAF-salte ved hjælp af en kolonne med udelukkelse af engangsstørrelse ved at følge producentens anvisninger. For oligonukleotider, der er kortere end 15 nt, bekræftes eluering af produktet ved at opsamle eluatet i fraktioner og identificere de vigtigste produktfraktioner ved absorbans ved 260 nm på et UV-Vis-spektrofotometer.
  7. Koncentrer det debeskyttede RNA-oligonukleotid ved lyofilisering eller vakuumcentrifuge, hvis det er mindre end 15 nt, eller ved ethanoludfældning, hvis det er større end 15 nt.
  8. Forbered en præparativ skala 10% -20% polyacrylamid / 8 M urinstof / 1x TBE gel ved hjælp af 19: 1 mono: bis acrylamidbestand i henhold til de relevante protokoller for oligonukleotidstørrelse, gelplade og stativ. Gelpladen samles i gelstativet med 1x TBE i reservoirer og forkøres ved 35 W (eller alt efter hvad der er relevant for gelpladeformat) i mindst 30 min.
  9. Det faste oligonukleotid opløses i ureagelbelastningsbuffer (8 M urinstof, 10% saccharose, 50 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA med bromophenol og xylencyanolløbende farvestoffer) og opvarmes til 80 °C. Polyacrylamidgelen hældes på, og der køres i 1-2 timer ved 25-35 W (eller alt efter hvad der er relevant for gelpladeformatet og oligonukleotidstørrelsen).
    BEMÆRK: Bromophenolblå eller xylencyanol bør udelukkes fra gelbelastningsbufferen for oligonukleotider kortere end 15 nt, hvis en af dem migrerer med produktet, da det er vanskeligt at fjerne disse farvestoffer fra det eluterede oligonukleotid uden ethanoludfældning.
  10. Når gelelektroforese er afsluttet, skal du fjerne gelpladen fra gelstativet, adskille gelpladen og pakke gelen ind i polyvinylchloridfilm. Identificer produktbåndene ved at skygge tilbage med 254 nm UV-lys, og skær det vigtigste produktbånd ud ved hjælp af et barberblad.
  11. Oligonukleotidet udtages af den udskårne gel ved hjælp af knusnings- og blødgøringsmetoden42.
    1. Knus den udskårne gel ved at ekstrudere den gennem en plastsprøjte eller mekanisk.
    2. For oligonukleotider, der er længere end 15 nt:
      1. Elut i 3x volumener af knuse- og blødgøringsbuffer (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) i mindst 12 timer ved omrøring eller omrystning.
      2. Faste gelstykker fjernes ved at føre opløsningen gennem en sprøjte forsynet med et 0,2 μm filter, og oligonukleotidet koncentreres ved udfældning af ethanol.
    3. For oligonukleotid kortere end 15 nt:
      1. Elut i 3x volumener nukleasefrit vand i mindst 12 timer med omrøring eller omrystning.
      2. Faste gelstykker fjernes ved at føre opløsningen gennem en sprøjte forsynet med et 0,2 μm filter og koncentreres ved frysetørring.
      3. Resterende salte og opløste stoffer fjernes ved hjælp af en kolonne til udelukkelse af engangsstørrelse som i trin 5.6. Koncentrer ved frysetørring.
  12. Rensede triphosphorylaterede oligonukleotider opbevares ved -20 °C i TE-buffer (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) eller i en lignende oligonukleotidlagringsbuffer.
    1. Koncentrationen af oligonukleotid bestemmes ved at måle absorbansen ved 260 nm ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer.
      BEMÆRK: Oligonukleotidets estimerede udryddelseskoefficient bør ikke påvirkes af dets 5′-phosphoryleringstilstand og kan beregnes ud fra dets sekvens ved hjælp af en oligonukleotidudryddelseskoefficientberegner.
    2. Trifosforylering kontrolleres ved massespektrometri. Se efter en forventet masse på +239,94 Da i forhold til 5′-hydroxyl oligonukleotid.
      BEMÆRK: Enten matrixassisteret laserdesorption/ionisering eller elektrosprayioniseringsmassespektrometri (henholdsvis MALDI-MS eller ESI-MS) er egnede til at identificere oligonukleotidets triphosphorylationstilstand ved anvendelse af protokoller optimeret til nukleinsyrer. ESI-medlemsstaterne giver imidlertid mere ensartede resultater på grund af lavere grad af ionfragmentering. en repræsentativ kommerciel service leveres i materialetabellen.

6. Triphosphorylaterede oligonukleotider som substrater til ribozym selvreplikation

FORSIGTIG: 32P er en radioaktiv isotop, og følgende trin skal udføres ved hjælp af standard sikkerhedsprotokoller til arbejde med radioaktive materialer i et laboratorium og af en forsker, der er certificeret til brug af radioaktive materialer af de relevante miljøsundheds- og sikkerhedsafdelinger. Som et alternativ kan selvreplikerende ribozymsubstrat A fremstilles syntetisk med en 5′-fluorescein etiket14 og afbildes fluorescerende som i trin 7.9.

  1. Opløsning A fremstilles som en blanding af selvreplikator ribozym E og 5′-32P-mærket RNA-substrat A14 til koncentrationer på henholdsvis 0,30 μM og 30 μM. Der fremstilles opløsninger B-transskriberet og B-syntetisk med 15 μM triphosphorylateret RNA-substrat B, fremstillet ved in vitro transkription 14 eller kemisk triphosphorylation som ovenfor i henholdsvis 75 mM EPPS-buffer, pH 8,5 og 37,5 MgCl2. Begge opløsninger bringes op på 42 °C.
    BEMÆRK: Alle RNA-komponenter er angivet i materialetabellen.
  2. For at starte selvreplikation blandes hurtigt 5 μL opløsning A med 10 μL opløsning B-transskriberet eller B-syntetisk til en slutkoncentration på 0,1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mMMgCl2 og 50 mM EPPS-buffer, pH 8,5. Reaktionsblandingen inkuberes ved 42 °C.
  3. Med jævne mellemrum tages 0,5 μL alikvoter og slukkes i 9,5 μL formamidgelbelastningsbuffer (95% formamid; 10 mM EDTA, pH 8).
  4. Der fremstilles en analytisk polyacrylamid/8 M urea/1x TBE gel i henhold til passende protokoller for gelpladen og stativet. Saml den støbte gel og pladen i et gelstativ, fyld reservoirerne med 1x TBE, og kør den på 40 W (eller efter behov for forskellige gelplader og stativer) i 30 min.
  5. De slukkede reaktionsprøver opvarmes til 80 °C, der fyldes 5 μL af prøven i hvert hul, og gelen køres ved 40 W i ca. 40 minutter (eller eventuelt for forskellige gelplader og stativer).
  6. Fjern gelpladen fra gelstativet, demonter og pakk gelen i polyvinylchloridfilm. Dæk gelen med en fosforskærm og udsæt den i 1 time (eller efter behov for 32P cpm); scan skærmen ved hjælp af en fluorescerende / fosforescerende gelscanner.
  7. Kvantificer reaktionsudbyttet ved hjælp af software til kvantificering af gelbilleder.
    1. Åbn gelbilledet ved hjælp af analyseværktøjskassen, vælg Analyse | Figurdefinition, vælg Områder | rektangelformen, og tegn rektangler af samme størrelse omkring bånd svarende til ikke-reageret A og produkt E for hver gang og begge reaktioner.
    2. Vælg analyse | Baggrundssubtraktion, vælg Områder | rektangelformen, og tegn et rektangel af samme størrelse i en tom del af gelbilledet. Skift baggrundsstubktionsmetoden for alle rektangler til Billedrektangel.
    3. Vælg Vindue | 2 Områdevindue og derefter Rediger | Eksportér til Excel for at eksportere de kvantificerede båndpixelvolumener til en regnearksfil.
  8. Plot koncentrationen af produkt E versus tid, og tilpas dataene til den logistiske vækst Eq (1) ved hjælp af statistisk datatilpasningssoftware:
    [E] = Equation 1 (1)
    Hvor a er reaktionens maksimale omfang, er b graden af sigmoidicity, og c er eksponentiel vækstrate.
    1. I det eksporterede regneark skal du dividere produkt E-volumenet med summen af substrat A- og produkt E-volumener for at bestemme det fraktionerede udbytte af produktet for hver gang og begge reaktioner. Multiplicer med den oprindelige koncentration af substrat A (10 μM) for at bestemme udbyttet af produkt E som funktion af tiden.
    2. I software til tilpasning af statistiske data skal du vælge Filer | Ny | Ny projektfil, vælg XY under Ny tabel og graf, og klik på Opret. Indtast reaktionstiderne og produkt E-udbyttet for begge reaktioner i tilstødende kolonner og etiketkolonner tilsvarende (f.eks. "tid", "transskriberet B", "syntetisk B").
    3. Vælg Indsæt | Ny analyse, vælg XY-analyser | Ikke-lineær regression (kurvetilpasning), og klik derefter på OK. Vælg vækstkurver | Logistisk vækst og klik OK; Juster ikke andre parametre. Overhold tilpasningsparametrene og konfidensintervallerne under Resultater og plottet af datapunkter og tilpassede kurver under Grafer.

7. Kryds-chiral kopiering af L-RNA

  1. Der fremstilles 10 μL RNA-opløsning indeholdende 20 μM D-RNA 27,3t tværknal polymerase, 2 μM 5′-fluorescein-mærket L-RNA-primer, 4 μM biotinyleret L-RNA hammerhead-skabelon og 20 μM hver af L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG og pppCGC i 10 μL 50 mM Tris, pH 8,3. Udglød RNA'et ved at opvarme det til 90 °C i 1 minut og afkøle til 23 °C ved 0,2 °C/s i en PCR-termocyklist. Se materialetabellen for detaljer om polymerase, primer og skabelon.
  2. RNA-opløsningen inkuberes ved 17 °C, og reaktionen startes ved at tilsætte 10 μL 2x startbuffer (400 mM MgCl2, 500 mM NaCl og 50 mM Tris, pH 8,3). Det sikres, at de endelige koncentrationer af alle reaktionskomponenter er 10 μM polymerase, 1 μM primer, 2 μM skabelon, 10 μM hvert trinukleotid 5′-triphosphat, 200 mM MgCl2, 250 mM NaCl og 50 mM Tris, pH 8,3.
  3. Efterhånden som reaktionen fortsætter, skal du tage 10 μL aliquoter og slukke med 5 μL 0,5 M EDTA, pH 8.
  4. Til hver slukket reaktionsprøve tilsættes 0,1 mg streptavidinbelagte magnetiske perler (20 pmol biotin-oligonukleotidbindingskapacitet) suspenderet i 10 μL 1 M NaCl i TE-buffer med 0,05% neutralt vaskemiddel for at fange trimer-forlængede primere via den biotinylerede skabelon og inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur med omrystning.
  5. Indfang perlerne på en perleopsamlingsmagnet, fjern og kassér væske, og tilsæt 50 μL vaskeopløsning (250 mM NaCl i TE med 0,05 % neutralt rengøringsmiddel). Bland perlerne, fang dem igen, og fjern vaskeopløsningen. Gentag endnu en gang.
  6. For at eluere udvidede primere fra perler tilsættes 50 μL elueringsopløsning (25 mM NaOH med 0,05% neutralt rengøringsmiddel) og blandes perlerne. Genfang perlerne, fjern elueringsopløsningen, sluk med 100 mM Tris (pH 7,5), og udfældes med ethanol.
  7. Der fremstilles en analytisk polyacrylamid/8 M urea/1x TBE gel i henhold til de relevante protokoller for gelpladen og stativet. Saml den støbte gel og pladen i et gelstativ, fyld reservoirerne med 1x TBE, og kør den på 40 W (eller efter behov for forskellige gelplader og stativer) i 30 min.
  8. Opløs det udfældede RNA i 10 μL formamidgelbelastningsbuffer, og forbered ikke-reageret endemærket primer ved 0,5 μM i formamidgelbelastningsbuffer. Varm prøverne op til 80 °C, der fyldes 5 μL af prøven i hver brønd, og gelen køres ved 40 W i ca. 40 minutter (eller efter behov for forskellige gelplader og stativer).
  9. Fjern gelpladen fra stativet, og scan ved hjælp af en fluorescerende / fosforescerende gelscanner for at visualisere krydskirale L-RNA-forlængelsesprodukter.

Representative Results

Oligonukleotider bør syntetiseres ved hjælp af standardprotokoller, der passer til phosphoramiditterne og den automatiserede DNA/RNA-synthesizer, hvorved produktet oligonukleotid ikke er omdannet fra den faste understøtning i den oprindelige plastsyntesekolonne, med den 5%-terminale dimethoxytritylgruppe fjernet for at give den frie 5ʹ-hydroxyl (afsnit 1). Alle oligonukleotider, der blev anvendt i denne demonstration, blev fremstillet under anvendelse af 1.000 Å kontrolleret poreglas (CPG) harpiks som fast støtte og udført på 0,2 eller 1 μmol skala. Repræsentative eksempler på synthesizerkolonner, harpikser, reagenser og phosphoramiditter findes i materialetabellen. For større reaktioner kan det være nødvendigt at justere mængder og tidspunkter, der anvendes i efterfølgende trin.

Trifosforyleringsreaktionen udføres på søjlen i et specialbygget reaktionskammer (figur 2, afsnit 3) ved hjælp af standard, kommercielt tilgængelige komponenter, der er anført i materialetabellen , og følger skemaet illustreret i figur 1 (afsnit 4)28. Det er vigtigt, at forholdene holdes strengt vandfri under trifosforylering, og at alle opløsningsmidler og reagenser fremstilles over molekylære sigter på forhånd og får lov til at tørre helt inden brug (punkt 2). Trifosforylering tager typisk 2 timer at forekomme, og derefter kan den vaskede og tørrede søjle behandles i henhold til standard oligonukleotidbeskyttelses- og rensningsprocedurer (afsnit 5).

Efter debeskyttelse renses oligonukleotidtrifosfater ved denaturering af polyacrylamidgelelektroforese (PAGE), der viser et enkelt større produktbånd ved UV-back-shadowing, der kan udskæres og elueres fra gelen. 5′-triphosphatproduktet adskilles let fra reaktionssideprodukter for korte oligonukleotider, som vist for DNA-trinukleotid-5ʹ-triphosphater, pppAAA og pppCCC og L-RNA-trinukleotid 5ʹ-triphosphat pppGAA i figur 3A,B. Både 5′-hydroxyl- og 5′-trifosfatprodukterne til AAA- og CCC-DNA-trimere blev udskåret og identificeret ved massespektrometri og tilsvarende mærket i figur 3A. Yderligere bånd, som er synlige for AAA DNA-trimeren, indeholder generelt ikke nok materiale til at genvinde og identificere. Tilstedeværelsen af disse bånd korrelerer imidlertid med yderligere produktmasser i de urensede reaktionsprodukter (figur 3C), der typisk repræsenterer 5′-diphosphat-, monophosphat- og H-phosphonatsideprodukter, som diskuteret nedenfor.

Efter PAGE-rensning kan større oligonukleotider elueres ved hjælp af knusnings- og blødgøringsmetode42 og efterfølgende ethanoludfældning. Oligonukleotider under 15 nt kan imidlertid ikke udfældes effektivt og kræver derfor en modificeret procedure for gelelvstudledning (trin 5.11.3). Kolonnen med udelukkelse af engangsstørrelse, der er anført i materialetabellen, er kun klassificeret til brug med oligonukleotider, der er længere end 10 nt. Vi har imidlertid fundet ud af, at oligonukleotider så korte som trimere effektivt kan afsaltes ved hjælp af producentens anbefalede protokol. Ikke desto mindre anbefales det ved afsaltning af korte oligonukleotider (som i trin 5.6 og 5.11.3), at kolonne-eluatet opsamles i fraktioner, og produktfraktioner identificeres ved absorbans ved 260 nm ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer. En størrelsesekskluderingskolonne optimeret til kortere oligonukleotider findes i materialetabellen som et alternativt valg. Det endelige udbytte fra oligonukleotidsyntese i 1 μmolskala efter oprensning er 50-300 nmol.

Triphosphorylation kan bekræftes ved massespektrometri, hvor det triphosphorylaterede produkt har en masse +239,94 Da større end 5′-hydroxyl oligonukleotid, selvom tilstedeværelsen af materialer svarende til 5′-di- og monophosphat (henholdsvis+159,96 og +79,98 Da) ofte observeres. Et 5′-H-fosfonatsideprodukt med en masse +63,98 Da fra 5′-OH-massen kan også observeres, og høje niveauer af dette produkt indikerer, at forholdene under triphosphorylation ikke var tilstrækkeligt vandfri. Før rensning vil debeskyttede oligonukleotider typisk vise alle disse produkter (figur 3C), mens renset materiale vil vise en top svarende til 5′-triphosphatproduktet sammen med 5′-di- og monophosphater (figur 3D, E).

Massespektrometri alene vil typisk ikke give en streng måling af 5′-triphosphat renhed på grund af forskellige ioniseringshastigheder og fragmentering af trifosfatet under ionisering. For at måle slutproduktets renhed anbefales omvendt fase væskekromatografi og tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS), især for længere oligonukleotider. Analyse af D-RNA 5ʹ-trifosfater pppACGAGG og pppGAGACCGCAACUUA af RP-LC/ESI-MS (henholdsvis figur 4A,B) viser typisk slutproduktrenhed, der indeholder 20% 5ʹ-diphosphat, da disse to arter er vanskelige at adskille, når de er til stede på længere oligonukleotider.

Syntetiske 5′-triphosphat oligonukleotider fungerer typisk lige så godt eller bedre end materialer fremstillet enzymatisk i biokemiske undersøgelser. I afsnit 6 blev 5′-triphosphat 14 nt RNA-substrater fremstillet enten syntetisk eller ved in vitro-transkription som et eksempel sammenlignet i en RNA-katalyseret selvreplikationsreaktion 14,15,43,44,45. Ribozyme E katalyserer sammenføjningen af substrater A og B for at give en ny kopi af E i en autokatalytisk reaktion, der er i stand til eksponentiel vækst (figur 5A). E- og 32P-mærkede A-komponenter blev fremstillet ved in vitro-transkription, og triphosphorylateret substrat B blev fremstillet enten syntetisk, som beskrevet ovenfor, eller ved in vitro transkription 14. Selvreplikationsreaktionsfremskridt blev overvåget ved at tage periodiske prøver, der blev analyseret ved denaturering af PAGE og kvantificeret via en fluorescerende / fosforescerende gelscanner. De resulterende data, der passer til en logistisk vækstfunktion, afslørede, at enten transskriberet eller syntetisk B-substrat understøtter eksponentiel vækst, men syntetisk B giver en lidt større mængde produkt (figur 5B). Dette resultat kan afspejle sammensætningsmæssig heterogenitet ved 5′-enden af RNA fremstillet ved in vitro transkription 23,24.

Kemisk triphosphorylation muliggør også syntese af oligonukleotidtrifosfater, der ikke kan fremstilles biologisk, hverken in vitro eller i celler. I afsnit 7 blev nonbiologiske oligonukleotidtrifosfater sammensat af L-RNA, enantiomeren af naturligt D-RNA, fremstillet som i afsnit 1-5, anvendt som substrater for D-RNA "cross-chiral" polymerase ribozym 27.3t (figur 6A), som katalyserer den skabelonstyrede polymerisation af et længere L-RNA-produkt fra korte L-RNA oligonukleotid 5′-trifosfater på en sekvens-generel måde. Som et eksempel kan ribozymet syntetisere en L-RNA-version af hammerhead-selvspaltningsmotivet (figur 6B)18. Rensede L-RNA trinukleotidtrifosfater blev kombineret med en fluorescein-mærket L-RNA-primer og L-RNA-skabelon (figur 6C) og reagerede med den tvær-chirale ligase. Prøver i løbet af reaktionen blev analyseret af PAGE og afbildet ved hjælp af en fluorescerende / fosforescerende gelscanner for at demonstrere syntese af en L-RNA-version af hammerhead-ribozymet kodet af skabelonen (figur 6D).

Figure 3
Figur 3: Oprensning af trinukleotid-5-trifosfater. (A) PAGE-analyse (visualiseret ved UV-back-shadowing) af triphosphorylation af DNA-trinukleotider tri-deoxyadenosin (AAA, blå) og tri-deoxycytidin (CCC, rød), bevidst overbelastet for at visualisere mindre sideprodukter. Både 5ʹ-trifosfatproduktet (ppp) og 5ʹ-hydroxyl (OH) udgangsmateriale blev udskåret og identificeret af MALDI-MS. (B) Forberedende PAGE af triphosphorylation af L-RNA trinukleotid GAA, med større produktbånd udskåret og identificeret som 5ʹ-triphosphat (ppp) af ESI-MS. C) MALDI-MS af rå reaktionsprodukter efter debeskyttelse og D) rensede produkter fra (A). 5ʹ-trifosfat (ppp; pppAAA forventet 1.119 Da, observeret 1.118 Da; pppCCC forventet 1.047 Da, observeret 1.046); 5ʹ-diphosphat (pp), 5ʹ-monophosphat (p), 5ʹ-hydroxyl (OH) og 5ʹ-H-fosfonat (Hp) er mærket. (E) Dekonvoluteret massespektrum fra direkte injektion ESI-MS af isoleret 5ʹ-triphosphatprodukt fra (B) med identificerede toppe mærket (forventet 1.181,6 Da, observeret 1.181,0 Da). 5ʹ-diphosphat (pp) produkter observeres også, ligesom natriumion toppe for både tri- og di-phosphatprodukter (+22 Da). Almindelige forurenende toppe er mærket med en stjerne. For at lette sammenligningen blev massespektre normaliseret til den højeste intensitet målt i hvert spektrum og rapporteres som en procentdel i forhold til denne værdi. Forkortelser: PAGE = polyacrylamidgelelektroforese; MALDI-MS = matrixassisteret laserdesorption/ionisering; ESI-MS = elektrospray ionisering massespektrometri. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analytisk RP-LC af 6 nt og 14 nt D-RNA oligonukleotidtrifosfater. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ og (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS identificerede den største top af begge (~ 70%) som 5ʹ-trifosfat (ppp) med mindre mængder af 5ʹ-diphosphat (pp). Forkortelser: RP-LC = omvendt fase væskekromatografi; nt = nukleotider; ESI-MS = elektrospray ionisering massespektrometri. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning af oligonukleotid-5-triphosphatsubstrater fremstillet ved kemisk syntese eller in vitro-transkription. (A) Det selvreplikerende ribozym E ligater RNA A og 5′-triphosphorylateret RNA B. (B) Sammenligning af selvreplikationsreaktioner ved anvendelse af 10 μM A og 10 μM B, enten syntetisk (åbne cirkler) eller in vitro transskriberet (fyldte cirkler). (B) Data var egnede til den logistiske vækstligning: [E] = a / (1 + b e-ct), hvor a er det endelige udbytte, b er graden af sigmoidicity, og c er den eksponentielle vækstrate. Vækstraterne for de to reaktioner var identiske, ved 1,14 h-1, mens det endelige omfang var 10% højere for reaktioner med syntetisk B. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Tværklang L-RNA-polymerisation med et ribozym. (A) D-RNA 27.3t polymerase ribozym, som katalyserer skabelonafhængig ligering af L-RNA. (B) L-RNA-produktet syntetiseret med 27,3t udgør en del af et hammerhead-endonukleasemotiv. (C) L-RNA-polymerisation katalyseret med 27,3t ved anvendelse af en biotinyleret L-RNA-skabelon (brun), en endemærket L-RNA-primer (magenta) og fire L-RNA-trinukleotidtrifosfater (cyan), fremstillet syntetisk. (D) PAGE-analyse af forlængelsesprodukter af (B) ved 4 timer og 24 timer, der viser hver trinukleotidinkorporering op til produkt i fuld længde (sort prik). Ikke-reageret L-RNA-primer er inkluderet som en referencemarkør. Forkortelser: PAGE = polyacrylamidgelelektroforese; M = referencemarkør. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Triphosphorylationsproceduren beskrevet her er stort set kompatibel med oligonukleotidsyntese ved anvendelse af standard phosphoramiditkemi. Nukleosidphosphamiditter bør have base-labile beskyttelsesgrupper, der er kompatible med hurtig debeskyttelse i AMA39, herunder standard β-cyanoethyl på phosphiten og isobutyryl, dimethylformamidyl, acetyl, phenoxyacetyl eller 4-isopropylphenoxyacetylgrupper på de exocykliske aminer i nukleobaserne. Ribose 2'-hydroxylgrupper bør beskyttes af silylbeskyttende grupper, enten t-butyldimethylsilyl (TBDMS) eller tri-iso-propylsilyloxymethyl (TOM)40,41. Den base-labile pivaloyloxymethyl (PivOM) gruppe er også blevet rapporteret at være kompatibel med kemisk triphosphorylation30.

Der er beskrevet flere metoder til kemisk triphosphorylation af syntetiske oligonukleotider 28,29,30,31,32,33,34,35. Vi har fundet triphosphorylation ved hjælp af Ludwig-Eckstein reagens37 at være en af de mest tilgængelige, der ikke kræver nogen specialiseret syntese af reagenser og intet specialudstyr. Oligonukleotid-5′-trifosfater fremstillet ved denne metode er rutinemæssigt blevet anvendt som substrater for RNA-ligase-ribozymer, herunder anvendelse af enzymatisk utilgængelige L-RNA-oligonukleotidtrifosfater for at opnå skabelonafhængig syntese og replikation af denne "spejlbillede" nukleinsyre 14,16,17,18 . Metoden er også velegnet til fremstilling af små 5′-triphosphorylaterede stamme-loop RNA'er, der er potente aktivatorer af det medfødte immunrespons hos hvirveldyr 6,7.

Ludwig-Eckstein-reagenset, salicylphosphorchloridit37, er stærkt reaktivt over for vand og renser effektivt alt vand, der indføres ved opløsning af reagenset, inden det lægges på oligonukleotidkolonnen. Efter dette punkt vil det 5′-phosphitylaterede oligonukleotid imidlertid fortrinsvis reagere med ethvert vand, der indføres i systemet over pyrophosphat, og danne et 5′-H-fosfonatsideprodukt efter oparbejdning 28,37,38. Omhyggelig fremstilling af triphosphorylationsreagenser og triphosphorylationsreaktionskammeret sikrer, at dette sideprodukt ikke dannes. Til tørring af opløsningsmidler sælges type 4 Å molekylærsigte færdigpakket i teflonposer, der er kompatible med de fleste organiske opløsningsmidler under forskellige varemærker af de fleste oligonukleotidsyntesereagensfirmaer. Yderligere forholdsregler, såsom at udføre triphosphorylation i et handskerum under en vandfri atmosfære, er generelt ikke nødvendige.

Reaktion af 5′-phosphitylateret oligonukleotid med TBAP danner et cyklisk 5′-trimetaphosphit-mellemprodukt, som derefter oxideres til det cykliske 5′-trimetaphosphat ved anvendelse af oligonukleotidsynteseoxidatoropløsning (jod i vand / pyridin / THF). Det skal bemærkes, at kommercielle oxidationsopløsninger anvender varierende mængder jod, og det er vigtigt at anvende den høje 0,1 M jodkoncentration for at sikre fuldstændig oxidation til triphosphatet. Det cykliske produkt hydrolyseres til det endelige lineære 5′-triphosphat i samme opløsning37, og der skal anvendes alternative vandfri oxidationsopløsninger, hvis der ønskes linearisering med andre nukleofiler end vand (se nedenfor for anvendelser)33. Ethvert resterende cyklisk trimetaphosphat vil imidlertid blive lineariseret under efterfølgende alkalisk debeskyttelse af oligonukleotid. Hydrolyse af det cykliske 5′-trimetaphosphat giver kun det lineære snarere end forgrenede trifosfat37,46.

Oligonukleotidbeskyttelse behøver typisk ikke at blive ændret for at rumme 5′-triphosphorylation, men der bør tages et par forholdsregler. Trifosfatet er relativt stabilt til kort eksponering for alkaliske tilstande, men man skal passe på ikke at udsætte trifosfatet for AMA længere end nødvendigt. Beskyttelse af grupper, der kræver mere langvarig behandling med ammoniak eller AMA i mere end 10 minutter ved 65 °C, bør undgås. Mere skånsomme behandlinger, såsom 2 timer i ammoniak ved stuetemperatur, er acceptable, når de er kompatible med andre phosphoramiditbeskyttende grupper. En almindelig, hurtig debeskyttelsesmetode til silylbeskyttet syntetisk RNA-oligonukleotider bruger triethylamintrihydrofluorid og høj temperatur47; Dette bør dog undgås ved fremstilling af RNA 5′-trifosfater, da de langvarige sure betingelser viser sig at fremskynde trifosfathydrolyse31,32.

Forberedende PAGE har vist sig at være den enkleste og mest pålidelige metode til postdebeskyttelsesrensning af 5′-triphosphorylaterede oligonukleotider (figur 3 og figur 4). Imidlertid kan præparativ omvendt fase HPLC også bruges til at rense triphosphorylaterede produkter. Tilstedeværelsen af 5′-diphosphat og i mindre grad 5′-monophosphatprodukter observeres rutinemæssigt ved verifikation af triphosphorylation ved massespektrometri. Vi har observeret 5′-triphosphatfragmentering under massespektrometri fra meget rent materiale fremstillet ved kemisk syntese eller transkription, især hvis instrumentet ikke er optimeret til analyse af oligonukleotider. Ikke desto mindre viser RP-LC-analyse ofte, at 10%-20% af 5′-diphosphat-sideproduktet er til stede i længere 5′-triphosphorylaterede oligonukleotider (figur 4). Kommercielle præparater af tributylammoniumpyrophosphat kan være forurenet med så meget som 20% monophosphat, hvilket vil give 5′-diphosphat som et sideprodukt under triphosphorylation30,31. Omhyggelig forberedelse af dette reagens internt kan give meget mere rene TBAP-lagre31. Vi har imidlertid fundet, at oligonukleotider triphosphorylateret ved anvendelse af kommercielle kilder til TBAP stadig viser sammenlignelig eller større reaktivitet, når de anvendes som substrater i enzymatiske reaktioner (figur 5B) sammenlignet med materiale fremstillet ved in vitro transkription.

En bemærkelsesværdig yderligere anvendelse af oligonukleotidtriphosphorylation med Ludwig-Eckstein-reagenset udnytter det cykliske trimetaphosphit-mellemprodukt33. Hvis det efterfølgende oxidationstrin udføres med 1 M t-butylperoxid i hexaner, som ofte anvendes til oligonukleotidoxidation under vandfri betingelser, forekommer oxidation af phosphiten uden ringåbningshydrolyse, hvilket giver det cykliske trimetaphosphat. Dette mellemprodukt kan derefter omsættes med primære amin- eller alkoholnukleofiler for at give 5′-trifosfater med modifikationer ved γ-fosfat. Disse modifikationer indbefatter tilsætning af et lipofilt mærke bundet af en phosphoramidatbinding, hvilket letter hurtig triphosphatspecifik oprensning ved RP-LC efterfulgt af sur hydrolyse af mærket fratriphosphatet 33. Fluorescerende modifikationer i γ-fosfatpositionen kan også introduceres til brug som realtids fluorescerende reportere til ribozyme-katalyserede ligeringsreaktioner15,33.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski og Katrina Tjhung for nyttige diskussioner om bedste praksis for kemiske trifosforyleringsreaktioner og til Gerald Joyce for nyttige kommentarer. Dette arbejde blev støttet af tilskud MCB 2114588 fra National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm polyethersulfone syringe filter MilliporeSigma SLMP025SS Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5)
0.22 µm PTFE syringe filter MilliporeSigma SLLG013SL Syringe filter for removing CPG resin (Section 5)
1 mL plastic syringes ThermoFisher Scientific 14-823-434 (BD 309659) Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
1,4-Dioxane, anhydrous MilliporeSigma 296309 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) MilliporeSigma 324124 Triphosphorylation reagent (sections 2–4)
30 mL glass bottles MilliporeSigma 23232 Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2)
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene Bio-Rad Laboratories 7328103 Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 Bio-Rad Laboratories 1610144 For PAGE (sections 5–7)
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL Glen Research 40-4050-50 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
Ammonia-neutralizing Trap ThermoFisher Scientific ANT100 and ANS121 For use with Speedvac DNA130 (section 5)
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad Laboratories 1610700 For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7)
Aqueous ammonia, 28% MilliporeSigma 338818 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Aqueous methylamine, 40% TCI America TCI-M0137 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer any column-based synthesizer is acceptable (section 1)
Bead-capture magnet ThermoFisher Scientific 12320D For streptavidin bead capture (section 7)
Bromophenol blue Bio-Rad Laboratories 1610404 For PAGE urea loading buffer (section 5)
Deep vacuum oil pump ThermoFisher Scientific VLP200-115 For use with lyophilizer (section 5)
Drierite dessicant, 10-20 mesh MilliporeSigma 737828 Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase prepared in house18 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns Glen Research 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
D-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes ANP-3201, 3202, 3203, 3205 representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm Glen Research 20-0021-01 Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid MilliporeSigma E1894 Ribozyme reaction buffer component (section 6)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid MilliporeSigma EDS Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7)
Filters for Expedite synthesis columns Glen Research 20-0021-0F Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1)
Fluorescent/phosphorescent gel scanner Cytiva Amersham Typhoon RGB, 29187193 For visualizing analytical PAGE (sections 6–7)
Formamide, deionized VWR Life Science 97062 For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7)
Gel image quantitation software Cytiva ImageQuant TL For quantifying scanned gel images (section 6)
Glass desiccator MilliporeSigma CLS3121150 Triphosphorylation solvent storage (section 2)
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk ChemGenes N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
L-RNA hammerhead template prepared in house18 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA primer prepared in house18 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Lyophilizer/Freeze Dryer VirTis Benchtop K For concentrating oligonucleotides (section 5)
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid MilliporeSigma M2670 For ribozyme reactions (sections 6–7)
N,N-Dimethylformamide, anhydrous MilliporeSigma 227056 Triphosphorylation solvent (section 2)
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) ThermoFisher Scientific 45000150 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5)
Non-coring stainless steel needle, 20 G ThermoFisher Scientific 14-815-410 Needles for piercing rubber septa (sections 2–4)
Oligonucleotide extinction coefficient calculator Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5)
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water ChemGenes RN-1456 Triphosphorylation reagent (section 4)
PAGE plates Timberrock/CBS NGP-250-BO and NO For PAGE (sections 5–7)
PAGE power supply Bio-Rad Laboratories PowerPac HV 1645056 For PAGE (sections 5–7)
PAGE spacers and combs (analytical) Timberrock/CBS VGS-0725 and VGC-0714 For PAGE (sections 6–7)
PAGE spacers and combs (preparative) Timberrock/CBS VGS-3025R and VGC-3001 For PAGE (section 5)
PAGE stand Timberrock/CBS ASG-250 For PAGE (sections 5–7)
Parafilm M ThermoFisher Scientific 13-374-12 (Bemis PM999) Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
PCR thermocycler Bio-Rad Laboratories C1000 Touch Thermalcycler For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) MilliporeSigma GE17-0010-01 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5)
Phosphor screens Cytiva 28956480 For visualizing 32P-labeled RNA (section 6)
Phosphoramidite synthesis reagents Glen Research 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1)
Polypropylene screw-cap sealable tube MilliporeSigma BR780752 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5)
Pyridine, anhydrous MilliporeSigma 270970 Triphosphorylation solvent (section 2)
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) Novatia n/a Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5)
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white MilliporeSigma Z564702 Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2)
Self-replicator ribozyme E prepared in house14 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate A prepared in house14 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate B, transcribed prepared in house14 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves ChemGenes DMT-1975 Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2)
Sodium Chloride (NaCl), solid MilliporeSigma S7653 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Sodium Hydroxide (NaOH), solid MilliporeSigma S8045 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Statistical data-fitting software GraphPad Prism For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6)
Streptavidin-coated magnetic beads ThermoFisher Scientific 65002 For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
Sucrose MilliporeSigma 84097 For PAGE urea loading buffer (section 5)
TBE running buffer, 10x ThermoFisher Scientific AAJ62788K3 For PAGE (sections 5–7)
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran Aldrich 216143 For removing 2′-silyl protecting groups (section 5)
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad Laboratories 1610801 For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7)
Tributylamine MilliporeSigma 90781 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) MilliporeSigma P8533 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tris base MilliporeSigma T6666 Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7)
TWEEN20 polysorbate detergent MilliporeSigma P7949 Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7)
Urea MilliporeSigma U5378 For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7)
UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000, ND2000 For measuring oligonucleotide concentrations (section 5)
Vacuum centrifuge ThermoFisher Scientific Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator For removing AMA and THF (section 5)
Xylene cyanol Bio-Rad Laboratories 1610423 For PAGE urea loading buffer (section 5)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuman, S. What messenger RNA capping tells us about eukaryotic evolution. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (8), 619-625 (2002).
  2. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  3. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  4. Myong, S., et al. Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5'-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science. 323 (5917), 1070-1074 (2009).
  5. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 140, 805-820 (2010).
  6. Wang, Y., et al. Structural and functional insights into 5'-ppp RNA pattern recognition by the innate immune receptor RIG-I. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 781-787 (2010).
  7. Goubau, D., et al. Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition of RNA bearing 5'-diphosphates. Nature. 514 (7522), 372-375 (2014).
  8. Joyce, G. F. Forty years of in vitro evolution. Angewandte Chemie. 46 (34), 6420-6436 (2007).
  9. Robertson, M. P., Ellington, A. D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. Nature Biotechnology. 17 (1), 62-66 (1999).
  10. Robertson, M. P., Hesselberth, J. R., Ellington, A. D. Optimization and optimality of a short ribozyme ligase that joins non-Watson-Crick base pairings. RNA. 7 (4), 513-523 (2001).
  11. Hesselberth, J. R., Robertson, M. P., Knudsen, S. M., Ellington, A. D. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array. Analytical Biochemistry. 312 (2), 106-112 (2003).
  12. Lam, B. J., Joyce, G. F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nature Biotechnology. 27 (3), 288-292 (2009).
  13. Lam, B. J., Joyce, G. F. An isothermal system that couples ligand-dependent catalysis to ligand-independent exponential amplification. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 3191-3197 (2011).
  14. Olea, C., Horning, D. P., Joyce, G. F. Ligand-dependent exponential amplification of a self-replicating L-RNA enzyme. Journal of the American Chemical Society. 134 (19), 8050-8053 (2012).
  15. Olea, C., Joyce, G. F. Real-Time Detection of a Self-Replicating RNA Enzyme. Molecules. 21 (10), (2016).
  16. Sczepanski, J. T., Joyce, G. F. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. 515 (7527), 440-442 (2014).
  17. Tjhung, K. F., Sczepanski, J. T., Murtfeldt, E. R., Joyce, G. F. RNA-catalyzed cross-chiral polymerization of RNA. Journal of the American Chemical Society. 142 (36), 15331-15339 (2020).
  18. Bare, G. A. L., Joyce, G. F. Cross-chiral, RNA-catalyzed exponential amplification of RNA. Journal of the American Chemical Society. 143 (45), 19160-19166 (2021).
  19. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15 (21), 8783-8798 (1987).
  20. Chelliserrykattil, J., Ellington, A. D. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2'-O-methyl RNA. Nature Biotechnology. 22 (9), 1155-1160 (2004).
  21. Ibach, J., et al. Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2′-O-methyl-modified RNA. Journal of Biotechnology. 167 (3), 287-295 (2013).
  22. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  23. Pleiss, J. A., Derrick, M. L., Uhlenbeck, O. C. T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA. 4 (10), 1313-1317 (1998).
  24. Schenborn, E. T., Mierendorf, R. C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Research. 13 (17), 6223-6236 (1985).
  25. Martin, C. T., Muller, D. K., Coleman, J. E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry. 27 (11), 3966-3974 (1988).
  26. Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
  27. Vasilyev, N., Serganov, A. Preparation of short 5′-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Nucleic Acid Crystallography: Methods and Protocols. , 11-20 (2016).
  28. Lebedev, A. V., Koukhareva, I. I., Beck, T., Vaghefi, M. M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5'-triphosphates using solid support approach. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20 (4-7), 1403-1409 (2001).
  29. Paul, N., Springsteen, G., Joyce, G. F. Conversion of a ribozyme to a deoxyribozyme through in vitro evolution. Chemistry & Biology. 13 (3), 329-338 (2006).
  30. Zlatev, I., et al. Efficient solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphates of DNA, RNA, and their analogues. Organic Letters. 12 (10), 2190-2193 (2010).
  31. Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J. -J., Morvan, F. Solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphate DNA, RNA, and chemically modified oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 1, Unit1.28 (2012).
  32. Zlatev, I., et al. Automated parallel synthesis of 5'-triphosphate oligonucleotides and preparation of chemically modified 5'-triphosphate small interfering RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (3), 722-732 (2013).
  33. Goldeck, M., Tuschl, T., Hartmann, G., Ludwig, J. Efficient solid-phase synthesis of pppRNA by using product-specific labeling. Angewandte Chemie. 53 (18), 4694-4698 (2014).
  34. Sarac, I., Meier, C. Efficient automated solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-triphosphates. Chemistry-A European Journal. 21 (46), 16421-16426 (2015).
  35. Sarac, I., Meier, C. Solid-phase synthesis of DNA and RNA 5'-O-triphosphates using cycloSal chemistry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 64 (1), 4-67 (2016).
  36. Perez, J. T., et al. Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11525-11530 (2010).
  37. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. The Journal of Organic Chemistry. 54 (3), 631-635 (1989).
  38. Gaur, R. K., Sproat, B. S., Krupp, G. Novel solid phase synthesis of 2'-o-methylribonucleoside 5'-triphosphates and their α-thio analogues. Tetrahedron Letters. 33 (23), 3301-3304 (1992).
  39. Reddy, M. P., Hanna, N. B., Farooqui, F. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides. Tetrahedron Letters. 35 (25), 4311-4314 (1994).
  40. Hogrefe, R. I., McCaffrey, A. P., Borozdina, L. U., McCampbell, E. S., Vaghefi, M. M. Effect of excess water on the desilylation of oligoribonucleotides using tetrabutylammonium fluoride. Nucleic Acids Research. 21 (20), 4739-4741 (1993).
  41. Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2′-O-[(Triisopropylsilyl)oxy]methyl(2′-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta. 84 (12), 3773-3795 (2001).
  42. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), (2019).
  43. Paul, N., Joyce, G. F. A self-replicating ligase ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12733-12740 (2002).
  44. Lincoln, T. A., Joyce, G. F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 323 (5918), 1229-1232 (2009).
  45. Robertson, M. P., Joyce, G. F. Highly efficient self-replicating RNA enzymes. Chemistry & Biology. 21 (2), 238-245 (2014).
  46. Singh, J., et al. Synthesis of modified nucleoside oligophosphates simplified: fast, pure, and protecting group free. Journal of the American Chemical Society. 141 (38), 15013-15017 (2019).
  47. Bellon, L. Oligoribonucleotides with 2'-O-(tert-butyldimethylsilyl) groups. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 3., Unit 3.6 (2001).

Tags

Bioengineering udgave 184
Kemisk triphosphorylation af oligonukleotider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bare, G. A. L., Horning, D. P.… More

Bare, G. A. L., Horning, D. P. Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (184), e63877, doi:10.3791/63877 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter