Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kemisk trifosforylering av oligonukleotider

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63877
Automatic Translation
1, 1
1The Salk Institute

Summary

Oligonukleotid 5′-trifosfater är allestädes närvarande komponenter i essentiella biologiska vägar och har sett ökande användning i biotekniska tillämpningar. Här beskriver vi tekniker för rutinsyntes och rening av oligonukleotid-5′-trifosfater, med utgångspunkt från oligonukleotider framställda med standard automatiserade syntestekniker.

Abstract

5′-trifosfatet är en väsentlig nukleinsyramodifiering som finns under hela livet och används alltmer som en funktionell modifiering av oligonukleotider inom bioteknik och syntetisk biologi. Oligonukleotid 5′-trifosfater har historiskt framställts in vitro med enzymatiska metoder. Dessa metoder är emellertid begränsade till naturliga RNA-oligonukleotider, har starka sekvenspreferenser och tenderar att producera heterogena produkter. Nya metoder för kemisk trifosforylering kompletterar både den reducerade kostnaden för automatiserad oligonukleotidsyntes genom fosforamiditkemi och det varierande utbudet av nukleotidmodifieringar som nu finns tillgängliga. Således är syntesen av oligonukleotidtrifosfater av godtycklig sekvens och längd, och eventuellt innehållande olika ickenaturliga modifieringar, nu tillgänglig.

Detta dokument presenterar lämpliga metoder och tekniker för kemisk trifosforylering av oligonukleotider med användning av salicylfosforkloridit och pyrofosfat. Denna metod använder kommersiellt tillgängliga reagenser, är kompatibel med de flesta oligonukleotider framställda med standard fastfassyntesmetoder och kan slutföras i 2 timmar efter oligonukleotidsyntes, före deprotektion och rening. Två användningar av kemiskt trifosforylerade oligonukleotider som substrat för katalytiska RNA-enzymer demonstreras, inklusive syntesen av en spegelbildsversion av hammarhuvudet ribozym från icke-biologiska L-RNA-trifosfater.

Introduction

Den 5′-trifosforylerade formen av RNA är allestädes närvarande i biologin eftersom den genereras av RNA-transkription inom alla livets domäner och genom RNA-replikation under livscykeln för många RNA-virus. Dessa trifosfater tjänar som substrat för bildandet av 7-metylguanylat-täckt mRNA i eukaryoter och spelar därför en viktig roll i proteinuttryck1. Däremot behålls trifosfatet i bakterier och virus; således erkänns RNA 5′-trifosfater av medfödda immunitetssvarsregulatorer i eukaryoter 2,3,4,5,6,7. Utanför biologin har en mängd RNA-ligas ribozymer utvecklats för att använda 5′-trifosfat in vitro8 och modifierats för användning i diagnostiska analyser 9,10,11,12,13,14,15. Ett sådant ribozym kan användas för mallberoende syntes av L-RNA, den icke-biologiska "spegelbild" -enantiomeren av naturligt D-RNA, från små L-RNA-oligonukleotid 5′-trifosfater 16,17,18. Den rutinmässiga beredningen av trifosforylerade oligonukleotider med varierande sekvens och ryggradssammansättning är avgörande för att undersöka dessa system.

Den vanligaste och mest tillgängliga metoden för framställning av RNA 5′-trifosfater i laboratoriet är genom in vitro-transkription. RNA som produceras med denna metod begränsas emellertid i sekvens och storlek av promotor- och substratkrav för RNA-polymerasenzymet. T7 RNA-polymeras och specialiserade derivat är de vanligaste polymeraserna som används för detta ändamål 19,20,21,22. In vitro transkriberat RNA framställt med dessa enzymer måste initieras med en 5′-terminal purin och är starkt partisk mot puriner i de första 10 nukleotiderna23,24. Dessutom är enzymatisk inkorporering av bas- eller ryggradsmodifierade nukleotider i bästa fall ineffektiv och oftare omöjlig med naturliga polymeraser, vilket begränsar möjligheten att producera oligonukleotid-5′-trifosfater som består av allt annat än naturligt D-RNA. En annan begränsande faktor är att RNA som genereras genom in vitro-transkription kan innehålla betydande 5′- och 3′- heterogenitet och produceras som extremt heterogena produkter när de är kortare än 20 nt 23,24,25,26,27.

Däremot kan kemisk trifosforylering av oligonukleotider framställda genom fosforamiditsyntes i fast fas 28,29,30,31,32,33,34,35 användas för att framställa oligonukleotid-5′-trifosfater 3-50 nt långa, av vilken sekvens som helst. Dessutom kan ett brett spektrum av nukleinsyramodifieringar som är tillgängliga för fosforamiditsyntes tillsättas till oligonukleotider före 5′-trifosforylering 14,15,16,17,18,29,36. Många av dessa metoder använder fosfitylationsreagenset salicylfosforkloridit, som utvecklades av Ludwig och Eckstein för lösningsfasens trifosforylering av mononukleosider37. Trifosforylering av oligonukleotider med detta reagens uppnås på den fasta fasen genom fosfitetsavation av oligonukleotiden 5′-hydroxyl, omvandling till trifosfat genom reaktion med pyrofosfat och oxidation, följt av standardprocedurer för klyvning av oligonukleotiden från fast stöd, deprotektion och rening (Figur 1)28.

Figure 1
Figur 1: Schema för trifosforylering av syntetiska oligonukleotider. I det första steget fosfateras oligonukleotiden 5ʹ-hydroxyl med SalPCl. I nästa steg reageras 5ʹ-salicylfosfiten med TBAP för att bilda den cykliska metafosfiten, sedan oxideras i det tredje steget för att generera det cykliska 5ʹ-trimetafosfatet i DNA / RNA-synthesizeroxidationslösning (0,1 M jod / pyridin /H2O / THF), som snabbt hydrolyseras för att ge det linjära 5ʹ-trifosfatet i samma lösning28,33, 37. Efterföljande alkalisk klyvning från det fasta CPG-stödet och deprotektionen av oligonukleotiden i vattenhaltig MeNH2 / ammoniak kommer att hydrolysera eventuellt kvarvarande cykliskt trimetafosfat till linjär form. Förkortningar: SalPCl = salicylfosforokloridit; TBAP = tributylammoniumpyrofosfat; THF = tetrahydrofuran; CPG = kontrollerat porglas; MeNH2 = metylamin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Även om tidiga publicerade rapporter som använde denna metod ofta led av dåliga utbyten och oönskade sidoprodukter 28,37,38, är noggrant underhåll av vattenfria förhållanden allt som är nödvändigt för att rutinmässigt få höga utbyten. Detta kan uppnås genom noggrann beredning av reagens och användning av en enkel reaktionsanordning monterad från standardplastkomponenter. Här demonstrerar vi lämpliga steg för kemisk trifosforylering av oligonukleotider, inklusive beredning av reagens, montering av reaktionskammaren, trifosforyleringsreaktionen och efterföljande deprotektion och rening av de trifosforylerade oligonukleotiderna. Dessutom ingår den representativa användningen av 5′-trifosforylerade oligonukleotider som substrat för ligasribolymer för syntes av större nukleinsyraprodukter med naturliga D-RNA och abiotiska L-RNA-ryggrader.

Protocol

1. Automatiserad fastfassyntes av 5′-hydroxyloligonukleotider på ett fast stöd

  1. Förbered den automatiserade DNA / RNA-synthesizern med reagens och fosforamiditer enligt måloligonukleotidkompositionen och instrumentinstruktionerna.
  2. Ladda en synteskolonn som innehåller fast stöd på synthesizern och syntetisera oligonukleotider enligt synthesizerinstrumentprotokollen.
    OBS: Trifosforyleringsförfarandet har optimerats för oligonukleotider framställda på 1 μmolskala.
  3. Ta bort den 5′-dimetoxytritylskyddande gruppen för att ge den faststödda oligonukleotiden 5′-hydroxylen som en del av oligonukleotidsyntesen i föregående steg, eller genom att utföra ett terminalt detritetssteg enligt synthesizerinstrumentprotokollen.
  4. Ta bort kolonnen som innehåller 5′-hydroxyloligonukleotiden på fast stöd från synthesizern, torka under ett husvakuum i 10 minuter för att avlägsna kvarvarande lösningsmedel och fortsätt till trifosforylering (avsnitt 3 och 4) när material för trifosforylering har framställts (avsnitt 2).
    OBS: Om den torkade kolonnen inte används omedelbart kan den förvaras under normal atmosfär i en sluten plastbehållare med torkmedel vid -20 °C. Ytterligare torkning behövs inte i detta skede eftersom kolonnen torkas noggrant före trifosforylering i avsnitt 3.

2. Förbereda material för trifosforylering

  1. Fäst en torr argonkälla med justerbart tryck på ett gasgrenrör med minst två linjer och anslut till en bubblare. Se till att ledningarna slutar i 1 ml plastsprutor för att underlätta anslutningen till reaktionsapparaten.
  2. Samla utrustning som ska användas under trifosforylering, inklusive 1 ml plastsprutor, en trevägs stoppkran av polypropen, noncoring-nålar, 1,5 ml polypropenrör och en liten metallspatel. Förvara dem i en förseglad behållare eller exsickator med torkmedel vid rumstemperatur i minst 1 dag före användning.
  3. Bered 30 ml vardera av vattenfri 1,4-dioxan, 3:1 dioxan:pyridin i volymprocent, N,N-dimetylformamid (DMF) och acetonitril (ACN) i torkade 30 ml glasflaskor med torkfällor (4 Å molekylsiktar i förseglade membranpaket) minst 1 dag före användning. Försegla med gummi septa och förvara i en exsickator med torkmedel.
  4. Förvara fast 2-klor-4H-1,3,2-bensodioxafosforin-4-on (salicylfosforkloridit, SalPCl) i originalbehållaren i en förseglad burk med torkmedel vid 4 °C. Spola alltid behållaren med argon mellan användningarna.
  5. Bered en tributylammoniumpyrofosfatlösning (TBAP) minst 5 dagar före trifosforyleringsreaktionen:
    1. Väg upp 1-5 g fast TBAP i en torkad 30 ml glasflaska och lös upp i 1 ml DMF och 0,5 ml tributylamin per g TBAP.
    2. Tillsätt tre torkfällor, försegla flaskan med en gummiseptum under argon och bubbla med argon i 30 min till avgas.
    3. Förvaras i en förseglad burk med torkmedel vid 4 °C i 5 dagar så att molekylsiktarna kan absorbera allt spårvatten. Förvara burken vid -20 °C och förbered färsk efter 6 månader.

3. Montering och användning av trifosforyleringsapparaten

  1. Låt synteskolonnen värmas upp till rumstemperatur om den hämtas från förvaring vid -20 °C.
  2. Montera reaktionskammaren som visas i figur 2:
    1. Förbered förkammaren: ta bort kolven från en torr 1 ml spruta, skär av toppen av sprutan med sax eller ett rakblad och fäst sprutan i synteskolonnen. Fäst den trevägs stoppkranen på toppen av sprutan och fäst stoppkranens sidoinlopp till den torra argonkällan med bubblaren, så att stoppkranens övre inlopp är reagensinjektionsporten.
    2. Fäst denna apparat på ett stativ med klämmor och täta alla uppströms fogar med vaxtätningsfilm. Justera stoppkranen så att injektionsporten är stängd och apparaten är öppen för argonkällan. Stäng bubbtern och låt argon vid lågt tryck (<10 psi) strömma genom reaktionskammaren i 5 minuter.
      OBS: Flera reaktionskammare kan ställas parallellt med trifosforylat 2-4 oligonukleotider. En linje från grenröret bör dock reserveras för att leverera argon till reagensflaskorna.
    3. Öppna bubblaren igen och fäst en spruta i botten av synteskolonnen, som kommer att vara avfallssprutan. Dra argon genom kolonnen upprepade gånger med hjälp av avfallssprutan; sätt sedan tillbaka sprutan med kolven helt intryckt.
      ANMÄRKNING: Om inte reagenser laddas ska stoppkranen ställas in så att injektionsporten är stängd och apparaten öppen för argonkällan, som visas i figur 2A. På samma sätt ska avfallssprutan fästas och fogen till synteskolonnen förseglas med vaxtätningsfilm om inte reagens avlägsnas aktivt.
  3. Så här tillsätter du ett reagens eller ett lösningsmedel:
    1. Fäst en nål på den torra argonkällan och sätt in den i reagens- eller lösningsmedelsflaskans septum, var försiktig så att du inte sänker ner nålen i flaskinnehållet.
    2. Montera en torr spruta med en nål och sätt in den i reagens- eller lösningsmedelsflaskans septum, utan att nedsänka den i flaskans innehåll. Fyll sprutan med argon, dra ut nålen från septum och utvisa argonen. Fyll sprutan med argon och utvisa igen; Fyll sedan sprutan med den erforderliga volymen lösningsmedel eller reagens under argontryck.
    3. Justera stoppkranen på apparaten så att argonkällan stängs och injektionsporten är öppen (bild 2B). Ta snabbt bort den fyllda sprutan och nålen från källflaskan, torka bort eventuellt lösningsmedel som sitter fast på sidan eller spetsen av nålen och sätt in nålen i injektionsporten. Utvisa reagenset i apparatens förkammare, ta bort nålen och stäng injektionsporten och öppna apparaten igen för argonkällan.
    4. Dra försiktigt vätskan från förkammaren hela vägen genom synteskolonnen med hjälp av avfallssprutan så att all vätska nu hålls i avfallssprutan. Tryck nu långsamt upp lösningen i synteskolonnen igen, så att inga gasbubblor finns i kolonnen. För att blanda eller omröra, dra försiktigt lösningen upp och ner över kolonnen med avfallssprutan.
      OBS: Flytta alltid vätska långsamt och försiktigt genom reaktionskammaren för att säkerställa att inga tätningar bryts, vilket gör att luft kan komma in i apparaten.
  4. Så här tar du bort ett reagens eller lösningsmedel från kolonnen:
    1. Dra långsamt lösningen i avfallssprutan. När huvuddelen av lösningen har passerat in i avfallssprutan, dra argon igenom för att spola det återstående lösningsmedlet från kolonnen.
    2. Ta bort vaxtätningsfilmen runt sprutleden, ta sedan bort sprutan och kassera avfallslösningen. Byt ut avfallssprutan mot en ny, torr spruta och återförslut fogen med vaxtätningsfilm.

Figure 2
Figur 2: Trifosforyleringsapparat. Under blandning eller reaktioner är anordningen (A) öppen för argonkällan (i) och stängd för luften genom att justera trevägsstoppkranen (ii). Reagenser dras från förkammaren (iii) till synteskolonnen (iv) med hjälp av avfallssprutan (v). Reagenser avlägsnas genom att dra all vätska i avfallssprutan (v) och kassera den. Vid laddning av reagenser (B) är trevägsstoppkranen (ii) öppen för atmosfären och reagenset laddas i förkammaren (iii) med hjälp av en spruta och nål (vi). C) Ett fotografi av den monterade utrustning som är inställd enligt punkt A för reagensblandning och reagensreaktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

4. Trifosforylering på kolonnen av syntetisk 5′-hydroxyloligonukleotid

  1. Ta bort SalPCl- och TBAP-lösningen från förvaringen vid -20 °C och låt dem värmas till rumstemperatur före användning.
  2. Tillsätt 200 μl pyridin/dioxan till förkammaren enligt steg 3.3.1–3.3.3. Ladda dock inte lösningsmedel på synteskolonnen förrän i steg 4.4.
  3. Använd en torr metallspatel för att väga 6-12 mg SalPCl i ett torrt 1,5 ml mikrocentrifugrör och lös upp i 100 μl dioxan genom att försiktigt spruta lösningsmedlet upp och ner i mikrocentrifugröret.
  4. Tillsätt den upplösta SalPCl till förkammaren och ladda den på synteskolonnen enligt steg 3.3. Låt den reagera i 15 minuter och agitera lösningen var 5: e minut. Ta bort och kassera SalPCl-lösningen enligt steg 3.4.
    OBS: SalPCl tillsätts i stort överskott och kommer att rensa allt vatten som absorberas under beredning och laddning i reaktionskammaren. Införandet av eventuell fukt under steg 4.5 och 4.6 kommer emellertid att äventyra det slutliga oligonukleotid-5′-trifosfatutbytet.
  5. Tillsätt 250 μL TBAP-lösning till förkammaren och ladda den på synteskolonnen enligt steg 3.3. Låt den reagera i 20 min, agitera var 5:e minut. Ta bort och kassera TBAP-lösningen enligt steg 3.4.
  6. Tvätta kolonnen med 0,5 ml DMF, därefter 0,5 ml ACN, avlägsna lösningsmedlet efter varje tillsats enligt steg 3.3 och 3.4.
  7. Tillsätt 250 μl oxidationslösning (0,1 M jod i tetrahydrofuran (THF)/pyridin/vatten, 88:10:2) till förkammaren och fyll den på synteskolonnen enligt steg 3.3. Låt den reagera i 30 min och agitera var 10:e minut. Ta bort och kassera oxidationslösningen enligt steg 3.4.
  8. Tvätta kolonnen med 0,5 ml ACN och ta bort den enligt steg 3.3 och 3.4.
  9. Demontera reaktionsapparaten. Tvätta synteskolonnen med 5 ml ACN och torka kolonnen.

5. Klyvning från fast stöd, deprotektion och rening

  1. Ta bort det torkade fasta stödhartset från synteskolonnen och överför det till ett 1,5 ml polypropenskruvlockförseglingsbart rör med en silikon o-ring.
  2. Suspendera hartset i 1 ml av en 1:1-blandning av 28%-30% vattenhaltig ammoniak och 40% vattenhaltig metylamin (AMA) och täta röret tätt. Inkubera vid 65 °C i 10 min med intermittent blandning genom mild inversion39. Använd en mildare behandling vid rumstemperatur i 2 timmar för oligonukleotider längre än 40 nt.
    VARNING: Uppvärmning av AMA-lösningen kommer att sätta röret under högt tryck. Om röret inte är tätat tätt eller inte använder en ammoniakkompatibel (silikon) o-ring kan röret ventilera gas eller läcka lösningsmedel, vilket kan äventyra säkerheten eller slutproduktens utbyte. Öppna aldrig röret medan det är över omgivningstemperaturen, eftersom varm AMA-lösning kan utveckla gas våldsamt.
  3. Kyl röret på is och centrifugera det kort (6 000-12 000 × g i 10 s). Ta bort supernatanten från hartset, filtrera genom en spruta utrustad med ett 0,2 μm filter och överför till ett nytt, sterilt polypropenrör. Indunsta lösningen till torrhet med en vakuumcentrifug försedd med en ammoniakneutraliserande kemisk fälla.
    OBS: Om den syntetiska oligonukleotiden inte innehåller några RNA-nukleotider med 2′-silylskyddande grupper, gå vidare till steg 5.8.
  4. Avlägsna silylskyddande grupper genom att lösa upp det torkade materialet i 1 ml 1 M tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) i THF, upphetta till 55 °C, skaka vid behov för att helt lösa upp oligonukleotiden och inkubera vid rumstemperatur i 16–24 timmarom 40,41.
  5. Släck TBAF-lösningen med 1 ml 1 M Tris-buffert, pH 7,5, och avlägsna THF med en vakuumcentrifug.
  6. Ta bort TBAF-salter med hjälp av en uteslutningskolumn för engångsstorlek enligt tillverkarens instruktioner. För oligonukleotider kortare än 15 nt, bekräfta eluering av produkten genom att samla eluatet i fraktioner och identifiera huvudproduktfraktionerna genom absorbans vid 260 nm på en UV-Vis-spektrofotometer.
  7. Koncentrera den avskyddade RNA-oligonukleotiden genom frystorkning eller vakuumcentrifug om den är mindre än 15 nt, eller genom etanolutfällning om den är större än 15 nt.
  8. Bered en preparativ skala 10%-20% polyakrylamid/8 M urea/1x TBE gel med 19:1 mono:bis akrylamidstock, enligt lämpliga protokoll för oligonukleotidstorlek, gelplatta och stativ. Montera gelplattan i gelstället med 1x TBE i behållare och kör på 35 W (eller som är lämpligt för gelplattformat) i minst 30 minuter.
  9. Lös upp den fasta oligonukleotiden i ureagelbelastningsbuffert (8 M urea, 10% sackaros, 50 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA med bromfenol och xylencyanol rinnande färgämnen) och värm till 80 °C. Belastning på polyakrylamidgelen och kör i 1-2 timmar vid 25-35 W (eller beroende på vad som är lämpligt för gelplattformat och oligonukleotidstorlek).
    OBS: Bromfenolblå eller xylen cyanol bör uteslutas från gelbelastningsbufferten för oligonukleotider som är kortare än 15 nt om någon av dem migrerar tillsammans med produkten, eftersom det är svårt att avlägsna dessa färgämnen från den eluerade oligonukleotiden utan etanolutfällning.
  10. När gelelektroforesen är klar, ta bort gelplattan från gelstället, demontera gelplattan och linda gelén i polyvinylkloridfilm. Identifiera produktbanden genom att bakåtskölja med 254 nm UV-ljus och skär ut huvudproduktbandet med ett rakblad.
  11. Extrahera oligonukleotiden från den utskurna gelén med kross- och blötläggningsmetoden42.
    1. Krossa den utskurna gelén genom att extrudera den genom en plastspruta eller mekaniskt.
    2. För oligonukleotider längre än 15 nt:
      1. Eluera i 3x volymer kross- och blötläggningsbuffert (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) i minst 12 timmar med omrörning eller skakning.
      2. Avlägsna fasta gelbitar genom att leda lösningen genom en spruta försedd med ett 0,2 μm filter och koncentrera oligonukleotiden genom etanolutfällning.
    3. För oligonukleotid kortare än 15 nt:
      1. Eluera i 3x volymer nukleasfritt vatten i minst 12 timmar med omrörning eller skakning.
      2. Avlägsna fasta gelbitar genom att leda lösningen genom en spruta försedd med ett 0,2 μm filter och koncentrera genom frystorkning.
      3. Avlägsna kvarvarande salter och lösta ämnen med hjälp av en uteslutningskolonn för engångsstorlek enligt steg 5.6. Koncentrera genom lyofilisering.
  12. Förvara renade trifosforylerade oligonukleotider vid -20 °C i TE-buffert (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) eller i en liknande oligonukleotidlagringsbuffert.
    1. Bestäm koncentrationen av oligonukleotiden genom att mäta absorbansen vid 260 nm med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer.
      OBS: Den uppskattade extinktionskoefficienten för oligonukleotiden bör inte påverkas av dess 5′-fosforyleringstillstånd och kan beräknas utifrån dess sekvens med hjälp av en oligonukleotidutrotningskoefficienträknare.
    2. Verifiera trifosforylering med masspektrometri. Leta efter en förväntad massa på +239,94 Da i förhållande till den för 5′-hydroxyloligonukleotiden.
      OBS: Antingen matrisassisterad laserdesorption / jonisering eller elektrosprayjoniseringsmasspektrometri (MALDI-MS respektive ESI-MS) är lämpliga för att identifiera oligonukleotidens trifosforyleringstillstånd vid användning av protokoll optimerade för nukleinsyror. ESI-MEDLEMSSTATERNA ger dock mer konsekventa resultat på grund av lägre grad av jonfragmentering. en representativ kommersiell tjänst tillhandahålls i materialförteckningen.

6. Trifosforylerade oligonukleotider som substrat för ribozym-självreplikation

VARNING: 32P är en radioaktiv isotop och följande steg bör utföras med hjälp av standardsäkerhetsprotokoll för att arbeta med radioaktiva material i ett laboratorium och av en forskare som är certifierad för användning av radioaktiva material av relevanta miljöhälso- och säkerhetsavdelningar. Som ett alternativ kan självreplikerande ribozymsubstrat A framställas syntetiskt med en 5′-fluoresceinetikett14 och avbildas fluorescerande, som i steg 7.9.

  1. Förbered lösning A som en blandning av självreplikator ribozym E och 5′-32P-märkt RNA-substrat A14 till koncentrationer av 0,30 μM respektive 30 μM. Förbered lösningar B-transkriberade och B-syntetiska med 15 μM trifosforylerat RNA-substrat B, framställt genom in vitro-transkription 14 respektive kemisk trifosforylering enligt ovan i 75 mM EPPS-buffert, pH 8,5 och 37,5MgCl2. Bringa båda lösningarna till 42 °C.
    OBS: Alla RNA-komponenter listas i materialförteckningen.
  2. För att initiera självreplikation, blanda snabbt 5 μL lösning A med 10 μL lösning B-transkriberad eller B-syntetisk till en slutlig koncentration av 0,1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mMMgCl2 och 50 mM EPPS-buffert, pH 8,5. Inkubera reaktionsblandningen vid 42 °C.
  3. Ta med jämna mellanrum 0,5 μL alikvoter och släck i 9,5 μl formamidgelladdningsbuffert (95% formamid; 10 mM EDTA, pH 8).
  4. Bered en analytisk polyakrylamid/8 M urea/1x TBE-gel enligt lämpliga protokoll för gelplattan och stativet. Montera den gjutna gelén och plattan i ett gelstativ, fyll behållarna med 1x TBE och kör vid 40 W (eller beroende på vad som är lämpligt för olika gelplattor och stativ) i 30 minuter.
  5. Värm de släckta reaktionsproverna till 80 °C, fyll 5 μl av provet i varje brunn och kör gelén vid 40 W i cirka 40 minuter (eller beroende på vad som är lämpligt för olika gelplattor och stativ).
  6. Ta bort gelplattan från gelstället, demontera och linda gelén i polyvinylkloridfilm. Täck gelén med en fosforskärm och exponera i 1 timme (eller i förekommande fall för 32P cpm); skanna skärmen med en fluorescerande / fosforescerande gelskanner.
  7. Kvantifiera reaktionsutbytet med hjälp av programvara för kvantifiering av gelbilder.
    1. Öppna gelbilden med hjälp av Analysis Toolbox, välj Analysis | Figurdefinition, välj Områden | rektangelformen och rita rektanglar av samma storlek runt band som motsvarar oreagerat A och produkt E för varje gång och båda reaktionerna.
    2. Välj | Bakgrunds subtraktion, välj Områden | rektangelformen och rita en rektangel av samma storlek i en tom del av gelbilden. Ändra bakgrunds subtraktionsmetoden för alla rektanglar till Bildrektangel.
    3. Välj Fönster | 2 Områdesfönster och sedan Redigera | Exportera till Excel om du vill exportera de kvantifierade bandpixelvolymerna till en kalkylbladsfil.
  8. Plotta koncentrationen av produkt E kontra tid och anpassa data till den logistiska tillväxten Eq (1) med hjälp av statistisk dataanpassningsprogramvara:
    [E] = Equation 1 (1)
    Där a är reaktion maximal utsträckning, b är grad av sigmoidicity och c är exponentiell tillväxthastighet.
    1. I det exporterade kalkylbladet delar du produktens E-volym med summan av substrat A- och produkt E-volymerna för att bestämma produktens fraktionerade utbyte för varje gång och båda reaktionerna. Multiplicera med den initiala koncentrationen av substrat A (10 μM) för att bestämma utbytet av produkt E som en funktion av tiden.
    2. I programvara för anpassning av statistiska data väljer du File | Nya | Ny projektfil, välj XY under Ny tabell och diagram och klicka på Skapa. Ange reaktionstider och produkt E-utbyten för båda reaktionerna i intilliggande kolumner och märk kolumner på motsvarande sätt (t.ex. "tid", "transkriberad B", "syntetisk B").
    3. Välj Infoga | Ny analys, välj XY-analyser | Icke-linjär regression (kurvpassning) och klicka sedan på OK. Välj tillväxtkurvor | Logistisk tillväxt och klicka på OK; justera inga andra parametrar. Observera passningsparametrarna och konfidensintervallen under Resultat och diagrammet över datapunkter och anpassade kurvor under Diagram.

7. Kors-kiral kopiering av L-RNA

  1. Förbered 10 μL RNA-lösning innehållande 20 μM D-RNA 27,3t kors-kiral polymeras, 2 μM 5′-fluoresceinmärkt L-RNA-primer, 4 μM biotinylerad L-RNA-hammarhuvudmall och 20 μM vardera av L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG och pppCGC, i 10 μL 50 mM Tris, pH 8,3. Glödga RNA genom att värma det till 90 °C i 1 min och kyla till 23 °C vid 0,2 °C/s i en PCR-termocykler. Se materialtabellen för detaljer om polymeras, primer och mall.
  2. Inkubera RNA-lösningen vid 17 °C och starta reaktionen genom att tillsätta 10 μl 2x startbuffert (400 mMMgCl2, 500 mM NaCl och 50 mM Tris, pH 8,3). Se till att de slutliga koncentrationerna av alla komponenter i reaktionen är 10 μM polymeras, 1 μM primer, 2 μM mall, 10 μM vardera trinukleotid 5′-trifosfat, 200 mM MgCl2, 250 mM NaCl och 50 mM Tris, pH 8,3.
  3. När reaktionen fortskrider, ta 10 μL alikvoter och släck med 5 μL 0,5 M EDTA, pH 8.
  4. Tillsätt 0,1 mg streptavidinbelagda magnetiska pärlor (20 pmol biotin-oligonukleotidbindningskapacitet) suspenderade i 10 μL 1 M NaCl i TE-buffert med 0,05% neutralt tvättmedel för att fånga trimerförlängade primers via den biotinylerade mallen och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur med skakning.
  5. Fånga pärlorna på en pärlfångningsmagnet, ta bort och kassera vätska och tillsätt 50 μL tvättlösning (250 mM NaCl i TE med 0,05% neutralt tvättmedel). Blanda pärlorna, fånga dem igen och ta bort tvättlösningen. Upprepa en gång till.
  6. För att eluera förlängda primers från pärlor, tillsätt 50 μL elueringslösning (25 mM NaOH med 0,05% neutralt tvättmedel) och blanda pärlorna. Återta pärlorna, ta bort elueringslösningen, släck med 100 mM Tris (pH 7,5) och fäll ut med etanol.
  7. Bered en analytisk polyakrylamid/8 M urea/1x TBE-gel enligt lämpliga protokoll för gelplattan och stativet. Montera den gjutna gelén och plattan i ett gelstativ, fyll behållarna med 1x TBE och kör vid 40 W (eller beroende på vad som är lämpligt för olika gelplattor och stativ) i 30 minuter.
  8. Lös upp det utfällda RNA i 10 μL formamidgelladdningsbuffert och förbered oreagerad ändmärkt primer vid 0,5 μM i formamidgelladdningsbuffert. Värm proverna till 80 °C, fyll 5 μl av provet i varje brunn och kör gelén vid 40 W i cirka 40 minuter (eller beroende på vad som är lämpligt för olika gelplattor och stativ).
  9. Ta bort gelplattan från stativet och skanna med en fluorescerande / fosforescerande gelskanner för att visualisera kors-kirala L-RNA-förlängningsprodukter.

Representative Results

Oligonukleotider bör syntetiseras med hjälp av standardprotokoll som är lämpliga för fosforamiditerna och automatiserad DNA / RNA-synthesizer, vilket lämnar produkten oligonukleotid från det fasta stödet i den ursprungliga plastsynteskolonnen, med den 5ʹ-terminala dimetoxitritylgruppen borttagen för att ge den fria 5ʹ-hydroxylen (avsnitt 1). Alla oligonukleotider som användes i denna demonstration framställdes med användning av 1 000 Å-kontrollerat porglas (CPG) harts som fast stöd och leddes på 0,2 eller 1 μmolskala. Representativa exempel på synthesizerkolonner, hartser, reagenser och fosforamiditer finns i materialförteckningen. För reaktioner i större skala kan volymer och tider som används i efterföljande steg behöva justeras.

Trifosforyleringsreaktionen utförs på kolonnen i en specialbyggd reaktionskammare (figur 2, avsnitt 3) med hjälp av standard, kommersiellt tillgängliga komponenter som anges i materialtabellen och följer schemat som illustreras i figur 1 (avsnitt 4)28. Det är viktigt att förhållandena hålls strikt vattenfria under trifosforylering och att alla lösningsmedel och reagenser bereds över molekylsiktar i förväg och får torka helt före användning (avsnitt 2). Trifosforylering tar vanligtvis 2 timmar att inträffa, och därefter kan den tvättade och torkade kolonnen behandlas enligt standard oligonukleotidskydd och reningsförfaranden (avsnitt 5).

Efter deskydd renas oligonukleotidtrifosfater genom denaturering av polyakrylamidgelelektrofores (PAGE), vilket visar ett enda huvudproduktband genom UV-bakgrundsskuggning som kan skäras ut och elueras från gelén. 5′-trifosfatprodukten separeras lätt från reaktionsbiprodukter för korta oligonukleotider, vilket visas för DNA-trinukleotid 5ʹ-trifosfater, pppAAA och pppCCC och L-RNA-trinukleotid 5ʹ-trifosfatpppGAA i figur 3A,B. Både 5′-hydroxyl- och 5′-trifosfatprodukterna för AAA- och CCC-DNA-trimers skars ut och identifierades med masspektrometri och märktes på motsvarande sätt i figur 3A. Ytterligare band, som är synliga för AAA DNA-trimern, innehåller i allmänhet inte tillräckligt med material för att återhämta sig och identifiera. Närvaron av dessa band korrelerar emellertid med ytterligare produktmassor i de orenade reaktionsprodukterna (figur 3C), som vanligtvis representerar 5′-difosfat-, monofosfat- och H-fosfonat-sidoprodukter, som diskuteras nedan.

Efter PAGE-rening kan större oligonukleotider elueras med hjälp av kross- och blötläggningsmetoden42 och efterföljande etanolutfällning. Oligonukleotider som är mindre än 15 nt kan emellertid inte fällas ut effektivt av etanol och kräver därför ett modifierat förfarande för geelekuering (steg 5.11.3). Kolumnen för uteslutning av engångsstorlek som anges i materialtabellen är endast klassad för användning med oligonukleotider längre än 10 nt. Vi har dock funnit att oligonukleotider så korta som trimers effektivt kan avsaltas med tillverkarens rekommenderade protokoll. Vid avsaltning av korta oligonukleotider (som i steg 5.6 och 5.11.3) rekommenderas dock att kolonnen eluat samlas upp i fraktioner och produktfraktioner identifieras genom absorbans vid 260 nm med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer. En storleksuteslutningskolumn optimerad för kortare oligonukleotider finns i materialtabellen som ett alternativt val. Det slutliga utbytet från oligonukleotidsyntes i 1 μmolskala efter rening är 50-300 nmol.

Trifosforylering kan bekräftas med masspektrometri, där den trifosforylerade produkten har en massa +239,94 Da större än 5′-hydroxyloligonukleotiden, även om närvaron av material som motsvarar 5′-di- och monofosfat (+159,96 respektive +79,98 Da) ofta observeras. En 5′-H-fosfonat sidoprodukt med en massa +63.98 Da från 5′-OH-massan kan också observeras, och höga nivåer av denna produkt indikerar förhållanden under trifosforylering var inte tillräckligt vattenfria. Före rening kommer avskyddade oligonukleotider vanligtvis att visa alla dessa produkter (figur 3C), medan renat material kommer att visa en topp som motsvarar 5′-trifosfatprodukten tillsammans med 5′-di- och monofosfater (figur 3D, E).

Masspektrometri ensam ger vanligtvis inte ett rigoröst mått på 5′-trifosfatrenhet på grund av differentiella joniseringshastigheter och fragmentering av trifosfatet under jonisering. För att mäta slutproduktens renhet rekommenderas vätskekromatografi med omvänd fas och tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS), särskilt för längre oligonukleotider. Analys av D-RNA 5ʹ-trifosfater pppACGAGG och pppGAGACCGCAACUUA med RP-LC/ESI-MS (figur 4A,B, respektive) visar typisk slutproduktrenhet, innehållande 20% 5ʹ-difosfat eftersom dessa två arter är svåra att separera när de förekommer på längre oligonukleotider.

Syntetiska 5′-trifosfat oligonukleotider fungerar vanligtvis lika bra eller bättre än material framställda enzymatiskt i biokemiska studier. I avsnitt 6 jämfördes som exempel 5′-trifosfat 14 nt RNA-substrat framställda antingen syntetiskt eller genom in vitro-transkription i en RNA-katalyserad självreplikationsreaktion 14,15,43,44,45. Ribozyme E katalyserar sammanfogningen av substraten A och B för att ge en ny kopia av E i en autokatalytisk reaktion som kan exponentiell tillväxt (Figur 5A). E och 32P-märkta A-komponenter framställdes genom in vitro-transkription, och trifosforylerat substrat B framställdes antingen syntetiskt, som beskrivits ovan, eller genom in vitro-transkription 14. Självreplikationsreaktionsförloppet övervakades genom att ta periodiska prover som analyserades genom denaturering av PAGE och kvantifierades via en fluorescerande / fosforescerande gelskanner. De resulterande uppgifterna, anpassade till en logistisk tillväxtfunktion, avslöjade att antingen transkriberat eller syntetiskt B-substrat stöder exponentiell tillväxt, men syntetisk B ger en något större mängd produkt (figur 5B). Detta resultat kan återspegla sammansättnings heterogenitet vid 5′-änden av RNA framställt genom in vitro-transkription 23,24.

Kemisk trifosforylering möjliggör också syntes av oligonukleotidtrifosfater som inte kan framställas biologiskt, varken in vitro eller i celler. I avsnitt 7 användes icke-biologiska oligonukleotidtrifosfater bestående av L-RNA, enantiomeren av naturligt D-RNA, framställt som i sektionerna 1-5, som substrat för D-RNA "kors-kirala" polymeras ribozym 27.3t (figur 6A), som katalyserar den mallstyrda polymerisationen av en längre L-RNA-produkt från korta L-RNA-oligonukleotid 5′-trifosfater på ett sekvensgeneralt sätt. Som ett exempel kan ribozymet syntetisera en L-RNA-version av hammarhuvudets självklyvningsmotiv (figur 6B)18. Renade L-RNA-trinukleotidtrifosfater kombinerades med en fluoresceinmärkt L-RNA-primer och L-RNA-mall (figur 6C) och reagerade med den kors-kirala ligan. Prover under reaktionens gång analyserades av PAGE och avbildades med hjälp av en fluorescerande / fosforescerande gelskanner för att visa syntes av en L-RNA-version av hammarhuvudet ribozym kodat av mallen (Figur 6D).

Figure 3
Figur 3: Rening av trinukleotid-5ʹ-trifosfater. (A) PAGE-analys (visualiserad genom UV-back-shadowing) av trifosforylering av DNA-trinukleotider tri-deoxyadenosin (AAA, blå) och tri-deoxycytidin (CCC, röd), avsiktligt överbelastad för att visualisera mindre sidoprodukter. Både utgångsmaterialet 5ʹ-trifosfatprodukt (ppp) och 5ʹ-hydroxyl (OH) skars ut och identifierades av MALDI-MS. (B) Preparativ SIDA av trifosforylering av L-RNA-trinukleotid GAA, med huvudproduktintervall utskuren och identifierad som 5ʹ-trifosfat (ppp) av ESI-MS. C) MALDI-MS av råreaktionsprodukter efter deskydd och (D) renade produkter från (A). 5ʹ-trifosfat (ppp; pppAAA förväntade 1 119 Da, observerade 1 118 Da; pppCCC förväntade 1 047 Da, observerade 1 046); 5ʹ-difosfat (pp), 5ʹ-monofosfat (p), 5ʹ-hydroxyl (OH) och 5ʹ-H-fosfonat (Hp) är märkta. (E) Dekonvoluterat massspektrum från direktinjicerad ESI-MS av isolerad 5ʹ-trifosfatprodukt från (B), med identifierade toppar märkta (förväntade 1 181,6 Da, observerade 1 181,0 Da). 5ʹ-difosfatprodukter (pp) observeras också, liksom natriumjontoppar för både tri- och difosfatprodukterna (+22 Da). Vanliga föroreningstoppar är märkta med en asterisk. För att underlätta jämförelsen normaliserades masspektra till den högsta intensitet som uppmätts i varje spektrum och rapporteras i procent i förhållande till det värdet. Förkortningar: PAGE = polyakrylamidgelelektrofores; MALDI-MS = matrisassisterad laserdesorption/jonisering; ESI-MS = elektrosprayjoniseringsmasspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Analytisk RP-LC av 6 nt och 14 nt D-RNA oligonukleotidtrifosfater. Tandem ESI-MS identifierade den största toppen av båda (~ 70%) som 5ʹ-trifosfat (ppp), med mindre mängder av 5ʹ-difosfat (pp). Förkortningar: RP-LC = vätskekromatografi med omvänd fas; nt = nukleotider; ESI-MS = elektrosprayjoniseringsmasspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Jämförelse av oligonukleotid 5ʹ-trifosfatsubstrat framställda genom kemisk syntes eller in vitro-transkription. (B) Data passade till den logistiska tillväxtekvationen: [E] = a / (1 + b e-ct), där a är det slutliga utbytet, b är graden av sigmoidicity och c är den exponentiella tillväxttakten. Tillväxthastigheterna för de två reaktionerna var identiska, vid 1,14 h-1, medan den slutliga omfattningen var 10% högre för reaktioner med syntetisk B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Kors-kiral L-RNA-polymerisation med ett ribozym. (B) L-RNA-produkten syntetiserad av 27.3t utgör en del av ett hammarhuvudendonukleasmotiv. (C) L-RNA-polymerisation katalyserad med 27,3 ton med användning av en biotinylerad L-RNA-mall (brun), en ändmärkt L-RNA-primer (magenta) och fyra L-RNA-trinukleotidtrifosfater (cyan), framställda syntetiskt. (D) PAGE-analys av förlängningsprodukter av (B) vid 4 timmar och 24 timmar, som visar varje trinukleotidinblandning upp till fullängdsprodukt (svart prick). Oreagerad L-RNA-primer ingår som referensmarkör. Förkortningar: PAGE = polyakrylamidgelelektrofores; M = referensmarkör. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Trifosforyleringsförfarandet som beskrivs här är i stort sett kompatibelt med oligonukleotidsyntes med användning av standardfosforamiditkemi. Nukleosidfosforamiditer bör ha bas-labila skyddsgrupper som är kompatibla med snabb deprotektion i AMA39, inklusive standardgrupperna β-cyanoetyl på fosfiten och isobutyryl, dimetylformamidyl, acetyl, fenoxiacetyl eller 4-isopropylfenoxiacetylgrupper på de exocykliska aminer i nukleobaserna. Ribos 2'-hydroxylgrupper bör skyddas av silylskyddande grupper, antingen t-butyldimetylsilyl (TBDMS) eller tri-iso-propylsilyloximetyl (TOM)40,41. Den balabila pivaloyloximetylgruppen (PivOM) har också rapporterats vara kompatibel med kemisk trifosforylering30.

Flera metoder har beskrivits för kemisk trifosforylering av syntetiska oligonukleotider 28,29,30,31,32,33,34,35. Vi har funnit att trifosforylering med Ludwig-Eckstein-reagens37 är en av de mest tillgängliga, vilket inte kräver någon specialiserad syntes av reagens och ingen specialutrustning. Oligonukleotid-5′-trifosfater framställda med denna metod har rutinmässigt använts som substrat för RNA-ligasribolymer, inklusive användning av enzymatiskt otillgängliga L-RNA-oligonukleotidtrifosfater för att uppnå mallberoende syntes och replikation av denna "spegelbild" nukleinsyra 14,16,17,18 . Metoden är också lämplig för framställning av små 5′-trifosforylerade stamslinga RNA som är potenta aktivatorer av det medfödda immunsvaret hos ryggradsdjur 6,7.

Ludwig-Eckstein-reagenset, salicylfosforokloridit37, är mycket reaktivt mot vatten och rensar effektivt allt vatten som införs vid upplösning av reagenset innan det laddas på oligonukleotidkolonnen. Efter denna punkt kommer emellertid den 5′-fosfitylerade oligonukleotiden företrädesvis att reagera med vilket vatten som helst som införs i systemet över pyrofosfat och bildar en 5′-H-fosfonat sidoprodukt efter workup 28,37,38. Noggrann beredning av trifosforyleringsreagenser och trifosforyleringsreaktionskammaren säkerställer att denna sidoprodukt inte bildas. För lösningsmedelstorkning säljs typ 4 Å-molekylsiktar färdigförpackade i teflonpåsar som är kompatibla med de flesta organiska lösningsmedel under olika varumärken av de flesta oligonukleotidsyntesreagensföretag. Ytterligare försiktighetsåtgärder, såsom att utföra trifosforylering i en handskfack under en vattenfri atmosfär, är i allmänhet inte nödvändiga.

Reaktion av den 5′-fosfitylerade oligonukleotiden med TBAP bildar en cyklisk 5′-trimetafosfit-intermediär, som sedan oxideras till det cykliska 5′-trimetafosfatet med användning av oligonukleotidsyntesoxidationslösning (jod i vatten/ pyridin / THF). Det bör noteras att kommersiella oxidationslösningar använder varierande mängder jod, och det är viktigt att använda den höga 0,1 M jodkoncentrationen för att säkerställa fullständig oxidation till trifosfatet. Den cykliska produkten hydrolyseras till det slutliga linjära 5′-trifosfatet i samma lösning37, och alternativa, vattenfria oxidationsmedel måste användas om linjärisering med andra nukleofiler än vatten önskas (se nedan för applikationer)33. Eventuellt kvarvarande cykliskt trimetafosfat kommer emellertid att linjäriseras under efterföljande alkalisk deprotektion av oligonukleotiden. Hydrolys av det cykliska 5′-trimetafosfatet ger endast det linjära, snarare än grenadetrifosfatet 37,46.

Oligonukleotiddeskydd behöver vanligtvis inte modifieras för att rymma 5′-trifosforylering, men några försiktighetsåtgärder bör vidtas. Trifosfatet är relativt stabilt till kort exponering för alkaliska förhållanden, men man bör vara försiktig så att trifosfatet inte utsätts för AMA längre än nödvändigt. Att skydda grupper som kräver mer långvarig behandling i ammoniak eller AMA i mer än 10 minuter vid 65 °C bör undvikas. Mer skonsamma behandlingar, såsom 2 h i ammoniak vid rumstemperatur är acceptabla när de är kompatibla med andra fosforamiditskyddande grupper. En vanlig, snabb deprotektionsmetod för silylskyddade syntetiska RNA-oligonukleotider använder trietylamintrihydrofluorid och hög temperatur47; Detta bör dock undvikas vid framställning av RNA5′-trifosfater eftersom de långvariga sura förhållandena visar sig påskynda trifosfathydrolys31,32.

Preparativ PAGE har visat sig vara den enklaste och mest tillförlitliga metoden för efterbehandlingsrening av 5′-trifosforylerade oligonukleotider (figur 3 och figur 4). Preparativ omvänd fas HPLC kan emellertid också användas för att rena trifosforylerade produkter. Närvaron av 5′-difosfat och, i mindre utsträckning, 5′-monofosfatprodukter observeras rutinmässigt vid verifiering av trifosforylering med masspektrometri. Vi har observerat 5′-trifosfatfragmentering under masspektrometri från mycket rent material framställt genom kemisk syntes eller transkription, särskilt om instrumentet inte är optimerat för analys av oligonukleotider. Ändå visar RP-LC-analys ofta att 10% -20% av 5′-difosfatsidans produkt är närvarande i längre 5′-trifosforylerade oligonukleotider (figur 4). Kommersiella preparat av tributylammoniumpyrofosfat kan kontamineras med så mycket som 20% monofosfat, vilket kommer att ge 5′-difosfat som en sidoprodukt under trifosforylering30,31. Noggrann beredning av detta reagens internt kan ge mycket mer rena TBAP-lager31. Vi har dock funnit att oligonukleotider som trifosforyleras med hjälp av kommersiella källor till TBAP fortfarande visar jämförbar eller större reaktivitet när de används som substrat i enzymatiska reaktioner (figur 5B), jämfört med material som framställts genom in vitro-transkription.

En anmärkningsvärd ytterligare användning av oligonukleotidtrifosforylering med Ludwig-Eckstein-reagenset utnyttjar den cykliska trimetafosfitmellanen33. Om det efterföljande oxidationssteget utförs med 1 M t-butylperoxid i hexaner, som ofta används för oligonukleotidoxidation under vattenfria förhållanden, sker oxidation av fosfiten utan ringöppningshydrolys, vilket ger det cykliska trimetafosfatet. Denna intermediär kan sedan reageras med primära amin- eller alkoholnukleofiler för att ge 5′-trifosfater med modifieringar vid γ-fosfat. Dessa modifieringar innefattar tillsats av en lipofil tagg kopplad av en fosforamidatbindning, vilket underlättar snabb trifosfatspecifik rening med RP-LC, följt av sur hydrolys av taggen från trifosfat33. Fluorescerande modifieringar vid γ-fosfatpositionen kan också introduceras för användning som fluorescerande reportrar i realtid för ribozymkatalyserade ligeringsreaktioner15,33.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski och Katrina Tjhung för användbara diskussioner om bästa praxis för kemiska trifosforyleringsreaktioner och till Gerald Joyce för användbara kommentarer. Detta arbete stöddes av bidrag MCB 2114588 från National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm polyethersulfone syringe filter MilliporeSigma SLMP025SS Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5)
0.22 µm PTFE syringe filter MilliporeSigma SLLG013SL Syringe filter for removing CPG resin (Section 5)
1 mL plastic syringes ThermoFisher Scientific 14-823-434 (BD 309659) Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
1,4-Dioxane, anhydrous MilliporeSigma 296309 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) MilliporeSigma 324124 Triphosphorylation reagent (sections 2–4)
30 mL glass bottles MilliporeSigma 23232 Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2)
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene Bio-Rad Laboratories 7328103 Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 Bio-Rad Laboratories 1610144 For PAGE (sections 5–7)
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL Glen Research 40-4050-50 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
Ammonia-neutralizing Trap ThermoFisher Scientific ANT100 and ANS121 For use with Speedvac DNA130 (section 5)
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad Laboratories 1610700 For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7)
Aqueous ammonia, 28% MilliporeSigma 338818 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Aqueous methylamine, 40% TCI America TCI-M0137 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer any column-based synthesizer is acceptable (section 1)
Bead-capture magnet ThermoFisher Scientific 12320D For streptavidin bead capture (section 7)
Bromophenol blue Bio-Rad Laboratories 1610404 For PAGE urea loading buffer (section 5)
Deep vacuum oil pump ThermoFisher Scientific VLP200-115 For use with lyophilizer (section 5)
Drierite dessicant, 10-20 mesh MilliporeSigma 737828 Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase prepared in house18 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns Glen Research 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
D-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes ANP-3201, 3202, 3203, 3205 representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm Glen Research 20-0021-01 Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid MilliporeSigma E1894 Ribozyme reaction buffer component (section 6)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid MilliporeSigma EDS Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7)
Filters for Expedite synthesis columns Glen Research 20-0021-0F Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1)
Fluorescent/phosphorescent gel scanner Cytiva Amersham Typhoon RGB, 29187193 For visualizing analytical PAGE (sections 6–7)
Formamide, deionized VWR Life Science 97062 For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7)
Gel image quantitation software Cytiva ImageQuant TL For quantifying scanned gel images (section 6)
Glass desiccator MilliporeSigma CLS3121150 Triphosphorylation solvent storage (section 2)
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk ChemGenes N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
L-RNA hammerhead template prepared in house18 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA primer prepared in house18 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Lyophilizer/Freeze Dryer VirTis Benchtop K For concentrating oligonucleotides (section 5)
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid MilliporeSigma M2670 For ribozyme reactions (sections 6–7)
N,N-Dimethylformamide, anhydrous MilliporeSigma 227056 Triphosphorylation solvent (section 2)
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) ThermoFisher Scientific 45000150 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5)
Non-coring stainless steel needle, 20 G ThermoFisher Scientific 14-815-410 Needles for piercing rubber septa (sections 2–4)
Oligonucleotide extinction coefficient calculator Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5)
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water ChemGenes RN-1456 Triphosphorylation reagent (section 4)
PAGE plates Timberrock/CBS NGP-250-BO and NO For PAGE (sections 5–7)
PAGE power supply Bio-Rad Laboratories PowerPac HV 1645056 For PAGE (sections 5–7)
PAGE spacers and combs (analytical) Timberrock/CBS VGS-0725 and VGC-0714 For PAGE (sections 6–7)
PAGE spacers and combs (preparative) Timberrock/CBS VGS-3025R and VGC-3001 For PAGE (section 5)
PAGE stand Timberrock/CBS ASG-250 For PAGE (sections 5–7)
Parafilm M ThermoFisher Scientific 13-374-12 (Bemis PM999) Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
PCR thermocycler Bio-Rad Laboratories C1000 Touch Thermalcycler For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) MilliporeSigma GE17-0010-01 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5)
Phosphor screens Cytiva 28956480 For visualizing 32P-labeled RNA (section 6)
Phosphoramidite synthesis reagents Glen Research 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1)
Polypropylene screw-cap sealable tube MilliporeSigma BR780752 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5)
Pyridine, anhydrous MilliporeSigma 270970 Triphosphorylation solvent (section 2)
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) Novatia n/a Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5)
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white MilliporeSigma Z564702 Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2)
Self-replicator ribozyme E prepared in house14 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate A prepared in house14 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate B, transcribed prepared in house14 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves ChemGenes DMT-1975 Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2)
Sodium Chloride (NaCl), solid MilliporeSigma S7653 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Sodium Hydroxide (NaOH), solid MilliporeSigma S8045 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Statistical data-fitting software GraphPad Prism For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6)
Streptavidin-coated magnetic beads ThermoFisher Scientific 65002 For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
Sucrose MilliporeSigma 84097 For PAGE urea loading buffer (section 5)
TBE running buffer, 10x ThermoFisher Scientific AAJ62788K3 For PAGE (sections 5–7)
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran Aldrich 216143 For removing 2′-silyl protecting groups (section 5)
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad Laboratories 1610801 For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7)
Tributylamine MilliporeSigma 90781 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) MilliporeSigma P8533 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tris base MilliporeSigma T6666 Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7)
TWEEN20 polysorbate detergent MilliporeSigma P7949 Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7)
Urea MilliporeSigma U5378 For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7)
UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000, ND2000 For measuring oligonucleotide concentrations (section 5)
Vacuum centrifuge ThermoFisher Scientific Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator For removing AMA and THF (section 5)
Xylene cyanol Bio-Rad Laboratories 1610423 For PAGE urea loading buffer (section 5)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuman, S. What messenger RNA capping tells us about eukaryotic evolution. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (8), 619-625 (2002).
  2. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  3. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  4. Myong, S., et al. Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5'-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science. 323 (5917), 1070-1074 (2009).
  5. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 140, 805-820 (2010).
  6. Wang, Y., et al. Structural and functional insights into 5'-ppp RNA pattern recognition by the innate immune receptor RIG-I. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 781-787 (2010).
  7. Goubau, D., et al. Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition of RNA bearing 5'-diphosphates. Nature. 514 (7522), 372-375 (2014).
  8. Joyce, G. F. Forty years of in vitro evolution. Angewandte Chemie. 46 (34), 6420-6436 (2007).
  9. Robertson, M. P., Ellington, A. D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. Nature Biotechnology. 17 (1), 62-66 (1999).
  10. Robertson, M. P., Hesselberth, J. R., Ellington, A. D. Optimization and optimality of a short ribozyme ligase that joins non-Watson-Crick base pairings. RNA. 7 (4), 513-523 (2001).
  11. Hesselberth, J. R., Robertson, M. P., Knudsen, S. M., Ellington, A. D. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array. Analytical Biochemistry. 312 (2), 106-112 (2003).
  12. Lam, B. J., Joyce, G. F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nature Biotechnology. 27 (3), 288-292 (2009).
  13. Lam, B. J., Joyce, G. F. An isothermal system that couples ligand-dependent catalysis to ligand-independent exponential amplification. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 3191-3197 (2011).
  14. Olea, C., Horning, D. P., Joyce, G. F. Ligand-dependent exponential amplification of a self-replicating L-RNA enzyme. Journal of the American Chemical Society. 134 (19), 8050-8053 (2012).
  15. Olea, C., Joyce, G. F. Real-Time Detection of a Self-Replicating RNA Enzyme. Molecules. 21 (10), (2016).
  16. Sczepanski, J. T., Joyce, G. F. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. 515 (7527), 440-442 (2014).
  17. Tjhung, K. F., Sczepanski, J. T., Murtfeldt, E. R., Joyce, G. F. RNA-catalyzed cross-chiral polymerization of RNA. Journal of the American Chemical Society. 142 (36), 15331-15339 (2020).
  18. Bare, G. A. L., Joyce, G. F. Cross-chiral, RNA-catalyzed exponential amplification of RNA. Journal of the American Chemical Society. 143 (45), 19160-19166 (2021).
  19. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15 (21), 8783-8798 (1987).
  20. Chelliserrykattil, J., Ellington, A. D. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2'-O-methyl RNA. Nature Biotechnology. 22 (9), 1155-1160 (2004).
  21. Ibach, J., et al. Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2′-O-methyl-modified RNA. Journal of Biotechnology. 167 (3), 287-295 (2013).
  22. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  23. Pleiss, J. A., Derrick, M. L., Uhlenbeck, O. C. T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA. 4 (10), 1313-1317 (1998).
  24. Schenborn, E. T., Mierendorf, R. C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Research. 13 (17), 6223-6236 (1985).
  25. Martin, C. T., Muller, D. K., Coleman, J. E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry. 27 (11), 3966-3974 (1988).
  26. Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
  27. Vasilyev, N., Serganov, A. Preparation of short 5′-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Nucleic Acid Crystallography: Methods and Protocols. , 11-20 (2016).
  28. Lebedev, A. V., Koukhareva, I. I., Beck, T., Vaghefi, M. M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5'-triphosphates using solid support approach. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20 (4-7), 1403-1409 (2001).
  29. Paul, N., Springsteen, G., Joyce, G. F. Conversion of a ribozyme to a deoxyribozyme through in vitro evolution. Chemistry & Biology. 13 (3), 329-338 (2006).
  30. Zlatev, I., et al. Efficient solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphates of DNA, RNA, and their analogues. Organic Letters. 12 (10), 2190-2193 (2010).
  31. Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J. -J., Morvan, F. Solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphate DNA, RNA, and chemically modified oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 1, Unit1.28 (2012).
  32. Zlatev, I., et al. Automated parallel synthesis of 5'-triphosphate oligonucleotides and preparation of chemically modified 5'-triphosphate small interfering RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (3), 722-732 (2013).
  33. Goldeck, M., Tuschl, T., Hartmann, G., Ludwig, J. Efficient solid-phase synthesis of pppRNA by using product-specific labeling. Angewandte Chemie. 53 (18), 4694-4698 (2014).
  34. Sarac, I., Meier, C. Efficient automated solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-triphosphates. Chemistry-A European Journal. 21 (46), 16421-16426 (2015).
  35. Sarac, I., Meier, C. Solid-phase synthesis of DNA and RNA 5'-O-triphosphates using cycloSal chemistry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 64 (1), 4-67 (2016).
  36. Perez, J. T., et al. Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11525-11530 (2010).
  37. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. The Journal of Organic Chemistry. 54 (3), 631-635 (1989).
  38. Gaur, R. K., Sproat, B. S., Krupp, G. Novel solid phase synthesis of 2'-o-methylribonucleoside 5'-triphosphates and their α-thio analogues. Tetrahedron Letters. 33 (23), 3301-3304 (1992).
  39. Reddy, M. P., Hanna, N. B., Farooqui, F. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides. Tetrahedron Letters. 35 (25), 4311-4314 (1994).
  40. Hogrefe, R. I., McCaffrey, A. P., Borozdina, L. U., McCampbell, E. S., Vaghefi, M. M. Effect of excess water on the desilylation of oligoribonucleotides using tetrabutylammonium fluoride. Nucleic Acids Research. 21 (20), 4739-4741 (1993).
  41. Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2′-O-[(Triisopropylsilyl)oxy]methyl(2′-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta. 84 (12), 3773-3795 (2001).
  42. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), (2019).
  43. Paul, N., Joyce, G. F. A self-replicating ligase ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12733-12740 (2002).
  44. Lincoln, T. A., Joyce, G. F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 323 (5918), 1229-1232 (2009).
  45. Robertson, M. P., Joyce, G. F. Highly efficient self-replicating RNA enzymes. Chemistry & Biology. 21 (2), 238-245 (2014).
  46. Singh, J., et al. Synthesis of modified nucleoside oligophosphates simplified: fast, pure, and protecting group free. Journal of the American Chemical Society. 141 (38), 15013-15017 (2019).
  47. Bellon, L. Oligoribonucleotides with 2'-O-(tert-butyldimethylsilyl) groups. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 3., Unit 3.6 (2001).

Tags

Bioteknik utgåva 184
Kemisk trifosforylering av oligonukleotider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bare, G. A. L., Horning, D. P.… More

Bare, G. A. L., Horning, D. P. Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (184), e63877, doi:10.3791/63877 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter