Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تشريح اليد من Caenorhabditis elegans الأمعاء

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64120
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Colorado State University

Summary

يصف البروتوكول الحالي إجراء لعزل الأمعاء عن ديدان الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans البالغة يدويا لإدخالها في علم الجينوم أو البروتينات أو الميكروبيوم أو المقايسات الأخرى.

Abstract

تتكون أمعاء Caenorhabditis elegans من 20 خلية فقط ، وهي حلقة الوصل بين العديد من الوظائف الداعمة للحياة ، بما في ذلك الهضم والتمثيل الغذائي والشيخوخة والمناعة والاستجابة البيئية. تتلاقى التفاعلات الحرجة بين مضيف C. elegans وبيئته داخل الأمعاء ، حيث تتركز ميكروبيوتا الأمعاء. لذلك ، فإن القدرة على عزل أنسجة الأمعاء بعيدا عن بقية الدودة ضرورية لتقييم العمليات الخاصة بالأمعاء. يصف هذا البروتوكول طريقة لتشريح أمعاء C. elegans البالغة يدويا. يمكن تنفيذ الإجراء في سلالات تحمل علامات الفلورسنت لأغراض السهولة أو التدريب. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن جمع الأمعاء من الديدان غير المصنفة من أي نمط وراثي. يسمح نهج التشريح المجهري هذا بالالتقاط المتزامن للأنسجة المعوية المضيفة وميكروبيوتا الأمعاء ، وهي فائدة للعديد من دراسات الميكروبيوم. على هذا النحو ، يمكن أن تشمل التطبيقات النهائية للمستحضرات المعوية الناتجة عن هذا البروتوكول على سبيل المثال لا الحصر عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا المعوية وعزل الحمض النووي من الجراثيم التي تم التقاطها. بشكل عام ، يوفر تشريح اليد لأمعاء C. elegans طريقة بسيطة وقوية للتحقيق في الجوانب الحرجة لبيولوجيا الأمعاء.

Introduction

تعد دودة الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans ، التي تحتوي على 959 خلية فقط ودورة حياة من بيضة إلى بيضة لمدة 4 أيام ، نظاما نموذجيا مثاليا للعديد من الدراسات الوراثية وعلم الجينوم والدراسات التنموية 1,2. ساهمت سهولة الفحص الجيني الأمامي والعكسي ، وانتشار علامات الفلورسنت المهندسة ، والقدرة على إجراء تحرير الجينوم الخاص بالنيوكليوتيدات ، والعديد من الموارد على مستوى المجتمع في الاكتشافات والرؤى الرئيسية في نظام C. elegans. ومع ذلك ، فإن العيب الكبير هو صعوبة الحصول على مجموعات نقية من الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء ، وهي صغيرة وهشة ويمكن أن تكون مترابطة. نظرا لأن المجموعات النقية من الخلايا مهمة لفحوصات الجينوم مثل RNA-seq و ChIP-seq و ATAC-seq ، فقد ظهرت عدة طرق للحصول على مستحضرات نقية لخلايا وأنسجة وأعضاء C. elegans. هنا ، يتم وصف طريقة لتشريح الأمعاء اليدوية ، في أقسام كبيرة ، من ديدان C. elegans البالغة. المستحضرات الناتجة مناسبة لفحوصات الجينوم النهائية (الشكل 1).

طريقة تشريح الأنسجة الدقيقة الموصوفة هنا (الشكل 2) هي مجرد نهج واحد. كما تم استخدام تقنيات بديلة أخرى - مثل وضع العلامات الجزيئية ، وتصنيف الديدان ، وتنقية أنواع الخلايا ذات الأهمية مع فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) والتحليل اللاحق - بنجاح لمسح السمات الخاصة بالأنسجة في البيولوجيا الجزيئية C. elegans. ومع ذلك ، فإن ميزة تشريح اليد على هذه الأساليب الأخرى هي أنه يمكن استخدامه لاستكشاف ميزات أمعاء C. elegans ومحتوياتها البكتيرية في وقت واحد3،4،5. يتيح ذلك تسلسل جين 16S rRNA ويسهل دراسات الميكروبيوم داخل نظام C. elegans. ومع ذلك ، فإن أحد القيود المهمة هو أن الخلايا المعوية ليست معزولة بشكل فردي.

يضفي وضع العلامات الجزيئية علامة خاصة بنوع الخلية على الجزيئات فقط داخل الأنسجة أو الخلايا المحددة ذات الأهمية. يمكن بعد ذلك عزل هذه العلامات عن الاستعدادات الكلية للدودة. وبهذه الطريقة ، قام المروجون الخاصون بالأنسجة الذين يقودون بروتينا مرتبطا بولي A موسوما أو قائدا مقسما بتمكين التنميط النسخي الخاص بالأنسجة6،7،8،9،10 و 3'UTRرسم الخرائط 11،12. وبالمثل ، تم إجراء ملفات تعريف عامل النسخ الخاصة بالأنسجة باستخدام ChIP-seq و DamID ، حيث تم إلحاق متغيرات عامل النسخ الخاصة بالمروج بعلامات أو اندماجات الإنزيم13,14.

يسمح نظام FACS بعزل أنواع الخلايا ذات الأهمية عن الديدان المنفصلة بناء على خصائصها الخلوية الجوهرية وخصائصها الفلورية. أنتج هذا النهج نسخات خاصة بالأنسجة من أعضاء متنوعة 8،15،16 وأنواع الخلايا العصبية الفردية8،9،15،16،17،18 وتم استخدامه لإنشاء خريطة تعبير للجهاز العصبي C. elegans بأكمله 19،20 . كما تم استخدام FACS ، وفرز النوى المنشط بالفلورة (FANS) ، لإنشاء ملفات تعريف كروماتين خاصة بالخلية21,22.

أخيرا ، يمكن إجراء تحليل ما بعد التخصيص في مقايسات دقة الخلية الواحدة. في هذه الطريقة ، يتم مسح جميع الخلايا الفردية ، وينسب نوع الخلية لكل منها في مرحلة التحليل ، ويتم تصفية أنواع الخلايا ذات الأهمية بشكل انتقائي لمزيد من الدراسة. تم استخدام التحليل اللاحق بنجاح للحصول على نسخ من الخلايا النامية ذات الدقة المكانية والزمانية العالية في أجنة C. elegans 23،24،25،26،27 و L1 28 مرحلة الديدان. كما تم تمييز إمكانية الوصول إلى الكروماتين باستخدام ATAC-seq بدلا من RNA-seq باستخدام استراتيجية مماثلة29.

كل نهج له مزاياه وقيوده. بالنسبة لأمعاء C. elegans ، يمكن تحقيق تصنيف الديدان وعزل الخلايا المعوية FACS في مراحل الجنين واليرقات30 ولكنه يمثل تحديا عند البالغين. يعتقد أن هذا يرجع إلى خلايا الأمعاء الكبيرة والمكررة داخليا والملتصقة بشدة مما يجعل من الصعب فصلها دون تلف. طريقة تشريح اليد الموصوفة هنا تتحايل على هذه التحديات ، مما يسمح بعزل أجزاء كبيرة من أمعاء الدودة البالغة. ممارسة تشريح الغدد التناسلية اليدوية من هذه المرحلة نفسها منتشرة ومباشرة. تشريح الأمعاء مشابه لتشريح الغدد التناسلية ولكنه أقل شيوعا32. البروتوكول المعروض هنا مقتبس من بروتوكول أطول غير منشور طوره الدكتور جيمس ماكغي وبارب غوشتينسكي. يستعير هذا البروتوكول المبسط تقنيات لعزل البلاستوميرات من الأجنة في المراحل المبكرة23،33،34،35. على الرغم من أن تشريح اليد غير ممكن لعزل معظم أنواع الخلايا أو الأنسجة في C. elegans ، إلا أنه مثالي لعزل الأمعاء عن الديدان البالغة. لذلك ، يكمل تشريح اليد وسائل أخرى للحصول على مستحضرات الخلايا الخاصة بالأمعاء.

Protocol

تم استخدام الديدان CL2122 للدراسة الحالية. تم الحصول على الديدان من خلال مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC ، انظر جدول المواد) ، بتمويل من مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية البحثية (P40 OD010440).

1. تزايد الديدان للتشريح

  1. قم بزراعة صفيحة واحدة كبيرة من ديدان CL2122 ذات المرحلة المختلطة للمزامنة باتباع إجراءات الاستزراع القياسية (أي ألواح NGM المصنفة ب E. coli OP50) 36,37.
    ملاحظة: يستغرق الأمر عموما ~ 96 ساعة للوصول إلى أقصى قدرة لوضع البيض.
    1. يقوم الجنين بإعداد الديدان خلال فترة 72-96 ساعة. بعد تحضير الجنين ، اترك الأجنة تفقس في M9 (انظر الجدول 1) لمدة 48 ساعة. سيؤدي ذلك إلى مجموعة متزامنة من ديدان المرحلة L1.
      ملاحظة: تؤوي ديدان CL2122 جينا محورا متكاملا - GFP (بروتين فلوري أخضر) مدفوعا من مروج mtl-2 (MeTaLlothionein 2) الخاص بالأمعاء38. هذا المروج خاص بسيتوبلازم الخلايا المعوية ويسمح بتصور الأمعاء على مجهر تشريح الفلورسنت. بمجرد التدريب ، قد لا يجد المستخدمون إرشادات مضان ضرورية.
  2. لوحة متزامنة الديدان L1 على ما لا يقل عن لوحين صغيرين. تنمو الديدان على لوحات NGM مع ما يكفي من الطعام حتى تصل إلى مرحلة البلوغ (يتم تحديدها من خلال وجود أجنة قادرة على وضع البيض). يستغرق هذا ما بين 38-46 ساعة عند 20 درجة مئوية.
    1. احرص على التأكد من أن نفس المرحلة التنموية يتم حصادها عبر النسخ المتماثلة وعبر السلالات المقارنة.
      ملاحظة: يعتمد طول الفترة الزمنية لنمو الديدان على الإجهاد ودرجة الحرارة ومصدر الغذاء ومرحلة النمو المستهدفة39. يمكن أيضا استخدام مراحل أخرى بالقرب من مرحلة البلوغ ، مثل L4 ومراحل البالغين الأكبر سنا. لتخطيط تجارب الميكروبيوم ، يمكن استخدام مصادر غذائية بكتيرية مختلفة تتجاوز مصدر الغذاء التقليدي (E. coli OP50) لزراعة الديدان ، مثل سلالات CeMbio4 أو مسببات الأمراض ذات الأهمية40.

2. تحضير محاليل المخزون والماصات الشعرية الدقيقة

ملاحظة: يقدم الجدول 1 تفاصيل جميع المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذه الدراسة.

  1. قم بإعداد 50 مل من أملاح البيض (المعروفة أيضا باسم مخزن البيض) في أنبوب مخروطي خال من النيوكلياز (انظر جدول المواد). بمجرد صنعه ، يخزن في درجة حرارة الغرفة.
  2. تحضير 10 مل من محلول مخزون ليفاميزول 100 مللي مول في أنبوب مخروطي خال من النيوكلياز. بمجرد التحضير ، اصنع 500 ميكرولتر من القسمة وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية. يمكن إذابة القسمة وتخزينها في 4 °C لمدة 1 أسبوع في كل مرة.
  3. تحضير 1 مل من محلول ألبومين مصل البقر الأسيتيل (BSA) من مخزون 20 ملغ/مل في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النيوكلياز. بمجرد التحضير ، اصنع 50 ميكرولتر من القسمة ذات الاستخدام الواحد وقم بتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: من المهم استخدام نسخة الأستيل من BSA لأن هذا هو الشكل الوحيد من BSA الخالي من النيوكلياز. يمكن أن يكون BSA غير الأسيتيل مصدرا مهما للنيوكليازات ، وبالتالي يؤدي إلى تدهور العينات.
  4. قم بإعداد ما لا يقل عن خمس ماصات شعرية دقيقة 50 ميكرومتر و 100 ميكرومتر لكل منها باتباع الخطوات أدناه.
    1. أولا ، اسحب الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية (4 بطول وقطر خارجي 1.2 مم) إلى شكل إبرة حقن باستخدام مجتذب إبرة (انظر جدول المواد) وشروط "الخلية الملتصقة ، C. elegans ، و Drosophila" من كتاب الطبخ Sutter Instruments Pipette41 (الشروط: الحرارة = المنحدر + 5 ؛ سحب = 100 ؛ . = 75 ؛ التأخير = 90 ؛ الضغط = 500 ؛ صندوق 2.5 مم × 2.5 مم).
    2. بعد ذلك ، قم بتشكيل الماصات الشعرية الدقيقة إما إلى 50 ميكرومتر (ثلاث علامات علامة كما هو موضح بواسطة مسطرة العين microforge تحت هدف M5 / 0.1) أو 100 ميكرومتر (خمس علامات علامة تحت نفس الظروف) باستخدام microforge (انظر جدول المواد). تمثل هذه الأحجام قطر الفتح المقدر للماصة الشعرية الدقيقة (الشكل 3).
    3. ثم قم بتثبيت أنبوب شفاط الفم على الماصات الشعرية الدقيقة.
      ملاحظة: يتم التحكم في ماصات الشفط تقليديا عن طريق سحب الماصات ، لكن العديد من بروتوكولات السلامة الحديثة لا تسمح بهذه الطريقة. على هذا النحو ، يمكن للمستخدمين التحكم في الشفط باستخدام أنبوب شفاط الفم عن طريق قرص الأنبوب بين الإصبع والإبهام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تركيب مرشح حقنة داخل نظام أنابيب شفاط الفم لمزيد من الأمان.

3. التحضير التجريبي

  1. تحضير 5 مل من المخزن المؤقت للتشريح في أنبوب مخروطي خال من النيوكلياز. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  2. تحضير 1 مل من محلول BSA الأسيتيل العامل في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النيوكلياز. الحفاظ على الجليد.
  3. اصنع 350 ميكرولتر من محلول ليفاميزول العامل في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النيوكلياز. تحضير في ثلاث نسخ (أنبوب واحد لحوالي 20 ديدان). الحفاظ على الجليد.
  4. تحضير مخزن خلبي في أنبوب طرد مركزي دقيق خال من النيوكلياز (الجدول 1). جعل في تكرار (أنبوب واحد لحوالي 10 الديدان تشريح). الحفاظ على الجليد. يؤدي استخدام مخزن الاستخلاب أثناء تشريح اليد إلى تحسين جودة وكمية الحمض النووي الريبي (الشكل 4).
  5. قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق واحد لكل مجموعة تجريبية تحتوي على 500 ميكرولتر من كاشف عزل الحمض النووي أو كاشف عزل محدد من قبل المجموعة (انظر جدول المواد) في أنبوب خال من النيوكلياز. الحفاظ على الجليد. سيتم استخدام هذا الأنبوب لجمع الأمعاء النهائية المعزولة للتخزين أو الاستخدام لاحقا.
  6. قم بإعداد حمام M9 واحد وحمام عازل تشريح واحد. للقيام بذلك ، احصل على طبقين بتري معقمين بقطر 35 مم. ثم أضف 2 مل من M9 إلى طبق واحد و 2 مل من مخزن التشريح إلى الآخر. أخيرا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول BSA العامل لكل حمام. دوامة لخلط. إضافة BSA إلى الحمامات سيمنع الديدان من الالتصاق بالبلاستيك.
  7. تحضير مجموعة التشريح. الحصول على شريحة تقعر 2 بئر (انظر جدول المواد) وإضافة 150 ميكرولتر من محلول ليفاميزول العمل إلى البئر الأول. ثم أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتشريح إلى البئر الثاني. أخيرا ، أضف 20 ميكرولتر من محلول BSA العامل لكل بئر. ستؤدي إضافة BSA إلى كل بئر إلى منع الديدان من الالتصاق بالشريحة.

4. تشريح اليد من الأمعاء C. elegans

  1. باستخدام معول دودة ، انقل 20 دودة بالغة من لوحة NGM إلى حمام M9 (الخطوة 3.6). هذا سوف يغسل البكتيريا الخارجية من الديدان.
  2. بعد ذلك ، انقل جميع الديدان العشرين من حمام M9 إلى حمام التشريح العازل (الخطوة 3.6). سيؤدي ذلك إلى مزيد من غسل البكتيريا الخارجية وموازنة الديدان في المخزن المؤقت للتشريح.
  3. بعد ذلك ، انقل دفعات من الديدان (أي في مجموعات من 10) من حمام التشريح العازل إلى البئر الذي يحتوي على محلول الليفاميزول (الخطوة 3.7).
    ملاحظة: ليفاميزول سوف يشل الديدان مؤقتا.
    1. بمجرد أن تتباطأ حركات الدودة ، انقلها بسرعة من بئر الليفاميزول إلى البئر الذي يحتوي على مخزن التشريح (الخطوة 3.7). احرص على عدم الإفراط في شل الديدان.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف عدد الديدان المنقولة على دفعات إلى محلول الليفاميزول بناء على راحة المستخدم. وينطبق هذا أيضا على عدد الديدان التي تم التقاطها في البداية في حمام M9 ثم انتقلت إلى الحمام العازل للتشريح. من الممارسات الجيدة أن يكون لديك ديدان إضافية متاحة للتشريح ، خاصة أثناء التدريب ، حيث يتعلم المستخدم ويشعر بالراحة مع البروتوكول.
  4. بعد ذلك ، اسمح للديدان بالبدء في التحرك قليلا في مخزن التشريح قبل بدء التشريح.
    ملاحظة: الأمعاء لا تنبثق بشكل جيد من الديدان المشلولة بشكل مفرط (أي الديدان التي لا تتحرك على الإطلاق).
  5. عندما تكون جاهزا ، قم بتشريح الديدان تحت نطاق تشريح الفلورسنت باستخدام إبرة تحت الجلد (أي 27 جم × 1/2 بوصة) (انظر جدول المواد) عن طريق إجراء قطع واحد إما خلف البلعوم مباشرة (الشكل 5 أأ) أو أمام المستقيم مباشرة (الشكل 5 أب). سينتج عن ذلك قسمان كبيران من الأمعاء ، نصف أمامي ونصف خلفي ونصف خلفي متوسط. استمر في هذا النمط لبقية الديدان ، مع الحفاظ على عدد أقسام الأمعاء التي تم الحصول عليها من الأقسام الأمامية والوسطى والخلفية المكافئة حتى يتم الحصول على العدد الإجمالي المطلوب للأمعاء.
    ملاحظة: يمكن أن يساعد لصق الإبرة تحت الجلد على برميل حقنة فارغ سعة 1 مل في التلاعب بها أثناء تشريح اليد. اعتمادا على راحة وتجربة المستخدم ، ليس من غير المألوف إجراء قطع تشريح لا ينتج عنه أي جزء معوي. ومع ذلك ، مع الممارسة ، يصبح هذا أقل شيوعا.
  6. انتظر حوالي 1 دقيقة حتى تنبثق الأمعاء إلى أقصى حد من الجسم. عادة ما تأخذ شكل حلقة وقد تكون عالقة في جزء من الغدد التناسلية (الشكل 5 أ). أثناء الانتظار ، أضف 50 ميكرولتر من محلول الاستخلاب إلى البئر للمساعدة في تقليل تدهور الحمض النووي الريبي (الشكل 4).
  7. أثناء الانتظار وللمساعدة بشكل أكبر في تسهيل بثق الأمعاء ، استخدم ماصة 100 ميكرو متر متصلة بشفاط الفم وارسم الأمعاء / الدودة داخل وخارج الماصة (الشكل 5 ب). هذا سوف يساعد أيضا على تحرير الأمعاء من الغدد التناسلية. احرص على عدم فقدان الأمعاء عن طريق امتصاصها بالكامل عن طريق الخطأ في ماصة الشعيرات الدموية الدقيقة.
    ملاحظة: يمكن للمستخدم التبديل بين ماصات microcapillary 100 μm و 50 μm لتحرير الأمعاء من بقية الجسم والغدد التناسلية. قد توفر فتحة القطر الأصغر لماصة الشعيرات الدموية الدقيقة 50 ميكرومتر فائدة لإزالة القطع اللاصقة من الأمعاء. يتم التحكم في ماصات الشفط تقليديا عن طريق سحب الماصات ، لكن العديد من بروتوكولات السلامة الحديثة لا تسمح بهذه الطريقة. على هذا النحو ، يمكن للمستخدمين التحكم في الشفط باستخدام أنبوب شفاط الفم عن طريق قرص الأنبوب بين الإصبع والإبهام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تركيب مرشح حقنة داخل نظام أنابيب شفاط الفم لمزيد من الأمان.
  8. بمجرد بثق الأمعاء بشكل كاف ، استخدم إبرة تحت الجلد 27 جم لقطعها بعيدا عن بقية الجسم وأي غدد تناسل متبقية. يمكن أن يختلف حجم قسم الأمعاء المعزول اختلافا كبيرا اعتمادا على تجربة الحصادة وجودة القطع ومستوى الشلل في الدودة.
    ملاحظة: يمكن مراقبة سلامة الأمعاء والشظايا المعوية بسهولة في جميع أنحاء البروتوكول عبر مضان GFP.
  9. الآن ، استخدم ماصة microcapillary لشفط قسم الأمعاء ونقله من البئر إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على كاشف عزل الحمض النووي أو كاشف العزل المحدد عدة عدة. الحفاظ على الأمعاء المعزولة في الكاشف على الجليد وكرر للأمعاء المتبقية.
    ملاحظة: يمكن إضافة أمعاء متعددة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على كاشف عزل الحمض النووي أو كاشف عزل آخر محدد بالمجموعة على مدار اليوم. الحفاظ على الجليد. إذا كان لا يمكن عزل جميع الأمعاء في 1 يوم ، يمكن الاحتفاظ بتلك التي تم عزلها بالفعل وتخزينها في كاشف عزل الحمض النووي (الذي يحافظ على الأحماض النووية) عند -80 درجة مئوية حتى تستأنف العزلة و / أو يمكن إكمالها. هنا ، تكون العينات مستقرة على المدى الطويل (أي عدة أشهر إلى 1 سنة) ويمكن أن تبقى حتى تكون جاهزة لعزل الأحماض النووية. يمكن حصاد الأمعاء في الماء أو أي مخزن مؤقت تحلل خاص بالمجموعة. ومع ذلك ، يجب مراعاة ذلك عند تحديد المدة التي يمكن أن تبقى فيها الأمعاء في مخزن مؤقت معين على الجليد (أو درجة حرارة أخرى مرغوبة) قبل الانتقال إلى التطبيقات النهائية.

5. عزل الحمض النووي الريبي من الأمعاء تشريح

  1. تجانس الأنسجة المكتسبة المخزنة في كاشف عزل الحمض النووي عن طريق إجراء ثلاث دورات تجميد / ذوبان / دوامة. للقيام بذلك ، استخدم حمام حبة 37 درجة مئوية والنيتروجين السائل (أو أي وسيلة أخرى مماثلة).
  2. بعد ذلك ، أضف 0.2 حجم من الفينول: الكلوروفورم: كاشف IAA (انظر جدول المواد) إلى العينة والدوامة لفترة وجيزة. على سبيل المثال ، بالنسبة لحجم عينة البدء البالغ 500 ميكرولتر ، فإن 0.2 حجم من الكلوروفورم سيكون 100 ميكرولتر.
  3. رج الأنبوب باليد لمدة 20 ثانية ، ثم احتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
  4. افصل مراحل العينة عن طريق الطرد المركزي (10000 × جم ، 18 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
  5. قم بإزالة المرحلة المائية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد خال من النيوكلياز.
    ملاحظة: احرص على عدم استنشاق الواجهة أو إزعاجها.
  6. بعد ذلك ، أضف حجما متساويا من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الطور المائي وهز العينة يدويا لمدة 20 ثانية.
  7. نقل 700 ميكرولتر من العينة إلى عمود الدوران (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بربط الحمض النووي الريبي بالعمود بالطرد المركزي (≥8000 × جم ، 30 ثانية ، RT [درجة حرارة الغرفة]). تخلص من التدفق من خلال. كرر ذلك مع أي عينة إضافية متبقية.
  8. أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW1 (انظر جدول المواد) إلى العمود لغسل العينة. ثم ، أجهزة الطرد المركزي (≥8000 × جم ، 30 ثانية ، RT) وتجاهل التدفق.
  9. إجراء هضم الحمض النووي على العمود. أضف 80 ميكرولتر من DNase I في المخزن المؤقت RDD (انظر جدول المواد) إلى عمود العينة. ثم احتضنها لمدة 15 دقيقة في RT.
  10. ثم أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت RW1 إلى العمود لغسل العينة. أجهزة الطرد المركزي (≥8000 × جم ، 30 ثانية ، RT) ونقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد. تخلص من أنبوب التدفق وأنبوب التجميع القديم. هذا الغسيل يزيل DNase.
  11. أضف 500 ميكرولتر من RPE (انظر جدول المواد) إلى عمود العينة. ثم ، أجهزة الطرد المركزي (≥8000 × جم ، 30 ثانية ، RT) وتجاهل التدفق. كرر لغسل ثانية.
  12. ثم ، جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة إضافية لزيادة تجفيف غشاء العمود (≥8000 × جم ، 1 دقيقة ، RT). بعد ذلك ، انقل عمود العينة إلى أنبوب تجميع أجهزة طرد مركزي دقيق جديد خال من النيوكلياز مع غطاء. تخلص من أنبوب التدفق وأنبوب التجميع القديم.
  13. أضف 14 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز مباشرة إلى غشاء عمود العينة. ثم احتضان العينة لمدة 2 دقيقة في RT. بعد ذلك ، أجهزة الطرد المركزي (≥8000 × جم ، 1 دقيقة ، RT) لتقليب الحمض النووي الريبي.
  14. قم بتخزين العينة على الثلج. بعد ذلك ، قم بتقييم جودة وكمية الحمض النووي الريبي للعينة باستخدام مجموعات الفحص المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتخزين العينة في فريزر -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: الحمض النووي الريبي مستقر بشكل عام عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة دون تدهور.

Representative Results

تم استخدام البروتوكول الحالي لعزل أجزاء كبيرة من الأمعاء عن C. elegans البالغة باليد (الشكل 2). تتكون عينة الأمعاء النهائية لكل مجموعة تجريبية موضحة من مجموعة متساوية من أقسام الأمعاء الأمامية والوسطى والخلفية. ومع ذلك ، اعتمادا على السؤال التجريبي ، يمكن أن يشتمل أيضا على مجموعة من أقسام الأمعاء الأمامية أو المتوسطة أو الخلفية فقط. وتعرض إجمالا ثلاث نتائج تمثيلية لهذا البروتوكول. الأول يصور تشريح وعزل الأمعاء بنجاح (الشكل 6). والثاني يبلغ عن نتائج عزل الحمض النووي الريبي من الأمعاء المعزولة (الشكل 7). ويظهر الثالث نتائج المراقبة الميكروبية من الأمعاء المعزولة (الشكل 8).

بالنسبة للنتيجة الأولى ، يعرض الشكل 6 أ كيف تبدو الأمعاء المبثوقة بعد إجراء شق أولي في الموقع "أ" في الشكل 5 أ داخل ديدان CL2122 البالغة. نظرا لأن ديدان CL2122 تؤوي مروج mtl-2 الخاص بالأمعاء المنصهر في GFP (mtl-2 p::GFP) ، فإن الأمعاء المعزولة سوف تتوهج باللون الأخضر تحت نطاق تشريح الفلورسنت. ثم يظهر التشريح الناجح لجزء معوي في الشكل 6 ب. هذا القسم من الأمعاء خال من الملوثات المرئية مثل الحطام من الغدد التناسلية أو الذبيحة. في المقابل ، يعرض الشكل 6C الأمعاء التي لم يتم تشريحها بنجاح ، حيث لا تزال الغدد التناسلية والذبيحة مرتبطة بشكل واضح بالجزء المعوي.

بالنسبة للنتيجة الثانية ، تم حصاد الأمعاء في كاشف عزل الحمض النووي ومعالجتها في اليوم التالي باستخدام بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي الكلي منخفض المدخلات (انظر جدول المواد). تنتج عينة الأمعاء النهائية المكونة من 60 قسما من الأمعاء الكلية من القسمين الأمامي والأوسط والأوسط الخلفي ما يقرب من 15 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي عالي الجودة (الشكل 7 أ). يمكن الحصول بسهولة على هذه الكمية من الأمعاء الكلية في يوم واحد ولكن يمكن أيضا تقسيمها على مدار عدة أيام إذا لزم الأمر. تعتبر غلة الحمض النووي الريبي من تشريح اليد أكثر كفاءة من تصنيف الديدان وعزل FACS للخلايا المعوية حيث أن مئات الآلاف من الخلايا المعوية مطلوبة للحصول على كميات متناسبة من إجمالي الحمض النووي الريبي (الشكل 7 ب). الأهم من ذلك ، أن عوائد الحمض النووي الريبي الناتجة عن تشريح اليد أكثر من كافية كمدخلات لمجموعات مكتبة RNA-seq التجارية (على سبيل المثال ، NEBNext Ultra II و NEBNext خلية واحدة / مدخلات منخفضة) ، والتي يمكن أن تستغرق أقل من 2 بيكوغرام من الحمض النووي الريبي.

بالنسبة للنتيجة الثالثة ، تم حصاد الأمعاء في ddH20 معقم ومعالجتها في نفس اليوم باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي الميكروبية التجارية (انظر جدول المواد). تنتج عينة الأمعاء النهائية المكونة من 40 قسما من الأمعاء الكلية من القسمين الأمامي والمتوسط والخلفي حوالي 0.009 بيكوغرام من إجمالي الحمض النووي الميكروبي باستخدام مقايسة الكشف عن البكتيريا الشاملة (انظر جدول المواد) (الشكل 8). هذه الكميات منخفضة للغاية بالنسبة لطرق القياس الكمي التقليدية ويجب استقرائها من منحنيات qPCR القياسية. من الناحية المثالية ، يجب على المستخدمين استهداف كمية إجمالية نهائية من الأمعاء >40 لأن هذا يزيد من حد الكشف وحدود الإشارة إلى الضوضاء فيما يتعلق بمستويات تلوث الكاشف.

عند التفكير في التصميم التجريبي ، من الضروري دائما جمع عينات التحكم المناسبة. بالنسبة لتجارب النسخ ، يمكن أن يشمل التحكم التجريبي المناسب الاستعدادات للدودة بأكملها التي تم جمعها بنفس طريقة الأمعاء. أثناء تشريح وعزل الأمعاء من C. elegans ، من الشائع رؤية أجزاء من الذبيحة والغدد التناسلية تتشبث بأقسام الأمعاء. في حين أنه من الناحية المثالية سيتم إزالة هذه الأنسجة الملوثة من الأمعاء قبل تخزينها للاستخدام في نهاية المطاف ، يمكن أن تشمل الضوابط التجريبية الإضافية جمع جثث الديدان المتبقية بعد تشريح الأمعاء و / أو جمع الغدد التناسلية المشرحة. بالنسبة لتجارب الميكروبيوم ، يمكن أن تشمل الضوابط أيضا مستحضرات الدودة بأكملها التي يتم جمعها بنفس طريقة الأمعاء ، بالإضافة إلى الضوابط التقليدية الإيجابية (الثقافة البكتيرية) والسلبية (الماء).

Figure 1
الشكل 1: تشريح اليد للأمعاء من C. elegans البالغة المستخدمة لتوليد مستحضرات خاصة بالأنسجة لاستخدامها في مجموعة متنوعة من فحوصات omics النهائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: مخطط لبروتوكول تشريح اليد. تم استخدام هذا البروتوكول لعزل أجزاء كبيرة من الأمعاء عن C. elegans البالغة باليد. يمكن عزل الأمعاء لفحوصات مختلفة في اتجاه مجرى النهر. يظهر هنا استخدام الأمعاء لعزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) وعزل الحمض النووي الميكروبي. صورة تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تصنيع ماصة الشعيرات الدموية الدقيقة. (أ) تظهر ماصة شعرية دقيقة مسحوبة حديثا، لكنها غير مطروقة، من خلال القطعة العينية للتشكيل الدقيق. يتم استخدام مسطرة العين لقياس ماصات صغيرة بحجم 50 ميكرومتر إلى قطر داخلي يقدر بثلاث علامات تجزئة (موضحة ، يشار إليها بسهم). (ب) تظهر الماصات غير المطروقة ، 50 ميكرومتر و 100 ميكرو متر تحت نطاق التشريح جنبا إلى جنب مع مسطرة معايرة مع 1 div = 0.1 mm. (C) يتم عرض الماصات الشعرية الدقيقة 50 μm و 100 μm من (B) مرة أخرى ولكن من وجهة نظر مختلفة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: استخدام مخزن الاستخلاب (CB) أثناء تشريح اليد لتحسين إنتاجية الحمض النووي الريبي. أدى بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي الكلي منخفض الإدخال إلى إنشاء مستحضرات الحمض النووي الريبي من الأنسجة المسماة. يتم عرض الرحلان الكهربائي الهلامي التمثيلي الذي يميز جودة الحمض النووي الريبي الكلي المعزول (RIN ، رقم سلامة الحمض النووي الريبي) والكمية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: خطوات تشريح اليد . (أ) خطوات التشريح الموضحة في البروتوكول موضحة هنا. في (1) ، يتم تصور أمعاء الدودة بواسطة مضان GFP. يمكن توزيع موقع الشق الأساسي بالتساوي بين الديدان لضمان تغطية متساوية عبر طول الأمعاء بالكامل. بدلا من ذلك ، يمكن اختيار مواقع الشق الأولي "أ" أو "ب" للحصول على إعداد خاص بشظايا الأمعاء الأمامية الوسطى أو المتوسطة الخلفية. في (2) ، تكون الأمعاء قد قذفت ، واتخذت شكل حلقة. في (3) ، يتم قطع الأمعاء أولا بعيدا عن جسم الدودة أثناء محاولة تحريرها من الذبيحة والغدد التناسلية. ثم تتم إزالة الأمعاء من أي جثة أو غدد تناسلية متبقية لا يمكن إزالتها. في (4) ، يتم عزل جزء نظيف من الأمعاء وجاهز للتخزين. (ب) الخطوة الحاسمة هي إخراج أي حطام ملتصق (أي المناسل والذبيحة) من الأمعاء عن طريق تمريره داخل وخارج الماصة الشعرية الدقيقة الموجودة في نهاية شفاط الفم. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 6
الشكل 6: النتائج التمثيلية لخطوات تشريح اليد. صورة تمثيلية توضح (أ) قذف الأمعاء من الدودة. هذه هي الديدان من النمط الوراثي CL2122 ، تعبر عن GFP تحت مروج mtl-2 الخاص بالخلايا المعوية. تظهر صورتان تمثيليتان (ب) جزءا نظيفا ومعزولا تماما من الأمعاء، (ج) أمعاء معزولة بها أنسجة ملوثة للمناسل والذبيحة. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 7
الشكل 7: النتائج التمثيلية لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي من الأمعاء المعزولة . (أ) يتم عرض صورة تمثيلية لمستحضرات الحمض النووي الريبي التي تم حلها بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز ، والتي تميز الجودة (RINs ، رقم سلامة الحمض النووي الريبي) وكمية إجمالي الحمض النووي الريبي المعزول. (ب) يظهر هلام تمثيلي من إجمالي الحمض النووي الريبي المعزول من الخلايا المعوية التي يتم حصادها من ديدان المرحلة L1 عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) للمقارنة. عند 20 خلية لكل أمعاء ، يمكن الاستدلال على أن طريقة تشريح اليد تنتج المزيد من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل أمعاء من الخلايا المعوية المنقاة FACS. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: النتائج التمثيلية لاستخلاص الحمض النووي الميكروبي الكلي من الأمعاء المعزولة. أنتجت مجموعة عزل الحمض النووي الميكروبية التجارية مستحضرات الحمض النووي من الأمعاء والديدان الكاملة والضوابط. تم استخدام اختبار الجينات البكتيرية لتحديد عدد البكتيريا في العينات. صورة تمثيلية ل (A) منحنيات تضخيم qPCR المتولدة ، (B) المنحنى القياسي E. coli OP50 المستخدم لتحديد العينات ، و (C) يتم عرض العينات. في (ب)، يتم تمثيل تركيزات بدء اللوغاريتم لمقاييس الإشريكية القولونية بيانيا مقابل قيم CT الخاصة بها. في (C) ، تم قطع نسختين متماثلتين (ممثلين) من 40 دودة كاملة وسطيا ، وتمت معالجة 40 قسما معويا معزولا لعزل gDNA الميكروبي. يتم أيضا عرض التحكم بدون قالب (NTC) من تشغيل qPCR. يمثل المحور Y عينة قيم CT . تظهر كمية الحمض النووي المحددة كميا من PCRs كقيم بيكوغرام إجمالية (pg) فوق أشرطة العينة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: تركيبات المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

توضح هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لتشريح الأمعاء يدويا من C. elegans البالغة ، مما يولد استعدادات نقية للمقايسات النهائية. تشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول (1) ضمان عدم الإفراط في شل الديدان ، (2) إجراء عمليات تشريح دقيقة ، (3) تزوير ماصات دقيقة الحجم بشكل مناسب للتشريح ، و (4) ضمان الشفاء العاجل للأمعاء السليمة أثناء الحصاد النهائي. لهذه الأسباب ، يجب توخي الحذر عند تعريض الديدان لمحلول الليفاميزول ، ويجب تحديث الإبر تحت الجلد بشكل متكرر لضمان أقصى قدر من الحدة. يعد التعامل مع الأمعاء باستخدام ماصة microcapillary وشفاط الفم خطوة أخرى ستتطلب الممارسة. تحدث الماصات الدقيقة المزورة بشكل صحيح بالحجم المناسب فرقا كبيرا في عزل أجزاء كبيرة من الأمعاء أثناء التشريح ، بالإضافة إلى تقليل خطر فقدان الأمعاء داخل الماصة الدقيقة. عادة ما يفقد مستخدمو البروتوكول الجدد الأمعاء على الحافة الداخلية للماصة الشعرية الدقيقة قبل أن يتم إخراجها إلى كاشف العزل. يمكن تعديل هذه المشكلة بالممارسة والماصات الدقيقة المزورة بشكل صحيح.

تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا للاستخدام في الديدان البالغة. تدعم التجارب الأولية أن هذا البروتوكول فعال أيضا للاستخدام في الديدان L4 والديدان الأكبر سنا. ومع ذلك ، لم يتم تقييم فعالية هذا البروتوكول بعد في ديدان مرحلة اليرقات المبكرة. أحد قيود هذا النهج هو الكمية الصغيرة من المواد التي ينتجها. على الرغم من أن الكميات كافية لتسلسل الحمض النووي الريبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل ، إلا أنها قد لا تكون كافية للمقايسات الأخرى. على هذا النحو ، يحتاج المستخدمون إلى تحديد ما إذا كان الحد الأدنى من المدخلات المطلوبة للفحص يمكن جمعها عمليا باستخدام هذا البروتوكول.

يستخدم مختبرنا بشكل روتيني FACS لتنقية الخلايا المعوية بعد العزل 30 ، وطرق التحليل اللاحقة لتحديد الخلايا المعوية ، وطريقة تشريح اليدهذه 30،42. يتميز تشريح اليد بأنه قابل للاستخدام في الديدان البالغة عندما يكون تصنيف الديدان وعزل الخلايا أقل نجاحا. علاوة على ذلك ، فإن كفاءة وجودة إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج من مستحضرات تشريح اليد عالية ، على الأرجح لأن الأنسجة يتم انتزاعها بسرعة من الديدان ثم ترسبها بسرعة في كاشف عزل الحمض النووي ، مما يقلل من تدهور الحمض النووي الريبي. فائدة أخرى لطريقة تشريح اليد هي أنها منخفضة التكلفة وسهلة التعلم ولا تتطلب معدات متخصصة. أخيرا ، يسمح هذا النهج بحصاد وعزل بكتيريا الأمعاء من الأمعاء الدودية ، مما يتيح إجراء دراسات الميكروبيوم النهائية.

يمثل بروتوكول تشريح اليد الموصوف هنا لعزل الأمعاء عن C. elegans البالغة أداة قوية لدراسة الجوانب المختلفة لبيولوجيا C. elegans. على سبيل المثال ، من خلال التحضير النقي للأمعاء ، يمكن للباحثين التحقيق في التقاطع بين المناعة والشيخوخة والتمثيل الغذائي والميكروبيوم.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نحن مدينون للعمل الرائد لجيمس ماكغي وبارب جوشينسكي ، اللذين طورا في البداية طريقة تشريح الأمعاء التي تم تكييف هذا البروتوكول منها. يتم دعم عملنا من خلال جائزة MIRA (R35) التي يشرف عليها المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (المعاهد الوطنية للصحة ، R35GM124877 إلى EON) وجائزة NSF-CAREER التي يشرف عليها NSF MCB Div للعلوم البيولوجية الجزيئية والخلوية (جائزة #2143849 إلى EON).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-420 Nuclease free BSA
CL2122 worm strain CGC (Caenorhabditis Genetics Center) CL2122 dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT.
Calcium Chloride Dihydrate Fisher C79 needed for making Egg Salts
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-108 Nuclease free conical tube needed for solution making.
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-103 Nuclease free conical tube needed for solution making.
Concavity slide (2-well) Electron Microscopy Sciences 71878-08 12-pk of 2-well concavity slides
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Millipore Sigma E3889 needed for making chelation buffer
Fluorescent Dissection Microscope Leica M205 FCA This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Millipore Sigma H4034 needed for making dissection buffer
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 for assesment of total RNA quality and quantity
HostZERO Microbial DNA Kit Zymo Research D4310 Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms
Hypodermic Needle (27G x 1/2") BD Scientific 305109 needed for hand dissection of intestines
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) Millipore Sigma L9756 used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines.
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) BD Scientific 309628 Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger.
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher M33 needed for making Egg Salts
Magnesium Sulfate Hpetahydrate Sigma-Aldrich 230391-500G needed for making M9 buffer
MF-900 Microforge Narishige MF-900 Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research.
1.7 mL Microtubes, Clear Olympus Plastics 22-282 Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage.
Mouth Aspirator Tube Millipore Sigma A5177 Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines.
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay Thermo Fisher A50137 Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR.
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instruments Model P-1000 Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging.
Petri Dish (35 x 10 mm) Genesee Scientific - Olympus Plastics 32-103 Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection.
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9730 Used in the isolation of total RNA
Potassium Chloride Millipore Sigma 529552 needed for making Egg Salts
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P0662-500G needed for making M9 buffer
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen Q33216 Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
Qubit RNA HS Assay Kit Invitrogen Q32852 Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111 Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol.
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection
Sodium Chloride Fisher S271 needed for making Egg Salts
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S373-500 needed for making M9 buffer
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) Thermo Fisher 72302520 Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting.
4150 TapeStation System Agilent G2992AA Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix Applied Biosystems A52699 master mix used for qPCR
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred.
Worm Pick NA NA Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. C. elegans II. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  3. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  6. Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans. Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).
  7. Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -J., Kim, S. K. Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans. Development. 133 (2), 287-295 (2005).
  8. Spencer, W. C., et al. A spatial and temporal map of C. elegans gene expression. Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).
  9. Spencer, W. C., et al. Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling. PLoS One. 9 (11), 112102 (2014).
  10. Ma, X., et al. Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT). Nucleic Acids Research. 44 (21), 156 (2016).
  11. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 4 (2015).
  12. Blazie, S. M., et al. Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues. Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).
  13. Gómez-Saldivar, G., et al. et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).
  14. Katsanos, D., Barkoulas, M. Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate. Science Advances. 8 (5), 3141 (2022).
  15. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).
  16. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  17. Mathies, L. D., et al. mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister. BMC Genomics. 20 (1), 427 (2019).
  18. Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing. Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).
  19. Glenwinkel, L., et al. In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system. eLife. 10, 64906 (2021).
  20. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  21. Charest, J., et al. Combinatorial action of temporally segregated transcription factors. Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).
  22. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).
  23. Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. A transcriptional lineage of the early C. embryo. Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).
  24. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  25. Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer. Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).
  26. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  27. Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution. Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).
  28. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  29. Durham, T. J., et al. Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes. Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).
  30. King, D. C., et al. The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome. bioRxiv. , (2021).
  31. Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU. Journal of Visualized Experiments. (140), e58339 (2018).
  32. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  33. Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 120 (2), 443-451 (1994).
  34. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and manipulation of embryonic cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  35. Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis. PLoS Genetics. 11 (4), 1005117 (2015).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  38. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  39. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy. WormAtlas. , (2006).
  40. Tan, M. -W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).
  41. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument Company. , Novato, CA. https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2018).
  42. Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm. Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).

Tags

علم الأحياء ، العدد 187 ، C. elegans ، الأمعاء ، تشريح اليد ، mtl-2 ، الميكروبيوم ، علم النسخ
تشريح اليد من <em>Caenorhabditis elegans</em> الأمعاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. … More

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. T. P., Osborne Nishimura, E. Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (187), e64120, doi:10.3791/64120 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter