Summary
Som reaktion på den alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi blev der udviklet en laboratorieprotokol til at teste den virale desinfektionseffekt af varmt vandvask af klud ansigtsbeklædning, bomuldsskrubber og denimbukser. Phi6-viruset (bakteriofag) blev brugt som organismen til at teste desinfektionseffektiviteten.
Abstract
Denne protokol giver et eksempel på en laboratorieproces til gennemførelse af hvidvaskningsundersøgelser, der genererer data om viral desinfektion. Mens protokollen blev udviklet til forskning under coronavirussygdommen 2019 (COVID-19) -pandemien, er den beregnet til at være en ramme, der kan tilpasses andre virusdesinfektionsundersøgelser; Det demonstrerer trinene til forberedelse af testviruset, podning af testmaterialet, vurdering af visuelle og integritetsændringer af de vaskede genstande på grund af hvidvaskningsprocessen og kvantificering af reduktionen i viral belastning. Derudover skitserer protokollen de nødvendige kvalitetskontrolprøver for at sikre, at eksperimenterne ikke er forudindtaget af forurening og målinger / observationer, der skal registreres for at spore den materielle integritet af de personlige værnemidler (PPE) -genstande efter flere hvidvaskningscyklusser. De repræsentative resultater, der præsenteres med protokollen, bruger Phi6-bakteriofagen podet på bomuldsskrubbe, denim og bomuldsbelægningsmaterialer og indikerer, at varmtvandsvasknings- og tørringsprocessen opnået over en 3-log (99,9%) reduktion i viral belastning for alle prøver (en 3-logreduktion er desinfektionspræstationsmetrikken i US Environmental Protection Agency's Product Performance Test Guideline 810.2200). Reduktionen i viral belastning var ensartet på tværs af forskellige steder på PPE-emnerne. Resultaterne af denne testprotokol for viral desinfektionseffektivitet bør hjælpe det videnskabelige samfund med at undersøge effektiviteten af hvidvaskning i hjemmet for andre typer testvirus og hvidvaskningsprocedurer.
Introduction
Coronavirus-sygdommen 2019 (COVID-19) -pandemien forårsagede hidtil uset global afbrydelse af forsyningskæden og førte til en kritisk mangel på mange varer, herunder vigtigt personligt beskyttelsesudstyr (PPE)1,2,3. De i højrisikoerhverv måtte tilpasse sig ved hjælp af anbefalede krisekapacitetsstrategier, og offentligheden vedtog brugen af ikke-specialiserede genstande såsom ansigtsbeklædning af stofmateriale primært til kildekontrol, men også for at give bærere noget åndedrætsværn. I USA var specialiseret åndedrætsværn (dvs. filtrering af åndedrætsværn (FFR'er) såsom N95'er) forbeholdt nogle af disse højrisikoerhverv (f.eks. Sundhedspleje) under forsyningsmangel4. Da man vidste lidt om alvorlig akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-Cov-2) transmission, blev en række andre typer tøjmaterialer også betragtet som barrierebeskyttelse tidligt i pandemien5. Med mangfoldigheden af stoffer, der bruges til bærerbeskyttelse, opstod der spørgsmål om brug, genbrug og desinfektion / dekontaminering af disse genstande. Mens det i USA var almindeligt accepteret, at rutinemæssig hjemmemaskinvask af ansigtsbeklædning og andre beklædningsgenstande gjorde vira på disse overflader ikke-smitsomme, eksisterede der kun få data til at validere denne påstand, og der manglede offentliggjorte laboratorieprotokoller til test. Formålet med den forskningsprotokol, der præsenteres her, er at give et eksempel på en laboratorieproces til gennemførelse af hvidvaskningsundersøgelser, der genererer data om viral desinfektion. Mens protokollen blev udviklet til forskning under COVID-19-pandemien, er den beregnet til at være en ramme, der kan tilpasses andre virusdesinfektionsundersøgelser.
Tøjets rolle i sygdomsoverførsel er et vanskeligt begreb at kvantificere. Det Internationale Videnskabelige Forum for Hjemmehygiejne forsøgte denne udfordrende opgave ved at foretage en gennemgang af tøjets rolle i spredningen af smitsomme sygdomme kombineret med en risikovurdering af hjemmehygiejnepraksis6. Inkluderet i dette arbejde var gennemgangen af flere videnskabelige undersøgelser, der undersøgte overlevelsen af forskellige virale stammer på forskellige typer stoffer som uld og bomuld 7,8,9,10,11. Hver undersøgelse fokuserede på en anden type virus, herunder vaccinia, poliovirus, respiratorisk syncytialvirus, herpesvirus og influenzavirus. Overlevelsestiderne for de forskellige vira på stofferne varierede fra 30 minutter til 5 måneder afhængigt af kombinationen af virus og materiale. Flere af undersøgelserne viste også overførsel af viral forurening fra materialet til hænderne. Som en del af publikationen blev effektiv hvidvaskning diskuteret som en vigtig ledelsesteknik til at reducere transmission, men erkendte, at omfanget af hvidvaskningens indvirkning på reduktion af sygdomsbyrden var afhængig af den specifikke virale forurening og vanskelig at kvantificere 7,8,9,10,11.
Hvidvaskningsprocessen ødelægger mikroorganismer ved hjælp af kemiske, fysiske og termiske behandlingsprocesser. For eksempel kan sæber og vaskemidler adskille jord og kan give nogle kemisk medierede antimikrobielle virkninger. Fysisk kan fortynding og agitation hjælpe med at reducere virale belastninger. En undersøgelse, der undersøgte persistensen af human coronavirus HCoV-OC43 på bomuldsprøver ved hjælp af industrielle og husholdningsvaskecyklusser med og uden temperatur og vaskemiddel, fandt ingen påviselig virus ved vask i uopvarmet vand uden vaskemiddel, men at i nærvær af en jordbelastning (kunstigt spyt) krævede husholdningsvaskecyklusser vaskemiddel til prøver for at have ikke-detekterende virusbelastninger12. Varmt vand i sig selv kan også give et effektivt middel til at ødelægge nogle mikroorganismer13,14.
I en nylig publikation, der opsummerer tilstanden af den nuværende vaskepraksis, blev mange faktorer såsom stofsammensætning, opbevaringsforhold, snavsbelastning, vasketemperatur og tid og tørretemperatur identificeret som varierende i global praksis for hvidvaskning15. Mens hvidvaskning er en almindelig rengøringsmetode for en stor procentdel af befolkningen, gør denne store variation i eksisterende praksis udstedelse af detaljerede retningslinjer for, hvordan man gør dette sikkert og effektivt, når en genstand kan være forurenet af en virus, udfordrende og sparsom. Under COVID-19-pandemien udstedte USA's centre for sygdomsbekæmpelse og forebyggelse (CDC) vejledning om, hvordan man vasker genstande til husejere16,17. Meget af denne hvidvaskvejledning var baseret på flere ældre undersøgelser af bakteriel desinfektion18,19 og understøttet af flere benchtop-undersøgelser, der har fundet indhyllede vira inaktiveret i vand med vaskemidler20,21. Vejledningen kan opsummeres som 1) følg producentens anvisninger for vaskemidlet, 2) brug den varmeste passende vandindstilling og 3) tør genstande helt. Begrundelsen for disse anbefalinger var, at vask på den varmeste mulige cyklus med vaskemiddel kombineret med tørring fuldstændigt (med varme, hvis det er muligt) vil dræbe SARS-CoV-2-viruset.
Alene antallet af mulige variationer i hvidvaskningsprocessen nødvendiggør en ensartet protokol, som præsenteret her, for at kunne isolere variabler og teste effektiviteten af viral desinfektion af specifikke processer. Hensigten med denne protokol kombineret med en instruktionsvideo er at demonstrere en laboratoriebaseret proces til hvidvaskning af varmt vand til replikation i andre forskningsundersøgelser. Derudover bør resultaterne af denne effektivitetstest af viral desinfektion opbygge forbrugernes tillid til effektiviteten af hvidvaskning i hjemmet under virusbaserede pandemier.
Protocol
Phi6 blev modtaget fra et samarbejdslaboratorium som en ~1 ml frossen aliquot og blev opbevaret ved -80 °C indtil brug. Det blev oprindeligt brugt til at udbrede flere viruslagre, som efterfølgende blev opbevaret ved -80 °C indtil brug. Phi6 blev valgt som demonstrationsvirus, fordi det almindeligvis anvendes som en modelindhyllet virus, kan formeres til høje titere og kræver et laboratorium med lavt biosikkerhedsniveau for at udføre testen22,23,24.
1. Forbered virusstamopløsning
- Progagate bakteriofag Phi6 i bakteriel vært Pseudomonas sprøjtingae ved hjælp af en modificeret Tryptic Soy Agar mediepræparat og blød agar overlay metode som beskrevet nedenfor.
- Forbered modificeret tryptisk soja Agar ved at veje og blande ingredienserne fra tabel 1 i deioniseret vand.
- Forbered en overnatningskultur af P. syringae ved at tilsætte en 1 ml aliquot P. syringae med en optisk tæthed (OD 600) mellem 0,9 og 1,5 til 100 ml modificeret tryptisk sojabouillon (tabel 1) og inkubere i en rystende inkubator ved ~ 260 o / min ved stuetemperatur (20-26 ° C).
- Forbered bløde agarrør ved at placere modificeret tryptisk soja Agar (~ 6 ml) i reagensglas og dække med en autoklaverbar hætte. Opbevares ved 4 °C indtil brug. Autoklave bløde agarrør ved 121 ° C i 15 minutter for at smelte agar. Opbevares ved 48 °C indtil plettering. Ligevægt ved 48 °C er vigtig, ellers kan virussen inaktiveres i analysen.
- Der tilsættes 1 ml ufortyndet koncentreret virusaliquot til blød agar og 100 μL logfase (OD600 mellem 0,9 og 1,5) P. syringaekultur. Hæld blød agar på overfladen af en størknet 100 mm diameter modificeret tryptic soja agar plade. For at forhindre bobler og/eller spild hvirvles pladerne forsigtigt for jævnt at fordele den bløde agar over den faste agaroverflade og inkuberes natten over ved stuetemperatur.
- Skrab forsigtigt 25 indholdet af de tre plader med en steril cellespreder i et sterilt 50 ml konisk rør indeholdende15 ml SM-buffer. Hvirvelrør ved maksimal indstilling i 1-2 minutter for at bryde agar op og centrifugeres derefter ved 7.000 x g i 15 min.
- Fjern supernatant og filtrer gennem et 0,2 μm sprøjtefilter. 1 ml aliquoter opbevares i cryovials ved -80 °C indtil brug.
2. Udfør visuel vurdering af personlige værnemidler før testen
- Anbring hvert PV-materiale på en ren, glat overflade (f.eks. en laboratoriebænk dækket med en engangspapirforing). Vurder hvert PPE-element i tre eksemplarer.
- Sørg for korrekt belysning under PPE-undersøgelsen. Mål og registrer længden og bredden af de uvaskede genstande på forskellige steder (figur 1).
Figur 1. Målesteder for vurdering af personlige værnemidler før prøvning. Denim-, skrubbe- og ansigtsdækkende steder, hvor længden blev registreret til sporing af væsentlige ændringer fra hvidvaskningsprocessen. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Forbered kuponer
- Lav testkuponer på 2 cm x 4 cm ved at skære PPE, forbered to kuponer pr. ansigtsbeklædning (tre ansigtsbeklædninger blev testet), fem kuponer pr. denimbuks (tre denimbukser blev testet) og tre kuponer pr. skrubbeskjorte (tre skrubber blev testet).
- Forbered et sæt 2 cm x 4 cm proceduremæssige blankkuponer (et sæt til et PPE-element i fuld størrelse) til hver materialetype, der ikke podes, men vil blive vasket. Forbered to kuponer til hver dag med ansigtsdækkende eksperimenter, fem kuponer til hver dag med denimeksperimenter og tre kuponer til hver dag med skrubbeeksperimenter.
- Forbered et sæt 2 cm x 4 cm positive kontrolkuponer, der vil blive podet, men ikke vasket. Forbered to kuponer til hver dag med ansigtsdækkende eksperimenter (tre ansigtsbeklædninger blev testet), fem kuponer til hver dag med denimeksperimenter (tre denimbukser blev testet) og tre kuponer til hver dag med skrubbeeksperimenter (tre skrubber blev testet) og tre kuponer i rustfrit stål.
BEMÆRK: Der blev valgt forskellige antal replikater baseret på varens størrelse. For eksempel er det fysisk vanskeligt at overholde fem kuponer på ansigtsbeklædningen, og to kuponer ville repræsentere et begrænset område af denimbukserne. Placeringerne blev valgt for at maksimere dækningen og i zoner, der kan blive foldet under hvidvaskning og være vanskeligere at rengøre.
4. Udfør podning
- Der fremstilles en 10% oksekødsekstraktopløsning ved at opløse 1 g oksekødsekstrakt i et samlet volumen på 10 ml 1x fosfatbufferet saltvand. Filter steriliser hele volumenet ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter.
- Optøning af virusstamopløsningen fremstillet i punkt 1 ved stuetemperatur. På brugsdagen tilsættes 100 μL af den optøede Phi6-bestand til 900 μL af 10% oksekødsekstraktopløsningen.
- Pod testkuponer og kuponer til positiv kontrol med ~107 PFU/prøve ved at pipettere en 10 μL dråbe opløsning på PV-emnet og sprede dråben ved hjælp af pipettespidsen. Afhængigt af PPE-materialet adskilles dråberne og samles forskelligt.
- Lad podede kuponer tørre i et biosikkerhedsskab. Bestemt tørretid (er) via observation for dine specifikke materialer. For de resultater, der præsenteres her, blev følgende tider brugt: skrubber = 30 min tørretid; ansigtsbeklædning = 60 minutters tørretid; denim = 30 min tørretid; rustfrit stål = 120 min tørretid.
- Fastgør podede kuponer til PPE-genstande i fuld størrelse i henhold til figur 2 ved hjælp af sikkerhedsnåle og aseptiske teknikker.
Figur 2. Test kuponplaceringer på denim, skrubber og ansigtsbeklædning. Bogstaverne A-D svarer til de unikke kuponidentifikatorer for alle hvidvaskningseksperimenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. Udfør hvidvaskning
- Forbered vaskemiddel til vask som følger.
- Steriliser ledningsvand, der skal bruges i vaskemaskinen, og saml 10 ml autoklaveret vand til en sterilitetskontrol. Til denne protokol, autoklave 7 L ledningsvand på en 60 minutters væskecyklus.
- Forbered vaskeopløsning i henhold til producentens fortyndingsvejledning. Til denne protokol opløses 1,54 ml vaskemiddel i 3,5 liter sterilt ledningsvand. Vaskeopløsningen opvarmes til 50 °C med en kogeplade og rørestang. Mål og registrer pH og temperatur i vaskeopløsningen. Saml 10 ml opløsning til sterilitetskontrol.
- Hæld vaskeopløsning i en steriliseret skive (3,25 L). Forsteriliser skiver ved hjælp af en 250 ppm-4 timers cyklus af dampholdigt hydrogenperoxid mellem testene.
- Anbring PPE-genstande i en steriliseret skive. Tilføj en denimbuks og en skrubbeskjorte pr. Vaskemaskine. Tilsæt en podet ansigtsbeklædning og fire ikke-forurenede fyldmasker pr. Skive; fyldmasker havde ikke kuponer vedhæftet.
- Vask PPE-emne i 18 minutter (to 9 minutters vaskecyklusser med normal omrøring). Tøm skiven og skyl tredobbelt med ledningsvand ved stuetemperatur (5 L hver gang) for at fjerne skum. Tilsæt stuetemperatur steriliseret ledningsvand i skiven (3,25 L) og udfør en 9 minutters lang skyllecyklus.
- Flyt PPE-elementerne ind i skivens spinside, og drej i 5 minutter. Flyt PV-elementerne til tørretumbleren, og tør i 80 minutter ved høj varme (93 °C).
- Flyt personlige værnemidler fra tørretumbler til sterilt arbejdsområde, og fjern aseptisk kuponerne fra hvert emne, og læg dem i koniske rør. Forfyld rørene med 10 ml 10% Dey-Engley bouillonekstraktionsbuffer og dæk med aluminiumsfolie.
6. Uddrag og opregne virale belastninger på kuponer
- Uddrag kuponer i 10 ml 10% Dey-Engley neutraliserende bouillon ved hvirvel i 2 minutter ved maksimal indstilling af dit udstyr.
- Pladeekstrakter ved hjælp af en konventionel soft top agar overlay metode26.
- Der fremstilles rør af blødmodificeret tryptisk sojaagar og en P. syringae-kultur som beskrevet i punkt 1. På testdagen autoklaver de bløde agarrør ved 121 ° C i 15 minutter for at smelte agaren. Hold den bløde agar ved 48 °C, indtil den er pletteret. Ligevægt ved 48 °C er vigtig, ellers kan virussen termisk inaktiveres i analysen.
- Der fremstilles en tidobling af fortyndingsserier i 1x fosfatbufferet saltvand for hver testprøve, der anvendes i vaskeundersøgelsen. Der anvendes både serielt fortyndede (100 μL) og ufortyndede (1 ml og 100 μL) alikvoter til plettering.
- Der tilsættes prøvealikvoter til det bløde agarrør indeholdende 6 ml blød agar og 100 μL af logfase P. syringae-kulturen (OD600 mellem 0,9-1,5). Hæld den bløde agar på overfladen af en størknet modificeret tryptisk sojaagarplade. Fordel den bløde agar jævnt over den faste agaroverflade ved at hvirvle pladen.
- Inkuber plader natten over ved stuetemperatur og opregnes manuelt den følgende dag ved at tælle de plakdannende enheder på hver plade.
7. Udfør visuel vurdering efter prøvningen af PV'er
- Dokumentere følgende i de forskellige PV-produkter, der anvendes til test: tegn på falmning, misfarvning og/eller beskadigelse (f.eks. rivning, strækning); Lugte; små huller, nedskæringer eller tårer (brug en lille lommelygte til at lede efter skader); adskillelse af lag, manglende tråde, områder, hvor bindingen er beskadiget; beskadigelse af sømme eller lynlåse; måle og registrere strækningen af elastik.
Representative Results
Flere forskellige typer kvalitetskontroldata og resultater genereres efter afslutningen af denne protokol. Plakdannende enheds (PFU) pladetællinger sammen med det ekstraherede prøvevolumen muliggør beregning af antallet af PFU pr. Testkupon. Tabel 2 er et eksempel på et dataregistreringsark til seriel fortynding/plettering. Ved hjælp af fortyndingsfaktoren, prøvevolumen og pladeantal fra tabel 1 viser tabel 3 repræsentative virale gendannelsesresultater for en ansigtsbeklædningstest. Bemærk, at disse data inkluderer testkuponer og kvalitetskontrolprøver til inokulum, kuponer og vaskevand (med og uden vaskemiddel). De proceduremæssige prøveemner til blind- og sterilitetskvalitetskontrol er vigtige for at bekræfte, at vandopløsningerne og PPE-materialerne ikke var forurenet med Phi6. Indikation af kontaminering ville medføre fejlagtige beregninger af desinfektionseffektiviteten og kræve, at testen gentages. De positive kontrolprøver har til formål at verificere, at viruslageropløsningen ikke miljømæssigt/naturligt nedbrydes under forsøgene, hvorved virkningen af vaskeprocessen oppustes i viral belastningsreduktion. Disse prøver skal forblive inden for 1 log PFU af podekontrollene for at acceptere testkuponresultaterne. En stor reduktion i PFU af de positive kontrolprøver indikerer også, at alle trin i kuponpodningen skal gennemgås omhyggeligt for at sikre, at analytikeren udfører protokollen med korrekte pipetterings- og spredningsteknikker.
Denne protokol indeholder også oplysninger til vurdering af ændringer i beklædningsgenstandes materielle egenskaber som følge af oplysninger om hvidvaskning og kvalitetskontrol vedrørende protokollen (tabel 4 og figur 3). Disse data er nyttige af flere grunde. Registrering af tendenser i målinger af PV-produkter gør det muligt at identificere en vare med en fabrikationsfejl. Denne identifikation kan hjælpe med at forklare afvigende mikrobielle data og kontekstualisere variationen i produktadfærd. Notater om lugt eller skader kan også give en indikation af, om vaskemaskinen eller tørretumbleren fungerede suboptimalt under et forsøg, og om testene skal gentages, eller udstyret skal serviceres. Hvis testplanen kræver flere processer til hvidvaskning af det samme PV-produkt, kan dataene desuden være med til at bestemme, hvor længe PV-produkterne bevarer deres integritet til brug ved hvidvaskning. Registrering af pH-værdien i vaskemiddelopløsningen giver en advarsel om ændringer i vandkilden eller vaskemiddelproduktet. Vedligeholdelse af en tidslog over vasketrinnene sikrer, at timeren på vaskemaskinen og tørretumbleren ikke forårsager variationer i forsøgsprotokollen.
I sidste ende bruges disse data til at rapportere desinfektionseffektiviteten af varmtvandsvaskningsproceduren mod surrogat for virale patogener. Effektiviteten af desinfektion af hvidvaskning (Eqn. 1) beregnes ved subtraktion af de gennemsnitlige log 10-virusgendannelser fra PPE-testkupon fra de gennemsnitlige log10-virusgendannelser fra PPE-positive kontrolresultater (figur 4). For testkuponresultater, der ikke registreres, bruges log10 på detektionsgrænsen i beregningen af desinfektionseffektiviteten. Det er almindeligt at rapportere desinfektionseffektivitet som logværdier til sammenligning med andre virale desinfektionsteknikker og standarder.
Desinfektionseffektivitet = Gennemsnitlig log 10 (positive kontroller) - Gennemsnitlig log10 (testkuponer) (Eqn. 1)
Figur 3. Ændring i PPE-dimensioner efter placering. Δ = Måling før test - måling efter test. En negativ Δ-værdi svarer til strækningen af varen på det angivne sted, og en positiv værdi svarer til krympning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. Effektivitet af hvidvaskning af varmt vand ved desinficering af ansigtsbeklædning, denim og skrubbe PPE-materialer fra Phi6. Stjerner angiver, at der er sket fuld desinfektion (ikke-detekterer på testkuponerne). Fejllinjer angiver standardafvigelse (n = 3). Placeringsbogstaver svarer til placeringen afbildet i figur 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1. Løsning opskrifter. Ingredienser og mængder, der er nødvendige for at forberede tryptisk soja agar, tryptisk soja bouillon, og oksekød ekstrakt løsninger. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 2. Et eksempel på en del af et resultatark for seriel fortynding/plettering. Skabelon til rapportering af rå mikrobielle data. Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 3. Ansigtsdækkende mikrobielle resultater. Eksempel på oversigtsark for behandlede plakdannende enhedsdata (PFU). Klik her for at downloade denne tabel.
Tabel 4. Skrubber kvalitetskontrol og materialevurderingslog. Skabelon til rapportering af kalibrering af pH-sonde, pH i vaskemiddelopløsning, målinger før og efter vask og cyklustider for vask. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Denne protokol blev udviklet til at udføre systematisk laboratorietest for at vurdere effektiviteten af viral desinfektion fra ppe/beklædningsgenstande i fuld størrelse. Procedurerne skitserer de kritiske trin til forberedelse af virussen, podning af testmaterialet, vurdering af ændringer i emnerne på grund af hvidvaskningsprocessen og kvantificering af reduktionen i viral belastning som følge af hvidvaskningsprocessen (maskinvask og tørring). Derudover skitserer protokollen de nødvendige kvalitetskontrolprøver for at sikre, at eksperimenterne ikke er forudindtaget af forurening og målinger / observationer, der skal registreres for at spore PPE-produkternes materielle integritet efter flere hvidvaskningscyklusser. Resultaterne ved hjælp af Phi6 indikerer, at varmtvandsvaskningsprocessen, der blev brugt i denne protokol, opnåede en større end 3-log reduktion i viral belastning for alle prøver (ansigtsbeklædning, skrubber og denimbukser). Den virale belastningsreduktion var også ensartet på tværs af forskellige steder på PPE / beklædningsgenstande. For at demonstrere 3-log reduktion kræver denne protokol brug af en høj viral belastning og et stabiliseringsmiddel (oksekødsekstrakt), der muligvis ikke er repræsentativt for jordbelastningen i alle situationer.
Minivaskere og kompakte tørretumblere blev valgt for at optimere antallet af replikateksperimenter, der kunne udføres i en pladsbegrænset indstilling, og for at holde steriliseringen af udstyr og vandmængde, der blev brugt under forsøgene, håndterbar for laboratoriepersonale. Som et resultat af brugen af miniskiven var skylletrinnene manuelle sammenlignet med de fleste hjemmevaskeapplikationer, der er fuldt automatiserede. Det er også vigtigt at huske, at maskinvask dominerer i udviklede lande, men håndvask praktiseres stadig over hele verden15. Derudover har nogle muligvis ikke adgang til varmt vand til vask, og andre lufttørrer tøj manuelt i stedet for maskintørring. Disse forskelle i hvidvaskningspraksis blev ikke behandlet i denne nuværende protokol, men kunne let undersøges med mindre ændringer såsom at erstatte vaske- og tørringstrinnene med at bruge en spand og en tæt linje
Der har været minimal fokus på rengøring/desinficering af viralt forurenede mundbind og gadebeklædning i den videnskabelige litteratur i fuld skala. Mere almindeligt vurderer undersøgelser filtreringsevnen for ansigtsbeklædning efter gentagen vask og tørring, men evaluerer ikke viral desinfektionseffekt27,28. For eksempel evaluerede Clapp et al. monteret filtreringseffektivitet af kludmasker og modificerede proceduremasker og fandt stor variation i ydeevne med enkle ændringer, der gav øget pasform og filtreringseffektivitet29. En anden undersøgelse så på filtreringseffektiviteten af fire stofmasker af forskellige materialer30, igen med fokus på kildekontrol eller personlig beskyttelse. Dette kan skyldes manglende specialisering for både den mikrobielle del og mekaniske test i samme laboratorium. Protokollen, der præsenteres her, giver en evaluering af desinfektionseffektivitet såvel som materialeforringelse.
Der har været en række dekontaminerings-/desinfektionsmetoder til engangs åndedrætsværn (primært N95'er), der for nylig blev offentliggjort i den videnskabelige litteratur31,32,33. Det primære fokus på FFR'er (f.eks. N95'er) skyldes det kritiske åndedrætsværn, de giver sundhedspersonale og andre frontlinjebeskæftigelser. Primære teknologier til respiratordekontaminering involverede fordampet hydrogenperoxid (VHP), ultraviolet bakteriedræbende stråling (UVGI) og fugtig varme (damp) til virusinaktivering. Viscusi et al. evaluerede fem dekontamineringsmetoder for FFR og UVGI; Ethylenoxid og VHP viste sig at være de mest lovende dekontamineringsmetoder31. Fischer et al. evaluerede fire forskellige dekontamineringsmetoder - UV-lys, tør varme, 70% ethanol og VHP - for deres evne til at reducere forurening med SARS-CoV-2 og deres virkning på N95 åndedrætsværnsfunktion32. Der er mange yderligere undersøgelser af effektive dekontamineringsteknologier for FFR'er, som blev opsummeret og offentliggjort i 202033. Disse specialiserede metoder er dog ikke tilgængelige eller designet til at blive brugt sikkert af den gennemsnitlige boligejer eller lille virksomhedsejer.
Denne protokol blev udviklet ved hjælp af Phi6, en indhyllet bakteriofag, der ligner SARS-CoV-2, har spikeproteiner og er af samme størrelse (80-100 nm)34 til al test. Da Phi6 ikke er et kendt patogen, kan det manipuleres i et generelt mikrobiologisk biosikkerhedsniveau 1 (BSL-1) laboratorium. Effekt mod Phi6 kan indikere effekten af andre indhyllede vira, men empirisk verifikation for hver virus af interesse er nødvendig35. Ved at bruge et lignende, ikke-patogent viralt middel er det håbet, at denne protokol kan gentages andre steder og bruges til at studere fremtidige virale epidemier / pandemier. Fremtidig forskning kan omfatte brug af desinfektionsmidler (f.eks. blegemiddel) ud over vaskemidler og en standardiseret protokol til håndvask og linjetørring.
Disclosures
Der er ingen kendte interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
U.S. Environmental Protection Agency (EPA) ledede gennem sit kontor for forskning og udvikling den forskning, der er beskrevet heri under EP-C-15-008 med Jacobs Technology Inc. Den er blevet gennemgået af agenturet, men afspejler ikke nødvendigvis agenturets synspunkter. Der bør ikke udledes nogen officiel godkendelse. EPA støtter ikke køb eller salg af kommercielle produkter eller tjenester. Forfatterne vil gerne takke EPA-entreprenørerne Denise Aslett for tilsynet med EPA RTP-mikrobiologien, Brian Ford, Rachael Baartmans og Lesley Mendez Sandoval for deres arbejde med dette projekt i EPA RTP-mikrobiologilaboratoriet, Ramona Sherman for at levere EPA-kvalitetssikringsgennemgangen og Worth Calfee og Shannon Serre for at levere EPA-tekniske anmeldelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
| Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
| Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
| Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
| SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
| Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
| Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
| Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
| Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
| Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
| Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
| Dextrose | Fisher | BP350 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
| Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
| Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
| Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
| Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
| Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
| pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
| pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
| pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
| Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
| Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
| Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
| Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
| Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
| Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
| Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
| Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
| Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
| Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
| Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
| Washer | Kuppet | KP1040600A | |
| Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
| Yeast extract | Gibco | 212750 |
References
- Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
- Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263 (2020).
- Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
- Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
- Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
- Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
- Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
- Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
- Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
- Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
- Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
- Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
- Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
- Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958 (2020).
- Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220 (2021).
- COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
- COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
- Walter, W. G., Schillinger, J. E.
- Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
- Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111 (2016).
- Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
- Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
- Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
- Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
- Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
- Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
- Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117 (2021).
- Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
- Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
- Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
- Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
- Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253 (2020).
- Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117 (2020).
- Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).
