Summary
Als Reaktion auf die Pandemie des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) wurde ein Laborprotokoll entwickelt, um die virale Desinfektionswirksamkeit der Heißwasserwäsche von Stoffgesichtsbedeckungen, Baumwollpeelings und Jeanshosen zu testen. Das Phi6-Virus (Bakteriophagen) wurde als Organismus verwendet, um die Desinfektionswirksamkeit zu testen.
Abstract
Dieses Protokoll ist ein Beispiel für einen Laborprozess zur Durchführung von Geldwäschestudien, die Daten zur Virusdesinfektion generieren. Während das Protokoll für die Forschung während der Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) entwickelt wurde, soll es ein Rahmen sein, der an andere Virusdesinfektionsstudien angepasst werden kann. Es zeigt die Schritte zur Vorbereitung des Testvirus, zur Impfung des Testmaterials, zur Bewertung von visuellen und Integritätsänderungen an den gewaschenen Artikeln aufgrund des Waschprozesses und zur Quantifizierung der Verringerung der Viruslast. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die erforderlichen Qualitätskontrollproben, um sicherzustellen, dass die Experimente nicht durch Kontamination und Messungen / Beobachtungen beeinträchtigt werden, die aufgezeichnet werden sollten, um die Materialintegrität der persönlichen Schutzausrüstung (PSA) nach mehreren Waschzyklen zu verfolgen. Die repräsentativen Ergebnisse, die mit dem Protokoll präsentiert werden, verwenden den Phi6-Bakteriophagen, der auf Baumwollpeeling, Denim und Gesichtsbedeckungsmaterialien aus Baumwolle geimpft wurde, und zeigen, dass der Heißwasserwasch- und Trocknungsprozess eine Reduzierung der Viruslast für alle Proben um 3 log (99,9%) erreicht hat (eine 3-log-Reduktion ist die Leistungsmetrik für Desinfektionsmittel in der Product Performance Test Guideline 810.2200 der US-Umweltschutzbehörde). Die Verringerung der Viruslast war an verschiedenen Stellen auf den PSA-Artikeln einheitlich. Die Ergebnisse dieses Testprotokolls zur Wirksamkeit der Virusdesinfektion sollten der wissenschaftlichen Gemeinschaft helfen, die Wirksamkeit der Heimwäsche für andere Arten von Testviren und Waschverfahren zu untersuchen.
Introduction
Die Coronavirus-Pandemie 2019 (COVID-19) verursachte eine beispiellose globale Unterbrechung der Lieferkette und führte zu einem kritischen Mangel an vielen Artikeln, einschließlich wichtiger persönlicher Schutzausrüstung (PSA)1,2,3. Diejenigen in Hochrisikoberufen mussten sich mit empfohlenen Krisenkapazitätsstrategien anpassen, und die Öffentlichkeit übernahm die Verwendung von nicht spezialisierten Gegenständen wie Gesichtsbedeckungen aus Stoffmaterial in erster Linie zur Quellenkontrolle, aber auch, um den Trägern einen gewissen Atemschutz zu bieten. In den Vereinigten Staaten war der spezielle Atemschutz (d. h. Filtern von Atemschutzmasken (FFRs) wie N95s) für einige dieser Hochrisikoberufe (z. B. Gesundheitswesen) während Versorgungsengpässen reserviert4. Als wenig über die Übertragung des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-Cov-2) bekannt war, wurden zu Beginn der Pandemie auch eine Vielzahl anderer Arten von Bekleidungsmaterialien als Barriereschutz in Betracht gezogen5. Mit der Vielfalt der Stoffe, die für den Trägerschutz verwendet werden, ergaben sich Fragen zur Verwendung, Wiederverwendung und Desinfektion / Dekontamination dieser Artikel. Während in den Vereinigten Staaten allgemein akzeptiert wurde, dass routinemäßiges Waschen von Gesichtsbedeckungen und anderen Kleidungsstücken Viren auf diesen Oberflächen nicht infektiös machte, gab es nur wenige Daten, um diese Behauptung zu validieren, und es fehlte an veröffentlichten Laborprotokollen für Tests. Das hier vorgestellte Forschungsprotokoll soll ein Beispiel für einen Laborprozess zur Durchführung von Geldwäschestudien liefern, die Daten zur Virusdesinfektion generieren. Obwohl das Protokoll für die Forschung während der COVID-19-Pandemie entwickelt wurde, soll es ein Rahmen sein, der an andere Virusdesinfektionsstudien angepasst werden kann.
Die Rolle von Kleidung bei der Übertragung von Krankheiten ist ein schwer zu quantifizierendes Konzept. Das International Scientific Forum on Home Hygiene versuchte diese anspruchsvolle Aufgabe, indem es eine Überprüfung der Rolle von Kleidung bei der Ausbreitung von Infektionskrankheiten in Verbindung mit einer Risikobewertung der häuslichen Hygienepraktiken durchführte6. In dieser Arbeit war die Überprüfung mehrerer wissenschaftlicher Studien enthalten, die das Überleben verschiedener Virusstämme auf verschiedenen Arten von Stoffen wie Wolle und Baumwolleuntersuchten 7,8,9,10,11. Jede Studie konzentrierte sich auf eine andere Art von Virus, einschließlich Vaccinia, Poliovirus, respiratorisches Synzytialvirus, Herpesvirus und Influenzavirus. Die Überlebenszeiten der verschiedenen Viren auf den Geweben reichten von 30 min bis 5 Monaten, abhängig von der Virus-Material-Kombination. Mehrere der Studien zeigten auch die Übertragung von Viruskontamination aus dem Material auf die Hände. Im Rahmen der Veröffentlichung wurde effektives Waschen als wichtige Managementtechnik zur Verringerung der Übertragung diskutiert, erkannte jedoch an, dass das Ausmaß der Auswirkungen der Geldwäsche auf die Verringerung der Krankheitslast von der spezifischen Viruskontaminante abhängt und schwer zu quantifizierenist 7,8,9,10,11.
Der Waschprozess zerstört Mikroorganismen durch chemische, physikalische und thermische Behandlungsverfahren. Zum Beispiel können Seifen und Reinigungsmittel Böden trennen und eine chemisch vermittelte antimikrobielle Wirkung entfalten. Physikalisch können Verdünnung und Unruhe zur Verringerung der Viruslast beitragen. Eine Studie, die die Persistenz des humanen Coronavirus HCoV-OC43 auf Baumwollmustern unter Verwendung von industriellen und häuslichen Waschzyklen mit und ohne Temperatur und Waschmittel untersuchte, fand kein nachweisbares Virus beim Waschen in unerhitztem Wasser ohne Waschmittel, aber dass bei Vorhandensein einer Bodenbelastung (künstlicher Speichel) häusliche Waschzyklen Reinigungsmittel für Proben benötigten, um nicht detektierte Virusladungen zu haben12. Heißes Wasser selbst kann auch ein wirksames Mittel zur Zerstörung einiger Mikroorganismensein 13,14.
In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung, die den Stand der aktuellen Wäschereipraktiken zusammenfasst, wurden viele Faktoren wie Stoffzusammensetzung, Lagerbedingungen, Schmutzbelastung, Waschtemperatur und -zeit sowie Trocknungstemperatur als unterschiedlich in globalen Waschpraktiken identifiziert15. Während Waschen eine gängige Reinigungsmethode für einen großen Prozentsatz der Bevölkerung ist, macht diese große Variation in den bestehenden Praktiken die Herausgabe detaillierter Anleitungen, wie dies sicher und effektiv zu tun ist, wenn ein Artikel mit einem Virus kontaminiert sein kann, schwierig und spärlich. Während der COVID-19-Pandemie gaben die United States Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Leitlinien zum Waschen von Gegenständen für Hausbesitzer heraus16,17. Ein Großteil dieser Waschleitlinien basierte auf mehreren älteren Studien zur bakteriellen Desinfektion18,19 und wurde durch mehrere Tischstudien unterstützt, in denen behüllte Viren gefunden wurden, die in Wasser mit Detergenzien20,21 inaktiviert wurden. Die Anleitung kann wie folgt zusammengefasst werden: 1) Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das Reinigungsmittel, 2) verwenden Sie die wärmste geeignete Wassereinstellung und 3) trocknen Sie die Gegenstände vollständig. Die Begründung dieser Empfehlungen war, dass das Waschen im größtmöglichen Zyklus mit Waschmittel in Kombination mit vollständiger Trocknung (wenn möglich mit Hitze) das SARS-CoV-2-Virus abtötet.
Die schiere Anzahl möglicher Variationen im Waschprozess erfordert ein einheitliches Protokoll, wie es hier vorgestellt wird, um Variablen isolieren und die Wirksamkeit der viralen Desinfektion bestimmter Prozesse testen zu können. Die Absicht dieses Protokolls in Verbindung mit einem Lehrvideo besteht darin, einen laborbasierten Heißwasserwäscheprozess für die Replikation in anderen Forschungsstudien zu demonstrieren. Darüber hinaus sollten die Ergebnisse dieses Wirksamkeitstests zur Wirksamkeit der Virusdesinfektion das Vertrauen der Verbraucher in die Wirksamkeit der Heimwäsche während viraler Pandemien stärken.
Protocol
Phi6 wurde von einem Mitarbeiterlabor als ~1 ml gefrorenes Aliquot erhalten und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Es wurde zunächst verwendet, um weitere Virusbestände zu verbreiten, die anschließend bei -80 °C bis zum Einsatz gelagert wurden. Phi6 wurde als Demonstrationsvirus ausgewählt, weil es üblicherweise als modellbehülltes Virus verwendet wird, an hohe Titer vermehrt werden kann und ein Labor mit niedrigem Biosicherheitsniveau erfordert, um die Testsdurchzuführen 22,23,24.
1. Virenstammlösung vorbereiten
- Vermehrung des Bakteriophagen Phi6 im bakteriellen Wirt Pseudomonas syringae unter Verwendung einer modifizierten Tryptose-Soja-Agar-Medienzubereitung und einer weichen Agar-Overlay-Methode, wie unten beschrieben.
- Bereiten Sie modifizierten Tryptose-Soja-Agar zu, indem Sie die Zutaten aus Tabelle 1 in entionisiertem Wasser abwiegen und mischen.
- Bereiten Sie eine Übernachtkultur von P. syringae vor, indem Sie ein 1 ml Aliquot von P. syringae mit einer optischen Dichte (OD 600) zwischen 0,9 und 1,5 bis100 ml modifizierter Tryptose-Sojabrühe (Tabelle 1) hinzufügen und in einem Schüttelinkubator bei ~ 260 U/min bei Raumtemperatur (20-26 °C) inkubieren.
- Bereiten Sie weiche Agarröhrchen vor, indem Sie modifizierten Tryptose-Soja-Agar (~ 6 ml) in Reagenzgläser geben und mit einer autoklavierbaren Kappe abdecken. Bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern. Weiche Agarrohre bei 121 °C für 15 min zum Schmelzen von Agar autoklavieren. Bei 48 °C bis zur Beschichtung halten. Ein Gleichgewicht bei 48 °C ist wichtig, da sonst das Virus im Assay inaktiviert werden kann.
- 1 ml unverdünntes konzentriertes Virusaliquot zu weichem Agar und 100 μL einer Log-Phase (OD600 zwischen 0,9 bis 1,5) P. syringae-Kultur zugeben. Gießen Sie weichen Agar auf die Oberfläche einer erstarrten modifizierten Tryptischer Soja-Agarplatte mit 100 mm Durchmesser. Um Blasen und/oder Verschütten zu vermeiden, schwenken Sie die Platten vorsichtig, um den weichen Agar gleichmäßig über die feste Agaroberfläche zu verteilen, und brüten Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
- 25 den Inhalt der drei Platten vorsichtig mit einem sterilen Zellstreuer in ein steriles 50 ml konisches Röhrchen mit 15 mL SM-Puffer abkratzen. Wirbelröhrchen bei maximaler Einstellung für 1-2 min, um Agar aufzubrechen und dann bei 7.000 x g für 15 min zu zentrifugieren.
- Überstand entfernen und durch einen 0,2 μm Spritzenfilter filtern. 1 ml Aliquots in Kryovialen bei -80 °C bis zur Verwendung lagern.
2. Führen Sie vor dem Test eine visuelle Bewertung des PSA-Artikels durch
- Legen Sie jedes PSA-Element auf eine saubere, glatte Oberfläche (z. B. einen Labortisch, der mit einer Einwegpapierfolie bedeckt ist). Bewerten Sie jeden PSA-Artikel in dreifacher Ausfertigung.
- Sorgen Sie für eine angemessene Beleuchtung während der PSA-Prüfung. Messen und notieren Sie die Länge und Breite der ungewaschenen Gegenstände an verschiedenen Stellen (Abbildung 1).
Abbildung 1. Messorte für PSA-Pre-Test-Assessment. Denim-, Peeling- und gesichtsbedeckende Stellen, an denen die Länge aufgezeichnet wurde, um Materialänderungen aus dem Waschprozess zu verfolgen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Gutscheine vorbereiten
- Machen Sie 2 cm x 4 cm Testcoupons, indem Sie PSA schneiden, bereiten Sie zwei Coupons pro Gesichtsbedeckung vor (drei Gesichtsbedeckungen wurden getestet), fünf Coupons pro Jeanshose (drei Jeanshosen wurden getestet) und drei Coupons pro Peeling-Shirt (drei Peelings wurden getestet).
- Bereiten Sie für jeden Materialtyp, der nicht geimpft, sondern gewaschen wird, einen Satz von 2 cm x 4 cm großen Blanko-Coupons (ein Set für einen PSA-Artikel in voller Größe) vor. Bereiten Sie zwei Gutscheine für jeden Tag der gesichtsbedeckenden Experimente, fünf Gutscheine für jeden Tag der Denim-Experimente und drei Gutscheine für jeden Tag der Peeling-Experimente vor.
- Bereiten Sie einen Satz von 2 cm x 4 cm großen Positivkontrollcoupons vor, die geimpft, aber nicht gewaschen werden. Bereiten Sie zwei Gutscheine für jeden Tag der Gesichtsbedeckungsexperimente vor (drei Gesichtsbedeckungen wurden getestet), fünf Gutscheine für jeden Tag der Denim-Experimente (drei Jeanshosen wurden getestet) und drei Gutscheine für jeden Tag der Peeling-Experimente (drei Peelings wurden getestet) und drei Edelstahlgutscheine.
HINWEIS: Je nach Größe des Elements wurde eine unterschiedliche Anzahl von Replikaten ausgewählt. Zum Beispiel ist es körperlich schwierig, fünf Coupons auf die Gesichtsbedeckung zu kleben, und zwei Coupons würden einen begrenzten Bereich der Jeanshose darstellen. Die Standorte wurden ausgewählt, um die Abdeckung zu maximieren und in Zonen, die während der Wäsche zusammengeklappt werden und schwieriger zu reinigen sein könnten.
4. Impfung durchführen
- Bereiten Sie eine 10% ige Rindfleischextraktlösung vor, indem Sie 1 g Rindfleischextrakt in einem Gesamtvolumen von 10 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung auflösen. Filter sterilisieren das gesamte Volumen mit einem 0,2 μm Spritzenfilter.
- Die in Abschnitt 1 hergestellte Virusstammlösung wird bei Raumtemperatur aufgetaut. Am Tag der Anwendung 100 μL der aufgetauten Phi6-Brühe zu 900 μL der 10%igen Rindfleischextraktlösung geben.
- Beimpfen Sie Testcoupons und Positivkontrollcoupons mit ~107 PFU/Probe, indem Sie einen 10 μL Lösungstropfen auf den PSA-Artikel pipettieren und den Tröpfchen mit der Spitze der Pipette verteilen. Je nach PSA-Material trennen sich die Tröpfchen unterschiedlich und aggregieren sich wieder.
- Lassen Sie geimpfte Coupons in einer Biosicherheitswerkbank trocknen. Bestimmung der Trockenzeit(en) durch Beobachtung für Ihre spezifischen Materialien. Für die hier vorgestellten Ergebnisse wurden folgende Zeiten verwendet: Peelings = 30 min Trockenzeit; Gesichtsbedeckung = 60 min Trockenzeit; Denim = 30 min Trocknungszeit; Edelstahl = 120 min Trockenzeit.
- Befestigen Sie geimpfte Coupons an PSA-Artikeln in voller Größe gemäß Abbildung 2 mit Sicherheitsnadeln und aseptischen Techniken.
Abbildung 2. Testen Sie Gutscheinstandorte auf Denim, Peelings und Gesichtsbedeckungen. Die Buchstaben A-D entsprechen den eindeutigen Coupon-Identifikatoren für alle Geldwäscheexperimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
5. Geldwäsche durchführen
- Waschmittel wie folgt vorbereiten.
- Sterilisieren Sie Leitungswasser, das in der Waschmaschine verwendet wird, und sammeln Sie 10 ml autoklaviertes Wasser für eine Sterilitätsprüfung. Für dieses Protokoll Autoklavieren Sie 7 L Leitungswasser in einem 60-minütigen Flüssigkeitszyklus.
- Bereiten Sie die Waschlösung gemäß den Verdünnungsanweisungen des Herstellers vor. Lösen Sie für dieses Protokoll 1,54 ml Reinigungsmittel in 3,5 l sterilem Leitungswasser auf. Die Waschlösung mit einer Heizplatte auf 50 °C erwärmen und umrühren. Messen und notieren Sie den pH-Wert und die Temperatur der Waschlösung. Sammeln Sie 10 ml Lösung zur Sterilitätskontrolle.
- Gießen Sie die Waschlösung in eine sterilisierte Waschmaschine (3,25 l). Vorsterilisieren Sie Waschmaschinen mit einem 250 ppm-4 h Zyklus dampfförmigem Wasserstoffperoxid zwischen den Tests.
- Legen Sie PSA-Artikel in eine sterilisierte Waschmaschine. Fügen Sie eine Jeanshose und ein Peeling-Shirt pro Waschmaschine hinzu. Fügen Sie eine geimpfte Gesichtsbedeckung und vier nicht kontaminierte Füllmasken pro Waschmaschine hinzu; Füllmasken hatten keine Coupons beigefügt.
- Waschen Sie PSA-Artikel für 18 min (zwei 9-minütige Waschgänge mit normalem Rühren). Lassen Sie die Waschmaschine ab und spülen Sie sie dreifach mit Leitungswasser bei Raumtemperatur (jeweils 5 l), um Schaum zu entfernen. Geben Sie sterilisiertes Leitungswasser bei Raumtemperatur in die Waschmaschine (3,25 l) und führen Sie einen 9-minütigen Spülzyklus durch.
- Bewegen Sie das/die PSA-Element(e) in die Schleuderseite der Waschmaschine und drehen Sie es 5 Minuten lang. Die PSA-Artikel in den Trockner geben und 80 min bei hoher Hitzestufe (93 °C) trocknen.
- Bewegen Sie die PSA vom Trockner in einen sterilen Arbeitsbereich und entfernen Sie die Coupons aseptisch von jedem Artikel und legen Sie sie in konische Röhrchen. Füllen Sie die Röhrchen mit 10 ml 10% Dey-Engley-Brüheextraktionspuffer vor und decken Sie sie mit Aluminiumfolie ab.
6. Virenlasten auf Coupons extrahieren und aufzählen
- Extrahieren Sie Coupons in 10 ml 10% Dey-Engley neutralisierender Brühe, indem Sie 2 Minuten lang bei der maximalen Einstellung Ihrer Ausrüstung wirbeln.
- Plattenextrakte unter Verwendung eines herkömmlichen Softtop-Agar-Overlay-Verfahrens26.
- Bereiten Sie Röhrchen aus weich modifiziertem Tryptose-Soja-Agar und einer P. syringae-Kultur wie in Abschnitt 1 beschrieben vor. Am Testtag die weichen Agarrohre bei 121 °C für 15 min autoklavieren, um den Agar zu schmelzen. Halten Sie den weichen Agar bis zum Auffüllen bei 48 °C. Die Äquilibrierung bei 48 °C ist wichtig, da sonst das Virus im Assay thermisch inaktiviert werden kann.
- Für jede in der Waschuntersuchung verwendete Testprobe wird eine zehnfache Verdünnungsreihe in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung hergestellt. Verwenden Sie sowohl seriell verdünnte (100 μL) als auch unverdünnte (1 ml und 100 μL) Aliquots für die Beschichtung.
- Das weiche Agarröhrchen mit 6 ml weichem Agar und 100 μl der log Phase P. syringae-Kultur (OD600 zwischen 0,9-1,5) wird mit Aliquots der Testprobe versehen. Gießen Sie den weichen Agar auf die Oberfläche einer erstarrten modifizierten Tryptose-Soja-Agarplatte. Verteilen Sie den weichen Agar gleichmäßig über die feste Agaroberfläche, indem Sie die Platte schwenken.
- Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur und zählen Sie sie am nächsten Tag manuell, indem Sie die plaquebildenden Einheiten auf jeder Platte zählen.
7. Durchführung einer visuellen Beurteilung der PSA nach dem Test
- Dokumentieren Sie in den verschiedenen PSA-Artikeln, die für die Prüfung verwendet werden, Folgendes: Anzeichen von Verblassen, Verfärbungen und/oder Beschädigungen (z. B. Reißen, Dehnen); Gerüche; kleine Löcher, Schnitte oder Risse (verwenden Sie eine kleine Taschenlampe, um nach Schäden zu suchen); Trennung von Schichten, fehlende Fäden, Bereiche, in denen die Bindung beschädigt ist; Schäden an Nähten oder Reißverschlüssen; Messen und notieren Sie die Dehnung von elastischen Mitteln.
Representative Results
Nach Abschluss dieses Protokolls werden verschiedene Arten von Qualitätskontrolldaten und -ergebnissen generiert. Die Plattenzählung der Plaqueforming-Einheit (PFU) ermöglicht zusammen mit dem extrahierten Probenvolumen die Berechnung der Anzahl der PFU pro Testcoupon. Tabelle 2 ist ein Beispiel für ein Datenaufzeichnungsblatt für serielle Verdünnungs-/Plattierungsergebnisse. Unter Verwendung des Verdünnungsfaktors, des Probenvolumens und der Keimzahl aus Tabelle 1 zeigt Tabelle 3 repräsentative Ergebnisse der Viruserholung für einen Gesichtsbedeckungstest. Beachten Sie, dass diese Daten die Testcoupons und die Qualitätskontrollproben für das Inokulum, die Coupons und das Waschwasser (mit und ohne Reinigungsmittel) enthalten. Die verfahrenstechnischen Leer- und Sterilitätsqualitätskontrollproben sind wichtig, um zu bestätigen, dass die Wasserlösungen und PSA-Materialien nicht mit Phi6 kontaminiert waren. Die Angabe einer Kontamination würde zu fehlerhaften Berechnungen der Desinfektionswirksamkeit führen und eine Wiederholung des Tests erfordern. Die Positivkontrollproben sollen nachweisen, dass die Virusstammlösung während der Experimente nicht umweltbedingt/natürlich abgebaut wurde, wodurch die Wirkung des Waschprozesses auf die Verringerung der Viruslast aufgebläht wird. Diese Proben sollten innerhalb von 1 log PFU der Inokulumkontrollen bleiben, um die Testcouponergebnisse zu akzeptieren. Eine starke Reduzierung der PFU der positiven Kontrollproben zeigt auch, dass alle Schritte der Coupon-Impfung sorgfältig überprüft werden sollten, um sicherzustellen, dass der Analytiker das Protokoll mit geeigneten Pipettier- und Spreiztechniken ausführt.
Dieses Protokoll enthält auch Informationen zur Beurteilung von Änderungen der Materialeigenschaften von Kleidungsstücken aufgrund von Geldwäsche und Qualitätskontrollinformationen im Zusammenhang mit dem Protokoll (Tabelle 4 und Abbildung 3). Diese Daten sind aus mehreren Gründen nützlich. Die Aufzeichnung der Trends bei den Messungen der PSA-Artikel ermöglicht die Identifizierung eines Artikels mit einem Herstellungsfehler. Diese Identifizierung kann dazu beitragen, mikrobielle Ausreißerdaten zu erklären und die Variation im Produktverhalten zu kontextualisieren. Das Notieren von Gerüchen oder Schäden kann auch einen Hinweis darauf geben, ob die Waschmaschine oder der Trockner während eines Experiments suboptimal funktioniert hat und ob die Tests wiederholt oder die Geräte gewartet werden sollten. Wenn der Prüfplan mehrere Waschzyklen desselben PSA-Artikels erfordert, können die Daten dazu beitragen, festzustellen, wie lange die PSA-Artikel ihre Integrität für die Verwendung beim Waschen behalten. Die Aufzeichnung des pH-Werts der Waschmittellösung warnt vor Änderungen der Wasserquelle oder des Waschmittelprodukts. Die Führung eines Zeitprotokolls der Waschschritte stellt sicher, dass der Timer an Waschmaschine und Trockner keine Abweichungen vom Versuchsprotokoll verursacht.
Letztendlich werden diese Daten verwendet, um die Desinfektionswirksamkeit des Heißwasserwäscheverfahrens gegen eine Leihmutter für virale Krankheitserreger zu berichten. Die Wirksamkeit der Desinfektion bei der Wäsche (Eqn. 1) wird berechnet, indem die durchschnittlichen logarithmischen 10-Virus-Wiederfindungen vom PSA-Testcoupon von den durchschnittlichen logarithmischen10-Virus-Wiederfindungen von den positiven PSA-Kontrollergebnissen subtrahiert werden (Abbildung 4). Für Testcouponergebnisse, die nicht detektiert sind, wird das Protokoll10 der Nachweisgrenze in der Desinfektionswirksamkeitsberechnung verwendet. Es ist üblich, die Desinfektionswirksamkeit als Log-Werte für den Vergleich mit anderen viralen Desinfektionstechniken und -standards anzugeben.
Desinfektionswirksamkeit = Durchschnittlich log 10 (Positivkontrollen) - Durchschnittlich log10 (Testcoupons) (Gleichung 1)
Abbildung 3. Änderung der PSA-Abmessungen je nach Standort. Δ = Pre-Test-Messung - Post-Test-Messung. Ein negativer Δ-Wert entspricht der Dehnung des Artikels an der angegebenen Stelle und ein positiver Wert entspricht der Schrumpfung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Wirksamkeit der Heißwasserwäsche bei der Desinfektion von Gesichtsbedeckungen, Denim und Peeling-PSA-Materialien von Phi6. Sterne bedeuten eine vollständige Desinfektion (Nicht-Detektion auf den Testcoupons). Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an (n = 3). Ortsbuchstaben entsprechen der in Abbildung 2 dargestellten Platzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1. Lösungsrezepte. Zutaten und Mengen, die zur Herstellung von tryptischem Sojaagar, tryptischer Sojabrühe und Rindfleischextraktlösungen erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2. Ein Beispielteil eines seriellen Verdünnungs-/Beschichtungsergebnisblatts. Vorlage für die Meldung mikrobieller Rohdaten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3. Gesichtsbedeckende mikrobielle Ergebnisse. Beispielzusammenfassungsblatt für verarbeitete PFU-Daten (Plaque-bildende Einheit). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4. Scrubs Qualitätskontrolle und Materialbewertungsprotokoll. Vorlage für die Berichterstattung über die Kalibrierung von pH-Sonde, pH-Wert der Waschmittellösung, Messungen vor und nach dem Waschen und Waschzykluszeiten. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um systematische Labortests durchzuführen, um die Waschwirksamkeit der Virusdesinfektion von PSA / Kleidungsstücken in voller Größe zu bewerten. Die Verfahren beschreiben die kritischen Schritte zur Vorbereitung des Virus, zur Impfung des Testmaterials, zur Bewertung der Veränderungen der Gegenstände aufgrund des Waschprozesses und zur Quantifizierung der Verringerung der Viruslast als Ergebnis des Waschvorgangs (Maschinenwaschen und Trocknen). Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die erforderlichen Qualitätskontrollproben, um sicherzustellen, dass die Experimente nicht durch Verunreinigungen und Messungen / Beobachtungen beeinträchtigt werden, die aufgezeichnet werden sollten, um die Materialintegrität der PSA-Artikel nach mehreren Waschzyklen zu verfolgen. Die Ergebnisse mit Phi6 zeigen, dass der in diesem Protokoll verwendete Heißwasserwäscheprozess eine Verringerung der Viruslast für alle Proben (Gesichtsbedeckung, Peelings und Jeanshose) um mehr als 3 log erreichte. Die Reduzierung der Viruslast war auch an verschiedenen Stellen auf den PSA-/Bekleidungsartikeln einheitlich. Um eine 3-Log-Reduktion nachzuweisen, erfordert dieses Protokoll die Verwendung einer hohen Viruslast und eines Stabilisierungsmittels (Rindfleischextrakt), das möglicherweise nicht für alle Situationen repräsentativ für die Bodenbelastung ist.
Mini-Waschmaschinen und kompakte Trockner wurden ausgewählt, um die Anzahl der Wiederholungsexperimente zu optimieren, die in einer räumlichen Umgebung durchgeführt werden können, und um die Sterilisation der während der Experimente verwendeten Geräte und Wassermengen für das Laborpersonal überschaubar zu halten. Aufgrund der Verwendung der Mini-Waschmaschine waren die Spülschritte im Vergleich zu den meisten vollautomatischen Haushaltswäscheanwendungen manuell. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Maschinenwäsche in den entwickelten Ländern vorherrscht, aber das Händewaschen immer noch auf der ganzen Welt praktiziertwird 15. Darüber hinaus haben einige möglicherweise keinen Zugang zu heißem Wasser zum Waschen, und andere trocknen Kleidung manuell an der Luft und nicht in der Maschine. Diese Unterschiede in den Waschpraktiken wurden in diesem aktuellen Protokoll nicht behandelt, könnten aber leicht mit geringfügigen Änderungen untersucht werden, wie z. B. dem Ersetzen der Wasch- und Trocknungsschritte durch die Verwendung eines Eimers und einer geschlossenen Linie.
Die Reinigung / Desinfektion von viral kontaminierten Gesichtsbedeckungen und Straßenkleidung wurde in der wissenschaftlichen Literatur in vollem Umfang nur minimal in den Fokus gerückt. Häufiger bewerten Studien die Filtrationsleistung von Gesichtsbedeckungen nach wiederholtem Waschen und Trocknen, aber nicht die Wirksamkeit der Virusdesinfektion27,28. Zum Beispiel bewerteten Clapp et al. die angepasste Filtrationseffizienz von Stoffmasken und modifizierten Verfahrensmasken und fanden große Leistungsunterschiede, wobei einfache Modifikationen eine erhöhte Passform und Filtrationseffizienz bewirkten29. Eine weitere Studie untersuchte die Filtrationseffizienz von vier Stoffmasken aus unterschiedlichen Materialien30, wobei der Schwerpunkt wiederum auf der Quellenkontrolle oder dem persönlichen Schutz lag. Dies kann auf eine mangelnde Spezialisierung sowohl für den mikrobiellen Teil als auch für mechanische Tests im selben Labor zurückzuführen sein. Das hier vorgestellte Protokoll bietet eine Bewertung der Desinfektionswirksamkeit sowie des Materialabbaus.
Es gibt eine Reihe von Dekontaminations-/Desinfektionsmethoden für Einweg-Atemschutz (hauptsächlich N95s), die kürzlich in der wissenschaftlichen Literatur31,32,33 veröffentlicht wurden. Der Hauptfokus auf FFRs (z. B. N95s) liegt auf dem kritischen Atemschutz, den sie für medizinisches Personal und andere Berufe an vorderster Front bieten. Primäre Technologien für die Dekontamination von Atemschutzmasken umfassten verdampftes Wasserstoffperoxid (VHP), ultraviolette keimtötende Strahlung (UVGI) und feuchte Wärme (Dampf) zur Inaktivierung von Viren. Viscusi et al. bewerteten fünf Dekontaminationsmethoden für FFRs und UVGI; Ethylenoxid und VHP erwiesen sich als die vielversprechendsten Dekontaminationsmethoden31. Fischer et al. bewerteten vier verschiedene Dekontaminationsmethoden - UV-Licht, trockene Wärme, 70% Ethanol und VHP - auf ihre Fähigkeit, die Kontamination mit SARS-CoV-2 zu reduzieren und ihre Wirkung auf die N95-Atemschutzfunktion32. Es gibt viele zusätzliche Studien zu effektiven Dekontaminationstechnologien für FFRs, die 2020 zusammengefasst und veröffentlicht wurden33. Diese spezialisierten Methoden sind jedoch nicht zugänglich oder so konzipiert, dass sie vom durchschnittlichen Haus- oder Kleinunternehmer sicher verwendet werden können.
Dieses Protokoll wurde unter Verwendung von Phi6 entwickelt, einem behüllten Bakteriophagen, der SARS-CoV-2 ähnlich ist, Spike-Proteine aufweist und für alle Tests eine ähnliche Größe (80-100 nm)34 hat. Da Phi6 kein bekannter Erreger ist, kann es in einem allgemeinen mikrobiologischen Labor der Biosicherheitsstufe 1 (BSL-1) manipuliert werden. Die Wirksamkeit gegen Phi6 kann auf die Wirksamkeit anderer umhüllter Viren hinweisen, jedoch ist eine empirische Überprüfung für jedes Virus von Interesse erforderlich35. Durch die Verwendung eines ähnlichen, nichtpathogenen Viruswirkstoffs hofft man, dass dieses Protokoll an anderer Stelle wiederholt und zur Untersuchung zukünftiger Virusepidemien / Pandemien verwendet werden kann. Zukünftige Forschungen können die Verwendung von Desinfektionsmitteln (z. B. Bleichmittel) zusätzlich zu Reinigungsmitteln und ein standardisiertes Protokoll für das Händewaschen und die Linientrocknung umfassen.
Disclosures
Es sind keine Interessenkonflikte bekannt, die offengelegt werden müssen.
Acknowledgments
Die U.S. Environmental Protection Agency (EPA) leitete über ihr Office of Research and Development die hierin unter EP-C-15-008 beschriebene Forschung mit Jacobs Technology Inc. Er wurde von der Agentur überprüft, spiegelt aber nicht unbedingt die Ansichten der Agentur wider. Eine offizielle Billigung sollte nicht abgeleitet werden. EPA befürwortet nicht den Kauf oder Verkauf von kommerziellen Produkten oder Dienstleistungen. Die Autoren danken den EPA-Auftragnehmern Denise Aslett für die Aufsicht über die EPA-RTP-Mikrobiologie, Brian Ford, Rachael Baartmans und Lesley Mendez Sandoval für ihre Arbeit an diesem Projekt im EPA-RTP-Mikrobiologielabor, Ramona Sherman für die Bereitstellung der EPA-Qualitätssicherungsüberprüfung und Worth Calfee und Shannon Serre für die Bereitstellung technischer EPA-Überprüfungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freezer (- 80 °C) | ThermoFisher Scientific | FDE30086FA | |
| Hot Plate | VWR | 97042-714 | |
| Safety Pins (steel) | Singer | 319921 | |
| Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3525 | |
| SM buffer | Teknova, Hollister, CA | S0249 | |
| Syringe filter (0.2 μm) | Corning, Corning, NY | PES syringe filters, 431229 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Teknova, Hollister, CA | P0196, 10X PBS solution | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Autoclavable caps | DWK Life Sciences, Millville, NJ | KIM-KAP Caps, 73663-18 | |
| Autoclave | Steris | AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS | |
| Beef Extract | Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA | P/N B4888-100g | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| Cell spreaders | Busse Hospital Disposables | 23600894 | |
| Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004271 | Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge |
| Certified Timer | https://nist.time.gov/ | Not Applicable | |
| Conical tubes (50 mL) | Corning Life Sciences | 352098 | Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AY509X33 | |
| Denim | Wrangler | Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW | |
| Detergent | Proctor and Gamble | Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068 | |
| Dextrose | Fisher | BP350 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Becton Dickinson | DF0819172 | |
| Dryer | Magic Chef | MCSDRY15W | |
| Face Coverings | Felina | Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4 | |
| Incubator (top agar) | Symphony | 414004-596 | |
| Laboratory Notebook | Scientific Notebook Company | 2001 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Media sterilization and dispensing system | Integra | Media Clave/Media Jet | |
| Petri Dishes (100 mm) | VWR | 25384-342 | |
| pH Meter | Orion/Oakton | STARA1110/EW-35634-35 | |
| pH Probe | Orion | 8157BNUMD | |
| pH Standards | Oakton | 00654-(00/04/08) | |
| Phi 6 and Pseudomonas syringae | Battelle Memorial Institute, Columbus, OH | Not Applicable | |
| Pipette & Tips | Rainin | (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382 | |
| Refrigerator | True Manufacturing Co., Inc. | GDM-33 | |
| Scrubs | Gogreen cool | PN: WS19100PT | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 57656 | |
| Stir Bar | Fisherbrand | 16-800-512 | |
| Tape Measure | Lufkin | PS3425 | |
| Test Tubes for Soft agar (14 mL) | Corning, Corning, NY | 352059 | |
| Thermometer | Fisherbrand | 14-983-19B | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T9410 | |
| Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags | STERIS | 62020TW | |
| Vortex (during the plating process) | Daigger Scientific, Inc | 3030A | Vortex Genie 2 |
| Vortex (for sample extraction) | Branson Ultrasonics | 58816-115 | Multi-Tube vortexer |
| Washer | Kuppet | KP1040600A | |
| Washer Sterilization | Steris | STERIS VHP ED1000 generator | |
| Yeast extract | Gibco | 212750 |
References
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