Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

קביעת יעילות חיטוי ויראלי של הלבנת מים חמים

Published: June 21, 2022 doi: 10.3791/64164
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 2, 2, 2, 4, 2
1Office of Research and Development, Center for Environmental Solutions and Emergency Response, Homeland Security and Materials Management Division, U.S. Environmental Protection Agency, 2Jacobs Technology Inc., 3Science Systems and Applications Inc., 4CSS Inc.
* These authors contributed equally

Summary

בתגובה למגפת התסמונת הנשימתית החריפה החמורה נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2), פותח פרוטוקול מעבדה לבדיקת יעילות החיטוי הנגיפי של הלבנת מים חמים של כיסויי פנים מבד, קרצוף כותנה ומכנסי ג'ינס. נגיף Phi6 (בקטריופאג') שימש כאורגניזם לבדיקת יעילות החיטוי.

Abstract

פרוטוקול זה מספק דוגמה לתהליך מעבדה לביצוע מחקרי הלבנה המפיקים נתונים על חיטוי ויראלי. בעוד שהפרוטוקול פותח למחקר במהלך מגפת הקורונה 2019 (COVID-19), הוא נועד להיות מסגרת, הניתנת להתאמה למחקרי חיטוי וירוסים אחרים; הוא מדגים את השלבים להכנת נגיף הבדיקה, חיסון חומר הבדיקה, הערכת שינויים חזותיים ותקינות בפריטים שנשטפו עקב תהליך הכביסה, וכימות הירידה בעומס הנגיפי. בנוסף, הפרוטוקול מתווה את דגימות בקרת האיכות הדרושות כדי להבטיח שהניסויים אינם מוטים על ידי זיהום ומדידות / תצפיות שיש לרשום כדי לעקוב אחר שלמות החומר של פריטי ציוד המגן האישי (PPE) לאחר מחזורי כביסה מרובים. התוצאות המייצגות שהוצגו עם הפרוטוקול משתמשות בבקטריופאג' Phi6 שחוסן על גבי חומרי קרצוף כותנה, ג'ינס וכותנה לכיסוי פנים ומצביעות על כך שתהליך הכביסה והייבוש במים חמים שהושג על ידי הפחתה של 3 לוגים (99.9%) בעומס הנגיפי עבור כל הדגימות (הפחתה של 3 לוגים היא מדד ביצועי החיטוי בהנחיית בדיקת ביצועי המוצר של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב 810.2200). הירידה בעומס הנגיפי הייתה אחידה במקומות שונים על פריטי ה-PPE. התוצאות של פרוטוקול בדיקת יעילות החיטוי הנגיפי הזה אמורות לסייע לקהילה המדעית לחקור את היעילות של הלבנה ביתית עבור סוגים אחרים של נגיפי בדיקה ונהלי כביסה.

Introduction

מגפת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) גרמה לשיבושים חסרי תקדים בשרשרת האספקה העולמית והובילה למחסור קריטי בפריטים רבים, כולל ציוד מגן אישי חיוני (PPE)1,2,3. אלה במקצועות בסיכון גבוה נאלצו להסתגל באמצעות אסטרטגיות קיבולת משבר מומלצות והציבור אימץ את השימוש בפריטים שאינם מיוחדים כגון כיסויי פנים מחומרי בד בעיקר לבקרת מקור, אך גם כדי לספק הגנה נשימתית מסוימת ללובשים. בארצות הברית, הגנה נשימתית מיוחדת (כלומר, סינון מכונות הנשמה (FFRs) כגון N95s) הייתה שמורה לחלק מהעיסוקים בסיכון גבוה אלה (למשל, שירותי בריאות) במהלך מחסור באספקה4. כאשר מעט מאוד היה ידוע על העברת נגיף קורונה 2 (SARS-Cov-2) עם תסמונת נשימתית חריפה חמורה, מגוון סוגים אחרים של חומרי לבוש נחשבו גם הם כהגנה על מחסום בתחילת המגיפה5. עם מגוון הבדים המשמשים להגנה על הלובשים, עלו שאלות לגבי השימוש, השימוש החוזר והחיטוי/טיהור של פריטים אלה. בעוד שבארצות הברית היה מקובל כי כביסה שגרתית במכונות ביתיות של כיסויי פנים ופריטי לבוש אחרים הפכה וירוסים על משטחים אלה ללא זיהומיים, נתונים מעטים היו קיימים כדי לאמת טענה זו, והיה מחסור בפרוטוקולי מעבדה שפורסמו לבדיקה. מטרת פרוטוקול המחקר המוצג כאן היא לספק דוגמה לתהליך מעבדתי לביצוע מחקרי הלבנה המפיקים נתונים על חיטוי ויראלי. בעוד שהפרוטוקול פותח למחקר במהלך מגיפת COVID-19, הוא נועד להיות מסגרת הניתנת להתאמה למחקרי חיטוי וירוסים אחרים.

תפקיד הבגדים בהעברת מחלות הוא מושג קשה לכימות. הפורום המדעי הבינלאומי להיגיינה ביתית ניסה משימה מאתגרת זו על ידי עריכת סקירה של תפקיד הבגדים בהתפשטות מחלות זיהומיות יחד עם הערכת סיכונים של נוהלי היגיינה ביתית6. בעבודה זו נכללה סקירה של מספר מחקרים מדעיים שבחנו את הישרדותם של זנים נגיפיים שונים על סוגים שונים של בדים כגון צמר וכותנה 7,8,9,10,11. כל מחקר התמקד בסוג אחר של נגיף, כולל vaccinia, poliovirus, וירוס סינסיטיאלי נשימתי, וירוס הרפס ונגיף שפעת. זמני ההישרדות של הנגיפים השונים על הבדים נעו בין 30 דקות ל-5 חודשים, תלוי בשילוב הנגיף-חומר. כמה מהמחקרים גם הדגימו העברת זיהום ויראלי מהחומר אל הידיים. במסגרת הפרסום נדונה הלבנה יעילה כטכניקת ניהול חשובה לצמצום ההדבקה, אך הכירה בכך שעוצמת ההשפעה של הכביסה על הפחתת נטל התחלואה תלויה במזהם הנגיפי הספציפי וקשה לכמתאותה 7,8,9,10,11.

תהליך הכביסה הורס מיקרואורגניזמים באמצעות תהליכי טיפול כימיים, פיזיקליים ותרמיים. לדוגמה, סבונים ודטרגנטים יכולים להפריד קרקעות ועשויים להקנות פעילות אנטי-מיקרוביאלית בתיווך כימי. מבחינה פיזית, דילול ותסיסה עשויים לסייע בהפחתת העומס הנגיפי. מחקר שבחן את ההתמדה של נגיף הקורונה האנושי HCoV-OC43 על דוגמיות כותנה באמצעות מחזורי כביסה תעשייתיים וביתיים עם ובלי טמפרטורה וחומר ניקוי לא מצא שום וירוס הניתן לזיהוי בעת שטיפה במים לא מחוממים ללא חומר ניקוי, אלא שבנוכחות עומס קרקע (רוק מלאכותי), מחזורי שטיפה ביתיים דרשו חומר ניקוי כדי שלדגימות יהיו עומסי וירוסים שאינם מזוהים12. מים חמים עצמם יכולים גם לספק אמצעי יעיל להשמדת מיקרואורגניזמים מסוימים13,14.

בפרסום שפורסם לאחרונה המסכם את מצב שיטות הכביסה הנוכחיות, גורמים רבים כגון הרכב הבד, תנאי האחסון, עומס הלכלוך, טמפרטורת הכביסה וזמן הייבוש וטמפרטורת הייבוש זוהו כמשתנים בפרקטיקות הגלובליות של כביסה15. בעוד שכביסה היא שיטת ניקוי נפוצה עבור אחוז גדול מהאוכלוסייה, השונות הגדולה הזו בפרקטיקות הקיימות הופכת את הוצאת ההנחיות המפורטות כיצד לעשות זאת בצורה בטוחה ויעילה, כאשר פריט עלול להיות מזוהם על ידי וירוס, למאתגרת ודלילה. במהלך מגפת COVID-19, המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארצות הברית (CDC) פרסמו הנחיות כיצד להלבין פריטים עבור בעלי בתים16,17. חלק גדול מהנחיית הכביסה הזו התבסס על כמה מחקרים ישנים יותר על חיטוי חיידקים18,19 ונתמך על ידי מספר מחקרים על ספסל שמצאו וירוסים עטופים מומתים במים עם דטרגנטים20,21. ניתן לסכם את ההנחיות כ- 1) עקוב אחר הוראות היצרן עבור חומר הניקוי, 2) השתמש בהגדרת המים המתאימה החמה ביותר, ו- 3) ייבש פריטים לחלוטין. הרציונל של המלצות אלה היה ששטיפה במחזור החם ביותר האפשרי עם חומר ניקוי בשילוב עם ייבוש מוחלט (עם חום אם אפשר) תהרוג את נגיף SARS-CoV-2.

המספר העצום של וריאציות אפשריות בתהליך הכביסה מחייב פרוטוקול אחיד, כמו זה שהוצג כאן, כדי להיות מסוגל לבודד משתנים ולבדוק את יעילות החיטוי הנגיפי של תהליכים ספציפיים. הכוונה של פרוטוקול זה יחד עם סרטון הדרכה היא להדגים תהליך הלבנת מים חמים במעבדה לשכפול במחקרים אחרים. בנוסף, התוצאות של בדיקת היעילות של חיטוי ויראלי זה צריכות לבנות את אמון הצרכנים ביעילות של הלבנת בתים במהלך מגיפות מבוססות נגיפיות.

Protocol

Phi6 התקבל ממעבדת שיתוף פעולה כאליקוט קפוא של ~ 1 מ"ל ואוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הוא שימש בתחילה להפצת מלאי וירוסים נוספים אשר אוחסנו לאחר מכן ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש. Phi6 נבחר כנגיף ההדגמה מכיוון שהוא משמש בדרך כלל כנגיף מעטפת מודל, ניתן להפיץ אותו לטיטרים גבוהים, ודורש מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית נמוכה כדי לבצע את הבדיקה22,23,24.

1. הכן פתרון מלאי וירוסים

  1. להפיץ בקטריופאג' Phi6 במזרק פסאודומונס מארח חיידקי באמצעות הכנת מדיה טריפטית שונה של Soy Agar ושיטת כיסוי אגר רכה כמתואר להלן.
    1. הכינו אגר סויה טריפטי מעובד על ידי שקילה וערבוב המרכיבים מטבלה 1 במים שעברו דה-יוניזציה.
    2. הכינו תרבית לילה של מזרק P. על ידי הוספת אליקוט של 1 מ"ל של מזרק P. עם צפיפות אופטית (OD600) בין 0.9 ל-1.5, ל-100 מ"ל של מרק סויה טריפטי שונה (טבלה 1) ודגירה באינקובטור רועד ב~260 סל"ד בטמפרטורת החדר (20-26 מעלות צלזיוס).
    3. הכינו צינורות אגר רכים על ידי הנחת אגר סויה טריפטי שונה (~ 6 מ"ל) במבחנות וכיסוי בכובע אוטומטי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. אוטוקלאב צינורות אגר רכים בטמפרטורה של 121°C למשך 15 דקות להמסת אגר. יש להחזיק בטמפרטורה של 48°C עד לציפוי. שיווי משקל ב-48 מעלות צלזיוס הוא חשוב, אחרת הנגיף עלול להיות מומת בבדיקה.
    4. הוסף 1 מ"ל של אליקוט וירוס מרוכז לא מדולל לאגר רך ו-100 μL של שלב לוג (OD600 בין 0.9 ל-1.5) תרבית מזרק P. יוצקים אגר רך על פני השטח של צלחת אגר סויה טריפטית מוצקה בקוטר 100 מ"מ. כדי למנוע בועות ו/או שפיכה, יש לסובב את הלוחות בעדינות כדי לפזר את האגר הרך באופן שווה על פני משטח האגר המוצק ולדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    5. מגרדים בעדינות25 מתכולת שלושת הלוחות בעזרת מפזר תאים סטרילי לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של חיץ SM. צינורות מערבולת בהגדרה מקסימלית למשך 1-2 דקות כדי לפרק אגר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 7,000 x גרם במשך 15 דקות.
    6. הסר סופרנטנט וסנן דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן 1 מ"ל בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

2. בצע הערכה חזותית לפני הבדיקה של פריט PPE

  1. הניחו כל פריט PPE על משטח נקי וחלק (למשל, ספסל מעבדה המכוסה בתוחם נייר חד פעמי). הערך כל פריט PPE במשולש.
  2. הקפידו על תאורה נאותה במהלך בדיקת ה-PPE. מדדו ותעדו את האורך והרוחב של הפריטים הלא שטופים במקומות שונים (איור 1).

Figure 1
איור 1. מיקומי מדידה של הערכת PPE לפני הבדיקה. מקומות ג'ינס, קרצוף וכיסוי פנים שבהם נרשם האורך לצורך מעקב אחר שינויים מהותיים מתהליך הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. הכינו קופונים

  1. הכינו תלושי בדיקה בגודל 2 ס"מ על 4 ס"מ על ידי חיתוך PPE, הכינו שני קופונים לכל כיסוי פנים (נבדקו שלושה כיסויי פנים), חמישה קופונים למכנס ג'ינס (נבדקו שלושה מכנסי ג'ינס) ושלושה קופונים לכל חולצת קרצוף (נבדקו שלושה קרצוף).
  2. הכינו סט של קופונים ריקים פרוצדורליים בגודל 2 ס"מ על 4 ס"מ (סט לפריט PPE אחד בגודל מלא) לכל סוג חומר שלא יתחסן אך יכובס. הכינו שני קופונים לכל יום של ניסויים בכיסוי פנים, חמישה קופונים לכל יום של ניסויי ג'ינס, ושלושה קופונים לכל יום של ניסויי קרצוף.
  3. הכינו סט של קופוני בקרה חיובית בגודל 2 ס"מ על 4 ס"מ שיחוסנו, אך לא יכובסו. הכינו שני קופונים לכל יום של ניסויים בכיסוי פנים (שלושה כיסויי פנים נבדקו), חמישה קופונים לכל יום של ניסויי ג'ינס (שלושה מכנסי ג'ינס נבדקו), ושלושה קופונים לכל יום של ניסויי קרצוף (שלושה סקראבים נבדקו), ושלושה קופונים מפלדת אל-חלד.
    הערה: מספר שונה של עותקים משוכפלים נבחרו בהתאם לגודל הפריט. לדוגמה, קשה פיזית להדביק חמישה קופונים על כיסוי הפנים, ושני קופונים ייצגו שטח מוגבל של מכנסי הג'ינס. המיקומים נבחרו כדי למקסם את הכיסוי ובאזורים שעלולים להתקפל במהלך הכביסה ולהיות קשים יותר לניקוי.

4. בצע חיסון

  1. הכינו תמיסת תמצית בקר 10% על ידי המסת 1 גרם של תמצית בקר בנפח כולל של 10 מ"ל של מי מלח 1x פוספט חצוי. המסנן מעקר את כל אמצעי האחסון באמצעות מסנן מזרק בגודל 0.2 מיקרומטר.
  2. להפשיר את תמיסת מלאי הנגיף שהוכנה בסעיף 1 בטמפרטורת החדר. ביום השימוש, יש להוסיף 100 μL של ציר Phi6 המופשר ל-900 μL של תמיסת תמצית בקר 10%.
  3. חיסון קופוני בדיקה וקופונים לבקרה חיובית עם ~ 107 PFU / דגימה על ידי צינורית טיפת תמיסה של 10 μL על פריט PPE והפצת הטיפות באמצעות קצה הפיפטה. בהתאם לחומר ה-PPE, הטיפות ייפרדו ויצטברו מחדש באופן שונה.
  4. אפשרו לקופונים מחוסנים להתייבש בארון בטיחות ביולוגית. קבעו את זמני הייבוש באמצעות תצפית על החומרים הספציפיים שלכם. עבור התוצאות המוצגות כאן, נעשה שימוש בזמנים הבאים: קרצוף = 30 דקות זמן יבש; כיסוי פנים = 60 דקות זמן יבש; ג'ינס = 30 דקות זמן ייבוש; נירוסטה = 120 דקות זמן ייבוש.
  5. הצמידו קופונים מחוסנים לפריטי PPE בגודל מלא לפי איור 2 באמצעות סיכות בטיחות וטכניקות אספטיות.

Figure 2
איור 2. בדקו את מיקומי הקופונים על ג'ינס, קרצוף וכיסויי פנים. האותיות A-D תואמות את מזהי הקופון הייחודיים לכל ניסויי הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. בצע כביסה

  1. הכינו את חומר הניקוי לכביסה באופן הבא.
    1. יש לעקר מי ברז שישמשו במכונת הכביסה ולאסוף 10 מ"ל מים אוטומטיים לבדיקת סטריליות. עבור פרוטוקול זה, autoclave 7 ליטר של מי ברז על מחזור נוזל של 60 דקות.
    2. הכינו תמיסת כביסה בהתאם להוראות הדילול של היצרן. עבור פרוטוקול זה, יש להמיס 1.54 מ"ל של חומר ניקוי ב-3.5 ליטר של מי ברז סטריליים. חממו את תמיסת הכביסה ל-50°C באמצעות פלטה חמה וערבבו. מדוד ורשום את ה- pH והטמפרטורה של תמיסת הכביסה. לאסוף 10 מ"ל של פתרון עבור בדיקת סטריליות.
  2. יוצקים תמיסת כביסה לתוך מכונת כביסה מעוקרת (3.25 L). יש לעקר מראש מכונות כביסה באמצעות מחזור של 250 ppm-4 שעות של מי חמצן אדים בין הבדיקות.
  3. הנח פריטי PPE במכונת כביסה מעוקרת. הוסיפו מכנסי ג'ינס אחד וחולצת קרצוף אחת לכל מכונת כביסה. הוסף כיסוי פנים מחוסן אחד וארבע מסכות מילוי לא מזוהמות לכל מכונת כביסה; למסכות מילוי לא היו מחוברים קופונים.
  4. יש לשטוף פריט PPE למשך 18 דקות (שני מחזורי כביסה של 9 דקות עם תסיסה רגילה). מסננים את מכונת הכביסה ושוטפים שלוש עם מי ברז בטמפרטורת החדר (5 ליטר בכל פעם) להסרת קצף. הוסיפו מי ברז מעוקרים בטמפרטורת החדר למכונת הכביסה (3.25 ליטר) ובצעו מחזור שטיפה באורך 9 דקות.
  5. הזז את פריטי ה- PPE לצד הסיבוב של מכונת הכביסה וסובב במשך 5 דקות. העבירו את פריטי ה-PPE למייבש וייבשו במשך 80 דקות על הגדרת החום הגבוה (93°C).
  6. העבר PPE ממייבש לסביבת עבודה סטרילית והסר באופן אספטי את הקופונים מכל פריט והנח אותם בצינורות חרוטיים. ממלאים מראש את הצינורות ב-10 מ"ל של 10% חיץ מיצוי מרק Dey-Engley ומכסים ברדיד אלומיניום.

6. לחלץ ולמנות מטענים ויראליים על קופונים

  1. חלץ קופונים ב-10 מ"ל של מרק מנטרל Dey-Engley 10% על ידי מערבולת למשך 2 דקות בהגדרה המרבית של הציוד שלך.
  2. תמציות צלחת בשיטת כיסוי אגר עליונה רכה קונבנציונלית26.
    1. הכן צינורות של אגר סויה טריפטי רך שונה ותרבית מזרק P . כמתואר בסעיף 1. ביום הבדיקה, autoclave את צינורות אגר רך ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להמיס את agar. החזיקו את האגר הרך בטמפרטורה של 48°C עד לציפוי. שיווי משקל ב-48 מעלות צלזיוס הוא חשוב, אחרת הנגיף יכול להיות מומת תרמית בבדיקה.
    2. הכינו סדרת דילול של פי עשרה במי מלח עם אגירת פוספטים עבור כל דגימת בדיקה ששימשה במחקר הכביסה. יש להשתמש הן באליקוטים מדוללים סדרתיים (100 μL) והן לא מדוללים (1 מ"ל ו-100 μL) לציפוי.
    3. הוסף אליקוטים לדוגמה לצינור האגר הרך המכיל 6 מ"ל של אגר רך ו-100 μL של תרבית מזרק P . שלב הלוג (OD600 בין 0.9-1.5). יוצקים את האגר הרך על פני השטח של צלחת אגר סויה טריפטית ממוצקת. פזרו את האגר הרך באופן שווה על פני משטח האגר המוצק על ידי סיבוב הצלחת.
    4. דגרו לוחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר וספרו ידנית את היום שלמחרת על ידי ספירת היחידות יוצרות הרובד על כל צלחת.

7. בצע הערכה חזותית לאחר הבדיקה של פריטי PPE

  1. תעד את הדברים הבאים בפריטי PPE השונים המשמשים לבדיקה: סימני דהייה, שינוי צבע ו/או נזק (לדוגמה, קריעה, מתיחה); ריחות; חורים קטנים, חתכים או קרעים (השתמש בפנס קטן כדי לחפש נזק); הפרדת שכבות, חוטים חסרים, אזורים שבהם הכריכה פגומה; נזק לתפרים או לרוכסן; למדוד ולהקליט את המתיחה של אלסטי.

Representative Results

מספר סוגים שונים של נתוני בקרת איכות ותוצאות נוצרים לאחר השלמת פרוטוקול זה. ספירת לוחות יצירת רובד (PFU) יחד עם נפח הדגימה שחולץ מאפשרים לחשב את מספר ה- PFU לכל קופון בדיקה. טבלה 2 היא דוגמה לגיליון הקלטת נתונים לקבלת תוצאות דילול/ציפוי סדרתי. באמצעות גורם הדילול, נפח הדגימה וספירת הצלחות מטבלה 1, טבלה 3 מציגה תוצאות התאוששות נגיפיות מייצגות עבור בדיקת כיסוי פנים. שים לב שנתונים אלה כוללים את תלושי הבדיקה ואת דגימות בקרת האיכות עבור האינוקולום, הקופונים ומי הכביסה (עם ובלי חומר ניקוי). דגימות בקרת האיכות הפרוצדורליות והסטריליות חשובות כדי לאשר שתמיסות המים וחומרי ה- PPE לא היו מזוהמים ב- Phi6. אינדיקציה לזיהום תגרום לחישובים שגויים של יעילות החיטוי ותחייב את הבדיקה לחזור על עצמה. דגימות הבקרה החיובית נועדו לוודא שתמיסת מלאי הנגיף לא התדרדרה מבחינה סביבתית/טבעית במהלך הניסויים, ובכך לנפח את השפעת תהליך הכביסה בהפחתת העומס הנגיפי. דגימות אלה צריכות להישאר בתוך 1 יומן PFU של פקדי inoculum כדי לקבל את תוצאות קופון הבדיקה. הפחתה גדולה ב- PFU של דגימות הבקרה החיוביות מצביעה גם על כך שיש לבחון בקפידה את כל השלבים של חיסון הקופון כדי להבטיח שהאנליסט מבצע את הפרוטוקול עם טכניקות צנרת והפצה מתאימות.

פרוטוקול זה מספק גם מידע להערכת שינויים בתכונות החומריות של פריטי לבוש עקב מידע על הלבנה ובקרת איכות הנוגעים לפרוטוקול (טבלה 4 ואיור 3). נתונים אלה שימושיים מכמה סיבות. רישום המגמות במדידות של פריטי PPE מאפשר זיהוי של פריט עם פגם בייצור. זיהוי זה עשוי לעזור להסביר נתונים מיקרוביאליים חריגים ולהקשר את השונות בהתנהגות המוצר. רישום של ריחות או נזקים עשוי גם לספק אינדיקציה אם מכונת הכביסה או המייבש פעלו בצורה לא אופטימלית במהלך ניסוי ואם יש לחזור על הבדיקות או לטפל בציוד. בנוסף, אם תוכנית הבדיקה דורשת מחזורי כביסה מרובים של אותו פריט PPE, הנתונים עשויים לסייע לקבוע כמה זמן פריטי PPE שומרים על שלמותם לשימוש בעת הכביסה. שמירה על רישום ה- pH של תמיסת הדטרגנט מספקת התראה לשינויים במקור המים או במוצר הדטרגנט. ניהול יומן זמן של שלבי הכביסה מבטיח כי הטיימר על מכונת הכביסה והמייבש אינו גורם לשינויים בפרוטוקול הניסוי.

בסופו של דבר, נתונים אלה משמשים לדיווח על יעילות החיטוי של הליך הלבנת המים החמים נגד פונדקאית לפתוגנים ויראליים. יעילות חיטוי הלבנת הכביסה (Eqn. 1) מחושבת על ידי חיסור ממוצע של יומן 10 מחלימים מנגיף מקופון בדיקת PPE מתוך היומן הממוצע10 מחלימים של וירוסים מתוצאות בקרה חיובית של PPE (איור 4). עבור תוצאות קופון בדיקה שאינן מזוהות, היומן10 של מגבלת הגילוי משמש בחישוב יעילות החיטוי. מקובל לדווח על יעילות החיטוי כערכי יומן לצורך השוואה עם טכניקות וסטנדרטים אחרים של חיטוי ויראלי.

יעילות חיטוי = יומן ממוצע 10 (בקרות חיוביות) - יומן ממוצע10 (שוברי בדיקה) (Eqn. 1)

Figure 3
איור 3. שינוי במידות PPE לפי מיקום. Δ = מדידה לפני הבדיקה - מדידה לאחר הבדיקה. ערך Δ שלילי מתאים למתיחה של הפריט במיקום שצוין וערך חיובי מתאים להתכווצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
תרשים 4. יעילות של הלבנת מים חמים בחיטוי כיסויי פנים, ג'ינס וחומרי PPE לשפשוף מבית Phi6. כוכבים מציינים חיטוי מלא שהתרחש (אי זיהוי בתלושי הבדיקה). קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (n = 3). אותיות מיקום מתאימות למיקום המתואר באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1. מתכוני פתרון. המרכיבים והכמויות הדרושים להכנת אגר סויה טריפטי, מרק סויה טריפטי ותמיסות תמצית בקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2. חלק לדוגמה של גיליון תוצאות דילול/ציפוי סדרתי. תבנית לדיווח על נתונים מיקרוביאליים גולמיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3. תוצאות מיקרוביאליות לכיסוי פנים. גיליון סיכום לדוגמה עבור נתוני יחידה יוצרת רובד מעובד (PFU). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4. סקראבס בקרת איכות ויומן הערכת חומרים. תבנית לדיווח על כיול של בדיקת pH, pH של תמיסת חומרי ניקוי, מדידות לפני ואחרי הכביסה וזמני מחזור הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

פרוטוקול זה פותח כדי לבצע בדיקות מעבדה שיטתיות כדי להעריך את יעילות הכביסה של חיטוי ויראלי מפריטי PPE/בגדים בגודל מלא. הנהלים מפרטים את השלבים הקריטיים להכנת הנגיף, לחיסון חומר הבדיקה, להערכת השינויים בפריטים עקב תהליך הכביסה ולכימות הירידה בעומס הנגיפי כתוצאה מתהליך הכביסה (כביסה וייבוש במכונה). בנוסף, הפרוטוקול מתווה את דגימות בקרת האיכות הדרושות כדי להבטיח שהניסויים אינם מוטים על ידי זיהום ומדידות / תצפיות שיש לרשום כדי לעקוב אחר שלמות החומר של פריטי PPE לאחר מחזורי כביסה מרובים. התוצאות באמצעות Phi6 מצביעות על כך שתהליך הלבנת המים החמים המשמש בפרוטוקול זה השיג הפחתה של יותר מ-3 לוגים בעומס הנגיפי עבור כל הדגימות (כיסוי פנים, פילינג ומכנסי ג'ינס). הפחתת העומס הנגיפי הייתה אחידה גם במקומות שונים על פריטי ה-PPE/ביגוד. כדי להדגים הפחתה של 3 לוגים, פרוטוקול זה דורש שימוש בעומס ויראלי גבוה ובחומר מייצב (תמצית בקר) שאולי אינו מייצג את עומס הקרקע לכל המצבים.

מכונות כביסה קטנות ומייבשי כביסה קומפקטיים נבחרו כדי לייעל את מספר הניסויים המשוכפלים שניתן לערוך בסביבה מוגבלת בחלל וכדי לשמור על עיקור הציוד ונפח המים המשמשים במהלך הניסויים לניהול עבור צוות המעבדה. כתוצאה מהשימוש במכונת הכביסה הזעירה, שלבי השטיפה היו ידניים בהשוואה לרוב יישומי הכביסה הביתית שהם אוטומטיים לחלוטין. חשוב גם לזכור כי כביסה במכונה שולטת במדינות מפותחות, אך שטיפת ידיים עדיין נהוגה בכל רחבי העולם15. בנוסף, ייתכן שלחלקם לא תהיה גישה למים חמים לכביסה, ואחרים ייבשו בגדים באוויר באופן ידני במקום ייבוש במכונה. הבדלים אלה בשיטות הכביסה לא טופלו בפרוטוקול הנוכחי, אך ניתן היה לחקור אותם בקלות באמצעות שינויים קלים כגון החלפת שלבי הכביסה והייבוש בשימוש בדלי ובקו סגור

יש התמקדות מינימלית בניקוי / חיטוי של כיסויי פנים ובגדי רחוב מזוהמים ויראלית בספרות המדעית בקנה מידה מלא. באופן נפוץ יותר, מחקרים מעריכים את ביצועי הסינון של כיסויי פנים לאחר שטיפה וייבוש חוזרים ונשנים, אך אינם מעריכים את יעילות החיטוי הנגיפי27,28. לדוגמה, Clapp et al. העריכו את יעילות הסינון המותאם של מסכות בד ומסכות פרוצדורה מותאמות ומצאו שונות רבה בביצועים, כאשר שינויים פשוטים מספקים התאמה ויעילות סינון מוגברים29. מחקר אחר בחן את יעילות הסינון של ארבע מסכות בד מחומרים שונים30, ושוב התמקד בבקרת מקור או בהגנה אישית. ייתכן שהדבר נובע מחוסר התמחות הן בחלק המיקרוביאלי והן בבדיקה מכנית באותה מעבדה. הפרוטוקול המוצג כאן מספק הערכה של יעילות החיטוי כמו גם השפלה של חומרים.

קיימות מספר שיטות טיהור/חיטוי להגנה נשימתית חד פעמית (בעיקר N95s) שפורסמו לאחרונה בספרות המדעית31,32,33. ההתמקדות העיקרית ב-FFRs (למשל, N95s) נובעת מההגנה הנשימתית הקריטית שהם מספקים לעובדי בריאות ולעיסוקים אחרים בקו החזית. הטכנולוגיות העיקריות לפירוק מכונות הנשמה כללו מי חמצן מאודים (VHP), קרינה חיידקית אולטרה סגולה (UVGI) וחום לח (קיטור) להשבתת הנגיף. Viscusi et al. העריכו חמש שיטות טיהור עבור FFRs ו- UVGI; אתילן אוקסיד ו- VHP נמצאו כשיטות הטיהור המבטיחות ביותר31. Fischer et al. העריכו ארבע שיטות טיהור שונות - אור UV, חום יבש, 70% אתנול ו-VHP - על יכולתן להפחית את הזיהום עם SARS-CoV-2 והשפעתן על פונקציית ההנשמה N9532. ישנם מחקרים רבים נוספים על טכנולוגיות טיהור יעילות עבור FFRs אשר סוכמו ופורסמו בשנת 202033. עם זאת, שיטות מיוחדות אלה אינן נגישות או מתוכננות לשימוש בטוח על ידי בעל הבית הממוצע או העסק הקטן.

פרוטוקול זה פותח באמצעות Phi6, בקטריופאג' עטוף הדומה ל-SARS-CoV-2, מכיל חלבוני ספייק, וגודלו דומה (80-100 ננומטר)34, לכל הבדיקות. מאחר ש-Phi6 אינו פתוגן ידוע, ניתן לתמרן אותו במעבדה מיקרוביולוגית כללית לביו-בטיחות ברמה 1 (BSL-1). יעילות נגד Phi6 עשויה להצביע על יעילותם של וירוסים עטופים אחרים, עם זאת, אימות אמפירי עבור כל וירוס מעניין הוא הכרחי35. על ידי שימוש בחומר נגיפי דומה, לא פתוגני, יש לקוות שניתן יהיה לחזור על פרוטוקול זה במקומות אחרים ולהשתמש בו לחקר מגיפות/מגיפות ויראליות עתידיות. מחקרים עתידיים עשויים לכלול שימוש בחומרי חיטוי (למשל, אקונומיקה) בנוסף לדטרגנטים ופרוטוקול סטנדרטי לשטיפת ידיים וייבוש קווים.

Disclosures

לא ידוע על ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב (EPA) באמצעות משרד המחקר והפיתוח שלה ניהלה את המחקר המתואר כאן תחת EP-C-15-008 עם Jacobs Technology Inc. הוא נבדק על ידי הסוכנות אך אינו משקף בהכרח את עמדות הסוכנות. אין להסיק אישור רשמי. EPA אינה תומכת ברכישה או מכירה של מוצרים או שירותים מסחריים כלשהם. המחברים רוצים להודות לקבלני ה-EPA דניס אסלט על הפיקוח על המיקרוביולוגיה של EPA RTP, בריאן פורד, רייצ'ל בארטמנס ולסלי מנדז סנדובל על עבודתם בפרויקט זה במעבדה למיקרוביולוגיה של EPA RTP, רמונה שרמן על מתן סקירת אבטחת האיכות של ה-EPA, ווורת' קאלפי ושאנון סרה על מתן סקירות טכניות של EPA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 Freezer (- 80 °C) ThermoFisher Scientific FDE30086FA
 Hot Plate VWR 97042-714
 Safety Pins (steel) Singer 319921
 Shaker Lab-Line Instruments, Inc. 3525
 SM buffer Teknova,  Hollister, CA S0249
 Syringe filter (0.2 μm) Corning, Corning, NY PES syringe filters, 431229
1X Phosphate Buffered Saline Teknova, Hollister, CA P0196, 10X PBS solution
Agar Becton Dickinson 214010
Autoclavable caps DWK Life Sciences, Millville, NJ KIM-KAP Caps, 73663-18
Autoclave Steris AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS
Beef Extract Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA P/N B4888-100g
Calcium chloride Sigma-Aldrich 793639
Cell spreaders Busse Hospital Disposables 23600894
Centrifuge ThermoFisher Scientific 75004271 Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge
Certified Timer https://nist.time.gov/ Not Applicable
Conical tubes (50 mL) Corning Life Sciences 352098 Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes
Cryovials Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA AY509X33
Denim Wrangler Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW
Detergent Proctor and Gamble Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068
Dextrose Fisher BP350
Dey-Engley neutralizing broth Becton Dickinson DF0819172
Dryer Magic Chef MCSDRY15W
Face Coverings Felina Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4
Incubator (top agar) Symphony 414004-596
Laboratory Notebook Scientific Notebook Company 2001
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
Media sterilization and dispensing system Integra Media Clave/Media Jet
Petri Dishes (100 mm) VWR 25384-342
pH Meter Orion/Oakton STARA1110/EW-35634-35
pH Probe Orion 8157BNUMD
pH Standards Oakton 00654-(00/04/08)
Phi 6 and Pseudomonas syringae Battelle Memorial Institute, Columbus, OH Not Applicable
Pipette & Tips Rainin (Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382
Refrigerator True Manufacturing Co., Inc. GDM-33
Scrubs Gogreen cool PN: WS19100PT
Sodium chloride Sigma-Aldrich 57656
Stir Bar Fisherbrand 16-800-512
Tape Measure Lufkin PS3425
Test Tubes for Soft agar (14 mL) Corning, Corning, NY 352059
Thermometer Fisherbrand 14-983-19B
Tryptone Sigma-Aldrich T9410
Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags STERIS 62020TW
Vortex (during the plating process) Daigger Scientific, Inc 3030A Vortex Genie 2
Vortex (for sample extraction) Branson Ultrasonics 58816-115 Multi-Tube vortexer
Washer Kuppet KP1040600A
Washer Sterilization Steris STERIS VHP ED1000 generator
Yeast extract Gibco 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Emanuel, E. J., et al. Fair allocation of scarce medical resources in the time of Covid-19. The New England Journal of Medicine. 382 (21), 2049-2055 (2020).
  2. Cohen, J., van der Meulen Rodgers, Y. Contributing factors to personal protective equipment shortages during the COVID-19 pandemic. Preventive Medicine. 141, 106263 (2020).
  3. Burki, T. Global shortage of personal protective equipment. The Lancet Infectious Diseases. 20 (7), 785-786 (2020).
  4. Optimizing Personal Protective Equipment (PPE) Supplies. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/ppe-strategy/index.html (2020).
  5. Livingston, E., Desai, A., Berkwits, M. Sourcing personal protective equipment during the COVID-19 pandemic. Jama. 323 (19), 1912-1914 (2020).
  6. Bloomfield, S. F., Exner, M., Signorelli, C., Nath, K. J., Scott, E. A. The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry. International Scientific Forum on Home Hygiene. , (2011).
  7. Hall, C. B., Douglas, R. G., Geiman, J. M. Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus. Journal of Infectious Diseases. 141 (1), 98-102 (1980).
  8. Turner, R., Shehab, Z., Osborne, K., Hendley, J. O. Shedding and survival of herpes simplex virus from 'fever blisters'. Pediatrics. 70 (4), 547-549 (1982).
  9. Bean, B., et al. Survival of influenza viruses on environmental surfaces. Journal of Infectious Diseases. 146 (1), 47-51 (1982).
  10. Brady, M. T., Evans, J., Cuartas, J. Survival and disinfection of parainfluenza viruses on environmental surfaces. American Journal of Infection Control. 18 (1), 18-23 (1990).
  11. Sidwell, R. W., Dixon, G. J., Mcneil, E. Quantitative studies on fabrics as disseminators of viruses: I. Persistence of vaccinia virus on cotton and wool fabrics. Applied Microbiology. 14 (1), 55-59 (1966).
  12. Owen, L., Shivkumar, M., Laird, K. The stability of model human coronaviruses on textiles in the environment and during health care laundering. Msphere. 6 (2), 00316-00321 (2021).
  13. Sehulster, L., et al. Guidelines for environmental infection control in health-care facilities. Recommendations from CDC and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC). American Society for Healthcare Engineering/American Hospital Association. , (2004).
  14. Chen, H., et al. Influence of different inactivation methods on severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA copy number. Journal of Clinical Microbiology. 58 (8), e00958 (2020).
  15. Abney, S. E., Ijaz, M. K., McKinney, J., Gerba, C. P. Laundry hygiene and odor control-state of the science. Applied and Environmental Microbiology. 87 (14), 0300220 (2021).
  16. COVID-19 Cleaning and Disinfecting Your Home. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/disinfecting-you-home.html (2021).
  17. COVID-19 Your Guide to Masks - How to select, properly wear, clean, and store masks. CDC. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/prevent-getting-sick/about-face-coverings.html (2021).
  18. Walter, W. G., Schillinger, J. E. Bacterial survival in laundered fabrics. Applied Microbiology. 29 (3), 368-373 (1975).
  19. Blaser, M. J., Smith, P. F., Cody, H. J., Wang, W. -L. L., LaForce, F. M. Killing of fabric-associated bacteria in hospital laundry by low-temperature washing. Journal of Infectious Diseases. 149 (1), 48-57 (1984).
  20. Gerhardts, A., et al. Testing of the adhesion of herpes simplex virus on textile substrates and its inactivation by household laundry processes. Journal of Biosciences and Medicines. 4 (12), 111 (2016).
  21. Heinzel, M., Kyas, A., Weide, M., Breves, R., Bockmühl, D. P. Evaluation of the virucidal performance of domestic laundry procedures. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 213 (5), 334-337 (2010).
  22. Casanova, L. M., Weaver, S. R. Inactivation of an enveloped surrogate virus in human sewage. Environmental Science & Technology Letters. 2 (3), 76-78 (2015).
  23. Aquino de Carvalho, N., Stachler, E. N., Cimabue, N., Bibby, K. Evaluation of Phi6 persistence and suitability as an enveloped virus surrogate. Environmental Science & Technology. 51 (15), 8692-8700 (2017).
  24. Ye, Y., Chang, P. H., Hartert, J., Wigginton, K. R. Reactivity of enveloped virus genome, proteins, and lipids with free chlorine and UV254. Environmental Science & Technology. 52 (14), 7698-7708 (2018).
  25. Bacteriology Culture Guide. ATCC. , Available from: https://www.atcc.org/resources/culture-guides/bacteriology-culture-guide (2022).
  26. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Bacteriophages. , Springer. 69-76 (2009).
  27. Sankhyan, S., et al. Filtration performance of layering masks and face coverings and the reusability of cotton masks after repeated washing and drying. Aerosol and Air Quality Research. 21 (11), 210117 (2021).
  28. Kumar, A., Bhattacharjee, B., Sangeetha, D., Subramanian, V., Venkatraman, B. Evaluation of filtration effectiveness of various types of facemasks following with different sterilization methods. Journal of Industrial Textiles. , (2021).
  29. Clapp, P. W., et al. Evaluation of cloth masks and modified procedure masks as personal protective equipment for the public during the COVID-19 pandemic. JAMA Internal Medicine. 181 (4), 463-469 (2021).
  30. Lu, H., Yao, D., Yip, J., Kan, C. -W., Guo, H. Addressing COVID-19 spread: development of reliable testing system for mask reuse. Aerosol and air quality research. 20 (11), 2309-2317 (2020).
  31. Viscusi, D. J., Bergman, M. S., Eimer, B. C., Shaffer, R. E. Evaluation of five decontamination methods for filtering facepiece respirators. Annals of Occupational Hygiene. 53 (8), 815-827 (2009).
  32. Fischer, R. J., et al. Effectiveness of N95 respirator decontamination and reuse against SARS-CoV-2 virus. Emerging Infectious Diseases. 26 (9), 2253 (2020).
  33. Derraik, J. G., Anderson, W. A., Connelly, E. A., Anderson, Y. C. Rapid review of SARS-CoV-1 and SARS-CoV-2 viability, susceptibility to treatment, and the disinfection and reuse of PPE, particularly filtering facepiece respirators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (17), 6117 (2020).
  34. Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Calfee, M. W., et al. Virucidal efficacy of antimicrobial surface coatings against the enveloped bacteriophage Φ6. Journal of Applied Microbiology. 132 (3), 1813-1824 (2022).

Tags

הנדסה גיליון 184
קביעת יעילות חיטוי ויראלי של הלבנת מים חמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mikelonis, A., Archer, J.,… More

Mikelonis, A., Archer, J., Wyrzykowska-Ceradini, B., Morris, E., Sawyer, J., Chamberlain, T., Abdel-Hady, A., Monge, M., Touati, A. Determining Viral Disinfection Efficacy of Hot Water Laundering. J. Vis. Exp. (184), e64164, doi:10.3791/64164 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter