Summary
Viene dimostrato un nuovo metodo di preparazione del campione per l'analisi di macrocolonie batteriche a base di agar mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.
Abstract
Comprendere le conseguenze metaboliche delle interazioni microbiche che si verificano durante l'infezione rappresenta una sfida unica nel campo dell'imaging biomedico. La spettrometria di massa con imaging a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI) rappresenta una modalità di imaging in situ senza etichetta in grado di generare mappe spaziali per un'ampia varietà di metaboliti. Mentre i campioni di tessuto sottilmente sezionati vengono ora analizzati di routine tramite questa tecnologia, le analisi di spettrometria di massa di imaging di substrati non tradizionali, come le colonie batteriche comunemente coltivate su agar nella ricerca microbiologica, rimangono impegnative a causa dell'elevato contenuto di acqua e della topografia irregolare di questi campioni. Questo documento illustra un flusso di lavoro di preparazione dei campioni per consentire l'analisi di spettrometria di massa di imaging di questi tipi di campioni. Questo processo è esemplificato utilizzando macrocolonie di co-coltura batterica di due patogeni gastrointestinali: Clostridioides difficile e Enterococcus faecalis. Lo studio delle interazioni microbiche in questo ambiente di agar ben definito ha anche dimostrato di integrare gli studi sui tessuti volti a comprendere la cooperazione metabolica microbica tra questi due organismi patogeni in modelli murini di infezione. Le analisi di spettrometria di massa per immagini dei metaboliti aminoacidici arginina e ornitina sono presentate come dati rappresentativi. Questo metodo è ampiamente applicabile ad altri analiti, patogeni microbici o malattie e tipi di tessuto in cui è richiesta una misura spaziale della biochimica cellulare o tissutale.
Introduction
Il microbioma umano è un ecosistema altamente dinamico che coinvolge interazioni molecolari di batteri, virus, archea e altri eucarioti microbici. Mentre le relazioni microbiche sono state intensamente studiate negli ultimi anni, molto resta da capire sui processi microbici a livello chimico 1,2. Ciò è in parte dovuto all'indisponibilità di strumenti in grado di misurare con precisione ambienti microbici complessi. I progressi nel campo della spettrometria di massa per immagini (IMS) nell'ultimo decennio hanno permesso la mappatura spaziale in situ e label-free di molti metaboliti, lipidi e proteine in substrati biologici 3,4. Il desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI) è emerso come la tecnica di ionizzazione più comune utilizzata nella spettrometria di massa di imaging, che prevede l'uso di un laser UV per ablare materiale dalla superficie di una sezione di tessuto sottile per la misurazione mediante spettrometria di massa4. Questo processo è facilitato dall'applicazione di una matrice chimica applicata in modo omogeneo alla superficie del campione, consentendo di effettuare misurazioni sequenziali in uno schema raster sulla superficie del campione. Le mappe termiche delle intensità degli ioni analita vengono quindi generate in seguito all'acquisizione dei dati. I recenti progressi nelle sorgenti di ionizzazione e nelle tecniche di campionamento hanno permesso l'analisi di substrati non tradizionali come campioni cellulari batterici5 e 6,7,8 di mammiferi cresciuti su agar nutriente. Le informazioni spaziali molecolari fornite dall'IMS possono fornire una visione unica della comunicazione biochimica delle interazioni microbo-microbo e ospite-microbo durante l'infezione 9,10,11,12,13,14.
Dopo l'infezione da Clostridioides difficile (CDI), C. difficile è esposto a un ambiente microbico in rapida evoluzione nel tratto gastrointestinale, dove le interazioni polimicrobiche possono avere un impatto sugli esiti dell'infezione15,16. Sorprendentemente, si sa poco sui meccanismi molecolari delle interazioni tra C. difficile e microbiota residente durante l'infezione. Ad esempio, gli enterococchi sono una classe di patogeni commensali opportunistici nel microbioma intestinale e sono stati associati ad una maggiore suscettibilità e gravità di CDI17,18,19,20. Tuttavia, si sa poco sui meccanismi molecolari delle interazioni tra questi patogeni. Per visualizzare la comunicazione di piccole molecole tra questi membri del microbioma intestinale, macrocolonie batteriche sono state coltivate qui su agar per simulare le interazioni microbi-microbi e la formazione di biofilm batterico in un ambiente controllato. Tuttavia, ottenere distribuzioni metaboliche rappresentative dopo l'analisi della spettrometria di massa di imaging MALDI di campioni di coltura batterica è difficile a causa dell'elevato contenuto di acqua e della topografia superficiale irregolare di questi campioni. Ciò è in gran parte causato dalla natura altamente idrofila dell'agar e dalla risposta superficiale non uniforme dell'agar durante la rimozione dell'umidità.
L'elevato contenuto di acqua dell'agar può anche rendere difficile ottenere un rivestimento omogeneo della matrice MALDI e può interferire con la successiva analisi MALDI eseguita nel vuoto21. Ad esempio, molte sorgenti MALDI operano a pressioni di 0,1-10 Torr, che è un vuoto sufficiente per rimuovere l'umidità dall'agar e può causare la deformazione del campione. Questi cambiamenti morfologici nell'agar indotti dall'ambiente sottovuoto causano gorgogliamento e fessurazioni nel materiale di agar essiccato. Questi artefatti riducono l'aderenza dell'agar al vetrino e possono causare lo smontaggio o lo sfaldamento del campione nel sistema di vuoto dello strumento. Lo spessore dei campioni di agar può arrivare fino a 5 mm dal vetrino, il che può creare un gioco insufficiente dall'ottica ionica all'interno dello strumento, causando contaminazione e/o danni all'ottica ionica dello strumento. Questi effetti cumulativi possono comportare riduzioni del segnale ionico che riflette la topografia superficiale, piuttosto che le interazioni biochimiche microbiche sottostanti. I campioni di agar devono essere essiccati in modo omogeneo e fortemente aderenti a un vetrino da microscopio prima dell'analisi sottovuoto.
Questo documento dimostra un flusso di lavoro di preparazione del campione per l'essiccazione controllata di macrocolonie di coltura batterica coltivate su terreni di agar. Questo processo di essiccazione più lento e in più fasi (rispetto a quelli precedentemente riportati) assicura che l'agar si disidrati uniformemente, riducendo al minimo gli effetti del gorgogliamento o della fessurazione dei campioni di agar montati su vetrini da microscopio. Utilizzando questo metodo di essiccazione graduale, i campioni sono fortemente aderenti al vetrino del microscopio e suscettibili per la successiva applicazione della matrice e l'analisi MALDI. Questo è esemplificato utilizzando colonie batteriche modello di C. difficile coltivate su modelli di tessuto agar e murino che ospitano CDI con e senza la presenza di patogeno commensale e opportunista, Enterococcus faecalis. Le analisi di spettrometria di massa di imaging MALDI di modelli batterici e tissutali consentono la mappatura spaziale dei profili dei metaboliti degli amminoacidi, fornendo nuove informazioni sul metabolismo e sulla comunicazione microbica bioenergetica.
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Protocol
NOTA: Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale pediatrico di Filadelfia e dalla Perelman School of Medicine dell'Università della Pennsylvania (protocolli IAC 18-001316 e 806279).
ATTENZIONE: Clostridium difficile (C. difficile) e Enterococcus faecalis (E. faecalis) sono patogeni BSLII e devono essere maneggiati con estrema cautela. Utilizzare protocolli di decontaminazione adeguati quando necessario.
1. Crescita di macrocolonie di coltura batterica e preparazione per la spedizione durante la notte
- Preparare colture di C. difficile ed E. faecalis durante la notte e coltivarle singolarmente a 37 °C in camera anaerobica (85% azoto, 10% idrogeno, 5% anidride carbonica) in brodo di infusione cerebrale-cuore integrato con 0,5% di estratto di lievito e 0,1% di l-cisteina (BHIS). Utilizzare l'1,5% di agar per tutti i campioni placcati.
- Normalizzare il terreno di coltura batterico alla densità ottica a 600 nm (OD600). Piastra 5 μL di ogni macrocolonia su piastre di agar BHIS + l-cisteina e crescere anaerobicamente per 7 giorni a 37 °C. Per le macrocolonie di specie miste, mescolare i terreni di coltura batterica in un rapporto 1: 1 prima della placcatura.
- Preparare vetrini da microscopio rivestiti di ossido di indio-stagno (ITO) utilizzando un ohmmetro per identificare il lato del vetrino con il rivestimento conduttivo. Utilizzare uno scriba con punta di diamante per incidere ed etichettare il lato rivestito di ITO del vetrino del microscopio.
- Estrarre l'intera coltura dalla piastra di crescita dell'agar e quindi montarla su un vetrino da microscopio rivestito con ITO, assicurandosi che le bolle d'aria non siano intrappolate tra l'agar e il vetrino.
NOTA: Il contenuto di acqua nel mezzo di agar dovrebbe consentire alla coltura di aderire naturalmente alla superficie del vetrino del microscopio. Un video che esemplifica questo processo è fornito nella documentazione supplementare di Yang et al.22. - Posizionare le colonie in scatole di vetrini per microscopio per protezione. Conservare le scatole di scorrimento in 8 in x 8 in sacchetti per il trasporto di campioni a rischio biologico con una manciata di pellet essiccanti e sigillare per la spedizione durante la notte per ulteriori lavorazioni e analisi.
NOTA: È importante mantenere un ambiente asciutto per le colture batteriche quando vengono spedite in condizioni ambientali per rallentare la crescita batterica e il metabolismo e mantenere la fissazione dei campioni batterici fino all'analisi. Questo metodo di spedizione è stato ottimizzato attraverso ampi esperimenti ed è preferito alla spedizione delle colonie congelate nel ghiaccio secco. I principali cambiamenti di temperatura prima dell'essiccazione tendono a causare lo smontaggio e il gorgogliamento sotto il campione di agar montato.
2. Essiccazione ad ambiente di macrocolonie batteriche di C. difficile + E. faecalis
- Rimuovere le colonie batteriche di agarosio montate su vetrini da microscopio rivestiti di ITO dal materiale di imballaggio. Porre i campioni in una scatola asciutta con essiccante per 48-72 ore a temperatura ambiente.
NOTA: Questo è un processo di essiccazione delicato e lento che riduce al minimo il gorgogliamento, la fessurazione o il distacco del mezzo di agar dalla superficie del vetrino del microscopio. - Smaltire correttamente tutto il materiale di imballaggio contaminato e decontaminare lo spazio di lavoro con un disinfettante battericida/sporicida appropriato.
- Ispezionare visivamente le colonie per rilevare eventuali deformazioni nella superficie dell'agar (ad esempio, gorgogliamento, fessurazione, smontaggio).
NOTA: L'altezza della superficie dell'agarosio dovrebbe diminuire visibilmente e giacere piatta su tutta la diapositiva.
3. Essiccazione sottovuoto e termomediata di macrocolonie batteriche C. difficile + E. faecalis
NOTA: È stato costruito un apparecchio di essiccazione sottovuoto costruito su misura (Figura 1) per facilitare la rimozione dell'umidità in eccesso dai campioni di agar. Questo apparecchio utilizza una pompa per vuoto rotativa a palette collegata in linea a un biofiltro HEPA, una trappola fredda e una camera in acciaio inossidabile, dove vengono posizionati i campioni batterici. Un trasformatore a tensione variabile è collegato a un filamento di filo isolato, che consente all'utente di riscaldare la camera per accelerare il processo di asciugatura.
- Chiudere la linea del vuoto nella camera di campionamento e accendere l'interruttore di alimentazione della pompa rotativa a palette per consentire alla pompa per vuoto di riscaldarsi e ottenere la corretta pressione del vuoto.
- Accendere il trasformatore a tensione variabile per riscaldare il filamento di filo avvolto attorno alla camera. Regolare l'alimentazione variabile fino a quando la temperatura interna della camera a vuoto raggiunge ~50 °C. Mentre la pompa si sta riscaldando, posizionare un impasto di ghiaccio secco e etanolo al 100% nel condensatore della trappola fredda.
NOTA: La trappola fredda condensa eventuali vapori o spore dal campione ed evita la contaminazione del sistema di pompe rotative a palette e dell'olio della pompa per vuoto. - Aprire la camera a vuoto utilizzando una chiave per allentare i morsetti a flangia a doppio artiglio da 16 mm. Inserire i campioni di agarosio nella camera e sigillare ermeticamente la camera con i morsetti a flangia a doppio artiglio da 16 mm.
- Aprire la valvola della pompa per evacuare la camera. Lasciare asciugare i campioni per 60-120 minuti (ad esempio, a ~150 mTorr).
NOTA: Questo tempo di asciugatura è sufficiente per rimuovere la maggior parte dell'umidità in piccole sezioni di agar. La determinazione empirica del tempo di asciugatura ottimale per la rimozione dell'umidità e la riduzione dell'altezza dell'agar può essere necessaria a seconda della configurazione individuale e dei campioni. Tempi di asciugatura sostanzialmente più lunghi possono far sì che l'agar essiccato diventi fragile e incline a screpolature. - Al termine, sfiatare lentamente la camera a vuoto a pressione ambiente chiudendo la valvola sulla pompa rotativa a palette e aprendo la valvola esterna all'aria ambiente. Aprire la camera utilizzando il protocollo precedentemente menzionato e rimuovere il campione di agarosio essiccato dalla camera.
- Conservare il campione in una scatola asciutta con essiccante fino all'applicazione della matrice.
NOTA: La figura 2 mostra le immagini della superficie dell'agar prima e dopo l'essiccazione.
4. Applicazione della matrice MALDI tramite spruzzatura robotizzata
NOTA: Dopo che i campioni di agarosio sono stati accuratamente essiccati e l'altezza delle sezioni di coltura è notevolmente diminuita, utilizzare uno spruzzatore a matrice robotica per applicare in modo omogeneo un rivestimento sottile di un composto chimico della matrice MALDI. Questa procedura deve essere eseguita in una cappa aspirante chimica e con adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, occhiali da laboratorio e un camice da laboratorio.
- Selezionare la matrice MALDI appropriata. Per seguire questo protocollo, utilizzare la matrice MALDI 1,5-diaminonaftalene (DAN) per il suo favorevole desorbimento e ionizzazione degli amminoacidi in modalità ioni negativi.
- Preparare 10 mL di una soluzione di matrice Dan Maldi da 10 mg/mL in acetonitrile/acqua 90/10 (v/v). Utilizzare solventi di grado HPLC, sonicare per 30 minuti e filtrare la soluzione attraverso filtri a siringa in nylon da 0,2 μm prima dell'introduzione alla pompa a siringa spruzzatrice robotizzata. Inoltre, preparare soluzioni di lavaggio per garantire che la linea dello spruzzatore sia pulita tra ogni utilizzo.
NOTA: Le soluzioni di lavaggio vengono scelte per aumentare la solubilità della matrice e di altri contaminanti nella linea dello spruzzatore e facilitarne la rimozione dal sistema. Le soluzioni di lavaggio qui utilizzate sono 90/10 (v/v) acetonitrile/acqua, 50/50 (v/v) acqua/metanolo, 99/1 (v/v) acetonitrile/acido acetico e 95/5 (v/v) acqua/idrossido di ammonio. - Attaccare il campione al vassoio dello spruzzatore e caricare le soluzioni preparate nella linea dello spruzzatore (Figura 3). Utilizzando il software del computer, specificare i parametri necessari per consentire un rivestimento uniforme del composto della matrice: temperatura dell'ugello 30 °C, otto passaggi, portata 0,1 mL/min, schema CC, tempo di asciugatura 0 s, 10 psi.
NOTA: È generalmente accettato che la maggior parte dei patogeni sarà inattivata mediante l'applicazione della matrice MALDI, che è tipicamente un piccolo acido organico o base. - Al termine della sequenza di spruzzatura, rimuovere il campione dal vassoio dello spruzzatore e conservarlo in un armadio di essiccazione fino all'analisi.
5. Preparazione di macrocolonie batteriche per l'acquisizione dei dati di spettrometria di massa di imaging MALDI
NOTA: Tutte le analisi di spettrometria di massa per immagini sono state eseguite utilizzando uno spettrometro di massa a risonanza di ciclotrone ionico a trasformata di Fourier (FTICR). Questo strumento è dotato di un sistema laser Nd:YAG MALDI (2 kHz, 355 nm).
- Inserire il campione rivestito di matrice nell'adattatore per vetrino per microscopio a piastre target MALDI e scrivere almeno tre marcatori fiduciali che racchiudono l'area del campione utilizzando marcatori permanenti (Figura 4). Utilizzare uno scanner piano per acquisire un'immagine ottica del vetrino del microscopio, compresi i marcatori fiduciali.
NOTA: I marcatori fiduciali consentiranno la registrazione dell'immagine ottica alla vista della telecamera MALDI osservata nello strumento. - Definire un metodo di strumento MS ottimizzato per l'intervallo di massa, la sensibilità e la risoluzione desiderati, che include la calibrazione di massa, le impostazioni del laser MALDI, i parametri dell'ottica ionica e le condizioni delle celle ICR. Per questo metodo, selezionare una finestra di massa di 100 Da da m/z 100 a 200 per l'arricchimento del segnale in fase gassosa in modalità ioni negativi utilizzando un approccio di accumulo continuo di ioni selezionati (CASI),23 che comprende i valori m/z dei metaboliti di interesse.
- Aprire il software di acquisizione immagini dello strumento e utilizzare la procedura guidata di configurazione per definire il nome e la posizione del file, il metodo di acquisizione MS, le regioni di interesse da campionare e la risoluzione spaziale dell'immagine.
NOTA: Risoluzioni spaziali di 100-300 μm sono tipicamente impiegate per l'imaging di macrocolonie batteriche. - Una volta definiti tutti i parametri, avviare la sequenza di acquisizione per acquisire in serie uno spettro di massa in ogni pixel attraverso le regioni definite di interesse.
NOTA: il tempo di acquisizione delle immagini dipende dalle impostazioni dello strumento, ma in genere varia da 2 a 6 ore per le immagini contenenti 5.000-10.000 pixel.
6. Analisi dei dati di spettrometria di massa per immagini e identificazione dei composti
- Dopo l'acquisizione delle immagini, salvare i dati con un'estensione di file ".mis", che è un formato di file specifico del fornitore per le piattaforme di spettrometria di massa di imaging. Aprire il file di dati in pacchetti software flexImaging o SCiLS o esportare in un formato di dati non proprietario come .mzml e visualizzarlo utilizzando software indipendente dal fornitore (ad esempio, Cardinal24 o MSIreader25,26).
NOTA: all'apertura dei dati di imaging in flexImaging viene visualizzato uno spettro di massa medio, che rappresenta le intensità medie di tutti gli ioni rilevati nelle regioni campionate. I picchi di interesse possono essere identificati provvisoriamente sulla base di misurazioni accurate della massa. Tipicamente, precisioni di massa superiori a 5 parti per milione (ppm) sono sufficienti per l'identificazione dei metaboliti sugli spettrometri di massa FTICR. - Utilizzando il software di riferimento, definire finestre di massa per i picchi di interesse per generare mappe di calore a falsi colori delle distribuzioni ioniche attraverso le regioni campionate.
- Sulla visualizzazione media dello spettro di massa, ingrandire il picco di interesse e selezionare una finestra di massa appropriata che comprenda l'area del profilo del picco.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra di massa evidenziata e selezionare Aggiungi filtro di massa .... Etichettare il valore m /z selezionato utilizzando l'identificazione provvisoria per il metabolita sospetto come determinato dalla misurazione accurata della massa ad alta risoluzione.
- Selezionare la soglia di intensità per regolare la gamma dinamica dell'immagine dell'analita visualizzata dalla mappa termica a falsi colori. Regolare ulteriormente i parametri di filtraggio di massa in modo che la finestra di massa comprenda l'area del profilo di picco, quindi aggiungere il filtro di massa.
NOTA: la normalizzazione dell'intensità può essere eseguita in modo appropriato per migliorare la quantificazione relativa tra le regioni misurate. Gli esperimenti qui riportati hanno utilizzato l'acquisizione dei dati CASI (vide infra), che può rendere imprecisi i metodi di normalizzazione del conteggio totale degli ioni (TIC) e del quadrato medio della radice (RMS). Pertanto, tutte le immagini ioniche mostrate nel presente documento vengono visualizzate senza normalizzazione.
7. Preparazione e spedizione di tessuti cecali di topo non infetti e infetti da C. difficile
- Innoculare topi maschi C57BL/6 di 4-8 settimane con antibiotici (0,5 mg/ml di cefoperazone o 0,5 mg/ml di cefoperazone + 1 mg/ml di vancomicina) in acqua potabile ad libitum per 5 giorni, seguiti da un periodo di recupero di 2 giorni e successiva infezione.
- Eutanasia gli animali mediante asfissia CO2 e raccogliere immediatamente l'organo cieco del topo. Incorporare in una miscela al 20% di composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) in acqua distillata.
- Posizionare i campioni su ghiaccio secco e quindi imballare e spedire per l'analisi; conservare a -80 °C fino all'analisi.
8. Criosezionamento di tessuti cecali di topo non infetti da C. difficile
- Pulire tutte le apparecchiature di criosezione risciacquando con etanolo al 100% e lasciare asciugare prima di posizionare i campioni nella camera del criostato. Preparare vetrini da microscopio rivestiti con ITO utilizzando un ohmmetro per identificare il lato del vetrino con il rivestimento conduttivo. Utilizzare uno scriba con punta di diamante per incidere ed etichettare il lato rivestito di ITO del vetrino del microscopio.
NOTA: È necessario indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, inclusi guanti, occhiali da laboratorio, un camice da laboratorio e maniche di criostato. - Eseguire la criosezione su un criomicrotomo di ricerca. Trasferire i tessuti ceca di topo incorporati in OCT da un congelatore a -80 °C alla camera di criomicrotomo (temperatura della camera di 30 °C, temperatura dell'oggetto di -28 °C) su ghiaccio secco. Montare i campioni di tessuto da confrontare utilizzando la spettrometria di massa di imaging (ad esempio, controllo non infetto vs. C. difficile-infetto) sullo stesso vetrino da microscopio per garantire una preparazione identica del campione di entrambi i tipi di tessuto e consentire confronti accurati dei metaboliti.
- All'interno della camera di criomicrotomo, montare il tessuto incorporato in OCT su un mandrino campione utilizzando una soluzione OCT aggiuntiva. Dopo che la soluzione OCT si è solidificata, fissare il mandrino alla testa del campione. Iniziare la criosezione con incrementi di 10-50 μm per raggiungere la profondità / piano tissutale desiderato dell'organo.
- Una volta raggiunta una sezione trasversale ottimale del tessuto, iniziare a raccogliere sezioni a 12 μm di spessore. Manipolare delicatamente la fetta usando pennelli artistici e posizionarla su un vetrino da microscopio rivestito in teflon.
- Arrotolare il vetrino del microscopio rivestito ITO sulla parte superiore della sezione di tessuto per prelevare il tessuto dal vetrino rivestito in teflon. Scongelare la sezione di tessuto sul vetrino del microscopio premendo il palmo sul retro del vetrino rivestito di ITO. Continuare a scongelare il supporto fino a quando la sezione del tessuto passa da una texture traslucida a una opaca/opaca.
- Trasferire i vetrini del microscopio montati su ghiaccio secco in una scatola asciutta con essiccante per la conservazione per l'analisi in giornata, o conservare a -80 °C per la conservazione a lungo termine.
9. Preparazione di tessuti cecali di topo non infetti rispetto a quelli infettati da C. difficile per l'applicazione di matrici e spettrometria di massa con imaging MALDI
- Eseguire l'applicazione della matrice MALDI utilizzando lo stesso protocollo descritto al punto 4 (temperatura ugello 30 ° C, otto passaggi, portata 0,1 ml / min, schema CC, tempo di asciugatura 0 s, 10 psi).
- Eseguire la spettrometria di massa per imaging MALDI utilizzando gli stessi protocolli descritti nei passaggi 5 e 6.
- Analizza le immagini ioniche da più repliche biologiche e confronta i risultati per la significatività tramite confronti di grafici a scatola di intensità utilizzando il software statistico SCiLS di cui sopra.
NOTA: I test statistici e i confronti appropriati dipenderanno dall'applicazione e possono includere segmentazione spaziale, modelli di classificazione e analisi comparativa per determinare le caratteristiche spettrali discriminative e correlate. Le analisi comparative possono includere l'assegnazione di valori p a caratteristiche significative, la generazione di analisi delle componenti principali per i confronti dei tessuti e la visualizzazione di grafici a scatola per identificare le variazioni. È anche utile visualizzare il tessuto utilizzando la microscopia a campo chiaro della sezione di tessuto colorata tramite ematossilina ed eosina (H & E) dopo spettrometria di massa di imaging. Ciò consente una chiara identificazione delle caratteristiche morfologiche nel tessuto e può essere analizzato in consultazione con un patologo qualificato.
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Representative Results
Abbiamo eseguito la spettrometria di massa con imaging MALDI di colonie batteriche modello e topi co-colonizzati con E. faecalis e C. difficile per studiare il ruolo degli amminoacidi nelle interazioni microbo-microbo. Le macrocolonie batteriche coltivate su agar fungono da modello ben definito per analizzare i cambiamenti biochimici distinti nella formazione del biofilm batterico. È importante garantire un processo di essiccazione controllato per le macrocolonie di coltura batterica coltivate su terreni di agar per ridurre al minimo le deformazioni e le fessurazioni nella superficie dell'agar. Ciò è stato ottenuto attraverso un processo in due fasi, che prevede l'essiccazione preliminare con essiccante a temperatura e pressione ambiente, seguita da una fase di essiccazione assistita da vuoto più rapida eseguita a temperatura elevata. È stato utilizzato un apparecchio di essiccazione costruito su misura per facilitare la disidratazione dell'agar durante la cattura del rilascio di eventuali contaminanti batterici o spore dai campioni (Figura 1). La fase aggiuntiva di essiccazione sottovuoto è necessaria per garantire che i campioni siano completamente disidratati e non subiscano deformazioni in caso di esposizione al vuoto della SM.
Le sezioni di agar erano inizialmente di 2-4 mm di altezza del campione (Figura 2A) e sono state ridotte a ~ 0,5 mm di altezza seguendo il protocollo di essiccazione (Figura 2B). È importante garantire un'asciugatura uniforme sulla superficie del campione durante questo protocollo di preparazione del campione. Grandi variazioni nell'altezza del campione si tradurranno in un raggio laser MALDI defocalizzato sulla superficie del campione, che può influire negativamente sull'efficienza di ionizzazione e sulla conseguente intensità dello ione analita. Un esempio di processo di essiccazione non riuscito è mostrato nella Figura 2D, dove la superficie dell'agar è ribollente e fessurata, rendendo il campione inutilizzabile per ulteriori analisi. Una volta che il campione batterico è stato accuratamente asciugato, viene applicato uno strato di matrice DAN MALDI utilizzando uno spruzzatore robotico (Figura 3). Questo strumento consente il controllo preciso dei parametri di spruzzatura, consentendo l'applicazione di un rivestimento a matrice uniforme (Figura 2C).
Dopo l'applicazione della matrice, i vetrini del microscopio contenenti i campioni vengono inseriti in un adattatore per vetrini per l'analisi su un FTICR MS (Figura 4). Le coordinate sul vetrino vengono registrate tra il software di acquisizione della spettrometria di massa per immagini e la fotocamera dello strumento disegnando prima segni fiduciali sulla diapositiva attorno alle regioni da misurare (indicate con i simboli "+" nella Figura 4). Il vetrino viene quindi scansionato digitalmente utilizzando uno scanner piano per registrare un'immagine ottica, che viene quindi utilizzata per definire la sequenza di acquisizione nel software flexImaging. Abbiamo ottimizzato le impostazioni dello strumento di spettrometria di massa per la trasmissione e la rilevazione di anioni metaboliti. Utilizzando l'arricchimento ionico in fase gassosa CASI, è stata definita una finestra di isolamento ionico per accumulare selettivamente ioni a m/z 150 ± 50 Da (Figura 5A), che contiene una serie di composti osservati dalla superficie del tessuto. In particolare qui per l'infezione da C. difficile, abbiamo trovato percorsi di aminoacidi per dimostrare ruoli interessanti e mutevoli durante il catabolismo batterico. Sulla base di accurate misurazioni di massa, i segnali ionici sono stati identificati a m / z 131,083 e m / z 173,104 come ornitina (errore di massa 0,34 ppm; Figura 5B) e arginina (errore di massa di 0,43 ppm; Figura 5C), rispettivamente.
La spettrometria di massa di imaging di macrocolonie batteriche è stata eseguita su monocolture di C. difficile e su colonie di co-coltura di C. difficile + E. faecalis (Figura 6). Un'immagine ottica dei campioni dopo l'applicazione della matrice MALDI evidenzia le regioni di acquisizione di interesse, che si estendono alle aree esterne dei biofilm di colonia (Figura 6A,C). La spettrometria di massa di imaging di questi campioni consente la mappatura spaziale dei metaboliti dell'amminoacido sia dell'ornitina che dell'arginina, che risultano alterati e localizzati in modo differenziale in presenza di E. faecalis (Figura 6B,D). Ad esempio, l'arginina è significativamente più abbondante nella monocoltura di C. difficile rispetto alla co-coltura C. difficile + E. faecalis (Figura 6D). Abbiamo anche esteso le analisi di spettrometria di massa di imaging a modelli murini di infezione utilizzando topi femmina C57BL / 6 privi di germi di 8 settimane che sono stati infettati con spore di C. difficile, entrambe le spore di C. difficile + cellule di E. faecalis (wt) (5 × 10 8 / mL), o un mutante trasposone contenente entrambe le spore di C. difficile + cellule di E. faecalis (mutante ArcD) (5 × 108 / ml) (Figura 7) 27 . Il cieco di topo è stato raccolto e congelato in composto OCT al 25% per mantenere la forma e la fedeltà dell'organo. Il composto OCT ha anche contribuito a sostenere le sezioni di tessuto sottile durante la criosezione. Analogamente al protocollo sopra menzionato, le sezioni di tessuto sono rivestite con uno strato di matrice DAN MALDI, scansionato utilizzando uno scanner ottico piano (Figura 7B) e analizzato mediante spettrometria di massa di imaging MALDI (Figura 7C). La colorazione istologica è stata eseguita su sezioni di tessuto dopo l'analisi della spettrometria di massa per immagini ed è stata impiegata una scansione ottica a campo chiaro ad alta risoluzione per valutare la morfologia del tessuto (Figura 7A). Lo strato di cellule epiteliali è chiaramente infiammato durante l'infezione rispetto al tessuto di controllo.
Figura 1: Apparecchi di essiccazione sottovuoto costruiti in casa. Un apparecchio di essiccazione sottovuoto costruito su misura viene utilizzato per accelerare la rimozione dell'umidità dai campioni di agar. I campioni vengono inseriti nella camera a vuoto, che viene sigillata ed evacuata utilizzando una pompa rotativa a palette, quindi riscaldata utilizzando un trasformatore a tensione variabile. Eventuali vapori/spore contaminanti dal campione vengono intrappolati nella trappola fredda e nei filtri in linea HEPA. Pressioni di 100-150 mTorr sono tipicamente impiegate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Essiccazione e preparazione delle macrocolonie batteriche. Immagini ottiche di campioni di agar (A) prima e (B) dopo la rimozione dell'umidità mediante essiccazione ed essiccazione assistita da vuoto. (C) Una matrice MALDI di 1,5-diamminonaftalene viene applicata alla cocoltura batterica dopo l'essiccazione mediante uno spruzzatore robotizzato. (D) L'essiccazione infruttuosa provoca tipicamente fessurazioni e gorgogliamenti all'interno dell'agar, rendendolo inutilizzabile per ulteriori analisi. Abbreviazioni: DAN = 1,5-diaminonaftalene; MALDI = desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Irrorazione robotizzata della matrice MALDI su campioni di agarosio. Immagini di (A) uno spruzzatore HTX M5 TM e (B) campioni di agarosio caricati nello spruzzatore a matrice robotica per l'applicazione della matrice MALDI. Abbreviazione: MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Adattatore per spettrometro di massa con campioni caricati per l'analisi. I campioni di agarosio rivestiti di matrice vengono caricati in un adattatore per vetrini MTP per l'analisi MALDI. I marcatori fiduciali sono visibili come segni più neri ("+"). Abbreviazione: MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Spettri di massa rappresentativi dei picchi ionici dei metaboliti identificati. (A) Modalità ioni negativi L'analisi MALDI di campioni di coltura batterica consente di rilevare decine di metaboliti. Misurazioni di massa accurate ad alta risoluzione consentono l'identificazione provvisoria di (B) ornitina a m / z 131,083 (errore di massa 0,34 ppm) e (C) arginina a m / z 173,104 (errore di massa 0,43 ppm). Gli spettri di massa vengono acquisiti utilizzando un potere di risoluzione di massa (FWHM) di 75.000 a m/z 150. Abbreviazioni: MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization; FWHM = larghezza intera a metà massimo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Analisi di spettrometria di massa di macrocolonie batteriche. (A,C) Le immagini ottiche dei campioni di agarosio mostrano le regioni di misurazione per l'analisi della spettrometria di massa per immagini, evidenziate da linee tratteggiate bianche. (B,D) Le immagini ioniche MALDI per ornitina (m/z 131.083, 0.038 ppm) e arginina (m/z 173.104, 0.60 ppm) mostrano distribuzioni spaziali uniche tra le colture batteriche. Si noti che le scale di intensità assoluta sono diverse per le immagini ioniche di co-coltura mostrate nei pannelli B e D. Ad esempio, l'arginina è significativamente più abbondante nella monocoltura di C. difficile rispetto alla co-coltura nei pannelli C e D, il che significa che questa scala di intensità è relativa all'abbondanza di arginina nella monocoltura, e sembra che non ci sia arginina presente in questa co-coltura. Al contrario, la co-coltura in A e B proietta l'intensità dell'arginina su una scala di intensità assoluta inferiore, poiché questo è l'unico campione nell'immagine. Abbreviazioni: MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization; CASI = accumulo continuo di ioni selezionati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Analisi di spettrometria di massa per immagini di tessuti cecali murini infetti. (A) Le immagini al microscopio in campo chiaro di tessuti colorati con ematossilina ed eosina da ceca di topo infetto consentono la visualizzazione della morfologia del tessuto. (B) Le immagini ottiche dei tessuti ceca del topo mostrano i campioni dopo l'applicazione di uno strato di matrice DAN MALDI. (C) Le immagini di ioni MALDI per ornitina (m/z 131,083, 0,88 ppm) e arginina (m/z 173,104, 0,15 ppm) mostrano distribuzioni spaziali uniche tra i campioni di tessuto. Abbreviazioni: MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization; DAN = 1,5-diaminonaftalene. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Durante la spettrometria di massa per imaging MALDI, è importante disporre di una superficie piana del campione per fornire un diametro focale costante del laser MALDI incidente sul substrato del campione. Le deviazioni nell'altezza del campione possono causare lo spostamento del raggio laser MALDI fuori fuoco, causando alterazioni del diametro e dell'intensità del fascio, che possono influire sull'efficienza della ionizzazione MALDI. Queste alterazioni nell'efficienza di ionizzazione possono provocare differenze nell'intensità dell'analita attraverso la superficie del tessuto che non riflettono la biochimica del tessuto sottostante, ma riflettono invece la topografia superficiale. Inoltre, la maggior parte delle sorgenti di ionizzazione MALDI operano a pressioni sub-atmosferiche e i campioni di agar idratato sono campioni fragili se sottoposti a condizioni di vuoto . Il vuoto di queste fonti può causare disidratazione dei campioni di agarosio, che può alterare la superficie del campione durante l'essiccazione. I campioni contenenti sacche d'aria o grandi quantità di acqua sono altamente suscettibili a questi cambiamenti. Questo problema si riscontra comunemente durante l'analisi della spettrometria di massa di imaging MALDI di campioni batterici cresciuti su agar. L'agar nutriente ha un alto contenuto di acqua per facilitare la crescita batterica; tuttavia, è essenziale rimuovere quanta più umidità possibile prima di applicare un rivestimento a matrice MALDI e introdurre il campione nel vuoto dello spettrometro di massa.
I campioni di agar idratati non sono quindi favorevoli per l'analisi sotto vuoto . Oltre ai cambiamenti morfologici indotti da condizioni di vuoto , esistono anche potenziali problemi con le altezze del campione che sporgono troppo dall'adattatore per vetrini a piastra target MALDI, che viene utilizzato per contenere il campione montato su vetrino del microscopio e portarlo nella posizione corretta per il punto focale del laser MALDI. Il meccanismo dello stadio MALDI è strettamente dedotto con altri componenti meccanici dello stadio e, mentre è in posizione, c'è uno spazio di pochi millimetri tra la superficie della piastra bersaglio del campione e l'estremità anteriore dell'ottica della sorgente ionica. Ciò può causare lo scraping del campione, che può spostare o smontare completamente il campione da analizzare. Inoltre, mentre i campioni di agar idratati aderiscono naturalmente alla superficie di un vetrino da microscopio, questo tende ad essere molto più debole dell'aderenza di un campione di agar completamente essiccato. Pertanto, i campioni di agar idratato sporgono ulteriormente dalla superficie della piastra bersaglio del campione e hanno un'aderenza più debole, il che causa un rischio maggiore di smontaggio e sfaldamento del campione nell'ottica ionica dello strumento a valle.
L'identità della matrice MALDI e la selezione del metodo di applicazione sono anche variabili importanti da considerare in un esperimento di spettrometria di massa per immagini. La selezione di una matrice organica MALDI dipende in gran parte dal substrato del campione e dai composti bersaglio di interesse. Ad esempio, molti metaboliti a basso peso molecolare (MW < 300 Da) sono costituiti da molti acidi organici, fosfati e altre partecipazioni, che sono più facilmente ionizzati nella polarità negativa28. Per l'analisi in modo negativo, sono preferite matrici di base, in modo tale che le loro strutture chimiche siano più suscettibili di accettare un protone (ad esempio, 9-amminoacridina, 1,5-diaminonaftalene), lasciando quindi una carica negativa su molti ioni di piccoli metaboliti di interesse. Abbiamo eseguito uno screening della matrice per gli analiti mirati di interesse e abbiamo scoperto che la matrice 1,5-diaminonapthalene (DAN) produceva il segnale più alto per i metaboliti aminoacidici di interesse per i campioni di tessuto di controllo. Durante l'applicazione della matrice MALDI, gli analiti di interesse vengono estratti dal substrato del campione e co-cristallizzati con la matrice MALDI. In alcuni casi, le condizioni di applicazione della matrice "più umida" faciliteranno una maggiore estrazione e co-cristallizzazione, con conseguente miglioramento della rilevazione dell'analita dopo l'analisi MALDI. Tuttavia, se il processo di applicazione della matrice utilizza troppo solvente, gli analiti possono essere delocalizzati all'interno del tessuto. È importante trovare un equilibrio tra un'efficace estrazione dell'analita e il mantenimento della fedeltà spaziale degli analiti nel tessuto quando si selezionano le condizioni per l'applicazione della matrice. Ad esempio, un apparato di sublimazione costruito su misura può essere utilizzato per applicare uno strato di matrice omogenea alle superfici campione e produce cristalli di matrice estremamente piccoli di dimensioni 29,30. Tuttavia, questo processo è piuttosto secco e potrebbe non essere ottimale per l'estrazione dell'analita31. Lo spruzzatore robotizzato qui utilizzato fornisce un controllo riproducibile e preciso della pressione di spruzzatura, della portata, della temperatura dell'ugello e di altri parametri che possono consentire metodi ottimizzati di estrazione dell'analita e co-cristallizzazione della matrice32.
I parametri strumentali sul FTICR MS qui utilizzati sono stati ottimizzati per la trasmissione e la rilevazione di ioni metaboliti in modalità ioni negativi. Ciò include la regolazione di elementi RF e DC nella regione di trasferimento ionico per trasmettere preferenzialmente ioni di basso peso molecolare (<m / z 200). I parametri che hanno un grande effetto sulla trasmissione ionica includono l'ampiezza RF dell'imbuto (65 V), l'impostazione della massa Q1 per l'isolamento ionico del filtro di massa quadrupolare (m / z 150) e il ritardo del tempo di volo tra la cella di accumulo dell'esapolo e la cella ICR (0,400 ms). Questi valori dei parametri selezionati trasmettono in modo più efficiente ioni con valori m/z bassi a scapito delle efficienze di trasmissione di ioni con valori m/z più grandi. Inoltre, abbiamo utilizzato un approccio di accumulo continuo di ioni selezionati (CASI), che consente l'arricchimento selettivo di ioni in una finestra di massa definita di interesse. In questo approccio, il filtro di massa quadrupolo viene utilizzato per trasmettere selettivamente un piccolo intervallo di valori m / z dalla sorgente di ionizzazione alla cella di accumulo dell'esapolo nello strumento, mentre gli ioni con valori m / z al di fuori di questa finestra di massa hanno traiettorie ioniche instabili e non vengono trasmessi attraverso il filtro di massa quadrupolo. Ciò consente l'arricchimento selettivo di analiti di scarsamente abbondanza di interesse per migliorare il limite di rivelazione e la gamma dinamica fino a tre ordini di grandezza attraverso l'eliminazione del rumore chimico. L'elevato potere di risoluzione della massa e la precisione di massa della piattaforma strumentale FTICR consentono la facile separazione dei composti isobarici (cioè la stessa massa nominale) e l'identificazione provvisoria dei metaboliti.
Un controllo attento e riproducibile della preparazione del campione, dell'applicazione della matrice MALDI e delle analisi di spettrometria di massa per immagini può consentire viste riproducibili della biochimica batterica nelle colonie e nei campioni di tessuto. Le macrocolonie batteriche servono come modelli semplificati per caratterizzare la comunicazione incrociata metabolica dei patogeni durante l'infezione microbica, che può quindi essere confrontata con sistemi più complessi come i tessuti animali. Ad esempio, l'arginina è risultata essere poco abbondante nel campione di co-coltura C. difficile + E. faecalis rispetto alla sola coltura di C. difficile (Figura 6), che è supportata dalla nota capacità di E. faecalis di consumare arginina come fonte di energia ed esportare ornitina dalla cellula attraverso l'antiporter ArcD33. I risultati della macrocolonia hanno portato allo studio di questa regolazione degli amminoacidi in un modello animale. I topi infettati da C. difficile + E. faecalis (wt) hanno mostrato significativamente meno arginina rispetto ai topi infettati da C. difficile da solo (Figura 7C), ricapitolando i risultati dell'immagine della colonia.
Per verificare l'ipotesi del metabolismo dell'arginina e il coinvolgimento dell'antiportatore ArcD, abbiamo utilizzato un mutante trasposone che mette fuori uso il trasporto del metabolita attraverso l'antiporter ArcD di E. faecalis. I topi infettati da C. difficile + E. faecalis (arcD::Tn) mostrano un aumento nella rilevazione di arginina e una diminuzione della rilevazione di ornitina rispetto al modello di co-infezione wild-type (Figura 7C) e generalmente salvano i livelli originali di aminoacidi osservati nel modello di infezione da C. difficile da solo (Figura 7A). Questa relazione inversa della regolazione dei metaboliti corrobora i risultati che E. faecalis si nutre di nutrienti aminoacidici prodotti da C. difficile. Inoltre, l'analisi istologica ha mostrato un esteso danno cellulare da topi infettati sia da C. difficile che da E. faecalis, che si osserva principalmente nel ceppo wild-type di E. faecalis opposto al mutante del trasposone ArcD. Questi risultati supportano le nostre recenti scoperte che l'arginina e l'ornitina sono fondamentali per la virulenza di C. difficile, il comportamento e
Fitness27. Nel complesso, questo flusso di lavoro dimostra un metodo efficace per preparare macrocolonie batteriche a base di agar per la spettrometria di massa di imaging MALDI e dimostra che questi sistemi possono servire come modelli utili per esaminare la cooperazione microbica durante l'infezione.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) con il premio GM138660. J.T.S. è stato sostenuto dalla Charles and Monica Burkett Family Summer Fellowship dell'Università della Florida. J.P.Z. è stato supportato dalle sovvenzioni NIH K22AI7220 (NIAID) e R35GM138369 (NIGMS). A.B.S. è stato supportato dal Cell and Molecular Biology Training Grant presso l'Università della Pennsylvania (T32GM07229).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm Titan3 nylon syringe filters | Thermo Scientific | 42225-NN | |
| 1,5-diaminonaphthalene MALDI matrix | Sigma Aldrich | 2243-62-1 | |
| 20 mL Henke Ject luer lock syringes | Henke Sass Wolf | 4200.000V0 | |
| 275i series convection vacuum gauge | Kurt J. Lesker company | KJL275807LL | |
| 7T solariX FTICR mass spectrometer equipped with a Smartbeam II Nd:YAG MALDI laser system (2 kHz, 355 nm) | Bruker Daltonics | ||
| Acetic acid solution, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 64-19-7 | |
| Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 75-05-8 | |
| Ammonium hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metals basis | Sigma Aldrich | 1336-21-6 | |
| Autoclavable biohazard bags: 55 gal | Grainger | 45TV10 | |
| Biohazard specimen transport bags (8 x 8 in.) | Fisher Scientific | 01-800-07 | |
| Brain heart infusion broth | BD Biosciences | 90003-040 | |
| C57BL/6 male mice | Jackson Laboratories | ||
| CanoScan 9000F Mark II photo and document scanner | Canon | ||
| CM 3050S research cryomicrotome | Leica Biosystems | ||
| Desiccator cabinet | Sigma Aldrich | Z268135 | |
| Diamond tip scriber, Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific | 50-254-51 | |
| Drierite desiccant pellets | Drierite | 21005 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
| flexImaging software | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl software | Bruker Daltonics | ||
| Glass vacuum trap | Sigma Aldrich | Z549460 | |
| HTX M5 TM robotic sprayer | HTX Technologies | ||
| Indium Tin Oxide (ITO)-coated microscope slides | Delta Technologies | CG-81IN-S115 | |
| In-line HEPA filter to vacuum pump | LABCONCO | 7386500 | |
| Methanol, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| MTP slide-adapter II | Bruker Daltonics | 235380 | |
| Optimal cutting temperature (OCT) compound | Fischer Scientific | 23-730-571 | |
| Peridox RTU Sporicide, Disinfectant and Cleaner | CONTEC | CR85335 | |
| PTFE (Teflon) printed slides, Electron Microscopy Sciences | VWR | 100488-874 | |
| Rotary vane vacuum pump RV8 | Edwards | A65401903 | |
| Tissue-Tek Accu-Edge Disposable High Profile Microtome Blades | Electron Microscopy Sciences | 63068-HP | |
| Transparent vacuum tubing | Cole Palmer | EW-06414-30 | |
| Ultragrade 19 vacuum pump oil | Edwards | H11025011 | |
| Variable voltage transformer | Powerstat | ||
| Water, suitable for HPLC | Sigma Aldrich | 7732-18-5 | |
| Wide-mouth dewar flask | Sigma Aldrich | Z120790 |
References
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