Summary
O presente artigo descreve uma técnica modificada para transplante cardíaco vascularizado heterotópico com técnica asséptica atualizada, analgesia e anestesia.
Abstract
O desenvolvimento de modelos experimentais de transplante cardíaco em animais tem contribuído para muitos avanços nos campos da imunologia e do transplante de órgãos sólidos. Embora o modelo de transplante cardíaco murino vascularizado heterotópico tenha sido inicialmente utilizado em estudos de rejeição de enxertos usando combinações de linhagens de camundongos incompatíveis, o acesso a cepas geneticamente modificadas e modalidades terapêuticas pode fornecer novos e poderosos insights pré-clínicos. Fundamentalmente, a metodologia cirúrgica dessa técnica não mudou desde o seu desenvolvimento, especialmente no que diz respeito a fatores importantes como técnica asséptica, anestesia e analgesia, que causam impactos materiais na morbimortalidade pós-cirúrgica. Além disso, espera-se que melhorias no manejo perioperatório proporcionem melhorias tanto no bem-estar animal quanto nos resultados experimentais. Este artigo relata um protocolo desenvolvido em colaboração com um especialista no assunto em anestesia veterinária e descreve a técnica cirúrgica com ênfase no manejo perioperatório. Além disso, discutimos as implicações desses refinamentos e fornecemos detalhes sobre a solução de problemas de etapas cirúrgicas críticas para esse procedimento.
Introduction
Devemos muito de nossa compreensão de imunologia e transplante à pesquisa baseada em modelos experimentais de transplante de órgãos sólidos usando cobaias animais. Desde a primeira descrição do transplante cardíaco vascularizado emmamíferos1, tais modelos têm contribuído para o conhecimento em amplos domínios, incluindo a aplicação terapêutica da hipotermia2, os benefícios do uso de suturas especializadas3 e técnicas para homotransplantes totais de pulmão e coração4. O desenvolvimento de modelos de transplante cardíaco emratos5,6 proporcionou maior escopo para experimentação imunológica devido à disponibilidade de diferentes linhagens. A gama substancialmente maior de linhagens de camundongos endogâmicas e mutantes disponíveis levou Corry et al.7 a desenvolver uma técnica de transplante cardíaco heterotópico murino devido às consideráveis vantagens que essa faixa traz para a pesquisa em transplantes. Esse modelo tem sido amplamente utilizado e tem contribuído para um maior entendimento da rejeição do enxerto8 e da terapêutica9. Desde sua primeira descrição, entretanto, a técnica permaneceu praticamente inalterada, além de alguns pequenos detalhes técnicos, como ajustes na posição dos sítios anastomóticos10,11.
Desde a integração da técnica de Corry et al.7 em nossos experimentos, identificamos áreas promissoras para o aprimoramento do protocolo, a saber, técnicas assépticas, anestesia e analgesia. Esperava-se que as melhorias nessas áreas oferecessem um impacto positivo nos resultados experimentais e melhorassem o bem-estar animal. Isso já foi demonstrado quando a técnica asséptica é utilizada em cirurgias de pequenos animais, pois auxilia na redução de infecções pós-operatórias12, o que não só impacta na morbidade e mortalidade, mas também pode comprometer experimentos desenhados para avaliar a resposta imune após a cirurgia de transplante. Do ponto de vista anestésico e analgésico, o uso de um regime refinado ajuda a reduzir o custo para os animais e equilibrar o argumento ético desse modelo cirúrgico, atenuando a dor e o sofrimento dos sujeitos experimentais. Além disso, a anestesia e a analgesia adequadas limitam a resposta ao estresse associada à dor, melhorando a qualidade da recuperação pós-operatória e, finalmente, aumentando a taxa de sucesso cirúrgico13.
Com o objetivo de melhorar o bem-estar animal e os resultados experimentais, um protocolo foi desenvolvido com ajustes para preencher essas lacunas. Este protocolo foi adaptado daquele originalmente descrito por Corry et al.7 com consulta de um anestesista veterinário e com a devida consideração tanto dos efeitos quanto da duração dos efeitos das intervenções farmacológicas utilizadas no regime anestésico e analgésico. A abordagem baseou-se nos princípios da anestesia balanceada e da analgesia multimodal para garantir cuidados perioperatórios adequados14. Além da aplicação da técnica asséptica, o opioide buprenorfina e o anestésico local bupivacaína foram administrados preventivamente. A anestesia geral foi realizada com o anestésico inalatório isoflurano.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Esta pesquisa foi realizada de acordo com o Código de Práticas para o Cuidado e Uso de Animais para FinsCientíficos15 e aprovada sob os Protocolos de Ética Animal RA/3/100/1568 e AE173 (The University of Western Australia Animal Ethics Committee e The Harry Perkins Institute of Medical Research Animal Ethics Committee, respectivamente). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, instrumentos e animais usados neste protocolo.
1. Preparo do animal para a cirurgia
NOTA: O pessoal é dedicado à função de realizar a cirurgia ou monitorar a anestesia durante todo o procedimento.
- Para analgesia pré-operatória, administrar uma dose de buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg, diluída a 0,03 mg/mL com cloreto de sódio a 0,9%) por via subcutânea no camundongo receptor pelo menos 1 h antes do início da cirurgia receptora. Insira todos os detalhes relacionados à administração de medicamentos, sua dose, o horário de administração e seus efeitos no registro anestésico.
OBS: Esta abordagem não é necessariamente necessária para o doador, pois é uma cirurgia não recuperativa, onde o doador é sacrificado sob anestesia geral imediatamente após a retirada do órgão. - Indução anestésica
- Coloque o camundongo na câmara de indução do sistema respiratório anestésico com um fluxo de oxigênio de 1-2 L·min−1 com isoflurano a 4%. Confirme a anestesia adequada observando decúbito, perda do reflexo de retificação e diminuição da frequência respiratória.
- Uma vez adequadamente anestesiado, remova o camundongo da câmara de indução e raspe o abdome ventral usando cortadores para remover os pelos. No caso do doador, raspar a área que se estende da genitália até a margem superior do tórax ventral. No caso do receptor, raspar a área que se estende da genitália até o rebordo costal. Em ambos os casos, garantir que a área raspada atinja lateralmente a linha axilar média.
- Para manter a anestesia, posicione o camundongo em decúbito dorsal para receber anestésico e oxigênio do cone nasal do sistema respiratório (sem reinalação), que fornece oxigênio a uma taxa de 1 L·min−1 e isoflurano (1,5%-2,5%).
NOTA: A superfície de trabalho cirúrgico é uma placa cirúrgica sobre uma almofada de aquecimento, e cada membro do mouse é fixado usando fita de micropore. - Dada a dificuldade em monitorar de forma abrangente as alterações fisiológicas associadas à anestesia em camundongos, monitorar e registrar parâmetros limitados. Monitore a temperatura, a profundidade da anestesia e a frequência respiratória pelo menos a cada 5 minutos durante a duração da anestesia.
- Para evitar hipotermia grave e hipertermia (do aquecimento ativo pela almofada térmica), monitore a temperatura corporal durante todo o procedimento. Insira uma sonda retal limpa e lubrificada no reto do animal e, em seguida, fixe-a na placa cirúrgica usando fita adesiva de micropore.
NOTA: Esta sonda retroalimenta um sistema dinâmico (uma característica do sistema de entrega de anestésicos), que modifica a temperatura da almofada de aquecimento para controlar a temperatura corporal. - Peça ao responsável pela anestesia que avalie a profundidade anestésica observando as respostas à estimulação da pata ou cauda a partir da pressão aplicada por pinça atraumática, do reflexo palpebral e do tônus muscular.
- Medir a frequência respiratória observando o movimento da parede torácica enquanto observa o esforço respiratório subjetivamente para avaliar o volume corrente. Calcule a frequência respiratória contando as respirações durante um período de 10-15 s e multiplicando por 6 ou 4, respectivamente, para determinar uma frequência respiratória/min.
- Para evitar hipotermia grave e hipertermia (do aquecimento ativo pela almofada térmica), monitore a temperatura corporal durante todo o procedimento. Insira uma sonda retal limpa e lubrificada no reto do animal e, em seguida, fixe-a na placa cirúrgica usando fita adesiva de micropore.
- Para o preparo da pele, desinfetar o sítio cirúrgico com aplicadores estéreis com ponta de algodão. Aplicar clorexidina em movimento circular, expansivo, trabalhando do centro do sítio cirúrgico até as bordas. Repetir esse processo 3x (com um novo aplicador com ponta de algodão a cada vez) antes da aplicação final de uma combinação de clorexidina e etanol com um novo aplicador estéril com ponta de algodão no mesmo padrão, movendo-se do centro do sítio cirúrgico para a borda.
- Peça ao cirurgião que aplique um gel para as mãos à base de etanol antes de vestir um avental cirúrgico estéril e luvas cirúrgicas estéreis.
- Para preparar o campo cirúrgico, coloque campos cirúrgicos estéreis (pré-cortados para 25 cm x 25 cm) em cada lado da prancha cirúrgica, servindo como local para a colocação de instrumentos estéreis. Use uma tesoura estéril para fenestrate um pano estéril mais largo de 25 cm x 40 cm para cortar uma abertura pequena (um pouco mais longa do que o local da incisão), em forma oval. Coloque este pano sobre a parte superior do animal de modo que a fenestração esteja localizada no local da incisão proposta. Certifique-se de que as extremidades laterais deste terceiro drape se sobreponham aos dois campos menores de cada lado para criar um campo cirúrgico contínuo.
2. Cirurgia do doador
NOTA: Consulte a Figura Suplementar S1 para os principais aspectos da cirurgia de doador.
- Realizar a cirurgia do doador com o auxílio de um microscópio biocular cirúrgico. Para começar, use um aumento de 8x e realize uma incisão ventral na linha média da pele usando uma lâmina de bisturi cirúrgico (#23). Certifique-se de que a incisão se estende da extremidade caudal da área raspada até o rebordo costal com uma margem intacta de pele preparada em cada extremidade.
NOTA: O aumento inicial de 8x é escolhido para permitir a visualização suficiente da macroestrutura do sujeito no início da cirurgia. A partir deste ponto, a ampliação fica a critério do operador e deve ser selecionada para fornecer um equilíbrio adequado entre a consciência situacional fornecida pela ampliação menor e o detalhe fino que pode ser visualizado com maior ampliação. - Usando dois aplicadores estéreis com ponta de algodão umedecidos com soro fisiológico aquecido, deslocar o intestino delgado para expor a aorta abdominal e a veia cava inferior (VCI). Use os aplicadores para dissecar sem rodeios esses vasos do tecido circundante.
- Use uma seringa de 3,0 mL com uma agulha de 30 G, 0,5 para extrair 2,5 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% 100 UI·mL−1 (mantida a 4 °C até que seja necessário durante a cirurgia). Usando pinça de sutura de corpo reto com ponta reta e corpo redondo com a mão não dominante para fixar a aorta abdominal na área infradiafragmática, use a mão dominante para injetar 1,5 mL de solução na aorta em direção ao coração. Selar a aortotomia resultante com pressão de um aplicador com ponta de algodão.
- Use tesoura microcirúrgica de ponta reta para transeccionar a VCI para permitir a exsanguinação.
- Realizar toracotomia com tesoura cirúrgica para fazer duas incisões nas linhas axilares-médias bilaterais. Neste momento, confirme a morte do animal e desligue o vaporizador de isoflurano.
- Fixar o segmento mediano resultante da parede torácica usando uma pinça de micro-bulldog. Passe isso para o assistente cirúrgico não estéril que pode prender isso ao cone do nariz usando fita cirúrgica de micropore.
OBS: O objetivo é proporcionar tração neste segmento do tórax, que auxilia na exposição dos tecidos cardíacos. - Com pinça de sutura de corpo redondo, identifica e mobiliza a VCI intratorácica.
OBS: O ideal é que a pinça de ponta reta esteja na mão não dominante e a pinça curva na mão dominante. - Com a VCI presa na pinça da mão não dominante, use a mão dominante para injetar o restante 1,5 mL de solução heparinizada de cloreto de sódio a 0,9% 100 UI·mL−1 no coração.
- Com ambos os conjuntos de pinças, ligar a VCI com seda trançada 7/0 de 2 cm de comprimento. Use um nó de amarração de instrumento com dois arremessos adicionais para segurança. Faça este nó o mais proximal possível ao longo do vaso para o coração.
- Fixe as duas extremidades desse nó usando pinças de artéria. Posicione essas pinças de modo que proporcionem uma tração suave do coração no sentido caudal para facilitar o posicionamento ideal do vaso para posterior dissecção.
- Identificar o timo na face anterossuperior do coração. Utilizar pinça para dissecar esse órgão do doador para identificar a veia cava superior (VCS).
- Remover a adventícia e os tecidos associados da VCS com pinças. Use pinça curva para dissecar bruscamente e fazer um pequeno canal posterior ao vaso. Certifique-se de que este canal é o mais próximo possível do coração.
- Passe um pedaço de seda trançada 7/0 de 2 cm de comprimento por este canal usando pinça e depois amarre-o usando a técnica mencionada.
- Em um ponto a aproximadamente 2 mm dessa ligadura (no lado oposto ao coração), divida a VCL com uma tesoura microcirúrgica curva.
- Usando aplicadores com ponta de algodão, vire o coração para a direita anatômica.
- Identificar a veia áziga na anatômica esquerda do coração. Usando pinças, disseque-o sem rodeios das estruturas circundantes. Como antes, use pinças de ponta curva para criar um pequeno canal posterior a esse vaso.
- Use um terceiro pedaço de seda trançada 7/0 cortada a 2 cm para ligar a veia áziga na máxima proximidade com o coração usando a mesma técnica de amarração de nós. Corte o vaso a 2 mm da ligadura do lado afastado do coração.
- Usando aplicadores com ponta de algodão, vire o ápice do coração de volta para a esquerda anatômica. Utilizar pinça para identificar e mobilizar a aorta ascendente. Passe a pinça curva abaixo do arco aórtico para criar um canal entre a aorta ascendente e descendente.
- Com tesoura microcirúrgica de ponta reta, transeccionar o arco aórtico proximal aos seus ramos.
- Com o uso de pinças, identificar e mobilizar a artéria pulmonar. Usando pinças curvas, faça um canal posterior ao vaso.
- Com tesoura microcirúrgica de ponta reta, transeccionar a artéria em um ponto proximal à sua bifurcação.
- Use uma cânula de irrigação Rycroft para injetar suavemente 2 mL de 10 UI·mL−1 de cloreto de sódio heparinizado a 0,9% através da artéria pulmonar e da aorta ascendente para liberar qualquer sangue restante do coração.
NOTA: Um flush adequado é indicado pela depuração do sangue visível dos vasos coronários. - Usando um pedaço de 3 cm de seda trançada 7/0, ligue os vasos posteriores restantes (as veias pulmonares) em bloco usando um nó do cirurgião com dois arremessos subsequentes. Separe o coração da parede torácica posterior cortando cuidadosamente com tesoura cirúrgica.
- Retire suavemente o coração do tórax, submerja-o na University of Wisconsin Solution (UWS) e, em seguida, coloque-o no gelo para armazenamento (a 4 °C).
3. Cirurgia do receptor
- Após a preparação do animal, conforme descrito na secção 1., aplicar lubrificante ocular. Injetar uma dose baseada no peso (8 mg/kg) de bupivacaína (diluída a 0,25% para 0,625 mg/mL em solução de cloreto de sódio a 0,9%) no tecido subcutâneo do abdome ventral ao longo do local planejado para incisão. Use uma seringa de insulina 29G para esta injeção e procure uma linha reta de sangramento visível que cubra a extensão da incisão planejada (Figura Suplementar S2A-C).
NOTA: Cinco a sete minutos devem ser administrados para dar tempo para o pico de efeito do anestésico local. - Com o microscópio regulado para aumento de 8x, fazer uma incisão ventral na linha média da pele usando uma lâmina de bisturi cirúrgico estéril (#23). Certifique-se de que a laparotomia se estenda do abdome inferior até o rebordo costal. Inserir um afastador para maximizar o campo cirúrgico (Figura Suplementar S2D).
- Umedeça um segmento de gaze estéril de 5 cm x 5 cm com solução de cloreto de sódio a 0,9% aquecida e posicione-a na face superior do sítio cirúrgico. Usando cotonetes estéreis umedecidos, eviscere suavemente os intestinos, posicione-os em cima dessa gaze e envolva a gaze ao redor do órgão (Figura Suplementar S3A).
NOTA: Este procedimento ajuda a reduzir a perda de líquidos insensíveis durante a cirurgia e auxilia na retração. - Liberar e mobilizar a aorta abdominal e a VCI dos tecidos circunvizinhos usando uma técnica de dissecção romba. Use uma combinação de aplicadores com ponta de algodão e pinças de sutura de corpo redondo para esta etapa. Certifique-se de que a área de depuração esteja entre a face infra-renal dos vasos e logo acima da bifurcação da aorta (Figura Suplementar S3B).
NOTA: A visualização adequada neste ponto facilitará a anastomose vascular de alta qualidade. - Identificar os vasos abdominais posteriores. Com o uso de pinças, tracione suavemente a aorta em direção afastada da coluna vertebral (isto é, longitudinal ao eixo dos vasos abdominais).
NOTA: É importante que apenas a aorta e não a VCI seja manuseada dessa forma devido à friabilidade desta última. - Ligate cada vaso abdominal identificado na zona anastomótica planejada. Faça um canal em ambos os lados desses vasos cefalocraticamente, passando a pinça curva posterior aos vasos abdominais de ambos os lados. Ligate cada vaso identificado e mobilizado desta maneira usando comprimentos de náilon 10/0 amarrados com instrumentos nos nós do cirurgião com um lançamento adicional (Figura Suplementar S3C).
- Isole o local da anastomose da circulação. Para isso, instale uma pinça cirúrgica tanto na cabeça quanto nas extremidades caudais dos vasos abdominais (importante, nessa ordem precisa). Certifique-se de que as braçadeiras cruzem ambos os vasos em um grau suficiente para garantir a oclusão completa.
- Usando pinça na mão não dominante para fixar a aorta, realizar uma aortotomia com agulha 30 G na face anterior da aorta. Estenda-o com tesoura microcirúrgica de ponta reta (Figura Suplementar S3D).
- Realizar uma venotomia. Com pinça reta, aplicar tração anterior suave na VCI no ponto alinhado com o meio da aortotomia. Utilizar tesoura microcirúrgica curva com o lado côncavo voltado anteriormente para remover um segmento de VCI de comprimento igual ao da aortotomia (Figura Suplementar S4A).
- Usando 10 UI·mL−1 solução de cloreto de sódio heparinizada, lave o interior dos vasos abertos do sangue restante.
- Coloque o coração doador no abdômen. Certifique-se de que o posicionamento seja tal que a aorta ascendente esteja diretamente ao lado da aortotomia abdominal e o coração seja rodado para que a artéria pulmonar possa ser traída para a segunda anastomose.
- Com náilon 10/0, colocar um ponto de permanência entre as 12 horas da aortotomia e a extremidade correspondente da luz da aorta ascendente. Realize isso usando pinça de ponta reta e um porta-agulha microcirúrgico e amarre-o usando um nó de cirurgião com três arremessos subsequentes. Corte as extremidades para deixar aproximadamente 2 mm de sutura.
- Colocar um segundo ponto de permanência entre a posição das 6 horas da aortotomia e o aspecto correspondente da aorta ascendente. Como essa sutura também servirá de base para suturas subsequentes, deixe pelo menos 10 mm da cauda para a amarração final.
- Colocar uma sutura contínua de náilon 10/0 de forma ascendente para contrapor a borda anatômica direita da aortotomia e a borda livre correspondente da aorta ascendente. Use aproximadamente quatro arremessos para esta linha.
- Passar a extremidade livre da sutura ao redor da sutura de permanência distal antes de colocar uma segunda sutura contínua e contínua descendo pelo lado esquerdo anatômico para afetar a aposição com a borda livre remanescente da aortotomia. Amarre a sutura à cauda usando um nó do cirurgião com dois arremessos adicionais.
- Coloque uma sutura de permanência entre a posição das 12 horas da venotomia da VCI e a extremidade correspondente da luz da artéria pulmonar.
- A partir desse ponto de ancoragem, colocar uma sutura contínua e descendente entre a borda anatômica esquerda da artéria pulmonar e a borda correspondente da venotomia. Utilizar uma média de quatro arremessos para essa linha seguidos de um entre a posição das 6 horas da venotomia e a extremidade correspondente da luz da artéria pulmonar. Faça mais quatro arremessos para desenhar as bordas livres finais da artéria pulmonar e a venotomia juntas.
- Amarre a extremidade livre da sutura à extremidade da âncora usando um nó de amarração de instrumento com dois arremessos adicionais.
- Reposicione o coração para sentar-se centralmente no abdômen usando cotonetes. Verifique se os vasos estão torcidos, o que interferiria no fluxo sanguíneo.
- Posicionar espuma de gel sobre todas as linhas de sutura (Figura Suplementar S4B). Colocar e moldar duas peças de aproximadamente 2 mm cada uma ao redor delas de modo que todas as linhas de sutura visíveis sejam cobertas.
- Solte as pinças vasculares: primeiro a pinça caudal e, em seguida, a pinça cefálica. Como uma pequena quantidade de hemorragia é esperada, posicione preventivamente aplicadores com ponta de algodão sobre os locais da anastomose para fornecer pressão.
- Uma vez livre de vazamentos observáveis, avaliar o coração quanto à pulsação (Figura Suplementar S4C). Se isso não estiver ocorrendo, verifique se não ocorreu torção dos vasos cardíacos (especialmente para a VCI).
- Reposicione os intestinos agora sobre e ao redor do coração. Se parecer seco, umedeça a cavidade peritoneal usando solução de cloreto de sódio aquecida.
- Fechar a cavidade abdominal usando monofilamento de prolene 6/0 não absorvível por camadas:
primeiro a camada muscular e, em seguida, a pele (Figura Suplementar S4D). Use a técnica contínua ininterrupta. - Retire suavemente o recipiente da prancha cirúrgica e retire-o do anestésico.
- Administrar 1 mL de soro fisiológico aquecido por via subcutânea e colocar o receptor em uma gaiola pré-preparada com aquecimento para observação conforme protocolos de recuperação pós-operatória (Figura Suplementar S4E).
4. Cuidados pós-operatórios
- Imediatamente após a cirurgia, colocar o receptor em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento sob observação atenta por pelo menos 3 h. Durante esse período, monitorar vários parâmetros (atividade, postura corporal, condição do apelo, expressão facial, marcha, ventilação, aparência do local cirúrgico, presença de batimento cardíaco abdominal palpável) pelo menos a cada 30 min. Atribua um escore a cada parâmetro (0 = normal, 1 = anormal leve ou intermitente, 2 = anormal moderada ou consistentemente).
NOTA: As intervenções são desencadeadas pela soma dos parâmetros monitorados que excedem os escores de bem-estar especificados pelo protocolo de ética relacionado a este modelo. - Mova os recipientes para um armário aquecido mantido a 25 °C, onde permanecem até o dia 7 pós-operatório. Durante os primeiros 3 dias, monitore-os pelo menos 2x ao dia. Nos 4 dias restantes, monitore-os pelo menos 1x diariamente. Para analgesia pós-operatória, administrar uma dose de buprenorfina (0,5-0,1 mg/kg, diluída a 0,03 mg/mL com cloreto de sódio a 0,9%) por via subcutânea no camundongo receptor na noite pós-operatória e duas vezes ao dia nos próximos 3 dias de pós-operatório.
- Uma vez retirado do gabinete aquecido, monitore os recipientes pelo menos 2x por semana até o desfecho experimental apropriado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para determinar a eficácia da técnica cirúrgica em promover bons resultados de cicatrização de feridas e recuperação de camundongos, experimentos iniciais em laboratório determinaram as características de sobrevida de uma variedade de enxertos cardíacos de imunogenicidade variável ao receptor. Estes incluíram enxertos congênicos (n = 5) e singênicos (n = 5), que compartilham os mesmos marcadores do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) do receptor, e enxertos de grande mismatch (n = 9), nos quais o enxerto e o receptor têm marcadores MHC diferentes. Usamos a palpação direta do batimento cardíaco abdominal heterotópico para avaliar a função e a viabilidade do enxerto em andamento, que serve como um marcador proxy de rejeição versus tolerância.
Em ambos os grupos controle, todos os enxertos foram viáveis ao final do tempo experimental de 100 dias (média indefinida). O grupo incompatível teve um tempo médio de sobrevida de 9 dias. A Figura 1 apresenta as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier demonstrando o contraste acentuado na sobrevida do enxerto entre os enxertos cardíacos incompatíveis econtroles16. Esses dados sugerem que a técnica seja suficiente para promover uma resposta cicatricial adequada após o procedimento. Na presença de inflamação patológica, entretanto, neste caso representada pela rejeição do enxerto na condição de incompatibilidade, a destruição tecidual leva à rápida perda de função.
Figura 1: Influência do desajuste na sobrevida do transplante cardíaco ortotópico. Curvas de sobrevida que ilustram a recuperação completa e aceitação de transplantes cardíacos murinos heterotópicos singênicos (n = 5) e congênicos (n = 5) por pelo menos 100 dias pós-cirurgia, em contraste com a rápida rejeição de transplantes cardíacos murinos heterotópicos incompatíveis (n = 7) a partir do 7º dia pós-operatório. Esses dados foram publicados em Prosser et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Estágio da Cirurgia | Tempo de isquemia fria | Tempo de isquemia quente |
| Doador | 13 – 15 min | |
| Armazenamento 4 °C | 20- 25 min | |
| Destinatário | 22 – 25 min |
Tabela 1: Variação dos tempos de isquemia quente e fria para cirurgias de doadores e receptores associadas ao transplante cardíaco ortotópico.
Figura Suplementar S1: Principais aspectos da cirurgia de doador. (A) Anestesia com isoflurano; (B) injeção de heparina; (C) coração do doador exposto; (D) lavagem do coração com soro fisiológico heparinizado; E) Amarração do navio; (F) coração doado para armazenamento de isquemia fria. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S2: Principais aspectos do preparo cirúrgico do receptor e cauterização dos vasos cutâneos cortados. (A) Preparo do sítio cirúrgico receptor; (B) injeção de bupivacaína; (C) drapeamento cirúrgico estéril do sítio cirúrgico; (D) cauterização dos vasos cutâneos cortados. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S3: Principais aspectos da cirurgia do receptor - desde o reposicionamento dos intestinos até a aortotomia. (A) Reposicionamento temporário dos intestinos; (B) veia cava inferior exposta e pinçada; (C) colocação da sutura de suspensão; (D) primeira fase: aortotomia. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S4: Principais aspectos da cirurgia do receptor - da venotomia à recuperação. (A) Segunda fase: venotomia; (B) colocação da espuma de gel; (C) reperfusão; (D) fechamento cirúrgico; (E) recuperação. Clique aqui para baixar este arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O modelo de transplante cardíaco ortotópico murino é um modelo pré-clínico robusto usado principalmente para investigar os efeitos da incompatibilidade MHC sobre o nível e a natureza da rejeição imunológica e, mais recentemente, o efeito do transplante na retenção da imunidade residente no tecido do enxerto16. Embora inicialmente seguindo de perto o protocolo de Corry et al.7 , refinamos o protocolo para incorporar padrões de melhores práticas de técnica asséptica, analgesia e anestesia. A atualização dessas novas práticas foi obtida por meio de treinamento adicional, fornecimento de luvas, aventais e campos cirúrgicos estéreis, aplicação de anestesia adicional e atualização da dosagem de analgesia. Tais mudanças levaram a um pequeno aumento no tempo de colocação cirúrgica e custos adicionais por cirurgia.
O uso de animais para tratar de preocupações importantes de pesquisa é permitido sob um contrato entre pesquisadores e um comitê de ética animal (CEA) para manter uma licença social para realizar tal trabalho. As decisões de um CEA baseiam-se em diretrizes éticas claras15, com um princípio primordial de equilibrar os custos para o animal contra os benefícios para a sociedade. O conceito dos três Rs (redução, substituição e refinamento) é vital para abordar como os custos de um projeto são mitigados.
A minimização dos danos aos animais envolvidos pela adoção de analgesia e anestesia perioperatórias apropriadas para a espécie tem papel insubstituível nos modelos animais de cirurgia e é um exemplo de refinamento. Além disso, cuidados e técnicas que reduzam o risco de vetores ambientais e comportamentais de infecção para o receptor cirúrgico têm implicações positivas tanto para reduzir os danos ao animal em termos de morbidade e mortalidade quanto para ajudar a minimizar os custos financeiros associados à repetição de cirurgias malsucedidas. Embora a limpeza do "centro cirúrgico" animal experimental não se aproxime da de um equivalente hospitalar, não deve ser uma reflexão tardia em tal trabalho.
Do ponto de vista científico, as infecções pós-operatórias necessariamente influenciam o perfil de citocinas inflamatórias e células imunes, que são as leituras típicas para experimentos que avaliam a recuperação ou rejeição de transplantes. Deve-se, portanto, fazer um esforço máximo para controlar a infecção pós-operatória, dado o impacto adverso que isso pode ter na validade da pesquisa. O foco na analgesia é importante do ponto de vista do bem-estar animal. As cirurgias de transplante de animais são procedimentos importantes, e grande esforço deve ser feito para reduzir a dor e o sofrimento desnecessários dos indivíduos. Para retornar aos resultados práticos desse enfoque, um benefício prático adicional do controle efetivo da dor é a menor probabilidade de os animais serem retirados do protocolo experimental devido a sinais de sofrimento associados à dor.
Desde que esse procedimento foi descrito pela primeira vez, vários autores relataram a solução de problemas comuns que ocorrem durante o procedimento10,11. O controle da hemorragia após a liberação das pinças é bem descrito e espelha técnicas utilizadas em cirurgias humanas, nomeadamente o uso de pressão para o local da hemorragia, sutura posterior e agentes hemostáticos. Observamos que o sangramento geralmente ocorre a partir de um dos dois locais principais: os locais de anastomose ou danos ao miocárdio. Abordagens para interromper o sangramento do coração foram relatadas por Niimi10, que controlou o sangramento do coração através da ligadura do átrio. Em nossa experiência, a derivação do fluxo sanguíneo do próprio miocárdio é excepcionalmente desafiadora devido à sua rica vascularização.
Deve-se ter o devido cuidado, portanto, para evitar essa lesão, que é causada mais comumente por uma ponta de pinça mal controlada que entra em contato com o músculo cardíaco durante a cirurgia. Buscamos, portanto, apenas entrar em contato direto com o músculo cardíaco usando aplicadores umedecidos com ponta de algodão. Para reduzir o contato direto na manipulação do coração, as extremidades livres da ligadura de seda final podem ser usadas para mover o coração, como ao movê-lo da UWS para a cavidade torácica.
Um segundo grande desafio é a prevenção da paralisia pós-operatória dos membros pélvicos, complicação que obriga à eutanásia. Curiosamente, descobrimos que um tempo isquêmico quente de >30 min está associado a um maior risco de ocorrência dessa paralisia. Nossos tempos isquêmicos são rigorosamente monitorados e registrados como um padrão informal de desempenho. Deve-se notar, no entanto, que o tempo de isquemia não parece predizer de forma confiável essa complicação. Niimi10, por exemplo, cirurgião de grande experiência operatória (mais de 3.000 cirurgias), relatou que tempos isquêmicos de até 2 h são aceitáveis.
Talvez ainda mais surpreendente do que isso, Abbott et al.5, que desenvolveram uma técnica semelhante em ratos, mas usaram uma configuração anastomótica término-terminal no abdome (isto é, a VCI e a aorta abdominal foram ligadas permanentemente), relataram dois ratos mantidos como sobreviventes a longo prazo durando mais de 100 dias sem quaisquer efeitos aparentes do mal. Essas diferenças intergrupos nos resultados talvez sejam explicadas por técnicas sutilmente diferentes ou, alternativamente, pelas diferenças genéticas entre diferentes linhagens de camundongos. Por exemplo, notamos que os camundongos Ly5.1 são muito mais suscetíveis a essa complicação do que os camundongos BALB/c. Para melhorar a clareza sobre os efeitos do tempo de isquemia na incidência de paralisia de membros posteriores, o efeito do tempo de oclusão dos vasos abdominais pôde ser investigado.
Em resumo, este protocolo descrito fornece refinamentos diretos às técnicas estabelecidas usando medicamentos e materiais prontamente disponíveis. Esses refinamentos alinham o padrão ao qual esse modelo cirúrgico é realizado ao padrão clínico veterinário e beneficiam os animais e, em última instância, a pesquisa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer os esforços soberbos da equipe de cuidados com animais da Universidade da Austrália Ocidental e do Harry Perkins Institute of Medical Research, cuja dedicação e experiência contribuíram para a viabilidade e o sucesso dessas cirurgias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2030 Rycroft irrigating cannula 30 G | McFarlane | 56005HU | |
| Braided surgical silk 7-0 | |||
| Bulldog clamp curved - 35 mm | Roboz | RS-7441-5 | |
| Bupivacaine 0.25% | |||
| Buprenorphine | |||
| Castroviejo needle holder catch curved - 145 mm | Haag-Streit | 11.62.15 | |
| Chlorhexidine 5% solution | Ebos | JJ61371 | |
| Cotton-tipped applicator - 7.5 cm | Dove | SN109510 | |
| Ethanol 70% solution | Ebos | WH130192EE | |
| Gauze 5 x 5 cm white | Aero | AGS50 | |
| Gelfoam 80 mm x 125 mm | Pfizer | 7481D | |
| Hair clipper | Wahl | 9860L | |
| Heparin 1,000 IU in 1 mL | |||
| Iris SuperCut scissors straight - 11.5 cm | Inka Surgical | 11550.11 | |
| Isoflurane vaporiser | Darvall | 9176 | |
| Micro bulldog clamp - 3.7 cm | Greman | 14119-G | |
| Micro scissors curved 105 mm | |||
| Micropore plain paper surgical tape - 2.5 cm wide | Ebos | 7810L | |
| Microsurgical scissors - curved tip | |||
| Monofilament polyprolene suture - 5/0 | Surgipro | P-205-X | |
| Myweigh i101 Precision Scale 100 g x 0.005 g | Myweigh | Kit00053 | |
| Needle - 30 G x 0.5 inch | BD | BD304000 | |
| Needleholder 15 cm curved "super fine" | Surgical Specialists | ST-B-15-8.2 | |
| Nylene 10/0 x 15 cm on 3.8 mm 3/8 circle round bodied taper (diam 0.07mm) CV300 | |||
| Round body suture forceps curved 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD281R | |
| Round body suture forceps straight 0.3 mm 120 mm | B. Braun | FD280R | |
| Round handled vannas spring scissors-str/12.5 cm | 15400-12 | ||
| Spring scissors-Cvd Sm blades | 15001-08 | ||
| Stevens scissors blunt straight 110 mm | |||
| Surgical backboard | Rigid laminated cardboard. 15 x 15 cm | ||
| Surgical drapes | Cut into two sizes. 25 cm x 25 cm, and 25 cm x 40 cm | ||
| Surgical microscope | |||
| Syringe - 1 mL | BD | 592696 | |
| Syringe - 3 mL | Leica | M651 | |
| Toothed forceps | BD | 309657 | |
| University of Wisconsin Solution | |||
| Warming pad | Far infrared warming pad 20 x 25 cm | ||
| Westcott spring scissors | |||
| Yasargil clip applier bayonet | Aesculap | FE582K | |
| Yasargil titanium clip perm 6.6 mm | Aesculap | A19FT222T | |
| Mouse usage | |||
| Strain/SEX/Weight | Donor | Recipent | |
| BALB/c, female, 19-23 g | 7 | 21 | |
| C57BL/6, female, 17-20 g | 7 | ||
| CD45.1 BALB/c, female, 17-21 g | 5 |
References
- Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M.
- Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F.
- Downie, H. G.
- Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. Complete homotransplantation of canine heart and lungs. A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Joffre, O., et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).
- Gregori, S., et al. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A.
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR Journal. , (2021).
- Adams, S., Pacharinsak, C.
- Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC. , Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
- Prosser, A., et al. Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation. Cell Reports. 35 (7), 109141 (2021).
