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Biochemistry

फ्लोरोसेंट आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा झिल्ली प्रोटीन गुणवत्ता का तेजी से मूल्यांकन

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64322
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Peak Proteins Ltd.

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक और संरचनात्मक विश्लेषण के लिए उनकी गुणवत्ता का आकलन करने के लिए झिल्ली प्रोटीन पर फ्लोरोसेंट आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एफएसईसी) करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। डिटर्जेंट-घुलनशील और डिटर्जेंट-मुक्त स्थितियों के तहत कई जी-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (जीपीसीआर) के लिए एकत्र किए गए प्रतिनिधि एफएसईसी परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं।

Abstract

झिल्ली प्रोटीन संरचनात्मक स्पष्टीकरण और बायोफिज़िकल लक्षण वर्णन के दौरान, झिल्ली से निष्कर्षण के बाद एकत्रित नहीं होने वाले एक को खोजने के लिए विभिन्न टैग, ट्रंकेशन, विलोपन, संलयन साथी सम्मिलन और स्थिर उत्परिवर्तन वाले कई प्रोटीन संरचनाओं का परीक्षण करना आम है। इसके अलावा, डिटर्जेंट, एडिटिव, लिगैंड, या बहुलक को निर्धारित करने के लिए बफर स्क्रीनिंग जो झिल्ली प्रोटीन के लिए सबसे स्थिर स्थिति प्रदान करती है, एक महत्वपूर्ण अभ्यास है। फ्लोरोसेंट आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता का प्रारंभिक लक्षण वर्णन प्रोटीन शुद्धिकरण की आवश्यकता के बिना विभिन्न संरचनाओं या स्थितियों का आकलन और रैंक करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, और यह उपकरण नमूना आवश्यकता को भी कम करता है। झिल्ली प्रोटीन को फ्लोरोसेंटली टैग किया जाना चाहिए, आमतौर पर उन्हें जीएफपी टैग या इसी तरह से व्यक्त करके। प्रोटीन को सीधे पूरी कोशिकाओं से घुलनशील किया जा सकता है और फिर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट रूप से स्पष्ट किया जा सकता है; बाद में, प्रोटीन को एक आकार बहिष्करण कॉलम में पारित किया जाता है, और एक फ्लोरोसेंट ट्रेस एकत्र किया जाता है। यहां, जीपीसीआर लक्ष्य स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट रिसेप्टर (एस1 पीआर 1) और सेरोटोनिन रिसेप्टर (5 एचटी2 एआर) पर एफएसईसी और प्रतिनिधि एफएसईसी डेटा चलाने के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है।

Introduction

आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), जिसे जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी के रूप में भी जाना जाता है, आमतौर पर प्रोटीन विज्ञान1 में उपयोग किया जाता है। एसईसी के दौरान, प्रोटीन को उनके हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या के आधार पर अलग किया जाता है, जो प्रोटीन आकार और आकार2 का एक कार्य है। संक्षेप में, यह पृथक्करण छिद्रपूर्ण मोतियों के पैक बिस्तर पर प्रवाह के तहत प्रोटीन के नमूनों को लागू करके प्राप्त किया जाता है जो आणविक छलनी के रूप में कार्य करते हैं। उपयोग किए जाने वाले मोती अक्सर छिद्र आकार की एक परिभाषित श्रेणी के साथ क्रॉस-लिंक्ड अगारोस होते हैं ताकि प्रोटीन को मोतियों 3,4,5,6,7 के छिद्रों में प्रवेश करने या बाहर रखने की अनुमति मिल सके। छोटे हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या वाले प्रोटीन छिद्रों के भीतर अधिक अनुपात में समय बिताते हैं और इस प्रकार, धीमी दर से पैक किए गए बिस्तर के माध्यम से प्रवाहित होते हैं, जबकि बड़े प्रोटीन मोतियों (बहिष्कृत मात्रा) के बाहर अधिक अनुपात में समय बिताते हैं और तेज दर से पैक किए गए बिस्तर के माध्यम से चलते हैं। एसईसी का उपयोग प्रोटीन शुद्धिकरण चरण के रूप में किया जा सकता है जब एक प्रारंभिक कॉलम का उपयोग कियाजाता है। जब एक विश्लेषणात्मक कॉलम का उपयोग किया जाता है, तो एसईसी का उपयोग प्रोटीन की गुणवत्ता और गुणों का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकताहै। उदाहरण के लिए, प्रोटीन समुच्चय जो एक नमूने में मौजूद हो सकते हैं और खराब गुणवत्ता वाले प्रोटीन का संकेत देते हैं, वे बहुत बड़े होते हैं, जिसका अर्थ है कि वे केवल बहिष्कृत मात्रा में यात्रा करते हैं और इस प्रकार, शुरुआती बिंदु पर कॉलम से अलग हो जाते हैं; इस खंड को स्तंभ शून्य या शून्य मात्रा के रूप में जाना जाता है। इसके अलावा, आणविक भार मानकों का उपयोग कॉलम को कैलिब्रेट करने के लिए किया जा सकता है, जिससे रुचि के प्रोटीन के अनुमानित आणविक भार को एक मानक वक्र से इंटरपोलेट किया जा सकता है।

आमतौर पर, 280 एनएम पर प्रोटीन अवशोषण का उपयोग आकार बहिष्करण कॉलम से प्रोटीन क्षालन की निगरानी के लिए किया जाता है। यह एक विश्लेषण उपकरण के रूप में एसईसी के उपयोग को प्रतिबंधित करता है जब तक कि रुचि का प्रोटीन काफी हद तक दूषित प्रोटीन से मुक्त नहीं होता है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन शुद्धिकरण के अंतिम चरण में। हालांकि, फ्लोरोसेंट एसईसी (एफएसईसी) रुचि के प्रोटीन का उपयोग करता है जिसे फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है। इसलिए, एक फ्लोरोसेंट सिग्नल का उपयोग विशेष रूप से अन्य प्रोटीन या यहां तक कि कच्चे मिश्रण 8,9 की उपस्थिति में रुचि के प्रोटीन के क्षालन की निगरानी के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि फ्लोरोसेंट सिग्नल अत्यधिक संवेदनशील होते हैं, इसलिए बेहद कम प्रोटीन मात्रा वाले नमूनों पर सफल विश्लेषण किया जा सकता है। रुचि के प्रोटीन को अक्सर अभिव्यक्ति निर्माण में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या उन्नत जीएफपी (ईजीएफपी) टैग को शामिल करके फ्लोरोसेंटली लेबल किया जाता है। फ्लोरोसेंट सिग्नल को तब 395 एनएम या 488 एनएम पर उत्तेजना द्वारा निगरानी की जा सकती है और जीएफपी या ईजीएफपी के लिए क्रमशः 509 एनएम या 507 एनएम पर फ्लोरोसेंट उत्सर्जन का पता लगाया जासकता है।

एसईसी कॉलम से प्रोटीन क्षालन की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल का उपयोग करने का लाभ एफएसईसी को झिल्ली प्रोटीन नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाता है जब घुलनशील प्रोटीन की तुलना में अभिव्यक्ति का स्तर विशेष रूप से खराब होता है। महत्वपूर्ण रूप से, झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता और गुणों का विश्लेषण सीधे कच्चे लाइसेट से घुलनशीलता के बाद किया जा सकता है, बिना शुद्धिकरण प्रक्रिया को अनुकूलित करने की आवश्यकताके 11,12। इन कारणों से, एफएसईसी का उपयोग झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता का तेजी से विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, जबकि विभिन्न कारकों की खोज की जा सकती है जो समाधान में झिल्ली प्रोटीन के व्यवहार में सुधार के लिए आवश्यक हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, विभिन्न टैग, ट्रंकेशन, विलोपन, संलयन साथी सम्मिलन और स्थिर उत्परिवर्तन वाले कई निर्माणों का परीक्षण करना आम है ताकि एक ऐसा मिल सके जो झिल्ली13,14 से निष्कर्षण के बाद एकत्रित नहीं होता है। इसके अलावा, डिटर्जेंट, एडिटिव, लिगैंड, या बहुलक को निर्धारित करने के लिए बफर स्क्रीनिंग जो झिल्ली प्रोटीन के लिए सबसे स्थिर स्थिति प्रदान करती है, प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए सबसे अच्छी बफर संरचना को परिभाषित कर सकती है या डाउनस्ट्रीम उपयोगों के लिए स्थिरता प्रदान कर सकती है, जैसे कि बायोफिज़िकल परख या संरचनात्मक लक्षण वर्णन।

इस प्रकार, एफएसईसी विधि का समग्र लक्ष्य रुचि के लक्ष्य झिल्ली प्रोटीन के लिए एसईसी कॉलम क्षालन प्रोफ़ाइल एकत्र करना है। इसके अलावा, जैसा कि प्रतिदीप्ति का उपयोग किया जाता है, इस एसईसी ट्रेस को किसी भी लंबे शुद्धिकरण से पहले संरचनाओं और स्थितियों के अनुकूलन में जल्द से जल्द संभव बिंदु पर एकत्र किया जाता है। एफएसईसी ट्रेस का उपयोग विभिन्न बफर स्थितियों या झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं के साथ झिल्ली प्रोटीन को शुद्ध करने की सफलता की संभावना का न्याय करने के लिए एक तुलनात्मक उपकरण के रूप में किया जा सकता है। इस तरह, एफएसईसी प्रोफाइल के संग्रह का उपयोग अन्य विश्लेषण विधियों के लिए आवश्यक शुद्ध प्रोटीन की मात्रा उत्पन्न करने के प्रयास से पहले इष्टतम निर्माण डिजाइन और बफर संरचना पर पहुंचने के लिए एक त्वरित पुनरावृत्ति प्रक्रिया के रूप में किया जा सकता है।

Protocol

1. एफएसईसी के लिए डिटर्जेंट और बफर तैयारी

  1. एक डिटर्जेंट स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. 20 एमएल स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, 4 ग्राम डोडेसिल माल्टोसाइड (डीडीएम) पाउडर और 0.4 ग्राम कोलेस्टेरिल हेमिसुसिनेट (सीएचएस) पाउडर का वजन करें, और इसे प्रयोगशाला-ग्रेड डिस्टिल्ड एच 2 ओ के साथ20एमएल तक बनाएं।
    2. सभी घटकों को जोड़ने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर एंड-ओवर-एंड व्युत्क्रम के साथ मिलाएं जब तक कि घटक पूरी तरह से घुलनशील न हो जाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के अंत-ओवर-एंड मिश्रण की सिफारिश की जाती है।
    3. एलिकोट करें और उपयोग होने तक डिटर्जेंट स्टॉक को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि स्टॉक को तुरंत उपयोग करने की आवश्यकता है, तो डिटर्जेंट स्टॉक को बर्फ पर स्टोर करें।
      नोट: इस काम में उपयोग किया जाने वाला मानक डिटर्जेंट स्टॉक 20% (डब्ल्यू / वी) डीडीएम और 2% (डब्ल्यू / वी) सीएचएस मिश्रण था ( सामग्री की तालिका देखें)। विभिन्न डिटर्जेंट का उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, लॉरिल माल्टोज नियोपेंटाइल ग्लाइकोल; एलएमएनजी), या स्टाइरीन-मैलिक एसिड (एसएमए) जैसे पॉलिमर के साथ डिटर्जेंट-मुक्त निष्कर्षण के उपयोग का परीक्षण किया जा सकता है। परीक्षण की जाने वाली प्रयोगात्मक स्थितियों को डिजाइन करते समय यह तय करने की आवश्यकता है।
  2. एक घुलनशीलता बफर तैयार करें।
    1. एक बीकर में 100 एमएम एचईपीईएस, 200 एमएम एनएसीएल, 20% (वी / वी) ग्लिसरॉल, और 1 एक्स प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल ( सामग्री की तालिका देखें) की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए घटकों के सही वजन या मात्रा को मिलाकर एक घुलनशीलता बफर तैयार करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में, घुलनशीलता बफर के 50 एमएल की तैयारी पांच नमूनों को संसाधित करने के लिए पर्याप्त थी।
    2. बीकर में प्रयोगशाला-ग्रेड डिस्टिल्ड एच2ओ का 0.7 वॉल्यूम (उदाहरण के लिए, 35 एमएल यदि बफर बनाते हैं तो 35 एमएल) जोड़ें।
    3. एक चुंबकीय स्टिरर पर मिलाएं, और पीएच मीटर का उपयोग करके, केंद्रित एनएओएच के ड्रॉपवाइज जोड़ द्वारा बफर पीएच को 7.5 तक समायोजित करें।
    4. मापने वाले सिलेंडर का उपयोग करके, बफर को प्रयोगशाला-ग्रेड डिस्टिल्ड एच2ओ के साथ अंतिम आवश्यक मात्रा में टॉप अप करें।
  3. एसईसी रनिंग बफर तैयार करें।
    1. बीकर में 100 एमएम एचईपीईएस, 150 एमएम एनएसीएल और 10% (वी / वी) ग्लिसरॉल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए घटकों के सही वजन या मात्रा को जोड़कर एसईसी रनिंग बफर तैयार करें।
      नोट: वर्तमान अध्ययन में, एसईसी बफर के 600 एमएल तैयार करना पांच नमूने चलाने के लिए पर्याप्त था।
    2. बीकर में प्रयोगशाला-ग्रेड डिस्टिल्ड एच 2 ओ की 0.7 मात्रा (उदाहरण के लिए,420एमएल यदि बफर बनाते हैं) जोड़ें।
    3. एक चुंबकीय स्टिरर पर मिलाएं, और पीएच मीटर का उपयोग करके, केंद्रित एनएओएच के ड्रॉपवाइज जोड़ द्वारा बफर पीएच को 7.5 तक समायोजित करें।
    4. मापने वाले सिलेंडर का उपयोग करके, बफर को प्रयोगशाला-ग्रेड डिस्टिल्ड एच2ओ के साथ अंतिम आवश्यक मात्रा में टॉप अप करें।
    5. वैक्यूम के तहत बोतल-टॉप 0.45 μm छिद्र फ़िल्टर के माध्यम से SEC बफर को फ़िल्टर करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    6. एक बार जब बफर फिल्टर से गुजर जाता है, तो इसे वैक्यूम के नीचे छोड़कर तब तक डिगैस करें जब तक कि हिलने पर कोई और बुलबुले दिखाई न दें।
    7. चरण 1 में तैयार डिटर्जेंट स्टॉक की आवश्यक मात्रा को जोड़कर एसईसी बफर में 0.03% (डब्ल्यू / वी) डीडीएम और 0.003% (डब्ल्यू / वी) सीएचएस की अंतिम एकाग्रता जोड़ें (उदाहरण के लिए, 600 एमएल एसईसी बफर बनाते समय 0.9 एमएल)।
    8. उपयोग से पहले बफर को पहले से ठंडा करें।
      नोट: परीक्षण की गई स्थितियों के आधार पर विभिन्न बफर का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि रुचि के प्रोटीन पर विभिन्न डिटर्जेंट के प्रभाव का परीक्षण किया जाता है, तो प्रोटीन को घुलनशील बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिटर्जेंट के समान डिटर्जेंट के साथ एक बफर आदर्श रूप से बनाने की आवश्यकता होगी। यदि एसएमए के साथ डिटर्जेंट-मुक्त स्थितियों का परीक्षण किया जाता है, तो डिटर्जेंट को एसईसी बफर से पूरी तरह से छोड़ दिया जाना चाहिए। हालांकि, डिटर्जेंट स्क्रीनिंग के लिए प्रोटोकॉल संशोधनों के बारे में अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें।

2. एफएसईसी के लिए नमूना तैयारी

  1. सेल छर्रों को तैयार करें।
    नोट: परख के लिए प्रारंभिक बिंदु जीएफपी-टैग (या अन्य फ्लोरोसेंटली लेबल) प्रोटीन के निलंबन सेल अभिव्यक्ति संस्कृति से सेल गोली की कटाई कर रहा है। फसल के लिए सटीक समय और स्थितियां व्यक्त किए जा रहे प्रोटीन, उपयोग की जा रही सेल लाइन, उन स्थितियों पर निर्भर करेंगी जिनमें कोशिकाएं उगाई गई हैं, और जिस विधि से प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित किया गया है। ये विवरण इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे हैं। इस अध्ययन में, एसएफ 21 सेल पेलेट के 0.5-1 ग्राम का उपयोग परीक्षण करने के लिए प्रति शर्त किया गया था, जो पी 2 बैकुलोवायरस के 1: 20 कमजोर पड़ने के लगभग 4 x 106 व्यवहार्य कोशिकाओं / एमएल के साथ संक्रमण के 2-3 दिनों के बाद 25-50 एमएल कल्चर के अनुरूप था। कृपया ध्यान दें कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया है और अन्य यूकेरियोटिकसेल लाइनों (जैसे, एचईके 293 ई) से सेल छर्रों के समान गीले वजन के साथ समान रूप से अच्छी तरह से काम करने के लिए पाया गया है।
    1. जब निलंबन संस्कृतियों की कोशिकाएं कटाई के लिए तैयार होती हैं, तो 25-50 एमएल कल्चर एलिकोट को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    2. ट्यूबों को संतुलित करें, और कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 2,000 x g पर स्विंग-आउट बाल्टी (सामग्री की तालिका देखें) में बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें।
    3. कल्चर सुपरनैटेंट को धीरे से हटाकर और त्याग दें, या यदि सेल गोली विशेष रूप से ढीली है तो पिपेट फिलर के साथ 50 एमएल पाइप का उपयोग करें।
    4. यदि कोशिकाओं का उपयोग विश्लेषण के लिए तुरंत किया जाएगा, तो सेल गोली को बर्फ पर रखें, और सीधे चरण 5 पर आगे बढ़ें। यदि कोशिकाओं को बाद के चरण में उपयोग के लिए सहेजा जाना है, तो कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर रखकर फ्रीज करें।
    5. यदि सेल पेलेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया है, तो इसे 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर या जब तक नमूना अब जमे हुए नहीं है, तब तक इसे तेजी से पिघलाएं। इस चरण के बाद नमूने को तुरंत बर्फ पर ले जाएं।
  2. नमूने को पुन: निलंबित और घुलनशील करें।
    1. सेल गोली में घुलनशीलता बफर (चरण 1.2) के 2 एमएल जोड़ें।
    2. 15-30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एंड-ओवर-एंड व्युत्क्रमण के साथ इनक्यूबेट करें जब तक कि समरूप न हो।
    3. 1% डीडीएम/0.1% सीएचएस की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रीमिक्स्ड डिटर्जेंट स्टॉक (चरण 1.1) (उदाहरण के लिए, 20% डीडीएम/2% सीएचएस स्टॉक का 100 μL) जोड़ें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर एंड-ओवर-एंड व्युत्क्रम के साथ 30 मिनट के लिए घुलनशील करें।
      नोट: यदि वांछनीय है, तो समानांतर में कई स्थितियों का परीक्षण किया जा सकता है। समानांतर नमूनों की संख्या जिन्हें एक बार में संसाधित किया जा सकता है, एसईसी प्रयोग चलाने के लिए उपलब्ध प्रणाली पर निर्भर करेगा। यहां वर्णित सेटअप में, एक समय में पांच नमूने तक संसाधित करना संभव था।
  3. कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण का प्रदर्शन करें।
    1. नमूने को 15 मिनट के लिए 2,000 x g पर स्विंग-आउट बाल्टी में प्री-चिल्ड (4 डिग्री सेल्सियस) बेंचटॉप सेंट्रीफ्यूज में सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. एक उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन चरण निष्पादित करें।
    1. 5 एमएल सिरिंज से जुड़ी कुंद-अंत सुई का उपयोग करके कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन से सुपरनैटेंट को अल्ट्रा-सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूबों (जैसे, 0.5-2 एमएल ट्यूब) में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें, इस बात का ध्यान रखें कि कम गति वाले स्पिन से गोली को परेशान न किया जाए।
    2. ट्यूबों के जोड़े को 0.05 ग्राम के भीतर संतुलित करें, और उन्हें एक निश्चित-कोण अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन रोटर में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. सेंट्रीफ्यूज 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 250,000 x g पर।

3. आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)

  1. तेजी से प्रोटीन तरल क्रोमैटोग्राफी (एफपीएलसी) प्रणाली तैयार करें, और कॉलम को बराबर करें।
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सिस्टम तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें), उदाहरण के लिए, सिस्टम को एसईसी बफर के साथ भरकर और हवा के पंपों को शुद्ध करके।
    2. एसईसी कॉलम को एफपीएलसी से कनेक्ट करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कॉलम में कोई हवा प्रवेश न करे। यह एफपीएलसी सिस्टम के प्रवाह पथ के साथ ड्रॉप-टू-ड्रॉप कनेक्शन करने के लिए पानी से भरे सिरिंज (कॉलम के निचले हिस्से से जुड़ी) के साथ एसईसी कॉलम पर वापस दबाव लागू करके पूरा किया जाता है।
    3. एसईसी कॉलम को प्रयोगशाला-ग्रेड डिस्टिल्ड और फ़िल्टर किएगए एच 2ओ के 1.5 कॉलम वॉल्यूम (24 एमएल कॉलम के लिए 36 एमएल) में धोकर पूर्व-समतुल्य करें, इसके बाद अनुशंसित प्रवाह दर और कॉलम के लिए दबाव पर एसईसी बफर के 1.5 कॉलम वॉल्यूम ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: एफएसईसी करने के लिए इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली एफपीएलसी प्रणाली ठंडे वातावरण में थी और इसमें पांच-स्थिति लूप वाल्व और छह-स्थिति प्लेट अंश कलेक्टर फिट था। यह सेटअप पांच नमूनों को लोड करने और रन के बीच मैन्युअल हस्तक्षेप की आवश्यकता के बिना स्वचालित फैशन में एक ही कॉलम के नीचे क्रमिक रूप से चलाने की अनुमति देता है। एसईसी प्रयोगों को चलाने के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूर्व-पैक 24 एमएल कॉलम का उपयोग किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें), जिसमें एक राल था जो 10-600 केडीए की आणविक भार सीमा में प्रोटीन को हल करने की अनुमति देता था। यदि रुचि का प्रोटीन विशेष रूप से बड़ा है, तो इसके बजाय एक वैकल्पिक कॉलम मैट्रिक्स का उपयोग किया जा सकता है, जिससे आणविक भार में 5,000 केडीए तक प्रोटीन को अलग करने की अनुमति मिलती है। लिपिड मिसेल की उपस्थिति उपयोग किए गए प्रोटीन और डिटर्जेंट के आधार पर झिल्ली प्रोटीन के समग्र आकार को >150 केडीए तक बढ़ा देगी।
  2. नमूना स्तंभ पर लागू करें, और SEC प्रयोग चलाएँ।
    1. सिरिंज से जुड़ी कुंद-अंत सुई का उपयोग करके उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन चरण से सुपरनैटेंट को 1 एमएल सिरिंज में स्थानांतरित करें। यह पेलेट को परेशान किए बिना सेंट्रीफ्यूज ट्यूब से नमूना वसूली की अनुमति देता है।
    2. लोड करने के लिए नमूना लूप सेट करें। लोडिंग पोर्ट में सिरिंज से नमूने के 600-700 μL को इंजेक्ट करके 500 μL नमूना लूप को ओवरफिल करें। उपयोग किए गए सिस्टम के आधार पर, इस लोडिंग चरण को विधि में प्रोग्राम किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोई गलती नहीं की गई है।
    3. विधि के दौरान, कॉलम के लिए अनुशंसित प्रवाह दर और दबाव पर एसईसी बफर के 4 एमएल के साथ खाली करके लूप से नमूने को कॉलम में इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. स्तंभ को समान प्रवाह दर पर तब तक चलाएँ जब तक कि बफर के 1.5 कॉलम वॉल्यूम (24 एमएल कॉलम के लिए 36 एमएल) नीचे न गुजर जाएं।
    5. कॉलम वॉल्यूम के 0.25 (24 एमएल कॉलम के लिए 6 एमएल) पर, 90 अंशों को इकट्ठा करने के लिए 0.2 एमएल अंश एकत्र करना शुरू करें।
      नोट: चूंकि कॉलम की शून्य मात्रा 0.3 कॉलम वॉल्यूम होने की उम्मीद है, इससे तुरंत पहले अंशों का संग्रह शुरू करना यह सुनिश्चित करता है कि सभी प्रोटीन के क्षालन की निगरानी की जाती है, जिसमें शून्य मात्रा में मौजूद कोई भी प्रोटीन शामिल है।

4. फ्लोरोसेंट ट्रेस संग्रह और विश्लेषण

  1. अंश कलेक्टर (चरण 3.2.5) से नमूने को 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें, और फ्लोरोसेंट सिग्नल पढ़ें।
    1. फ्लोरेसेंस रीडिंग लेने से पहले, एकत्र किए गए नमूनों को पतला करें। एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रयोगशाला-ग्रेड डिस्टिल्ड एच2ओ के 90 μL को एक जलाशय से एक अपारदर्शी फ्लैट बॉटम 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    2. यदि चरण 3.2.5 के दौरान अंशों को 96-वेल ब्लॉक में एकत्र किया गया था, तो ब्लॉक से अपारदर्शी फ्लैट बॉटम 96-वेल प्लेट में एसईसी अंशों के 10 μL को स्थानांतरित करने के लिए एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें, और ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। अन्यथा, यदि चरण 3.2.5 के दौरान एसईसी अंशों को अलग-अलग ट्यूबों में एकत्र किया गया था, तो प्रत्येक अंश के 10 μL को अपारदर्शी फ्लैट बॉटम 96-वेल प्लेट में एक-एक करके स्थानांतरित करें, नमूनों को मिलाने के लिए हर बार ऊपर और नीचे करें।
    3. अपारदर्शी फ्लैट बॉटम 96-वेल प्लेट को प्लेट रीडर में रखें, और फ्लोरेसेंस को मापें। यदि जीएफपी फ्लोरोसेंट लेबल (यहां उपयोग किया जाता है) है, तो उत्तेजना को 488 एनएम के जितना संभव हो उतना करीब सेट करें, और फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को 507 एनएम के जितना संभव हो उतना करीब पता लगाएं।
      नोट: फ्लोरेसेंस रीडिंग लेने से पहले आवश्यक कमजोर पड़ने की दर अभिव्यक्ति संस्कृति में मौजूद प्रोटीन की कुल मात्रा और उपयोग किए जा रहे प्लेट रीडर की संवेदनशीलता पर निर्भर करेगी। इस अध्ययन में दिखाए गए उदाहरणों में, नमूने पानी में 10 गुना पतला थे। शुरुआती बिंदु के लिए एक सुझाव के रूप में, अंशों को पता लगाने से पहले पानी या बफर में 5-10 गुना पतला किया जाना चाहिए। यदि रिकॉर्ड किया गया एफएसईसी ट्रेस सिग्नल विशेष रूप से कम है, तो इसके बजाय छोटे कमजोर पड़ने या यहां तक कि एक अस्पष्ट नमूना का उपयोग किया जा सकता है। इस अध्ययन में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया उपकरण एक प्लेट रीडर था जो 488 एनएम पर उत्तेजना और 507 एनएम पर फ्लोरोसेंट उत्सर्जन का पता लगाने में सक्षम था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. एफएसईसी निशान प्लॉट करें।
    1. प्लेट रीडर से डेटा को कच्चे प्रारूप (कच्चे पाठ या अल्पविराम-पृथक मान फ़ाइल) में निर्यात करें। इन कच्चे डेटा को एफएसईसी ट्रेस के वाई-अक्ष पर प्लॉट किया जाएगा।
    2. एक्स-अक्ष के लिए, उस मात्रा की गणना करें जिस पर प्रत्येक अंश एकत्र किया गया था। पहले कुएं को क्षालन मात्रा की आवश्यकता होती है जिस पर विभाजन देरी (इस उदाहरण में 6 एमएल) के लिए पहला अंश एकत्र किया गया था। इसके बाद के अंशों को क्रमिक रूप से एकत्रित अंश मात्रा (इस उदाहरण में 0.2 एमएल) से बढ़ना चाहिए।
    3. एक बार एक्स-अक्ष और वाई-अक्ष डेटा की गणना हो जाने के बाद, डेटा को ग्राफिंग सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) में कॉपी और पेस्ट करें ताकि प्रत्येक कुएं में फ्लोरोसेंट सिग्नल को उस मात्रा के खिलाफ प्लॉट किया जा सके जिस पर यह कॉलम से निकला था।
      नोट: चित्रा 1 एक FSEC प्रयोग चलाने के लिए आवश्यक चरणों का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है।
  3. FSEC निशान का विश्लेषण करें।
    1. शून्य मात्रा (24 एमएल कॉलम के लिए लगभग 8 एमएल) पर प्रोटीन क्षालन की मात्रा का आकलन करें, जो इंगित करता है कि प्रोटीन आकार में बहुत बड़ा है और संभवतः प्रकट / एकत्रित है।
    2. किसी भी बाद की चोटियों में प्रोटीन एल्यूटिंग की मात्रा का आकलन करें, जो मुड़े हुए प्रोटीन का संकेत देते हैं। यह प्रोटीन आकार के आधार पर 24 एमएल कॉलम के लिए 10 एमएल और 16 एमएल के बीच होने की उम्मीद है (जब डिटर्जेंट / लिपिड मिसेल के साथ जुड़ा हुआ है)। चोटी के आकार पर पूरा ध्यान दें, खासकर यदि यह 3-4 एमएल (24 एमएल कॉलम के लिए) से अधिक फैली एक व्यापक या विभाजित चोटी है, क्योंकि यह एक पॉलीस्प्रेट नमूने को इंगित करता है।
    3. मोनोमर शिखर में दर्ज अधिकतम संकेत को शून्य शिखर में अधिकतम संकेत से विभाजित करके मोनोमेरिक चोटी ऊंचाई और शून्य शिखर ऊंचाई के बीच अनुपात की गणना करें।
      नोट: यह मान मोनोस्प्रेसिटी इंडेक्स का प्रतिनिधित्व करता है और प्रोटीन की गुणवत्ता के मात्रात्मक माप की अनुमति देता है; बड़े मान सर्वोत्तम संभव गुणवत्ता का संकेत देते हैं, जबकि 1 से नीचे के मान समस्याग्रस्त नमूने का संकेत देते हैं, क्योंकि उनके पास मुड़े हुए प्रोटीन की तुलना में अधिक समेकित प्रोटीन होता है।
    4. यदि कई एफएसईसी रन की तुलना की जानी है और सबसे महत्वपूर्ण विशेषता प्रत्येक मामले में मोनोमर की मात्रा है, तो निशान को प्लेट रीडर (जैसे, आरएफयू) द्वारा दर्ज किए गए कच्चे संकेत के रूप में प्लॉट करें।
      नोट: यदि अनफोल्डेड प्रोटीन की तुलना में मोनोमर की मात्रा की तुलना अधिक महत्वपूर्ण है, तो सिग्नल को ट्रेस में न्यूनतम और अधिकतम रीडिंग का उपयोग करके कुल सिग्नल के प्रतिशत तक सामान्यीकृत किया जाना चाहिए, जो निशान के बीच समेकित और मोनोमेरिक प्रोटीन के बीच अनुपात में अंतर को बढ़ाएगा।

Figure 1
चित्र 1: FSEC प्रयोग चलाने के लिए आवश्यक चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (1) रुचि के फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन को व्यक्त करने वाली कोशिकाएं घुलनशील होती हैं। (2) कच्चे घुलनशीलता को पहले कम गति वाले स्पिन के साथ स्पष्ट किया जाता है, उसके बाद (3) एक उच्च गति स्पिन। (4) स्पष्ट नमूना सतह पर तैरने वाला लोड किया जाता है और एक उपयुक्त एसईसी कॉलम पर चलाया जाता है, और (5) अंश एकत्र किए जाते हैं। (6) अंशों के नमूने 96-वेल प्लेट में स्थानांतरित किए जाते हैं, और (7) एफएसईसी ट्रेस को प्लॉट करने के लिए प्लेट रीडर का उपयोग करके एक जीएफपी-फ्लोरोसेंट सिग्नल का पता लगाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Representative Results

सबसे पहले, इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्लेट रीडर के लिए ईजीएफपी का पता लगाने की गतिशील सीमा और निचली सीमाओं की जांच की गई थी। ज्ञात सांद्रता के एक शुद्ध ईजीएफपी मानक को 50 μL अंतिम मात्रा में 50 ng.μL-1, 25 ng.μL-1, 12.5 ng.μL-1, 6.25 ng.μL-1, 3.125 ng.1, 1.5625 ng.1, 1.5625 ng.1, 0.78125 ng.1, 0.78125 ng-1, और 507 nm के उत्सर्जन का उपयोग करके प्रतिदीप्ति को पढ़ा गया था। ). इस प्रयोग ने संकेत दिया कि प्लेट रीडर में प्रति कुएं ईजीएफपी-लेबल प्रोटीन के 30 एनजी की कम पहचान सीमा थी और सिग्नल संतृप्ति से पहले प्रति कुएं ईजीएफपी-लेबल प्रोटीन की 500 एनजी तक की गतिशील सीमा थी। निचली सीमा के लिए मान का उपयोग करना और यह मानते हुए कि प्रोटीन क्षालन कॉलम वॉल्यूम के 0.33 तक ही सीमित है, एसईसी कॉलम लोडिंग के लिए रुचि के ईजीएफपी लेबल प्रोटीन के 1.28 μg जितना कम आवश्यक है ताकि पता लगाने योग्य एफएसईसी सिग्नल देखा जा सके।

Figure 2
चित्रा 2: ईजीएफपी मानक वक्र। शुद्ध ईजीएफपी मानक के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल का स्कैटर ग्राफ 50 एनजीएल-1, 25 एनजीएल-1, 12.5 एनजीएल-1, 6.25 एनजीएल-1, 3.125 एनजीएल-1, 1.5625 एनजीएल-1, 0.78125, और 0.390625 एनजीएल-1 तक पतला हो गया। (ए) संतृप्त संकेत वाले सहित सभी कमजोर पड़ने प्रदर्शित होते हैं। (बी) एक ज़ूम-इन स्कैटर ग्राफ जिसमें केवल वे मानक शामिल हैं जो प्लेट रीडर की गतिशील सीमा में आते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

दूसरे, इस अध्ययन के लिए उपयोग किए गए 24 एमएल कॉलम को आणविक भार मानकों के साथ कैलिब्रेट किया गया था। एफएसईसी विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले समान बफर और रनिंग स्थितियों का उपयोग करते हुए, आणविक भार मानक ब्लू डेक्सट्रान (>2,000 केडीए), फेरिटिन (440 केडीए), एल्डोलेस (158 केडीए), कॉनल्ब्यूमिन (75 केडीए), और ओवलब्यूमिन (43 केडीए) को व्यक्तिगत रूप से इंजेक्ट किया गया और कॉलम के माध्यम से चलाया गया, और क्षालन निशान 280 एनएम अवशोषण पर एकत्र किए गए। दर्ज की गई क्षालन मात्रा क्रमशः 8.9 एमएल, 12.4 एमएल, 15.2 एमएल, 16.9 एमएल और 18 एमएल थी। जब इन क्षालन खंडों को Kav (समीकरण 1) में परिवर्तित किया गया और लॉग आणविक भार के खिलाफ प्लॉट किया गया, तो एक मानक वक्र फिट हो सकता है। इसने इस अध्ययन में परीक्षण किए गए जीपीसीआर के आणविक भार को मानक वक्र (चित्रा 3) के प्रक्षेप द्वारा अनुमानित करने की अनुमति दी। उदाहरण के लिए, डिटर्जेंट डीडीएम में घुलनशीलता के बाद जीपीसीआर सेरोटोनिन रिसेप्टर 2 ए (5 एचटी2 एआर) के एफएसईसी ट्रेस ने 13.4 एमएल की क्षालन मात्रा का संकेत दिया। यह 5एचटी2 एआर क्षालन मात्रा फेरिटिन और एल्डोलेस के लिए दर्ज उन क्षालन मात्राओं के बीच आती है और लगभग 300 केडीए का अनुमानित आणविक भार प्रदान करती है। इस अध्ययन में प्रयुक्त 5HT2AR निर्माण लगभग 50 kDA (ईजीएफपी टैग सहित) है, जिसका अर्थ है कि यदि 5HT2AR को मोनोमेरिक माना जाता है, तो 250 kDA आणविक भार को DDM डिटर्जेंट / लिपिड मिसेल के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। क्षालन खंडों के रूपांतरण के लिए समीकरण निम्नानुसार है (समीकरण 1):

Equation 1(समीकरण 1)

जहां Ve क्षालन आयतन है, V0 स्तंभ शून्य आयतन है, और Vc कुल स्तंभ आयतन है।

Figure 3
चित्र 3: आणविक भार मानकों का उपयोग करके एसईसी कॉलम का अंशांकन वक्र। (A) 5HT 2A R का एक प्रतिनिधिFSECट्रेस DDM में घुलनशील है, जिसमें आणविक भार मानकों ब्लू डेक्सट्रान (शून्य), फेरिटिन, एल्डोलेस, कोनल्ब्यूमिन और ओवलबुमिन के सापेक्ष क्षालन पदों को चिह्नित किया गया है। फेरिटिन, एल्डोलेस, कॉनएल्ब्यूमिन और ओवलब्यूमिन क्रमशः हरे, बैंगनी, लाल और सियान में रंगीन होते हैं। (बी) केएवी (समीकरण 1) में रूपांतरण के बाद मानकों के क्षालन स्थितियों का उपयोग करके आणविक भार अंशांकन वक्र को लॉग आणविक भार (एमआर) के खिलाफ प्लॉट किया गया है। डीडीएम में 5एचटी2 एआर के एम आर को केएवी का उपयोग करके वक्र से इंटरपोलेट किया गया था और इसे वक्र (नीला वर्ग) पर प्रदर्शित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एफएसईसी का उपयोग तब जीपीसीआर स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट रिसेप्टर (एस1 पीआर 1)15 की गुणवत्ता और गुणों का आकलन करने के लिए किया गया था। जीएफपी-टैग किए गए मानव एस 1 पीआर1 को व्यक्त करने वाली कीट कोशिकाओं को प्रोटोकॉल (चित्रा 1) में वर्णित एफएसईसी के लिए संसाधित किया गया था।

सबसे पहले, एसएमए (चित्रा 4 ए) के साथ डिटर्जेंट-मुक्त निष्कर्षण के खिलाफ डिटर्जेंट डीडीएम और एलएमएनजी का परीक्षण करके इष्टतम झिल्ली निष्कर्षण स्थितियों का पता लगाया गया था। मोनोस्प्रेड नमूने (14-15 एमएल कॉलम प्रतिधारण) की तुलना में प्रोटीन नमूने की गुणवत्ता और शून्य (~ 8 एमएल कॉलम प्रतिधारण) में प्रोटीन के बीच अनुपात का आकलन करने के लिए मोनोस्प्रेसिटी इंडेक्स का उपयोग किया गया था। एलएमएनजी में घुलनशील नमूना ने एक बेहतर मोनोमर पीक आकार और कम प्रोटीन एग्रीगेट पीक के साथ एक बेहतर एफएसईसी प्रोफाइल प्रदर्शित किया, यह दर्शाता है कि एलएमएनजी में घुलनशीलता और शुद्धि इस झिल्ली प्रोटीन के लिए सबसे स्थिर स्थितियां थीं। इसके विपरीत, डीडीएम में घुलनशील नमूना में अपेक्षाकृत खराब एफएसईसी प्रोफ़ाइल थी, जिसमें एक बड़ा समग्र शिखर और एक व्यापक मोनोमेरिक शिखर था, जो नमूने में पॉलीस्प्रेसिटी का संकेत देता था।

दूसरे, घुलनशीलता के दौरान नमूने में स्फिंगोसिन -1-फॉस्फेट (एस 1 पी) जोड़कर एफएसईसी प्रोफाइल पर लिगैंड जोड़कर लिगैंड जोड़कर प्रभाव की जांच की गई थी। इस उदाहरण में, डीडीएम का उपयोग घुलनशील अभिकर्मक के रूप में किया गया था, और एस 1 पी की उपस्थिति और अनुपस्थिति में एस1 पीआर 1 के एफएसईसी निशान की तुलना की गई थी (चित्रा 4 बी)। एस 1 पी की उपस्थिति में घुलनशील नमूना ने कम एकत्रीकरण के साथ एक बेहतर एफएसईसी ट्रेस दिखाया। इसने संकेत दिया कि लिगैंड की उपस्थिति में शुद्धिकरण समाधान में रिसेप्टर को स्थिर करके प्रोटीन नमूना गुणवत्ता में सुधार के लिए फायदेमंद था, लेकिन प्रोटीन गतिविधि के सरोगेट मार्कर के रूप में भी फायदेमंद था, क्योंकि परिणामों ने सुझाव दिया कि प्रोटीन सही ढंग से मुड़ा हुआ था और लिगैंड बाइंडिंग के लिए सक्षम था।

Figure 4
चित्र 4: S1PR 1 के कच्चे अर्क का उपयोग करकेFSEC इष्टतम झिल्ली निष्कर्षण स्थितियों और लिगैंड बाइंडिंग को दर्शाता है। (A) S1PR 1 के FSEC निशानकी तुलना स्टाइलिन-मैलिक एसिड सह-बहुलक (SMA; नीला), लॉरिल माल्टोज नियोपेंटाइल ग्लाइकोल (LMNG; लाल), या डोडेसिल माल्टोसाइड (DDM; काला) में घुलनशील है। (बी) एगोनिस्ट स्फिंगोसिन-1-फॉस्फेट (एस1 पी) की उपस्थिति (लाल) या अनुपस्थिति (काला) में डीडीएम में घुलनशील एस 1 पीआर 1 के एफएसईसी निशान की तुलना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एफएसईसी का उपयोग विभिन्न परिस्थितियों में 5एचटी2 एआर की दीर्घकालिक स्थिरता की जांच करने के लिए भी किया गया था। जीएफपी-टैग किए गए मानव 5एचटी2 एआर को डिटर्जेंट (डीडीएम) या एसएमए बहुलक में कीट कोशिका झिल्ली से घुलनशील किया गया था और 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर भंडारण के बाद कई समय बिंदुओं पर एफएसईसी द्वारा विश्लेषण किया गया था (चित्रा 5)। इनक्यूबेशन के कई दिनों के बाद, डीडीएम में 5एचटी2 ए आर नेकिसी भी तापमान पर मोनोमेरिक पीक ऊंचाई में महत्वपूर्ण गिरावट प्रदर्शित की, और कुल शिखर में महत्वपूर्ण वृद्धि देखी गई। इसके विपरीत, एसएमए लिपिड कण (एसएमएएलपी) में 5एचटी2 एआर ने प्रयोग के दौरान मोनोमेरिक पीक ऊंचाई में महत्वपूर्ण गिरावट नहीं दिखाई, यह दर्शाता है कि एसएमएलपी में प्रोटीन प्रतिकूल तापमान पर भी लंबे समय तक स्थिर रहा। सतह प्लास्मोन अनुनाद (एसपीआर) प्रयोगों जैसे डाउनस्ट्रीम बायोफिज़िकल अनुप्रयोगों के लिए प्रोटीन की तैयारी पर विचार करते समय यह महत्वपूर्ण हो सकता है, जिसके लिए बाध्यकारी प्रयोगों के सफल समापन के लिए नमूने को लंबे समय तक स्थिर और सक्रिय होने की आवश्यकता होती है।

Figure 5
चित्र 5: DDM या SMALP का उपयोग करके झिल्ली से निकाले गए 5HT2AR की गुणवत्ता पर समय और तापमान का प्रभाव, जैसा कि FSEC द्वारा विश्लेषण किया गया है। (A) 5HT 2A R के प्रतिनिधिFSECनिशान DDM में घुलनशील होते हैं और 1 दिन (ग्रे), 2 दिन (हरा), या 5 दिनों (नीले) के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत होते हैं। (बी) 4 डिग्री सेल्सियस (ग्रे) या आरटी (काले) पर संग्रहीत एसएमएएलपी नमूनों की तुलना में 4 डिग्री सेल्सियस (नीला) या आरटी (हरा) पर संग्रहीत डीडीएम नमूनों के लिए सामान्यीकृत मोनोमेरिक पीक ऊंचाई के हिस्टोग्राम। त्रुटि पट्टियाँ SEM के प्रतिनिधि हैं. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

एफएसईसी के साथ स्थिति स्क्रीनिंग के लिए सामान्य व्यवस्थित दृष्टिकोण जो यहां प्रस्तुत किए गए हैं, झिल्ली प्रोटीन के उत्पादन के लिए घुलनशीलता और शुद्धिकरण मापदंडों के तेजी से अनुकूलन की अनुमति देते हैं। इसका मतलब है कि बायोफिज़िकल और संरचनात्मक अध्ययन के लिए स्थिर और कार्यात्मक रूप से सक्रिय झिल्ली प्रोटीन का तेजी से उत्पादन किया जा सकता है। इसके अलावा, एफएसईसी को प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके चलाया जा सकता है जो संभवतः झिल्ली प्रोटीन प्रयोगशालाओं में पहले से ही मौजूद हैं, और इस प्रकार, परख चलाने के लिए एक विशेषज्ञ उपकरण की खरीद की कोई आवश्यकता नहीं है।

महत्वपूर्ण कदम
डिटर्जेंट में कोशिकाओं से घुलनशीलता के बिंदु से उस बिंदु तक का समय लगता है जिस पर नमूना एसईसी कॉलम (चरण 2.1.5-3.2.5) से गुजरता है, समय महत्वपूर्ण है, और इन चरणों के बीच कोई विराम नहीं होना चाहिए। सभी चरणों को 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर आयोजित किया जाना चाहिए, और इन चरणों को करने में लगने वाले समय को न्यूनतम संभव रखने की आवश्यकता है। किसी भी संभावित प्रकटन या गिरावट से पहले झिल्ली प्रोटीन के लिए एफएसईसी प्रोफाइल को रिकॉर्ड करने के लिए ये समय और तापमान की बाधाएं आवश्यक हैं। झिल्ली प्रोटीन को घुलनशील होने के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर भी प्रकट, एकत्रीकरण और गिरावट का अधिक जोखिम होता है। आदर्श रूप से, कोई भी नमूना जिसके लिए एफएसईसी निशान की तुलना की जानी है, उसे घुलनशीलता चरण के बाद उसी समय में एसईसी कॉलम को पारित करना चाहिए। व्यवहार में, यह मुश्किल है, खासकर अगर नमूने एक कॉलम के नीचे क्रमिक रूप से पारित किए जाते हैं, लेकिन एक दूसरे के 3 घंटे के भीतर पांच एसईसी निशान एकत्र करना संभव है, और इस समय सीमा में, महत्वपूर्ण गिरावट नहीं होनी चाहिए।

समस्या निवारण
यदि, एफएसईसी प्रयोग करने पर, कम या कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं है, तो यह संभव है कि रुचि के झिल्ली प्रोटीन ने चुनी हुई सेल लाइन को व्यक्त नहीं किया है, चुने हुए सेल लाइन की बहुत कम अभिव्यक्ति है, या चुने हुए डिटर्जेंट में घुलनशील नहीं किया गया है। यदि प्रतिदीप्ति संकेत एकत्र करने और एफएसईसी ट्रेस को रिकॉर्ड करने से पहले नमूनों को पतला किया गया था, तो एक सरल पहला कदम एसईसी अंशों को कम कमजोर करने या कमजोर करने की कोशिश करना होगा। यदि यह अभी भी एक व्याख्या योग्य एफएसईसी ट्रेस नहीं देता है, तो प्रोटीन की अभिव्यक्ति और घुलनशीलता की जांच की जानी चाहिए।

चरण 2.2.2 के बाद नमूने की प्रतिदीप्ति की जांच करके प्रोटीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण प्राप्त किया जा सकता है। यदि इस नमूने से बहुत कम या कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल नहीं है (उदाहरण के लिए, पृष्ठभूमि के बहुत करीब एक संकेत), तो प्रोटीन अभिव्यक्ति के साथ एक समस्या होने की संभावना है। झिल्ली प्रोटीन के अभिव्यक्ति स्तर में सुधार के लिए कदम उठाए जा सकते हैं, जैसे कि एक वैकल्पिक सेल लाइन पर स्विच करना या विकास की स्थिति को समायोजित करना, अभिव्यक्ति का प्रेरण, और प्रेरण / संक्रमण / अभिकर्मक और फसल के बीच का समय। हालांकि, विशेष रूप से खराब प्रोटीन अभिव्यक्ति एक अस्थिर झिल्ली प्रोटीन का संकेत दे सकती है और इस प्रकार, एक खराब निर्माण विकल्प।

यदि अभिव्यक्ति की जांच की गई है और एफएसईसी से पहले पृष्ठभूमि के ऊपर एक स्पष्ट फ्लोरोसेंट सिग्नल है, तो चरण 2.2.2 (कुल प्रोटीन) के बाद नमूने की तुलना में चरण 2.4.3 (घुलनशील झिल्ली प्रोटीन) के बाद नमूने के शेष फ्लोरोसेंट सिग्नल को मापकर घुलनशीलता दक्षता की जांच की जा सकती है। घुलनशीलता दक्षता के लिए 20% -30% होना आम है और अभी भी झिल्ली प्रोटीन के सफल विश्लेषण और शुद्धिकरण की अनुमति देता है। हालांकि, यदि घुलनशीलता दक्षता 20% से कम है, तो घुलनशीलता या विभिन्न घुलनशीलता स्थितियों के लिए एक अलग डिटर्जेंट की आवश्यकता हो सकती है। यदि घुलनशीलता में सुधार के प्रयास सफल नहीं होते हैं, तो यह एक विशेष रूप से अस्थिर झिल्ली प्रोटीन का संकेत दे सकता है और इस प्रकार, एक खराब निर्माण विकल्प।

यदि एफएसईसी ट्रेस (जैसे, 18-24 एमएल) में बहुत देर से एल्यूटिंग पीक देखा जाता है, तो यह इंगित करता है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन में प्रोटीन आणविक भार होता है जो अपेक्षा से बहुत कम होता है। यह ब्याज के झिल्ली प्रोटीन के अवक्रमित होने के कारण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप "मुक्त" जीएफपी हो सकता है। किसी को यह जांचना चाहिए कि क्या प्रोटीन इन-जेल जीएफपी फ्लोरेसेंस का उपयोग करके घुलनशीलता से पहले और बाद में बरकरार है। यदि रुचि का प्रोटीन कम हो रहा है या प्रोटियोलाइज्ड है, तो प्रोटीज अवरोधक की मात्रा को दो गुना से चार गुना तक बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, घुलनशीलता से पहले भी प्रोटीज या अवक्रमित प्रोटीन के प्रति उच्च संवेदनशीलता एक विशेष रूप से अस्थिर प्रोटीन का संकेत दे सकती है और इस प्रकार, एक खराब निर्माण विकल्प।

FSEC के संशोधन और आगे अनुप्रयोग
आमतौर पर, एफएसईसी में उपयोग किया जाने वाला फ्लोरोसेंट टैग जीएफपी या ईजीएफपी है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है। हालांकि, कई अलग-अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग उपलब्ध हैं। उपयोग किए जाने वाले फ्लोरोसेंट टैग की पसंद एक प्लेट रीडर होने पर निर्भर करती है जो चयनित फ्लोरोसेंट टैग के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल रिकॉर्ड करने के लिए सही उत्तेजना और उत्सर्जन मापदंडों को प्राप्त कर सकती है और विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों में क्वांटम उपज में बहुत कम बदलाव के साथ फ्लोरोफोरे हो सकती है। इसके अलावा, एफएसईसी फ्लोरोसेंट प्रोटीन तक ही सीमित नहीं है, लेकिन एक प्रोटीन के साथ भी समान रूप से अच्छी तरह से काम कर सकता है जिसे फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया है। उदाहरण के लिए, एक एनटीए डाई का उपयोग किया जा सकता है, जो हिस्टिडाइन-टैग झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं से अनुकूल रूप से बंधेगा। इसके अलावा, या तो फ्लोरोसेंट डाई के साथ रासायनिक रूप से लेबल किया गया एक फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी और रुचि के झिल्ली प्रोटीन को बांधने के लिए विशिष्ट या झिल्ली प्रोटीन निर्माण में शामिल शुद्धिकरण टैग अप्रत्यक्ष रूप से एफएसईसी के लिए एक लक्ष्य लेबल कर सकता है।

एफएसईसी का उपयोग करके डिटर्जेंट स्क्रीनिंग करते समय, इस बारे में एक विकल्प बनाया जा सकता है कि एसईसी कॉलम को चलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर में मिलान डिटर्जेंट होना चाहिए या क्या सभी रन में एक मानक डिटर्जेंट का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रोटीन के व्यवहार का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त किया जाएगा यदि पूरे प्रयोग को मिलान डिटर्जेंट के साथ किया जाता है। हालांकि, यह समय लेने वाला और डिटर्जेंट की बर्बादी हो सकता है यदि कॉलम को प्रत्येक रन करने से पहले एक नए डिटर्जेंट में फिर से जोड़ा जाना चाहिए। इसके अलावा, जैसा कि डिटर्जेंट स्क्रीनिंग का मुख्य उद्देश्य निशान की तुलना करना है, रुझान निशान में बने रहेंगे, भले ही स्थितियां आदर्श न हों। इस प्रकार, एक समझौता किया जा सकता है जिससे प्रोटीन को ब्याज के डिटर्जेंट में घुलनशील किया जाता है, लेकिन कॉलम को सभी रन (जैसे, डीडीएम) 11 में एकल डिटर्जेंट के साथ एक मानक बफर में चलाया जाता है, जो समय और डिटर्जेंट उपभोग्य सामग्रियों को बचा सकता है।

उपयोग किए गए एफएलपीसी उपकरण को संशोधित करके, एफएसईसी प्रोटोकॉल के थ्रूपुट को काफी बढ़ाया जा सकता है, और नमूना आवश्यकता को कम किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक एफपीएलसी या एचपीएलसी प्रणाली को एक ऑटोसैंपलर, एक छोटे बेड वॉल्यूम विश्लेषणात्मक कॉलम (जैसे 3.2 एमएल विश्लेषणात्मक एसईसी कॉलम), और कॉलम से सीधे निरंतर एफएसईसी निशान की निगरानी के लिए एक इन-लाइन फ्लोरोसेंट डिटेक्टर से लैस किया जा सकता है। परिणामी सेटअप कम समय में अधिक एफएसईसी रन करने की अनुमति देगा और मैन्युअल प्लॉटिंग चरण को हटा देगा, इस प्रकार कम समय सीमा में अधिक संख्या में स्थितियों का परीक्षण करने की अनुमति देगा। इसके अलावा, नमूना आवश्यकता को और कम किया जाएगा, क्योंकि प्रत्येक रन के लिए एफएसईसी कॉलम पर कम नमूने तैयार और लोड किए जाने होंगे। यह अभिव्यक्ति संस्कृतियों को प्लेट-आधारित प्रारूप में कम करने की संभावनाओं को खोल देगा, क्योंकि विश्लेषण के लिए ऐसी कम सामग्री की आवश्यकता होगी।

अन्य तरीकों की तुलना में एफएसईसी की ताकत और कमजोरियां
एफएसईसी का एक नुकसान यह है कि झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं को फ्लोरोसेंट लेबल पेश करने के लिए डिज़ाइन करने की आवश्यकता होती है, और परिचय पर, एक छोटी सी संभावना है कि लेबल का प्लेसमेंट रुचि के झिल्ली प्रोटीन के कार्य या तह में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, एफएसईसी प्रोटोकॉल, जैसा कि यहां वर्णित है, सेल लाइसेट की उपस्थिति में एक झिल्ली प्रोटीन की विशेषताओं की निगरानी करता है, जो प्रोटीन का एक कच्चा मिश्रण है। इस वातावरण में एक झिल्ली प्रोटीन का व्यवहार उस समय से भिन्न हो सकता है जब रुचि के झिल्ली प्रोटीन को अन्य प्रोटीनों से पूरी तरह से अलग होने पर शुद्धिकरण के अंत में एक प्रारंभिक एसईसी कॉलम के अधीन किया जाता है। इसके अलावा, एफएसईसी प्रोटीन की गुणवत्ता का कुछ गुणात्मक उपाय प्रदान करता है। हालांकि, एफएसईसी ट्रेस को मोनोडिस्पर्सिटी इंडेक्स में परिवर्तित करके, जैसा कि प्रोटोकॉल के चरण 4.3.3 में वर्णित है, प्रोटीन की गुणवत्ता का एक मात्रात्मक माप प्राप्त किया जा सकता है।

एफएसईसी एकमात्र विधि नहीं है जिसका उपयोग झिल्ली प्रोटीन संरचनाओं, घुलनशीलता की स्थिति और शुद्धिकरण बफर संरचना के शुरुआती विश्लेषण में किया जा सकता है। वैकल्पिक दृष्टिकोणों में एफएसईसी पर फायदे और नुकसान दोनों हैं। उदाहरण के लिए, फ्लोरोफोरे-आधारित थर्मोस्टेबिलिटी परख मौजूद हैं, विशेष रूप से डाई 7-डायथाइलमिनो-3-(4'-मेलिमिडिलफेनिल)-4-मिथाइलकौमेरिन (सीपीएम) 16,17 का उपयोग। इस विधि का लाभ यह है कि, एफएसईसी के विपरीत, जो प्रोटीन की गुणवत्ता का गुणात्मक माप प्रदान करता है, थर्मोस्टेबिलिटी परख सापेक्ष पिघलने के तापमान के रूप में एक मात्रात्मक माप प्रदान करते हैं। इसके अलावा, प्रोटीन निर्माण पर फ्लोरोसेंट टैग पेश करने की कोई आवश्यकता नहीं है। हालांकि, एफएसईसी की तुलना में थर्मोस्टेबिलिटी परख के नुकसान यह हैं कि शुद्ध प्रोटीन का उपयोग किया जाना चाहिए और परख सभी प्रोटीन संरचनाओं के साथ संगत नहीं है, क्योंकि यह मुड़े हुए प्रोटीन में देशी सिस्टीन अवशेषों की लाभप्रद स्थितियों पर निर्भर करता है।

एक और विधि जिसमें एफएसईसी और फ्लोरोफोरे-आधारित थर्मोस्टेबिलिटी परख दोनों के साथ समानताएं हैं, एक परख है जो झिल्ली प्रोटीन की तापमान संवेदनशीलता को मापती है। इस परख में, प्रोटीन को विभिन्न तापमानों के साथ चुनौती दी जाती है, और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद समाधान में रहने वाले प्रोटीन का पता लगाया जाता है। इस पद्धति में पता लगाने का कई तरीकों से आयोजन किया गया है, जिसमें समाधान18 में प्रतिदीप्ति को मापना, एसडीएस-पेज जेल बैंड19 की प्रतिदीप्ति, या पश्चिमी धब्बा20 में सिग्नल तीव्रता शामिल है। हालांकि, इन दृष्टिकोणों का एक महत्वपूर्ण नुकसान यह है कि परख बहुत श्रम-गहन है और परिणामों में उच्च शोर से ग्रस्त है, क्योंकि प्रत्येक व्यक्तिगत तापमान बिंदु को स्वतंत्र रूप से एकत्र किया जाना चाहिए।

अंत में, कई और उन्नत बायोफिज़िकल तकनीकों का उपयोग एफएसईसी के समान तरीके से झिल्ली प्रोटीन की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, प्रवाह-प्रेरित फैलाव विश्लेषण21, माइक्रोस्केल थर्मोफोरेसिस22, या एसपीआर। यद्यपि बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण हैं, इन विधियों का नुकसान विश्लेषण चलाने के लिए अत्यधिक विशिष्ट उपकरणों की आवश्यकता है।

निष्कर्ष में, एफएसईसी झिल्ली प्रोटीन उत्पादन अभियानों में उपयोग के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करता है, और हालांकि यह एकमात्र विकल्प नहीं है, लेकिन ऊपर सूचीबद्ध अन्य तरीकों पर इसके कई अलग-अलग फायदे हैं। ऑर्थोगोनल परख द्वारा परिणामों के क्रॉस-सत्यापन की हमेशा सिफारिश की जाती है, और ऊपर चर्चा की गई विधियों में से कोई भी पारस्परिक रूप से एक दूसरे से अनन्य नहीं है।

Disclosures

पीक प्रोटीन एक अनुबंध अनुसंधान संगठन है जो शुल्क के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति, शुद्धि, मास-स्पेक्ट्रोमेट्री और संरचनात्मक निर्धारण प्रदान करता है।

Acknowledgments

हम पूरी पीक प्रोटीन टीम की मदद और समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं। सेल विज्ञान टीम से, हम कीट सेल अभिव्यक्ति में अपनी मूल्यवान अंतर्दृष्टि और मार्गदर्शन के लिए इयान हैम्पटन को स्वीकार करना चाहते हैं। हम इस परियोजना को आगे बढ़ाने के लिए संसाधन और अवसर प्रदान करने के लिए मार्क एबॉट को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL and 5 mL plastic syringes  Generic  -  Syringes for transfer of samples 
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail Abcam ab201111 Protease inhibitors
15 mL tubes   Generic  -  15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation  
2 mL ultra-centrifuge tubes Beckman Coulter  344625  Tubes for ultra-centrifuge rotor 
50 mL tubes Generic  -  50 mL tubes for cell harvest 
96 deep-well blocks  Greiner 15922302 For collecting 0.2 mL SEC fractions 
ÄKTA  V9-L loop valve Cytiva  29011358 5 posiiton loop valve  for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA F9-C fraction collector Cytiva  29027743 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA pure 25 L Cytiva  29018224  FPLC system for running the experiment 
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)   Fisher Scientific  15828722  Centrifuge for low-speed spin 
Blunt end filling needles  Generic  -  For transfer of samples 
Bottle top vacuum filter  Corning 10005490 Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers
Cholesteryl hemisuccinate (CHS)  Generon  CH210-5GM  Additive for detergent solubilisation  
Disposable multichannel reseviour  Generic  -  Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate
Dodecyl maltoside (DDM)  Glycon  D97002-C-25g  Detergent for solubilisation 
eGFP protein standards BioVision K815-100 eGFP standards for fluorescent calibration curve 
Glycerol Thermo Scientific  11443297 Glycerol for buffer preparation
HEPES Thermo Scientific  10411451 HEPES for buffer preparation
High molecular weight SEC calibration standards kit Cytiva  28403842 Molecular weight calibration kit for SEC
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)  Generon  NB-19-0055-5G  Detergent for solubilisation 
Low molecular  weight SEC calibration standards kit Cytiva  28403841 Molecular weight calibration kit for SEC
MLA-130 ultra-centrifuge rotor Beckman Coulter  367114  Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate  Corning 10656853 96-well for reading fluorescent signal in plate reader 
Optima MAX-XP ultra-centrifuge Beckman Coulter  393315  Centrifuge for high-speed spin 
pH meter Generic  -  For adjusting the pH of buffers during preparation
Prism GraphPad -  Graphing software for plotting traces
Rotary mixer  Fisher Scientific  12027144  Mixer for end over end mixing in the cold 
Sodium chloride Fisher Scientific  10316943 Sodium chloride for buffer preparation
Sodium hydroxide Fisher Scientific  10488790 Sodium hydroxide for buffer preparation
Spectramax ID3 Plate Reader Molecular Devices 735-0391 Micro-plate reader capable of reading fluorescence
Stirrer plate Generic  -  For stirring buffers during preparation
Styrene maleic acid (SMA)  Orbiscope  SMALP 300  Polymer for detergent free extraction 
Superdex 200 Increase 10/300 GL  Cytiva  28990944  SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.
Vacuum pump Sartorius 16694-2-50-06 For filtering and degassing buffers

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References

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जैव रसायन अंक 191
फ्लोरोसेंट आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा झिल्ली प्रोटीन गुणवत्ता का तेजी से मूल्यांकन
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Rejnowicz, E., Wright, J., Veldman-Jones, M., Harborne, S. Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography. J. Vis. Exp. (191), e64322, doi:10.3791/64322 (2023).

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