Summary
Detta protokoll beskriver ett förfarande för att utföra fluorescerande storleksuteslutningskromatografi (FSEC) på membranproteiner för att bedöma deras kvalitet för nedströms funktionell och strukturell analys. Representativa FSEC-resultat som samlats in för flera G-proteinkopplade receptorer (GPCR) under tvätt- och rengöringsmedelslösliga förhållanden presenteras.
Abstract
Under membranproteinstrukturell belysning och biofysisk karakterisering är det vanligt att prova många proteinkonstruktioner som innehåller olika taggar, trunkeringar, deletioner, fusionspartnerinsatser och stabiliserande mutationer för att hitta en som inte aggregeras efter extraktion från membranet. Dessutom är buffertscreening för att bestämma tvättmedel, tillsats, ligand eller polymer som ger det mest stabiliserande tillståndet för membranproteinet en viktig praxis. Den tidiga karakteriseringen av membranproteinkvalitet genom fluorescerande storleksuteslutningskromatografi ger ett kraftfullt verktyg för att bedöma och rangordna olika konstruktioner eller förhållanden utan krav på proteinrening, och detta verktyg minimerar också provbehovet. Membranproteinerna måste vara fluorescerande märkta, vanligtvis genom att uttrycka dem med en GFP-tagg eller liknande. Proteinet kan solubiliseras direkt från hela celler och sedan grovt klargöras genom centrifugering; Därefter överförs proteinet till en storleksuteslutningskolonn och ett fluorescerande spår samlas in. Här presenteras en metod för att köra FSEC och representativa FSEC-data på GPCR-målen sfingosin-1-fosfatreceptor (S1PR1) och serotoninreceptor (5HT2AR).
Introduction
Storleksuteslutningskromatografi (SEC), även känd som gelfiltreringskromatografi, används ofta i proteinvetenskap1. Under SEC separeras proteiner baserat på deras hydrodynamiska radie, vilket är en funktion av proteinstorleken och formen2. I korthet uppnås denna separation genom att applicera proteinproverna under flöde på en packad bädd av porösa pärlor som fungerar som en molekylsikt. Pärlorna som används är ofta tvärbunden agaros med ett definierat intervall av porstorlekar för att tillåta proteiner att antingen komma in eller uteslutas från porerna i pärlorna 3,4,5,6,7. Proteiner med mindre hydrodynamiska radier tillbringar en större andel tid i porerna och strömmar därmed genom den packade bädden i långsammare takt, medan större proteiner tillbringar en större andel tid utanför pärlorna (den uteslutna volymen) och rör sig genom den packade bädden i snabbare takt. SEC kan användas som ett proteinreningssteg när en preparativ kolonn används1. När en analytisk kolumn används kan SEC användas för att analysera proteinkvaliteten och egenskaperna2. Till exempel tenderar proteinaggregat som kan vara närvarande i ett prov och indikerar protein av dålig kvalitet att vara mycket stora, vilket innebär att de bara reser i den uteslutna volymen och därmed elueras från kolonnen vid den tidigaste punkten; Denna volym kallas kolumnen void eller void volume. Dessutom kan molekylviktstandarder användas för att kalibrera kolonnen, vilket gör det möjligt att interpolera en uppskattad molekylvikt för proteinet av intresse från en standardkurva.
Vanligtvis används proteinabsorbansen vid 280 nm för att övervaka proteinelueringen från en storleksuteslutningskolonn. Detta begränsar användningen av SEC som ett analysverktyg tills proteinet av intresse i stort sett är fritt från förorenande proteiner, till exempel vid det sista steget av proteinrening. Fluorescerande SEC (FSEC) använder emellertid ett protein av intresse som är fluorescerande märkt. Därför kan en fluorescerande signal användas för att specifikt övervaka elueringen av proteinet av intresse i närvaro av andra proteiner eller till och med råblandningar 8,9. Eftersom fluorescerande signaler är mycket känsliga kan dessutom framgångsrik analys utföras på prover med extremt låga proteinmängder. Proteinet av intresse är ofta fluorescerande märkt genom att inkludera ett grönt fluorescerande protein (GFP) eller förbättrad GFP (eGFP) -tagg i uttryckskonstruktionen. Den fluorescerande signalen kan sedan övervakas genom excitation vid 395 nm eller 488 nm och detektering av fluorescerande emission vid 509 nm eller 507 nm för GFP respektiveeGFP 10.
Fördelen med att använda en fluorescerande signal för att övervaka proteineluering från en SEC-kolonn gör FSEC till ett värdefullt verktyg för att analysera membranproteinprover när uttrycksnivåerna är särskilt dåliga jämfört med lösliga proteiner. Avgörande är att kvaliteten och egenskaperna hos membranproteiner kan analyseras direkt efter solubilisering från rålysat utan krav på att optimera reningsprocessen först11,12. Av dessa skäl kan FSEC användas för att snabbt analysera membranproteinkvaliteten samtidigt som man undersöker de olika faktorer som kan krävas för att förbättra membraneproteinets beteende i lösning. Till exempel är det vanligt att testa många konstruktioner som innehåller olika taggar, trunkeringar, deletioner, fusionspartnerinsatser och stabiliserande mutationer för att hitta en som inte aggregeras efter extraktion från membranet13,14. Dessutom kan buffertscreening för att bestämma tvättmedel, tillsats, ligand eller polymer som ger det mest stabiliserande tillståndet för membranproteinet definiera den bästa buffertkompositionen för proteinrening eller för att ge stabilitet för nedströms användning, såsom biofysiska analyser eller strukturell karakterisering.
Således är det övergripande målet med FSEC-metoden att samla in en SEC-kolonnelueringsprofil för ett målmembranprotein av intresse. Dessutom, när fluorescens används, samlas detta SEC-spår in så tidigt som möjligt i optimeringen av konstruktionerna och förhållandena före någon långvarig rening. FSEC-spåret kan användas som ett jämförande verktyg för att bedöma sannolikheten för framgång att rena ett membranprotein med olika buffertförhållanden eller membranproteinkonstruktioner. På detta sätt kan insamlingen av FSEC-profiler användas som en snabb iterativ process för att komma fram till optimal konstruktionsdesign och buffertkomposition innan man spenderar ansträngning på att generera de mängder rent protein som krävs för andra analysmetoder.
Protocol
1. Tvättmedel och buffertberedning för FSEC
- Förbered en tvättmedelslösning.
- För att bereda en 20 ml stamlösning, väg upp 4 g dodecylmaltosidpulver (DDM) och 0,4 g kolesterylhemisuccinat (CHS) pulver och gör det till 20 ml med destilleratH2Oav laboratoriekvalitet.
- Efter tillsats av alla komponenter, blanda med änd-över-änd-inversion vid 4 °C tills komponenterna är helt lösliga. End-over-end-blandning över natten vid 4 °C rekommenderas.
- Alikvot och förvara tvättmedelslagren vid −20 °C fram till användning. Om buljongen måste användas omedelbart, förvara tvättmedelslagret på is.
OBS: Standardtvättmedlet som användes i detta arbete var en 20% (w / v) DDM och 2% (w / v) CHS-blandning (se materialtabell). Olika tvättmedel kan användas (t.ex. laurylmaltosneopentylglykol; LMNG), eller användning av tvättmedelsfri extraktion med polymerer såsom styren-maleinsyra (SMA) kan testas. Detta måste beslutas vid utformningen av de experimentella förhållanden som ska testas.
- Förbered en löslighetsbuffert.
- Bered en lösningsbuffert genom att kombinera komponenternas korrekta vikt eller volym för att uppnå en slutlig koncentration av 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20 % (v/v) glycerol och 1x proteasinhibitorcocktail (se materialförteckning) i en bägare.
OBS: I den aktuella studien var beredningen av 50 ml löslighetsbuffert tillräcklig för bearbetning av fem prover. - Tillsätt en 0,7 volym (t.ex. 35 ml om 50 ml buffert) destillerad H2Oav laboratoriekvalitet till bägaren.
- Blanda på en magnetomrörare och justera buffertens pH till 7,5 med en pH-mätare genom droppvis tillsats av koncentrerad NaOH.
- Fyll bufferten med hjälp av en mätcylinder på den slutliga erforderliga volymen med destillerat H2Oav laboratoriekvalitet.
- Bered en lösningsbuffert genom att kombinera komponenternas korrekta vikt eller volym för att uppnå en slutlig koncentration av 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20 % (v/v) glycerol och 1x proteasinhibitorcocktail (se materialförteckning) i en bägare.
- Förbered SEC-körningsbufferten.
- Förbered SEC-körbufferten genom att kombinera komponenternas korrekta vikt eller volym för att uppnå en slutlig koncentration på 100 mM HEPES, 150 mM NaCl och 10% (v / v) glycerol i en bägare.
OBS: I den aktuella studien var det tillräckligt att förbereda 600 ml SEC-buffert för att köra fem prover. - Tillsätt en 0,7 volym (t.ex. 420 ml om man gör 600 ml buffert) destillerad H2Oav laboratoriekvalitet till bägaren.
- Blanda på en magnetomrörare och justera buffertens pH till 7,5 med en pH-mätare genom droppvis tillsats av koncentrerad NaOH.
- Fyll bufferten med hjälp av en mätcylinder på den slutliga erforderliga volymen med destillerat H2Oav laboratoriekvalitet.
- Filtrera SEC-bufferten genom ett flaskfilter på 0,45 μm por under vakuum (se materialförteckning).
- När bufferten har passerat genom filtret, avgasa den genom att lämna den under vakuum tills inga fler bubblor visas när den skakas.
- Lägg till en slutlig koncentration på 0,03% (w/v) DDM och 0,003% (w/v) CHS till SEC-bufferten genom att lägga till den erforderliga volymen av tvättmedelslagret som förberetts i steg 1 (t.ex. 0,9 ml om du gör 600 ml SEC-buffert).
- Förkyl bufferten före användning.
OBS: Olika buffertar kan användas beroende på de testade förhållandena. Till exempel, om man testar effekten av olika tvättmedel på proteinet av intresse, skulle en buffert med samma tvättmedel som den som används för att solubilisera proteinet helst behöva göras. Om du testar tvättmedelsfria förhållanden med SMA bör tvättmedel utelämnas helt från SEC-bufferten. Se dock diskussionsavsnittet för mer information om protokolländringar för tvättmedelsscreening.
- Förbered SEC-körbufferten genom att kombinera komponenternas korrekta vikt eller volym för att uppnå en slutlig koncentration på 100 mM HEPES, 150 mM NaCl och 10% (v / v) glycerol i en bägare.
2. Provberedning för FSEC
- Förbered cellpellets.
OBS: Utgångspunkten för analysen är att skörda cellpelleten från en suspensionscelluttryckskultur av GFP-märkt (eller annat fluorescerande märkt) protein av intresse. De exakta tidpunkterna och villkoren för skörd beror på proteinet som uttrycks, cellinjen som används, de förhållanden som cellerna som har odlats i och metoden genom vilken proteinuttryck har inducerats. Dessa detaljer ligger utanför tillämpningsområdet för detta protokoll. I denna studie användes 0,5-1 g Sf21-cellpellet per tillstånd som skulle testas, vilket motsvarar 25-50 ml odling 2-3 dagar efter infektion med cirka 4 x 106 viabla celler/ml av en 1:20 spädning av P2 baculovirus. Observera att protokollet som beskrivs här har testats och visat sig fungera lika bra med liknande våtvikter av cellpellets från andra eukaryota cellinjer (t.ex. HEK293E).- När cellerna från suspensionskulturerna är klara att skördas, överför 25-50 ml odlingsalikvoter till 50 ml koniska rör.
- Balansera rören och använd en bänkcentrifug i en utsvängbar hink (se materialtabell) vid 2 000 x g i 15 minuter vid rumstemperatur för att pellet cellerna.
- Ta bort och kassera odlingssupernatanten genom att försiktigt tippa bort den, eller använd en 50 ml pipett med ett pipetfyllmedel om cellpelleten är särskilt lös.
- Om cellerna ska användas omedelbart för analys, lägg cellpelleten på is och fortsätt direkt till steg 5. Om cellerna ska sparas för att användas i ett senare skede, frys cellerna genom att placera dem vid -80 °C.
- Om cellpelleten har förvarats vid -80 °C, tina den snabbt genom att inkubera den i rumstemperatur i 15 minuter eller tills provet inte längre är fryst. Flytta provet omedelbart till is efter detta steg.
- Sususpendera och lösligisera provet på nytt.
- Tillsätt 2 ml av löslighetsbufferten (steg 1.2) till cellpelleten.
- Inkubera med änd-över-ände inversion vid 4 °C i 15–30 minuter tills den är homogen.
- Tillsätt förblandat tvättmedel (steg 1.1) (t.ex. 100 μl 20 % DDM/2 % CHS) för en slutlig koncentration på 1 % DDM/0,1 % CHS.
- Lösas i 30 minuter med end-over-end-inversion vid 4 °C.
OBS: Om så önskas kan flera villkor testas parallellt. Antalet parallella prover som kan bearbetas samtidigt beror på det tillgängliga systemet för att köra SEC-experimentet. I den inställning som beskrivs här var det möjligt att bearbeta upp till fem prover åt gången.
- Utför ett centrifugeringssteg med låg hastighet.
- Centrifugera provet i en förkyld (4 °C) bänkcentrifug i en utsvängbar skopa vid 2 000 x g i 15 minuter.
- Utför ett höghastighetscentrifugeringssteg.
- Överför försiktigt supernatanten från låghastighetscentrifugeringen till ultracentrifugeringsrör (t.ex. 0,5-2 ml rör) genom att använda en trubbig nål fäst vid en 5 ml spruta, var försiktig så att du inte stör pelleten från låghastighetsspinnet.
- Balansera rörpar med en noggrannhet av 0,05 g och placera dem i en ultracentrifugeringsrotor med fast vinkel (se materialtabell).
- Centrifugera vid 4 °C i 30 minuter vid 250 000 x g.
3. Storleksuteslutningskromatografi (SEC)
- Förbered FPLC-systemet (Fast Protein Liquid Chromatography) och balansera kolonnen.
- Förbered systemet enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning), till exempel genom att fylla systemet med SEC-buffert och rensa pumparna från luft.
- Anslut SEC-kolumnen till FPLC och se till att ingen luft kommer in i kolonnen. Detta åstadkoms genom att applicera mottryck på SEC-kolonnen med en spruta fylld med vatten (fäst vid kolonnens botten) för att utföra en dropp-till-släpp-anslutning med FPLC-systemets flödesväg.
- Förbalansera SEC-kolonnen genom att tvätta den först i 1,5 kolonnvolymer (36 ml för en 24 ml kolonn) destillerad och filtrerad H2Oav laboratoriekvalitet, följt av 1,5 kolonnvolymer SEC-buffert vid rekommenderad flödeshastighet och tryck för kolonnen (se materialtabell).
OBS: FPLC-systemet som användes i denna studie för att utföra FSEC var i en kall miljö och hade en femläges slingventil och en sexläges plattfraktionsuppsamlare monterad. Med den här inställningen kan fem exempel läsas in och köras sekventiellt nedåt i samma kolumn på ett automatiserat sätt utan att kräva manuella åtgärder mellan körningarna. För att köra SEC-experimenten användes en kommersiellt tillgänglig förpackad 24 ml kolonn (se materialtabell), som innehöll ett harts som tillät proteiner i molekylviktområdet 10-600 kDa att lösas. Om proteinet av intresse är särskilt stort kan en alternativ kolonnmatris användas istället, vilket möjliggör separation av proteiner upp till 5 000 kDa i molekylvikt. Observera att närvaron av tvättmedel/lipidmicellen ökar membranproteinets totala storlek med >150 kDa, beroende på vilket protein och tvättmedel som används.
- Tillämpa exemplet på kolumnen och kör SEC-experimentet.
- Överför supernatanten från höghastighetscentrifugeringssteget till en 1 ml spruta med en trubbig nål fäst vid sprutan. Detta möjliggör provåtervinning från centrifugröret utan att störa pelleten.
- Ställ in exempelslingan så att den läses in. Överfyll en provslinga på 500 μl genom att injicera 600–700 μl av provet från sprutan i laddningsporten. Beroende på vilket system som används kan detta laddningssteg programmeras in i metoden för att säkerställa att inga misstag görs.
- Under metoden injiceras provet från slingan i kolonnen genom att tömma det med 4 ml SEC-buffert vid rekommenderad flödeshastighet och tryck för kolonnen (se materialtabell).
- Kör kolonnen med samma flödeshastighet tills 1,5 kolonnvolymer (36 ml för en 24 ml kolonn) av bufferten har gått ner.
- Vid 0,25 av kolonnvolymen (6 ml för en 24 ml kolonn) börjar du samla 0,2 ml fraktioner för att samla 90 fraktioner.
OBS: Eftersom kolonnens tomrumsvolym förväntas vara 0,3 kolonnvolymer, säkerställer påbörjandet av insamlingen av fraktioner omedelbart före detta att elueringen av allt protein övervakas, inklusive eventuellt protein som finns i tomrumsvolymen.
4. Fluorescerande spårinsamling och analys
- Överför proverna från fraktionsuppsamlaren (steg 3.2.5) till en platta med 96 brunnar och läs av lysrörssignalen.
- Innan du tar en fluorescensavläsning, späd de uppsamlade proverna. Överför med hjälp av en flerkanalig pipett 90 μL destilleradH2Oav laboratoriekvalitet från en reservoar till varje brunn på en ogenomskinlig platta med 96 brunnar med plan botten (se materialtabell).
- Om fraktioner samlades upp i ett 96-brunnsblock under steg 3.2.5, använd en flerkanalig pipett för att överföra 10 μL av SEC-fraktionerna från blocket till den ogenomskinliga platta 96-brunnsplattan med platt botten och blanda genom pipettering upp och ner. Annars, om SEC-fraktioner samlades in i enskilda rör under steg 3.2.5, överför 10 μL av varje fraktion till den ogenomskinliga platta med 96 brunnar med plan botten en efter en, pipettera upp och ner varje gång för att blanda proverna.
- Placera den ogenomskinliga platta med 96 brunnar i plattläsaren och mät fluorescensen. Om GFP är den fluorescerande etiketten (används här), ställ in excitationen så nära 488 nm som möjligt och detektera den fluorescerande emissionen så nära 507 nm som möjligt.
Anmärkning: Den utspädning som krävs innan fluorescensavläsningen görs beror på den totala mängden protein av intresse i expressionskulturen och känsligheten hos den plattläsare som används. I exemplen som visas i denna studie späddes proverna 10 gånger i vatten. Som ett förslag till utgångspunkt bör fraktionerna spädas 5-10 gånger i vatten eller buffert före detektering. Om den registrerade FSEC-spårsignalen är särskilt låg kan mindre utspädningar eller till och med ett outspätt prov användas istället. Enheten som användes för detektion i denna studie var en plattläsare som kunde excitera vid 488 nm och detektera fluorescerande emission vid 507 nm (se materialtabell).
- Rita FSEC-spåren.
- Exportera data från plattläsaren i ett råformat (råtext eller en fil med kommaavgränsade värden). Dessa rådata kommer att plottas på Y-axeln i FSEC-spåret.
- För X-axeln, beräkna volymen vid vilken varje fraktion samlades in. Den första brunnen måste vara den elueringsvolym vid vilken den första fraktionen samlades in för att ta hänsyn till fraktioneringsfördröjningen (6 ml i detta exempel). Fraktionerna efter detta måste öka sekventiellt med den uppsamlade fraktionsvolymen (0,2 ml i detta exempel).
- När data från X-axeln och Y-axeln har beräknats, kopiera och klistra in data i grafprogrammet (se Materialförteckning) för att plotta den fluorescerande signalen i varje brunn mot volymen vid vilken den eluerades från kolonnen.
Figur 1 visar en schematisk representation av de steg som krävs för att köra ett FSEC-experiment.
- Analysera FSEC-spårningarna.
- Bedöm mängden proteineluering vid hålrumsvolymen (cirka 8 ml för en 24 ml kolonn), vilket indikerar att proteinet är mycket stort i storlek och sannolikt är veckat / aggregerat.
- Bedöm mängden proteineluering i senare toppar, vilket indikerar veckat protein. Detta förväntas vara mellan 10 ml och 16 ml för en 24 ml kolonn beroende på proteinstorleken (när den är associerad med ett tvättmedel / lipidmicell). Var noga med toppformen, särskilt om det är en bred eller delad topp som spänner över 3-4 ml (för en 24 ml kolonn), eftersom detta indikerar ett polydispers prov.
- Beräkna förhållandet mellan den monomera topphöjden och hålrumstopphöjden genom att dividera den maximala signalen som registrerats i monomertoppen med den maximala signalen i hålrumstoppen.
OBS: Detta värde representerar monodispersitetsindexet och möjliggör ett kvantitativt mått på proteinkvaliteten; Större värden indikerar bästa möjliga kvalitet, medan värden under 1 indikerar problematiska prover, eftersom de har mer aggregerat protein än veckat protein. - Om flera FSEC-körningar ska jämföras och den viktigaste egenskapen är mängden monomer i varje fall, plotta spåren som den råa signalen som registrerats av plattläsaren (t.ex. RFU).
OBS: Om en jämförelse av mängden monomer jämfört med det veckade proteinet är viktigare, måste signalen normaliseras till en procentandel av den totala signalen med hjälp av minsta och maximala avläsningar i spåret, vilket kommer att accentuera skillnader i förhållandet mellan aggregerat och monomera protein mellan spåren.
Figur 1: Schematisk representation av de steg som krävs för att köra ett FSEC-experiment. (1) Celler som uttrycker det fluorescerande märkta proteinet av intresse är solubiliserade. (2) Den råa lösligheten klargörs först med ett låghastighetsspinn, följt av (3) ett höghastighetsspinn. (4) Den klarade provsupernatanten laddas och körs på en lämplig SEC-kolumn, och (5) fraktionerna samlas in. (6) Prover av fraktionerna överförs till en platta med 96 brunnar och en fluorescerande signal detekteras med hjälp av en plattläsare för att (7) plotta FSEC-spåret. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
Först undersöktes det dynamiska omfånget och nedre gränserna för eGFP-detektion för plattläsaren som användes i denna studie. En renad eGFP-standard med känd koncentration späddes i en slutlig volym på 50 μl till 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 ng·μL−1 och 0,390625 ng·μL−1, och fluorescensen avlästes med en excitation på 488 nm och en emission på 507 nm (figur 2 ). Detta experiment indikerade att plattläsaren hade en lägre detektionsgräns på 30 ng eGFP-märkt protein per brunn och ett dynamiskt intervall på upp till 500 ng eGFP-märkt protein per brunn före signalmättnad. Genom att använda värdet för den nedre gränsen och anta att proteinelueringen är begränsad till 0,33 av kolonnvolymen krävs så lite som 1,28 μg eGFP-märkt protein av intresse för SEC-kolonnladdning för att en detekterbar FSEC-signal ska observeras.
Figur 2: standardkurva för eGFP. Spridningsgraf över den fluorescerande signalen för renad eGFP-standard utspädd till 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12,5 ng·μL−1, 6,25 ng·μL−1, 3,125 ng·μL−1, 1,5625 ng·μL−1, 0,78125 och 0,390625 ng·μL−1. (A) Alla utspädningar visas, inklusive de med mättad signal. (B) Ett inzoomat spridningsdiagram som endast omfattar de standarder som faller inom plattläsarens dynamiska område. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För det andra kalibrerades 24 ml-kolonnen som användes för denna studie med molekylviktstandarder. Med samma buffert- och driftsförhållanden som användes för FSEC-analysen injicerades molekylviktstandarderna blå dextran (>2 000 kDa), ferritin (440 kDa), aldolas (158 kDa), konalbumin (75 kDa) och ovalbumin (43 kDa) individuellt och kördes genom kolonnen, och elueringsspår samlades in vid 280 nm absorption. De registrerade elueringsvolymerna var 8,9 ml, 12,4 ml, 15,2 ml, 16,9 ml respektive 18 ml. När dessa elueringsvolymer omvandlades till Kav (ekvation 1) och plottades mot logaritmiska molekylvikter kunde en standardkurva passa. Detta gjorde det möjligt att uppskatta molekylvikten för de GPCR som testades i denna studie genom interpolering av standardkurvan (figur 3). Exempelvis indikerade FSEC-spåret av GPCR-serotoninreceptorn 2A (5HT2AR) efter solubilisering i tvättmedlet DDM en elueringsvolym på 13,4 ml. Denna 5HT2AR-elueringsvolym faller mellan de elueringsvolymer som registrerats för ferritin och aldolas och ger en uppskattad molekylvikt på cirka 300 kDa. 5HT2AR-konstruktionen som används i denna studie är cirka 50 kDa (inklusive eGFP-taggen), vilket innebär att om 5HT2AR antas vara monomera kan 250 kDa molekylvikt tillskrivas DDM-tvättmedlet/lipidmicellen. Ekvationen för omvandling av elueringsvolymer är följande (ekvation 1):
(Ekvation 1)
där V e är elueringsvolymen, V 0 är kolonnens tomrumsvolym och Vc är den totala kolonnvolymen.
Figur 3: Kalibreringskurva för SEC-kolonnen med molekylviktsstandarder . (A) Ett representativt FSEC-spår av 5HT2AR solubiliserat i DDM, med de relativa elueringspositionerna för molekylviktstandarderna blå dextran (Void), ferritin, aldolas, konalbumin och ovalbumin markerade. Ferritin, aldolas, konalbumin och ovalbumin är färgade i grönt, lila, rött respektive cyan. B) Kalibreringskurvan för molekylvikten med användning av standardämnenas elueringspositioner efter omvandling till Kav (ekvation 1) plottade mot logaritmis molekylvikt (Mr). Mr av 5HT2AR i DDM interpolerades från kurvan med Kav och visas på kurvan (blå fyrkant). Klicka här för att se en större version av denna figur.
FSEC användes sedan för att bedöma kvaliteten och egenskaperna hos GPCR-sfingosin-1-fosfatreceptorn (S1PR1)15. Insektsceller som uttrycker GFP-märkt human S1PR 1 bearbetades för FSEC enligt beskrivningen i protokollet (figur 1).
För det första undersöktes de optimala membranextraktionsförhållandena genom att testa tvättmedlen DDM och LMNG mot tvättmedelsfri extraktion med SMA (figur 4A). Monodispersitetsindexet användes för att bedöma proteinprovets kvalitet och förhållandet mellan proteinet i hålrummet (~ 8 ml kolonnretention) jämfört med det monodisperserade provet (14-15 ml kolonnretention). Provet som löstes i LMNG visade en överlägsen FSEC-profil med en bättre monomertoppform och en lägre proteinaggregattopp, vilket indikerar att solubilisering och rening i LMNG var de mest stabiliserande förhållandena för detta membranprotein. Däremot hade provet som solubiliserades i DDM en relativt sämre FSEC-profil, med en större aggregattopp och en bredare monomer topp, vilket indikerar polydispersitet i provet.
För det andra undersöktes effekten av ligandtillsats på FSEC-profilen genom tillsats av sfingosin-1-fosfat (S1P) till provet under löslighet. I detta fall användes DDM som solubiliseringsreagens och FSEC-spåren av S1PR1 i närvaro och frånvaro av S1P jämfördes (figur 4B). Provet som löstes i närvaro av S1P visade ett överlägset FSEC-spår med reducerad aggregering. Detta indikerade att rening i närvaro av en ligand var fördelaktig för att förbättra proteinprovkvaliteten genom att stabilisera receptorn i lösning men var också fördelaktig som en surrogatmarkör för proteinaktivitet, eftersom resultaten föreslog att proteinet var korrekt veckat och kompetent för ligandbindning.
Figur 4: FSEC med användning av ett råextrakt av S1PR 1 som indikerar optimala membranextraktionsförhållanden och ligandbindning. (A) Jämförelse av FSEC-spåren av S1PR1 solubiliserad i styren-maleinsyra-sampolymer (SMA; blå), laurylemaltosneopentylglykol (LMNG; röd) eller dodecylmaltosid (DDM; svart). (B) Jämförelse av FSEC-spåren av S1PR 1 solubiliserade i DDM i närvaro (röd) eller frånvaro (svart) av agonisten sfingosin-1-fosfat (S1P). Klicka här för att se en större version av denna figur.
FSEC användes också för att undersöka den långsiktiga stabiliteten hos 5HT2AR under olika förhållanden. GFP-märkt human 5HT2AR solubiliserades från insektscellmembran i antingen tvättmedel (DDM) eller SMA-polymer och analyserades av FSEC vid flera tidpunkter efter lagring vid 4 °C eller rumstemperatur (figur 5). Efter flera dagars inkubation visade 5HT2AR i DDM en signifikant minskning av den monomera topphöjden vid endera temperaturen, och signifikanta ökningar av den aggregerade toppen observerades. Däremot visade 5HT2AR i SMA-lipidpartikel (SMALP) inte en signifikant minskning av den monomera topphöjden under experimentets gång, vilket indikerar att proteinet i SMALP förblev stabilt längre, även vid ogynnsamma temperaturer. Detta kan vara viktigt när man överväger proteinpreparat för nedströms biofysiska tillämpningar såsom ytplasmonresonansexperiment (SPR), för vilka det finns ett krav på att provet ska vara stabilt och aktivt under en lång tidsperiod för att bindningsexperimenten ska kunna slutföras framgångsrikt.
Figur 5: Effekt av tid och temperatur på kvaliteten på 5HT 2A R extraherad från membranet med användning av antingen DDM eller SMALP, analyserad av FSEC. (A) Representativa FSEC-spår av 5HT2AR som lösligats i DDM och lagrats i rumstemperatur i 1 dag (grå),2dagar (grön) eller 5 dagar (blå). (B) Histogram av den normaliserade monomera topphöjden för DDM-prover lagrade vid 4 °C (blå) eller RT (grön) jämfört med SMALP-prover lagrade vid 4 °C (grå) eller RT (svart). Felstaplar är representativa för SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
De generiska systematiska metoderna för tillståndsscreening med FSEC som presenteras här möjliggör snabb optimering av solubiliserings- och reningsparametrar för produktion av membranproteiner. Detta innebär att stabila och funktionellt aktiva membranproteiner snabbt kan produceras för biofysikaliska och strukturella studier. Dessutom kan FSEC drivas med laboratorieutrustning som sannolikt redan finns på plats i membranproteinlaboratorier, och därmed finns det inget krav på inköp av ett specialinstrument för att köra analyserna.
Kritiska steg
Den tid det tar mellan löslighetspunkten från celler i tvättmedel till den punkt där provet förs ner i SEC-kolonnen (steg 2.1.5-3.2.5) är tidskritisk, och det får inte finnas några pauser mellan dessa steg. Alla steg ska utföras vid 4 °C eller på is, och den tid det tar att utföra dessa steg måste hållas till ett minimum. Dessa tids- och temperaturbegränsningar är nödvändiga för att registrera FSEC-profilen för membranproteinet före eventuell utveckling eller nedbrytning. Efter att membranproteinet har solubiliserats finns det en större risk för utveckling, aggregering och nedbrytning, även vid 4 °C. Helst bör alla prover för vilka FSEC-spåren ska jämföras passera SEC-kolumnen under samma tid efter löslighetssteget. I praktiken är detta svårt, särskilt om proverna skickas sekventiellt ner i en enda kolumn, men det är möjligt att samla upp till fem SEC-spår inom 3 timmar från varandra, och inom denna tidsram bör det inte finnas någon signifikant nedbrytning.
Felsökning
Om det vid utförandet av FSEC-experimentet finns låg eller ingen fluorescerande signal, är det möjligt att membranproteinet av intresse inte har uttryckt den valda cellinjen, har mycket lågt uttryck av den valda cellinjen eller inte har solubiliserats i det valda tvättmedlet. Om proverna späddes innan fluorescenssignalen samlades in och FSEC-spåret registrerades, skulle ett enkelt första steg vara att prova en lägre utspädning eller ingen utspädning av SEC-fraktionerna. Om detta fortfarande inte ger ett tolkningsbart FSEC-spår bör proteinets uttryck och löslighet kontrolleras.
Analysen av proteinuttrycket kan uppnås genom kontroll av provets fluorescens efter steg 2.2.2. Om det finns en mycket låg eller ingen fluorescerande signal från detta prov (t.ex. en signal mycket nära bakgrunden) är det troligt ett problem med proteinuttrycket. Åtgärder kan vidtas för att förbättra membranproteinets uttrycksnivåer, såsom byte till en alternativ cellinje eller justering av tillväxtförhållandena, induktionen av uttryck och tiden mellan induktionen/infektionen/transfektionen och skörden. Men särskilt dåligt proteinuttryck kan indikera ett instabilt membranprotein och därmed ett dåligt konstruktionsval.
Om uttrycket har kontrollerats och det finns en tydlig fluorescerande signal ovanför bakgrunden före FSEC, kan löslighetseffektiviteten kontrolleras genom att mäta provets återstående fluorescerande signal efter steg 2.4.3 (lösligt membranprotein) jämfört med provet efter steg 2.2.2 (totalt protein). Det är vanligt att löslighetseffektiviteten är 20% -30% och fortfarande möjliggör framgångsrik analys och rening av membranproteinet. Om löslighetseffektiviteten är mindre än 20% kan emellertid ett annat rengöringsmedel för löslighet eller andra löslighetsförhållanden krävas. Om försök att förbättra solubiliseringen inte lyckas kan detta indikera ett särskilt instabilt membranprotein och därmed ett dåligt konstruktionsval.
Om en mycket sen elueringstopp observeras i FSEC-spåret (t.ex. 18-24 ml), indikerar detta att det fluorescerande proteinet har en proteinmolekylvikt som är mycket lägre än förväntat. Detta kan orsakas av att membranproteinet av intresse bryts ned, vilket resulterar i "fri" GFP. Man bör kontrollera om proteinet är intakt före och efter löslighet med hjälp av GFP-fluorescens i gel. Om proteinet av intresse verkar vara nedbrytande eller proteolyzerat kan mängden proteashämmare ökas dubbelt till fyrfaldigt. En hög känslighet för proteaser eller nedbrutet protein redan före löslighet kan emellertid indikera ett särskilt instabilt protein och därmed ett dåligt konstruktionsval.
Ändringar och ytterligare tillämpningar av FSEC
Vanligtvis är den fluorescerande taggen som används i FSEC GFP eller eGFP, som beskrivs i detta protokoll. Det finns dock många olika fluorescerande proteintaggar tillgängliga. Valet av den fluorescerande taggen som ska användas beror på att ha en plattläsare som kan uppnå rätt excitations- och emissionsparametrar för att registrera den fluorescerande signalen för den valda fluorescerande taggen och ha en fluorofor med liten eller ingen förändring i kvantutbytet under olika miljöförhållanden. Dessutom är FSEC inte begränsat till fluorescerande proteiner utan kan också fungera lika bra med ett protein som har märkts med ett fluorescerande färgämne. Till exempel kan ett NTA-färgämne användas, vilket positivt skulle binda till histidin-märkta membranproteinkonstruktioner. Dessutom kan antingen en fluorescerande märkt antikropp kemiskt märkt med ett fluorescerande färgämne och specifikt för bindning av membranproteinet av intresse eller en reningsetikett inkluderad i membranproteinkonstruktionen indirekt märka ett mål för FSEC.
Vid tvättmedelsscreening med FSEC kan ett val göras om bufferten som används för att köra SEC-kolumnen ska innehålla det matchande tvättmedlet som proteinet har solubiliserats i eller om ett standardtvättmedel ska användas i alla körningar. En mer exakt representation av proteinets beteende kommer att erhållas om hela experimentet utförs med matchande tvättmedel hela tiden. Det kan dock vara tidskrävande och slöseri med tvättmedel om kolonnen måste balanseras i ett nytt tvättmedel innan varje körning utförs. Eftersom huvudsyftet med screening av tvättmedel är att jämföra spår kommer trenderna att finnas kvar i spåren även om förhållandena inte är idealiska. Således kan en kompromiss nås där proteinet solubiliseras i det intressanta tvättmedlet men kolonnen körs i en standardbuffert med ett enda tvättmedel över alla körningar (t.ex. DDM)11, vilket kan spara tid och tvättmedelsförbrukningsmaterial.
Genom att modifiera den använda FLPC-utrustningen kan genomströmningen av FSEC-protokollet ökas avsevärt och provbehovet kan minimeras. Till exempel kan ett FPLC- eller HPLC-system utrustas med en autosampler, en mindre bäddvolymanalyskolonn (såsom en 3,2 ml analytisk SEC-kolonn) och en in-line fluorescerande detektor för övervakning av kontinuerliga FSEC-spår direkt från kolonnen. Den resulterande installationen skulle göra det möjligt att utföra fler FSEC-körningar på kortare tid och ta bort det manuella plottningssteget, vilket gör att ett större antal villkor kan testas inom en kortare tidsram. Dessutom skulle provkravet minskas ytterligare, eftersom färre prover skulle behöva förberedas och laddas på FSEC-kolonnen för varje omgång. Detta skulle öppna möjligheter att reducera uttryckskulturerna till ett plattbaserat format, eftersom så lite material skulle krävas för analysen.
FSEC:s styrkor och svagheter jämfört med andra metoder
En nackdel med FSEC är att membranproteinkonstruktionerna måste utformas för att införa den fluorescerande etiketten, och vid införandet finns det en liten möjlighet att placeringen av etiketten kan störa funktionen eller vikningen av membranproteinet av intresse. Dessutom övervakar FSEC-protokollet, som beskrivs här, egenskaperna hos ett membranprotein i närvaro av celllysat, vilket är en råblandning av proteiner. Beteendet hos ett membranprotein i denna miljö kan vara annorlunda än när membranproteinet av intresse utsätts för en preparativ SEC-kolonn vid slutet av reningen när den är helt isolerad från andra proteiner. Dessutom ger FSEC ett något kvalitativt mått på proteinkvalitet. Genom att omvandla FSEC-spåret till ett monodispersitetsindex, såsom beskrivs i steg 4.3.3 i protokollet, kan emellertid ett kvantitativt mått på proteinkvaliteten erhållas.
FSEC är inte den enda metoden som kan användas vid tidig analys av membranproteinkonstruktioner, löslighetsförhållanden och reningsbuffertsammansättning. De alternativa tillvägagångssätten har både fördelar och nackdelar jämfört med FSEC. Det finns till exempel fluoroforbaserade termostabilitetsanalyser, särskilt användningen av färgämnet 7-dietylamino-3-(4′-maleimidylfenyl)-4-metylkumarin (CPM)16,17. Fördelen med denna metod är att, till skillnad från FSEC, som ger ett kvalitativt mått på proteinkvalitet, ger termostabilitetsanalyser ett kvantitativt mått i form av en relativ smälttemperatur. Dessutom finns det inget krav på att införa en fluorescerande tagg på proteinkonstruktionen. Nackdelarna med termostabilitetsanalyser jämfört med FSEC är emellertid att renat protein måste användas och att analysen inte är kompatibel med alla proteinkonstruktioner, eftersom den bygger på de fördelaktiga positionerna för inhemska cysteinrester i det veckade proteinet.
En annan metod som har likheter med både FSEC och fluoroforbaserade termostabilitetsanalyser är en analys som mäter temperaturkänsligheten hos ett membranprotein. I denna analys utmanas proteinet med olika temperaturer, och proteinet som förblir i lösning efter centrifugering detekteras. Detektion i denna metod har utförts på flera sätt, inklusive mätning av fluorescensen i lösning18, fluorescensen i ett SDS-PAGE-gelband19 eller signalintensiteten i en western blot20. En signifikant nackdel med dessa tillvägagångssätt är emellertid att analysen är mycket arbetsintensiv och benägen för högt brus i resultaten, eftersom varje enskild temperaturpunkt måste samlas in oberoende.
Slutligen kan flera mer avancerade biofysiska tekniker användas för att bedöma membranproteinkvalitet på liknande sätt som FSEC, till exempel flödesinducerad dispersionsanalys21, mikroskala termofores22 eller SPR. Även om det är mycket kraftfulla tillvägagångssätt är nackdelen med dessa metoder kravet på högspecialiserade instrument för att köra analyserna.
Sammanfattningsvis tillhandahåller FSEC ett ovärderligt verktyg för användning i membranproteinproduktionskampanjer, och även om det inte är det enda alternativet, har det flera distinkta fördelar jämfört med andra metoder, som anges ovan. Korsvalidering av resultaten genom ortogonala analyser rekommenderas alltid, och ingen av de metoder som diskuterats ovan utesluter varandra.
Disclosures
Peak Proteins är en kontraktsforskningsorganisation som tillhandahåller proteinuttryck, rening, masspektrometri och strukturell bestämning mot en avgift.
Acknowledgments
Vi vill tacka för hjälpen och stödet från hela Peak Proteins teamet. Från cellvetenskapsteamet vill vi tacka Ian Hampton för hans värdefulla insikter och vägledning i insektscelluttryck. Vi vill tacka Mark Abbott för att han har tillhandahållit resurser och möjlighet att driva detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
| 10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
| 15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
| 2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
| 50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
| 96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
| ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
| ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
| ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
| Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
| Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
| Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
| Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
| Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
| eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
| Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
| HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
| High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
| Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
| Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
| MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
| Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
| Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
| pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
| Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
| Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
| Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
| Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
| Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
| Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |
References
- Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
- Erickson, H. P. Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy. Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).
- Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water. Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).
- Lathe, G. H., Ruthven, C. R. The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water. Biochemical Journal. 60 (4), (1955).
- Polson, A. Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar. Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).
- Hjertén, S., Mosbach, R. 34;Molecular-sieve" chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide. Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).
- Porath, J., Flodin, P. Gel filtration: A method for desalting and group separation. Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).
- Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).
- Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).
- Hanson, M. A., et al. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335 (6070), 851-855 (2012).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents. Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).
- Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
- Harborne, S. P. D., et al. IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector. Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).
- Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -P. Defining thermostability of membrane proteins by western blotting. Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).
- Pedersen, M. E., Østergaard, J., Jensen, H. Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization. Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).
