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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64578
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

El presente protocolo describe la propagación del virus del Zika (ZIKV) en células de riñón de mono verde africano Vero y la cuantificación del ZIKV utilizando métodos de inmunodetección colorimétrica basados en células en formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento).

Abstract

El virus del Zika (ZIKV) es un virus transmitido por mosquitos que pertenece al género Flavivirus. La infección por ZIKV se ha asociado con anomalías cerebrales congénitas y, potencialmente, con el síndrome de Guillain-Barré en adultos. La investigación sobre el ZIKV para comprender los mecanismos de la enfermedad es importante para facilitar el desarrollo de vacunas y tratamientos. El método de cuantificación de virus es crucial y fundamental en el campo de la virología. El ensayo de formación de foco (FFA) es un ensayo de cuantificación de virus que detecta el antígeno viral con anticuerpos e identifica los focos de infección de las células mediante la técnica de inmunotinción de peroxidasa. El presente estudio describe el protocolo de propagación y cuantificación del virus utilizando formatos de 24 y 96 pocillos (alto rendimiento). En comparación con otros estudios similares, este protocolo ha descrito además la optimización del tamaño de los focos, lo que puede servir como guía para ampliar el uso de este ensayo para otros virus. En primer lugar, la propagación del ZIKV se realiza en células Vero durante 3 días. El sobrenadante de cultivo que contiene ZIKV se cosecha y cuantifica utilizando el FFA. Brevemente, el cultivo del virus se inocula en células Vero y se incuba durante 2-3 días. La formación de focos se determina después de procesos de tinción optimizados, incluida la fijación celular, la permeabilización, el bloqueo, la unión de anticuerpos y la incubación con sustrato de peroxidasa. Los focos de virus teñidos se visualizan utilizando un microscopio estereoscópico (recuento manual en formato de 24 pocillos) o un analizador de software (recuento automatizado en formato de 96 pocillos). El FFA proporciona resultados reproducibles y relativamente rápidos (3-4 días) y es adecuado para ser utilizado para diferentes virus, incluidos los virus que no forman placa. Posteriormente, este protocolo es útil para el estudio de la infección por ZIKV y podría utilizarse para detectar otros virus clínicamente importantes.

Introduction

La infección por el virus del Zika (ZIKV) es una enfermedad viral emergente transmitida por mosquitos. El primer aislamiento del ZIKV fue en Uganda en 1947 1,2; Permaneció desatendida desde 1947 hasta 2007, ya que los síntomas clínicos son más comúnmente asintomáticos y se caracterizan por enfermedad febril autolimitada. En 2007, la epidemia de zika comenzó en las islas Yap 3,4, seguida de epidemias más grandes en las regiones del Pacífico (Polinesia Francesa, Isla de Pascua, Islas Cook y Nueva Caledonia) de 2013 a 2014 5,6,7,8, donde se notificó por primera vez la complicación neurológica grave síndrome de Guillain-Barré (SGB) en adultos 9. Durante 2015 y 2016, la primera epidemia generalizada de ZIKV se extendió por las Américas después de la aparición del genotipo asiático de ZIKV en Brasil en 201310. Durante este brote, se notificaron entre 440.000 y 1,3 millones de casos de microcefalia y otros trastornos neurológicos en recién nacidos11. Actualmente no existe una cura o tratamiento específico para la infección por ZIKV; por lo tanto, existe una necesidad médica urgente de vacunas contra el ZIKV capaces de prevenir infecciones, particularmente durante el embarazo.

La cuantificación de virus es un proceso para determinar el número de virus presentes en una muestra. Desempeña un papel importante en la investigación, y los laboratorios académicos abarcan muchos campos, como la medicina y las ciencias de la vida. Este proceso también es importante en sectores comerciales, como la producción de vacunas virales, proteínas recombinantes, antígenos virales o agentes antivirales. Se pueden utilizar muchos métodos o ensayos para la cuantificación del virus12. La elección de los métodos o ensayos normalmente depende de las características del virus, el nivel de precisión deseado y la naturaleza del experimento o investigación. En general, los métodos de cuantificación de virus se pueden dividir en dos categorías: ensayos moleculares que detectan la presencia de ácido nucleico viral (ADN o ARN) y ensayos que miden la infectividad del virus in vitro12. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR, para el ADN) o la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR, para el ARN)13 y la PCR digital en gotas14 son ejemplos de técnicas moleculares comunes utilizadas para cuantificar el ácido nucleico viral en una muestra determinada15. Sin embargo, estas técnicas moleculares altamente sensibles no pueden diferenciar entre virus viables y no viables15. Por lo tanto, la investigación que requiere información sobre características biológicas, como la infectividad del virus en las células, no puede completarse utilizando las técnicas moleculares antes mencionadas; Se necesitan ensayos que puedan medir y determinar la presencia de virus viables. Los ensayos que miden la infectividad del virus incluyen el ensayo de formación de placa (PFA), la dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50% (TCID50), el ensayo de foco fluorescente y la microscopía electrónica de transmisión (TEM)12.

El PFA, desarrollado por Renato Dulbecco en 1952, es uno de los métodos más utilizados para la titulación de virus, incluido el ZIKV16. Se utiliza para determinar directamente las concentraciones virales de viriones líticos infecciosos. El método se basa en la capacidad de un virus lítico para producir efectos citopáticos (CPEs; zonas de muerte celular o placas, un área de infección rodeada de células no infectadas) en una monocapa celular inoculada después de una infección viral. Sin embargo, existen varios inconvenientes en el ensayo que afectan a su utilidad. El ensayo requiere mucho tiempo (tarda aproximadamente entre 7 y 10 días, dependiendo de los virus), depende de la EPC y es propenso a errores. En el presente estudio, presentamos una técnica inmunocolorimétrica, el ensayo de formación de foco (FFA), para detectar y cuantificar el ZIKV en formatos de placa de 24 pocillos y placa de 96 pocillos.

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Protocol

1. Propagación de virus

  1. Preparación celular
    1. Cultivar células Vero en un matraz de cultivo celular de75 cm2 que contenga 12 mL de medio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y 2 mM de L-glutamina (ver Tabla de Materiales). Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
    2. Monitorear las células bajo un microscopio; una vez que las células alcanzan el 70%-90% de confluencia, están listas para ser utilizadas (Figura 1A).
      NOTA: Las células Vero se duplican aproximadamente cada 24 h17. Las diluciones de 1:10 deben tardar de 3 a 4 días en alcanzar una confluencia del 80%-90% en un matraz de 75cm2 . Monitoree las células diariamente o cada dos días.
  2. Infección de la monocapa celular
    1. Retirar el medio de crecimiento del matraz de cultivo celular con una pipeta serológica de 10 ml. Enjuague el matraz con 3 ml de solución salina tamponada con fosfato (dPBS) de Dulbecco 2 veces con una pipeta serológica de 5 ml.
      NOTA: Se debe preparar un vaso de precipitados con hipoclorito de sodio al 10% para desinfectar cualquier residuo líquido infeccioso desechado de frascos/placas.
    2. Añadir 2 mL de DMEM sin suero (DMEM suplementado con 2 mM de L-glutamina sin FBS) y 20 μL de inóculo de ZIKV en el matraz de cultivo celular. Incubar el matraz con un balanceo suave durante 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción del virus.
      NOTA: La valoración de la cepa inicial de ZIKV será útil para determinar el volumen de adición de inóculo de ZIKV (paso 2).
      PRECAUCIÓN: El ZIKV está clasificado como un patógeno de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2). Todos los procedimientos con materiales que contengan ZIKV deben realizarse en un gabinete de bioseguridad certificado y seguir todos los procedimientos operativos estándar (SOP) del laboratorio con el equipo de protección personal adecuado.
  3. Adición del medio de superposición
    1. Después de 1 h de incubación, retire y deseche el inóculo del virus diluido con una pipeta serológica de 5 ml. Enjuague el matraz de cultivo celular con 3 ml de dPBS 2x.
    2. Añadir 12 mL de medio de mantenimiento (DMEM suplementado con FBS al 2%, 2 mM L-glutamina y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina) en el matraz de cultivo celular para mantener las células infectadas.
    3. Incubar las células Vero infectadas durante 3 días en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: Monitoree diariamente el CPE de las células Vero infectadas bajo un microscopio.
  4. Recolección de sobrenadante de cultivo celular que contiene ZIKV
    1. En el día 3 después de la infección, se puede observar redondeo y desprendimiento de células (CPE) (Figura 1B-D). Extraer el sobrenadante de cultivo celular que contiene el ZIKV en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando una pipeta serológica de 10 ml.
    2. Utilice un filtro de jeringa de polietersulfona de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) para filtrar el sobrenadante del cultivo celular. Aliquotar 500 μL del sobrenadante de cultivo celular filtrado en tubos de rosca de 2,0 mL y almacenar a -80 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: El ZIKV cosechado se puede almacenar a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.
      PRECAUCIÓN: Se deben tomar precauciones adicionales si se usa una aguja de jeringa, ya que la aguja puede perforar la piel. Es necesario establecer procedimientos operativos estándar de laboratorio.

2. Cuantificación del virus

  1. Preparación celular
    1. Siembre células Vero en placas designadas (placa de 24 pocillos: 0,5 ml/pocillo, 7,5 x 104 células/pocillo; placa de 96 pocillos: 0,1 ml/pocillo, 1,5 x 104 células/pocillo) e incube la placa durante la noche en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: Hay cinco puntos de tiempo diferentes que se deben analizar (placa de 24 pocillos: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h después de la infección; placa de 96 pocillos: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h y 72 h post-infección); Por lo tanto, prepare un plato para cada punto de tiempo.
    2. Después de las 24 h de incubación y una vez que las células alcanzan el 70%-90% de confluencia (Figura 1E), la placa está lista para la infección. Proceda a preparar el stock de virus diluido (paso 2.2) antes de la infección de la monocapa celular.
  2. Dilución de virus
    1. Para placas de 24 y 96 pocillos, prepare seis tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml para cada placa para llevar a cabo una dilución diez veces mayor (10-1 hasta 10-5), incluido un control negativo. Para la configuración del experimento para una placa de 24 pocillos, agregue 450 μL de DMEM sin suero en los seis tubos de microcentrífuga. Para la configuración del experimento para una placa de 96 pocillos, agregue 135 μL de DMEM sin suero en seis tubos.
      NOTA: Etiquete cada tubo claramente para indicar la dilución de su contenido antes de realizar la dilución en serie diez veces.
    2. Para realizar la dilución en serie, para la configuración del experimento de placa de 24 pocillos, agregue 50 μL de caldo de ZIKV que se cosechó en el paso 1 en el tubo 10-1 que contiene 450 μL de DMEM sin suero. Para la configuración del experimento de placa de 96 pocillos, agregue 15 μL de stock de ZIKV en el tubo 10-1 que contiene 135 μL de DMEM sin suero.
    3. Vórtice cada tubo para mezclar el virus y el medio. Esta es la primera dilución diez veces mayor.
      NOTA: Se requiere una mezcla adecuada de virus y medio de cultivo en cada tubo de dilución para garantizar una dilución en serie precisa.
    4. Para la configuración del experimento de la placa de 24 pocillos, utilice una punta de pipeta nueva para resuspender el tubo 10-1 y transfiera 50 μL de ZIKV diluido al tubo 10-2 como una segunda dilución diez veces mayor. Para la configuración del experimento de la placa de 96 pocillos, utilice una punta de pipeta nueva para volver a suspender el tubo 10-1 y transfiera 15 μl de ZIKV diluido al tubo 10-2 como una segunda dilución diez veces.
    5. Repita el paso 2.2.4 cuatro veces hasta el quinto tubo (excluyendo el control negativo).
      NOTA: Utilice una punta de pipeta nueva después de cada paso de pipeteo para evitar la contaminación cruzada.
  3. Infección de la monocapa celular
    1. Retire y deseche el medio acondicionado de cada pocillo (placa de 24 pocillos: 0,5 ml/pocillo; placa de 96 pocillos: 0,1 ml/pocillo).
    2. Enjuague cada pocillo con dPBS 2x (placa de 24 pocillos: 300 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 60 μL/pocillo).
    3. Trabajando de la dilución más alta a la más baja, agregue cada inóculo de virus diluido en serie en el pocillo (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo).
      NOTA: La infección de cada dilución se realizará en pocillos duplicados. Mantenga dos pozos no infectados como control negativo. Etiquete la placa y los pocillos claramente para evitar confusiones. Cambie las puntas de pipeta después de cada paso de pipeteo para evitar la contaminación cruzada.
    4. Incubar la placa con un balanceo suave durante 1 h a temperatura ambiente para permitir la adsorción del virus.
  4. Adición del medio de cultivo celular superpuesto
    1. Después de 1 h de incubación, retire y deseche la suspensión del virus desde la concentración más baja hasta la más alta.
    2. Lave las células infectadas con dPBS 2x (placa de 24 pocillos: 300 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 60 μL/pocillo).
    3. Recubra el pocillo con DMEM (suplementado con 2% de FBS, 2 mM de L-glutamina y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina) y 1,5% de carboximetilcelulosa de baja viscosidad (CMC; ver Tabla de Materiales) (placa de 24 pocillos: 1 mL/pocillo; placa de 96 pocillos: 0,2 mL/pocillo).
    4. Incubar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: No altere la placa durante este período de incubación.
    5. Saque la placa de la incubadora de cultivo celular para teñirla en diferentes momentos (placa de 24 pocillos: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h después de la infección; placa de 96 pocillos: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h y 72 h postinfección).

3. Tinción

  1. Fijación celular
    1. Después de las horas específicas de incubación (placa de 24 pocillos: 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h post-infección; placa de 96 pocillos: 24 h, 36 h, 48 h, 60 h y 72 h post-infección), retire y deseche el medio de recubrimiento y lave las celdas 3 veces con 1x PBS. Para la placa de 96 pocillos, retire y deseche el medio de recubrimiento y lave las celdas 3 veces con 60 μL/pocillo de 1x PBS con una pipeta multicanal.
    2. Agregue un 4% de paraformaldehído para fijar las células (placa de 24 pocillos: 300 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 60 μL/pocillo). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 min.
      PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es un formaldehído polimerizado sólido. Es un polvo cristalino blanco, sólido e inflamable que libera gas formaldehído cuando se mezcla con agua o se calienta. Todos los procedimientos que impliquen el uso de paraformaldehído deben llevarse a cabo en una campana extractora química certificada o en recintos de escape aprobados siguiendo los procedimientos normalizados de trabajo de laboratorio específicos para los productos químicos que contienen formaldehído.
    3. Después de 20 minutos, deseche el paraformaldehído y lave las celdas 3 veces con 1 PBS. Realice permeabilización, bloqueo e incubación de anticuerpos siguiendo los pasos 3.2-3.5.
      NOTA: Al desechar el paraformaldehído al 4%, siga el procedimiento de eliminación de desechos de la universidad o instituto.
  2. Permeabilización celular
    1. Añadir un 1% de poli(etilenoxi)etanol de octilfenoxi (ver Tabla de Materiales) para permeabilizar las células (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 min.
    2. Después de 15 minutos, deseche el poli(etilenoxi)etanol de octilfenoxi y lave las celdas 3 veces con 1x PBS.
  3. Bloqueante
    1. Añadir un 3% de leche desnatada para reducir la unión inespecífica en la muestra (placa de 24 pocillos: 500 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 100 μL/pocillo). Incubar la placa a temperatura ambiente durante 2 h.
    2. Después de 2 h, deseche la leche descremada al 3% y lave las celdas 3 veces con 1x PBS.
      NOTA: Este es un punto de parada. Después de añadir leche desnatada al 3%, las placas pueden almacenarse a 4 °C hasta 2 días antes de la inserción del anticuerpo primario.
  4. Incubación primaria de anticuerpos
    1. Añadir anticuerpo monoclonal anti-flavivirus, 4G2 (clon D1-4G2-4-15; anticuerpo primario, ver Tabla de materiales) diluido en leche desnatada al 1% (proporción 1:1.000) (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo). Incubar la placa a 37 °C durante 1 h.
    2. Después de 1 h, retire la solución que contiene el anticuerpo monoclonal y lave las células 3 veces con PBS 1x.
  5. Incubación secundaria de anticuerpos
    1. Añadir anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (ver Tabla de Materiales) diluido en leche desnatada al 1% (proporción 1:1.000) (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo). Incubar las placas a 37 °C durante 1 h.
    2. Después de 1 h, retire la solución que contiene el anticuerpo secundario y lave las células 3 veces con 1x PBS.
  6. Incubación de sustratos
    1. Añadir sustrato de peroxidasa 3,3'diaminobencidina (DAB) (ver Tabla de materiales) e incubar la placa durante 30 min en la oscuridad (placa de 24 pocillos: 200 μL/pocillo; placa de 96 pocillos: 40 μL/pocillo). Después de 30 minutos, detenga la reacción lavando los pozos con agua.
    2. Seque las placas al aire durante la noche y proceda a la enumeración de focos después de que las placas estén completamente secas.

4. Determinación del título del virus

  1. Proceso de conteo manual de focos (formato de 24 pocillos)
    1. Los focos se pueden visualizar bajo un microscopio estereoscópico. Seleccione la dilución que produzca 50-200 focos.
    2. Cuente los focos para cada réplica de la dilución seleccionada. Calcular el número medio de focos para cada una de las diluciones seleccionadas.
    3. Calcule la unidad de formación de focos por ml (UFF/ml) para cada muestra con la siguiente fórmula: UFF/ml = número medio de focos contados/(dilución x volumen de virus diluido añadido).
  2. Proceso automatizado de recuento de focos (formato de 96 pocillos)
    1. Escanee la placa de 96 pocillos en un analizador de software comercial.
      1. Haga doble clic en el software (consulte la tabla de materiales) para abrirlo.
      2. Haga clic en Cambiar de conjunto y asegúrese de que el conjunto se cambie a cualquiera que sea aplicable (Figura complementaria 1A). Haga clic en Aceptar.
      3. Comience el escaneo haciendo clic en Escanear > escaneo de placa completa (Figura complementaria 1B).
      4. Haga clic en Panel de control para asegurarse de que el formato de captura sea el formato de 96 pocillos (Figura complementaria 2A).
      5. Seleccione el modo de centrado como "Prealineación automática verificada por el usuario" (Figura complementaria 2B).
      6. Haga clic en Expulsar para cargar la placa.
        NOTA: Abra la tapa del plato y colóquelo hacia arriba con la fila A en la parte superior (Figura suplementaria 3A).
      7. Introduzca el nombre de la placa y haga clic en Aceptar. Haga clic en Cargar para cargar la placa.
      8. Haga clic en Iniciar para iniciar el escaneo. Después de eso, calibre las posiciones para A1, A12 y H1 usando los botones "Arriba, Abajo, Izquierda, Derecha" y haga clic en Confirmar (Figura complementaria 3B).
        NOTA: El software comenzará a escanear cada pocillo.
      9. Una vez que se complete el escaneo, aparecerá una imagen general. Haga clic en Cerrar.
      10. Salga del escaneo haciendo clic en Volver a la centralita.
    2. Cuente la placa de 96 pocillos con el software.
      1. Haga clic en Contar > Recuento inteligente.
      2. En el software, se mostrará el "Paso 1 de 5: Seleccionar las placas que se van a contar". Haga clic en Cargar placa(s). Marque toda la carpeta y haga clic en Seleccionar para importar la placa escaneada (Figura complementaria 4A).
      3. En el software, se mostrará el "Paso 2 de 5: Definir los parámetros de conteo". Haga clic en Ajustar parámetros y se mostrarán los parámetros (proceso difuso; pequeño/normal/grande/más grande/más grande +1; separación de puntos; área contada; balance de fondo; eliminación de fibras; compuerta).
        NOTA: Comience con un pozo y verifique hacia adelante y hacia atrás para encontrar la mejor configuración para todos los pozos.
      4. Una vez hecho esto, haga clic en Siguiente (Figura complementaria 4B).
      5. En el software, se mostrará el "Paso 3 de 5: Seleccionar/anular la selección de pozos". Una vez completada la selección del pozo a contar, haga clic en Siguiente para continuar.
        NOTA: Los pozos seleccionados para ser contados aparecerán con una "C" en la esquina superior derecha de cada pozo (Figura Suplementaria 5A).
      6. En el software, mostrará "Paso 4 de 5: Configuración de salida". Haga clic en Ver/Modificar la configuración de salida para verificar si la configuración (como el formato de la imagen) es adecuada. Haga clic en Guardar y salga > siguiente (Figura complementaria 5B).
      7. En el software, se mostrará "Paso 5 de 5: Iniciar AutoCount". Haga clic en Iniciar recuento automático (Figura complementaria 6A).
      8. Una vez completado, haga clic en Salir de AutoCount.
  3. Realice el control de calidad (QC) en el analizador de software comercial.
    1. En la página de la centralita, haga clic en Control de calidad > Agregar placa(s). Marque toda la carpeta para importar la placa contada, haga clic en Seleccionar > Iniciar control de calidad (Figura complementaria 6B).
    2. Haga doble clic en cada pozo para auditar los puntos. Haga clic en Contar para eliminar cualquier mancha. El software empezará a contar.
      NOTA: Asegúrese de que la opción "Manchas: Eliminar" esté marcada. La finalización del recuento puede indicarse mediante el número de focos contados, por ejemplo "30" (Figura complementaria 7A).
    3. Una vez finalizado el conteo (indicado por el número de focos contados, por ejemplo "30"), haga clic en "Sí" para eliminar las manchas (Figura complementaria 7B). Haga triple clic con el botón izquierdo en el lugar que se va a eliminar. Haga clic con el botón derecho para finalizar y, a continuación, haga clic en Sí.
    4. Haga clic en Finalizar placa y vaya a Descripción general del proyecto una vez que se complete el control de calidad.
  4. Realice la obtención de imágenes con el analizador de software.
    1. Verifique la imagen escaneada, contada y de la placa de control de calidad (Figura 2).

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Representative Results

El ZIKV se puede cuantificar utilizando el FFA, como se describe esquemáticamente en la Figura 3. Para la placa de 24 pocillos, las células Vero infectadas se fijaron a las 48 h, 60 h, 72 h, 84 h y 96 h después de la infección. Los resultados mostraron que las células permanecieron intactas (no se observó desprendimiento celular) después de 96 h (4 días) después de la infección (Figura 4 y Figura suplementaria 8A-E). La aparición de focos virales se observó por primera vez a las 48 h (2 días) después de la infección (Figura 4A-F). Sin embargo, el tamaño de los focos era demasiado pequeño, lo que dificultaba el recuento preciso de los focos. El tamaño óptimo de los focos se alcanzó a las 60 h (2,5 días) después de la infección (Figura 4B). En los últimos momentos (72 h, 84 h y 96 h después de la infección), los focos eran más grandes y tendían a fusionarse o superponerse. Los focos fusionados o superpuestos aumentaron con el tiempo (Figura 4C-E). Por lo tanto, se eligieron focos formados a las 60 h (2,5 días) después de la infección para determinar el título de ZIKV en una placa de 24 pocillos (Figura 4B).

Para la placa de 96 pocillos, las células Vero infectadas se fijaron a las 24 h, 36 h, 48 h, 60 h y 72 h después de la infección. Los resultados mostraron que las células permanecieron intactas después de 72 h (3 días) después de la infección (Figura 5A-F y Figura suplementaria 9A-E). La aparición de focos virales se observó por primera vez a las 24 h (1 día) después de la infección (Figura 5A). Sin embargo, el tamaño de los focos fue demasiado pequeño hasta 36 h (1,5 días) después de la infección, lo que dificultó determinar con precisión el número de focos (Figura 5A,B). El tamaño óptimo de los focos se alcanzó a las 48 h (2 días) después de la infección (Figura 5C). En los últimos momentos (60 h y 72 h después de la infección), se observaron focos superpuestos o fusionados, y el número de focos superpuestos aumentó con el tiempo (Figura 5D,E). Por lo tanto, se eligieron focos formados a las 48 h (2 días) después de la infección para determinar el título del virus de los aislados de ZIKV (Figura 5C). La formación de focos se puede visualizar y enumerar utilizando analizadores de software comerciales como alternativa.

Figure 1
Figura 1: Imagen microscópica de las células Vero. (A) Las células Vero en un aumento de 40x mostraron una confluencia del 70%-90% en un matraz de cultivo celular de 75cm2 para la propagación del virus. (B) CPE en células Vero después de haber sido infectado con ZIKV el día 1 después de la infección a un aumento de 100x. (C) CPE en células Vero después de haber sido infectado con ZIKV el día 2 después de la infección a un aumento de 100x. (D) CPE en células Vero después de haber sido infectado con ZIKV el día 3 después de la infección a un aumento de 100x. (E) Las células Vero con un aumento de 40x mostraron una confluencia del 70%-90% en una placa de 24 pocillos después de 24 h de incubación para la cuantificación del virus. Barra de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagen de una placa de control de calidad escaneada, contada y posterior a un formato de 96 pocillos utilizando un analizador de software comercial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Flujo de trabajo de tinción para el ensayo de formación de focos. Los procesos de tinción incluyen la fijación celular, la permeabilización, el bloqueo, la unión de anticuerpos y la incubación con sustrato de peroxidasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ensayo de formación de focos para ZIKV P6-740 en placas de 24 pocillos en diferentes puntos temporales. (A) Los focos son menos distintivos en el día 2 (48 h) después de la infección. (B) El tamaño óptimo de los focos se puede ver en el día 2,5 (60 h) después de la infección. (C-E) Los focos se han fusionado en el día 3 (72 h), el día 3,5 (84 h) y el día 4 (96 h) después de la infección. (F) Control negativo de la placa. Barra de escala: 1.000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Ensayo de formación de focos para ZIKV P6-740 en placas de 96 pocillos en diferentes puntos de tiempo. (A) Los focos son menos distintos para ser contados en el analizador de software comercial el día 1 (24 h) después de la infección. (B) Los focos son menos distintos para ser contados en el analizador de software comercial en el día 1.5 (36 h) después de la infección. (C) El tamaño óptimo de los focos se puede ver el día 2 (48 h) después de la infección. (D,E) Los focos se han fusionado en el día 2,5 (60 h) y el día 3 (72 h) después de la infección. (F) Control negativo de la placa. Barra de escala: 1.000 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Capturas de pantalla de la página de inicio del analizador de software comercial. (A) Cambie el conjunto a cualquiera aplicable en el analizador de software comercial. Haga clic en "Aceptar" una vez hecho esto. (B) Para comenzar a escanear en el analizador de software comercial, haga clic en "Escanear" y luego haga clic en "Escaneo de placa completa". Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Capturas de pantalla para ver "Formato de captura" y el modo de centrado seleccionado como "Prealineación automática verificada por el usuario" en el analizador de software comercial. (A) Para ver el formato de captura, haga clic en "Panel de control" y seleccione el formato de 96 pocillos como formato de captura. (B) Para el modo de centrado, seleccione "Prealineación automática verificada por el usuario". Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Colocación de la placa de 96 pocillos en la bandeja del lector de placas del analizador de software comercial y una captura de pantalla para calibrar las posiciones de los pocillos A1, A12 y H1. (A) Coloque el plato hacia arriba con la fila A en la parte superior. (B) Para calibrar las posiciones de los pozos A1, A12 y H1, utilice los botones "Arriba, Abajo, Izquierda, Derecha". Una vez hecho esto, haz clic en "Confirmar". Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Capturas de pantalla para seleccionar carpetas que contienen placas escaneadas para contar en el analizador de software comercial y "Paso 2 de 5: Definir parámetros de conteo". (A) Para contar las placas escaneadas, haga clic en "Cargar placa(s)". Marque toda la carpeta y haga clic en "Seleccionar" para importar las placas escaneadas. (B) Ajuste los parámetros de conteo. Haga clic en "Siguiente" una vez que se hayan establecido los parámetros. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Capturas de pantalla del analizador de software comercial "Paso 3 de 5: Seleccionar/anular la selección de pocillos" y "Paso 4 de 5: Configuración de salida". (A) Seleccione y anule la selección de los pozos que se contarán y haga clic en "Siguiente" una vez hecho esto. (B) Para la configuración de salida, haga clic en "Ver/Modificar configuración de salida" para verificar si la configuración es adecuada (por ejemplo, formato de imagen). Haga clic en "Guardar y salir" una vez hecho y luego haga clic en "Siguiente". Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 6: Capturas de pantalla del analizador de software comercial "Paso 5 de 5: Iniciar AutoCount" y página de control de calidad. (A) Una vez que esté listo para el conteo de placas, haga clic en "Iniciar conteo automático". (B) En la página de control de calidad, marque toda la carpeta para importar la placa contada, haga clic en "Seleccionar" y luego haga clic en "Iniciar control de calidad". Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 7: Capturas de pantalla de la página de control de calidad del analizador de software comercial. (A) Haga doble clic en cada pozo para auditar los puntos. Haga clic en "Contar" para eliminar cualquier mancha. Marque "Manchas: Eliminar". (B) Haga triple clic izquierdo para eliminar manchas. Haga clic con el botón derecho para finalizar, luego haga clic en "Sí". Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 8: Ensayo de formación de focos para ZIKV P6-740 en placas de 24 pocillos en diferentes puntos de tiempo. Se realizó una dilución seriada de diez veces (10-1 a 10-5) en ZIKV P6-740 y la infección se realizó en células Vero por duplicado, incluyendo un control negativo. Se tomó una imagen de datos brutos utilizando un microscopio estereoscópico, con la barra de escala indicando 1.000 μm. (A) Día 2 (48 h) después de la infección. (B) Día 2,5 (60 h) post-infección. (C) Día 3 (72 h) después de la infección. (D) Día 3,5 (84 h) post-infección. (E) Día 4 (96 h) después de la infección. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria 9: Ensayo de formación de focos para ZIKV P6-740 en placas de 96 pocillos en diferentes puntos de tiempo. Se realizó una dilución seriada de diez veces (10-1 a 10-5) en ZIKV P6-740 y la infección se realizó en células Vero por duplicado, incluyendo un control negativo. Se tomó una imagen de datos brutos utilizando un microscopio estereoscópico, con la barra de escala indicando 1.000 μm. (A) Día 1 (24 h) después de la infección. (B) Día 1,5 (36 h) después de la infección. (C) Día 2 (48 h) después de la infección. (D) Día 2,5 (60 h) post-infección. (E) Día 3 (72 h) después de la infección. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Existen varios ensayos para determinar el título del virus; la PFA tiene un protocolo de cuantificación del virus similar al de la FFA, en el que el inóculo del virus se diluye para permitir que se distingan placas o focos individuales. Después de la tinción, cada placa o foco indica una sola partícula infecciosa en el inóculo19. El PFA se tiñe con violeta cristalino para visualizar la formación de placa causada por la lisis o muerte celular. Por lo tanto, el PFA requiere más tiempo, ya que requiere más tiempo para que el virus cause CPE, y solo se restringe a los virus que inducen la lisis celular o la muerte. Muchos laboratorios han utilizado con éxito los FFA para determinar los títulos de virus infecciosos para los flavivirus, incluidos los ZIKV 19,20,21,22,23,24,25. El FFA es un método de inmunodetección colorimétrica basado en células que detecta el antígeno viral con anticuerpos y, por lo tanto, identifica las áreas focos de las células infectadas mediante la técnica de inmunotinción, pero no las placas12,26. La FFA ofrece algunas ventajas para el ZIKV sobre la PFA. Una clara ventaja es que se basa en el reconocimiento de anticuerpos de componentes virales sin CPE discernibles. Además, el uso de anticuerpos específicos del virus también es útil para identificar diferentes virus o serotipos virales en poblaciones mixtas27. Por lo tanto, el FFA es más específico que el PFA, ya que mide todas las infecciones virales y no depende de los virus que causan suficiente muerte celular para formar una placa visible28. El FFA también tiene un período de incubación más corto que el PFA, lo que requiere un CPE obvio que significa lisis y muerte celular. Finalmente, utilizando una placa de 96 pocillos, el método FFA proporciona la ventaja de utilizar más réplicas y diluciones más grandes para detectar y valorar el virus27,29. Además, el ensayo FFA reportado se puede adaptar fácilmente para pruebas de neutralización de virus y métodos para detectar compuestos antivirales. La incorporación de instrumentos o software de conteo celular automatizado comercial o gratuito puede mejorar aún más la usabilidad (consistencia, precisión, rendimiento) del FFA y sus métodos asociados.

Al comparar la placa de 24 pocillos con la placa de 96 pocillos, es importante tener en cuenta que el formato de 24 pocillos requiere que se cultive un mayor número de células en cultivos monocapa, así como mayores cantidades de medios y existencias de virus. Como resultado, es posible que el formato de placa de 24 pocillos no sea adecuado para su uso con muestras con volúmenes limitados. Esta limitación se puede superar utilizando el formato de 96 pocillos, como se describe en este documento. En primer lugar, el formato de 96 pocillos requiere menos material, lo que lo convierte en una opción más rentable. Además, el recuento automatizado de focos de virus teñidos en el formato de 96 pocillos permite un alto rendimiento y un análisis rápido, lo que no es posible en el formato de 24 pocillos, que requiere un recuento manual. Este proceso de conteo automatizado también aumenta la reproducibilidad y reduce la subjetividad en comparación con el conteo manual, lo que lleva a resultados más precisos y confiables del FFA. Por lo tanto, el formato de 96 pocillos con sistemas de imágenes automatizados es muy recomendable para laboratorios que requieren un alto rendimiento y una cuantificación fiable del virus.

Por otro lado, algunas personas utilizan el ensayo de enfoque inmunofluorescente para detectar el ZIKV 25,27,28,30,31. El ensayo de enfoque de inmunofluorescencia es paralelo al FFA, excepto que se realiza mediante inmunotinción de los antígenos con anticuerpos específicos conjugados con fluorocromos, seguido del recuento de focos de infección bajo un microscopio de fluorescencia25. Este ensayo utiliza reactivos más costosos y necesita microscopía de fluorescencia para completar el ensayo. Por lo tanto, el ensayo de enfoque de inmunofluorescencia se limita a laboratorios mejor equipados, como los laboratorios de referencia. No es fácil utilizar este ensayo en un entorno que requiere recursos.

Aunque el FFA tiene muchas ventajas, también tiene algunas limitaciones. En comparación con otros ensayos, como el PFA, el FFA implica más pasos durante los procesos de tinción. Si bien los pasos después de la fijación son flexibles y permiten pausas nocturnas o más largas, la tinción de los focos aún tarda más en completarse. Además, el FFA requiere anticuerpos específicos o de reacción cruzada en el proceso de tinción, lo que limita su aplicabilidad para identificar y cuantificar virus nuevos o novedosos. Además, el costo del FFA es más alto en comparación con el PFA, que solo requiere cristal violeta para teñir. Además de eso, vale la pena señalar que el proceso de conteo automatizado (formato de 96 pocillos) solo se puede realizar en un laboratorio con el equipo adecuado; por lo tanto, no será adecuado para laboratorios sin el equipo necesario.

En conclusión, presentamos protocolos detallados para la propagación y cuantificación del ZIKV utilizando el ensayo de inmunodetección colorimétrica basado en células o el FFA en formatos de placa de 24 pocillos y placa de 96 pocillos. El método ofrece una serie de ventajas prácticas sobre el PFA clásico. Es más rápido y apto para aplicaciones de alto rendimiento cuando se aplica con un sistema de imágenes automatizado para el recuento de focos. La estandarización de protocolos confiables para este estudio contribuirá en gran medida a la investigación sobre el zika y también se puede adaptar ampliamente para cuantificar otros virus clínicamente importantes.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Esta investigación recibió el apoyo del Ministerio de Educación Superior de Malasia en el marco del Programa de Becas de Investigación a Largo Plazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) y la financiación del programa del Centro de Excelencia de Instituciones Superiores (HICoE) (MO002-2019). La figura 3 de este estudio, que muestra el flujo de trabajo de tinción para el ensayo de formación de focos, está adaptada de "DAB Immunohistochemistry" de BioRender.com (2022). Recuperado de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Polyethersulfone syringe filter Sartorius S6534-FMOSK
1.5 mL microcentrifuge tube Nest 615601
10 mL sterile serological pipette Labserv 14955156
1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) Gibco 14190-136
2.0 mL Screw cap tube  Axygen SCT-200-SS-C-S
24-well plate Corning 3526
25 mL Sterile serological pipettes Labserv 14955157
3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate Thermo Scientific 34065
37 °C incubator with 5% CO2 Sanyo MCO-18AIC
5 mL sterile serological pipette Labserv 14955155
50 mL centrifuge tube Falcon LAB352070
75 cm2 tissue culture flask  Corning 430725U
96-well plate Falcon 353072
Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) MilliporeSigma MAB10216
Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) N/A N/A 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O
Biological safety cabinet, Class II Holten HB2448
CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) CTL-S6UNV12 Commercial software analyzer
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 12800-017
Fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS
Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) MilliporeSigma 12-349
Hemacytometer Laboroptik LTD Neubauer improved
IGEPAL CA-630 detergent Sigma-Aldrich I8896 Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL 
Inverted microscope ZEISS TELAVAL 31
Laboratory rocker FINEPCR CR300
L-Glutamine Gibco 25030-081
Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) Sigma-Aldrich C5678
Multichannel micropipette (10 - 100 µL) Eppendorf 3125000036
Multichannel micropipette (30 - 300 µL) Eppendorf 3125000052
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-streptomycin Gibco 15140-122
Single channel pipettes (10 - 100 µL) Eppendorf 3123000047
Single channel pipettes (100 - 1000 µL) Eppendorf 3123000063
Single channel pipettes (20 - 200 µL) Eppendorf 3123000055
Skim milk Sunlac Low Fat N/A Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining
Sodium Hypochlorite Clorox N/A To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates
Stereomicroscope Nikon SMZ1000
Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle Terumo SS10L21G
Vero African green monkey kidney cells  - ECACC 88020401 Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization.

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References

  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

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Immunology and Infection Número 194 Virus del Zika (ZIKV) Flavivirus Anomalías cerebrales congénitas Síndrome de Guillain-Barrã© Virología Ensayo de formación de foco (FFA) Antígeno viral Técnica de inmunotinción con peroxidasa Formato de 24 pocillos Formato de 96 pocillos Optimización del tamaño de los focos Células Vero Incubación Procesos de tinción Fijación celular Permeabilización Bloqueo Unión de anticuerpos Sustrato de peroxidasa
Propagación de virus y cuantificación colorimétrica basada en células
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