Summary
我们提出了一种改进的夹心酶联免疫吸附测定技术方案，以定量测量中性粒细胞细胞外捕获残留物的两种成分，髓过氧化物酶偶联-DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶偶联 DNA 复合物，来源于活化的中性粒细胞。
Abstract
某些刺激，如微生物，导致中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱（NET），其基本上是由DNA与颗粒蛋白组成的网状结构，如髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白（NE），以及细胞质和细胞骨架蛋白。尽管最近对NETs的兴趣有所增加，但没有灵敏，可靠的测定方法可用于在临床环境中测量NET。本文描述了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法，用于定量测量循环 NET 的两种成分，MPO-DNA 和 NE-DNA 复合物，它们是 NET 的特定成分，并作为 NET 的分解产物释放到细胞外空间。该测定使用用于MPO或NE的特异性单克隆抗体作为捕获抗体和DNA特异性检测抗体。MPO 或 NE 在含有 MPO-DNA 或 NE-DNA 复合物的样品初始孵育期间与捕获抗体的一个位点结合。该测定显示出良好的线性和高测定间和测定内精度。我们在16名伴有急性呼吸窘迫综合征的COVID-19患者中使用了它，发现MPO-DNA和NE-DNA的血浆浓度明显高于从健康对照获得的血浆。该检测法是研究人血浆和培养上清液中NET特征的可靠、高灵敏度和有用的方法。
Introduction
本文概述了一种定量生物体液中中性粒细胞细胞外捕获 （NET） 形成的方法，方法是使用夹心酶联免疫吸附测定法 （ELISA） 检测髓过氧化物酶 （MPO） 和中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE） 与 DNA 1,2 的复合物。NET由装饰有源自中性粒细胞颗粒3,4的抗菌蛋白酶的DNA骨架组成。MPO-DNA和NE-DNA复合物都是NET的重要和特异性成分，并作为NETs的分解产物释放到细胞外空间3,4。
NETs除了在抗菌防御中起重要的生理作用3外，还具有多种病理作用4,5，包括促进血栓形成6 和脓毒症恶化7。因此，NET最近引起了人们的关注。然而，由于缺乏灵敏、可靠的定量测定方法，NET的 体内 定量已被证明具有挑战性。
有几种方法可用，包括通过荧光显微镜8,9和流式细胞术10直接测量NET，以及间接测量循环游离DNA，核小体和瓜氨酸组蛋白H3，但每种方法都有自己的优点和局限性11。尽管免疫荧光显微镜方法特定于NETs，并且清楚地显示了NET的定位和形成程度，但样本仅限于活检组织和分泌物质。此外，该方法需要由熟练的研究人员进行，并且需要很长时间才能获得结果。通过流式细胞术测量NET相关成分的循环水平很容易，并且可以快速提供结果;但是，该方法并非特定于NETs 12。
我们13 和其他人 1,2 开发了一种高度灵敏且可靠的检测方法，用于使用改进的 ELISA 技术测量人血浆中循环的 NET 组分、MPO 偶联或 NE 偶联 DNA，该技术使用 MPO 或 NE 的特异性抗体作为捕获抗体和 DNA 特异性检测抗体。该测定法还可用于离体鉴定活化的中性粒细胞响应佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 （PMA） 刺激释放的细胞培养上清液中的 NET 组分。
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Protocol
这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的，并得到了爱知医科大学机构审查委员会的批准（2017-H341,2019-H137）。从每个参与者那里获得了书面知情同意。
1. 试剂制备
注意：为了进行夹心ELISA测定，试剂的制备如下所述。
- 包衣缓冲液：
- 要制备0.1 mol/L碳酸氢盐缓冲液，称取10.6 g无水碳酸钠（分子量，106 g/mol）和8.4 g碳酸氢钠（分子量，84 g/mol）。
- 将其添加到烧杯中约 900 mL 蒸馏水中。
- 通过添加所需量的稀释盐酸或氢氧化钠，将缓冲液的pH值调节至9.6。
- 用pH计检查pH值。
- 然后，加入所需体积的蒸馏水，使总体积达到 1,000 mL。
- 将此0.1mol/L碳酸氢盐缓冲液储存在4°C的冰箱中。
- 阻塞缓冲区：
- 将约 250 μL 20% 叠氮化钠和 1 g 牛血清白蛋白 （BSA） 加入由 137 mmol/L NaCl、8.1 mmol/L Na 2 HPO 4、2.68 mmol/L KCl 和 1.47 mol/L KH2PO 4 （pH7.4） 组成的 70 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，轻轻混合。
- 加入蒸馏水，使总体积达到 100 mL。牛血清白蛋白和叠氮化钠的终浓度分别为1%和0.05%。等待10分钟，然后溶液就可以使用了。
- 洗涤液：在蒸馏水中制备0.5%叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇，聚乙二醇叔辛基苯基醚（Triton X-100）。
- 用蒸馏水将 100% Triton X-100 稀释至 10%，并在使用前让 10% 溶液静置 1 天。
- 然后，用蒸馏水将10%的Triton X-100溶液重新稀释20倍，以达到0.5%的浓度。
- 抗体稀释：
- 在测定的第 1 天使用之前，将捕获抗体（抗 MPO 抗体 [1 mg/mL] 或抗 NE 抗体 [1 mg/mL]）在包被缓冲液 （pH 9.6） 中稀释至 1：2,000（见下文），检测抗体（过氧化物酶偶联的抗 DNA 抗体）在测定的第 3 天使用前用 PBS 稀释至 1：40（见下文）。
注意：对于初步实验，将iso型抗体（IgG兔[5mg / mL]和IgG1小鼠克隆Ci4[0.5mg / mL]）稀释至包被缓冲液（pH 9.6）中的1：10,000和1：1,000。
- 在测定的第 1 天使用之前，将捕获抗体（抗 MPO 抗体 [1 mg/mL] 或抗 NE 抗体 [1 mg/mL]）在包被缓冲液 （pH 9.6） 中稀释至 1：2,000（见下文），检测抗体（过氧化物酶偶联的抗 DNA 抗体）在测定的第 3 天使用前用 PBS 稀释至 1：40（见下文）。
- ABTS 底物溶液：根据样品数量，将一片、两片或三片 2,2'-联氮双（3 乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 （ABTS） 片剂溶解在 5 mL、10 mL 或 15 mL ABTS 缓冲液（含有过硼酸钠、柠檬酸和磷酸氢二钠）中;每个样品需要 100 μL。将制备的溶液储存在2-8°C避光。该解决方案可稳定长达 3 个月。
2. 样品收集和储存
- 等离子体分离：
- 通过用22G注射器静脉穿刺将4mL外周血样品收集到锂肝素采血管中，并在4°C下以1,600× g 离心10分钟。
- 将上清液转移到 2 mL 安全锁定样品管中。
- 在4°C下以16,000× g 重新离心上清液10分钟以除去任何残留细胞。
- 将上清液收集到新的安全锁定样品管中，而不会干扰管底部的沉淀。
- 将获得的血浆储存在-80°C直至进一步使用。
注意：为了通过该测定获得高通量结果，需要高质量的样品。如果使用血浆样品，请进行第二次离心以去除任何残留细胞。避免反复解冻样品。使用肝素作为抗凝剂，因为EDTA会影响脱氧核糖核酸酶活性。
- 多形核中性粒细胞的分离
- 通过用22G注射器静脉穿刺将外周血样品收集到锂肝素采血管中。
- 将 6 mL 血液分层到 6 mL 一步多晶型物上，并在室温 （RT） 下以 1,000 x g 离心管 45 分钟。
- 收获含有中性粒细胞的第三层血沉棕黄层，并在室温下以400× g 在无酚红RPMI-1640中洗涤3次10分钟。
- 将中性粒细胞重悬于含有补充有6%热灭活胎牛血清的2mM L-谷氨酰胺的无酚红RPMI-1640中，并用血细胞计数器在显微镜视野中计数细胞。
注意：该方法产生96%至98%的纯度，活性大于95%，通过台盼蓝染料排除评估。
- 体外多形核中性粒细胞活化和NETosis
- 将新鲜分离的多形核中性粒细胞稀释至1 × 105 个细胞/mL 的无酚红RPMI-1640中，含有2mM L-谷氨酰胺，补充有6%热灭活胎牛血清，并将它们接种在35 mm培养皿中。
- 为了诱导NET，在5%CO2 / 95%空气中用25nM PMA在37°C下刺激多形核中性粒细胞4小时。
- 孵育 4 小时后，通过在室温下直接向培养皿中加入 0.6 μg/mL DNase I 15 分钟来部分消化 NET，并通过添加 5 mM EDTA 停止 DNase I 活性。
- 收集含有合成NET的培养基，并在4°C下以400× g 离心10分钟以除去细胞碎片。
- 从四个健康对照中获取上清液，混合并储存在-80°C直至使用。
注意：从四个健康对照获得的DNase消化的PMA刺激的中性粒细胞用作NET标准1,14,15。使用PBS从连续稀释的NET标准品生成校准曲线，并将从未稀释的NET标准品中获得的光密度（OD）值指定为100%NET。
3. 测定法
注意：执行测定的步骤如下所述。
- 第一天
- 将总共 100 μL 含有 0.05 μg 抗体的稀释抗 MPO 或含有 0.05 μg 抗体的抗 NE 抗体应用于板的每个孔，包括空白孔。
注意：包被缓冲液不得含有任何类型的洗涤剂，否则，抗体可能无法均匀、平稳地结合到每个孔壁上。为防止钩状效应，包衣蛋白浓度不得超过20 μg/mL，因为高于该水平的浓度会使微量滴定板上的大多数可用位点饱和。蛋白质包衣溶液的典型浓度范围为2-10 μg/mL。对于初步实验，使用稀释的异型对照抗体IgG兔进行包被，而不是针对MPO的特异性单克隆抗体。使用稀释的 iso 型对照抗体 IgG1 小鼠进行包被，而不是针对 NE 的特异性单克隆抗体。 - 用粘性塑料盖覆盖板以防止样品蒸发，并在4°C孵育过夜以允许捕获抗体结合。
- 将总共 100 μL 含有 0.05 μg 抗体的稀释抗 MPO 或含有 0.05 μg 抗体的抗 NE 抗体应用于板的每个孔，包括空白孔。
- 第二天
- 从孔中弃去稀释的抗体溶液，然后每孔移取300μL洗涤溶液，并重复该洗涤程序三到四次。
- 通过在纸巾上敲干盘子来去除多余的PBS。
- 用 200 μL 封闭缓冲液封闭 ELISA 板的每个孔。
- 用粘性塑料盖紧紧覆盖板，并在室温下孵育1.5-2小时以阻塞孔。
- 从孔中完全丢弃封闭溶液，然后每孔移取300μL洗涤溶液，并重复该洗涤程序三到四次。
- 通过在纸巾上敲干盘子来去除多余的PBS。
- 向除空白孔外的每个孔中总共施用 25 μL 血浆或培养基，并加入 75 μL PBS 作为稀释剂，使最终体积为 100 μL;向空白孔中加入 100 μL PBS。
- 然后，通过将板放在250rpm的摇床上，在室温下混合样品10秒。
- 向每个孔中应用 2 μL 100 倍稀释的 DNase I （0.03 mg/mL），包括空白孔（反应混合物中 DNase I 的最终浓度：0.6 μg/mL）。
- 用粘性塑料盖密封板，并将板放在250rpm的摇床上，在室温下彻底混合样品10秒。
注意：为了评估DNA消化的最佳条件，在开发测定时，我们将含有来自COVID-19患者的MPO相关DNA的样品与0-0.9μg/ mL DNase I在室温下孵育15分钟，并使用涂有MPO特异性捕获抗体或物种匹配的iso型对照抗体的板。 - 将样品在室温下孵育15分钟。
- 取下粘性塑料盖，向每个孔中应用 1 μL 0.5 M EDTA 以停止 DNase 反应。
- 用粘性塑料盖重新密封板，并以 250 rpm 的速度将其放在振动台上，在室温下摇晃 15 秒。
- 然后，将板在4°C孵育过夜，以使NET的蛋白质组分附着在捕获抗体上。
- 第三天
- 取下粘性塑料盖，然后从孔中丢弃溶液。
- 从孔中完全弃去溶液，然后每孔移液300μL洗涤溶液，并重复该洗涤过程三到四次。
- 向每个孔中总共施用 100 μL 稀释的过氧化物酶偶联抗 DNA 检测抗体。
- 用粘性塑料盖紧密密封板，并在室温下孵育1.5小时。
- 从孔中完全丢弃溶液，然后每孔移液300μL洗涤溶液，并重复该洗涤程序三到四次。
- 小心地除去残留溶液。
- 向每个孔中总共施用 100 μL ABTS 底物溶液，并用粘性塑料盖覆盖板。
- 将板在室温下在黑暗中以250rpm在振荡器上孵育20-30分钟。
注意：每隔5分钟监测板，直到获得所需的OD读数。 - 加入总共 50 μL 的 2 M 硫酸以停止反应。
- 通过小心敲击板的侧面来混合孔中的液体内容物。
- 打开酶标仪，并将其连接到计算机。
- 在计算机上打开软件应用程序。
- 在状态栏中，创建一个新实验并为其命名。
- 设置以下所有板读数参数： 读取类型，吸光度;读取模式，端点;波长，2;Lm-1,405纳米;Lm-2,490 纳米;自动混合和消隐前，关闭;预读板，关闭;自动校准，开;条带，读取整个板;柱波长优先、柱优先;车速，正常;和自动读取，关闭。
- 然后，将装有样品的96孔板放入抽屉并关闭。
- 最后，选择“读取”按钮，以便立即 读取 板。
- 使用酶标仪读取每个孔在405nm波长下的吸光度（在此阶段，使用490nm的波长作为参考）。
- 从所有未知样品中单独自动减去测定培养基的吸光度值，并保存数据。
注意：使用从连续稀释的NET标准品获得的标准曲线计算样品1,14,15中NET的相对浓度。在这里，最终结果表示为“MPO或NE-DNA复合物（NET标准的百分比）”。检测限（LOD）由标准偏差（SD）和校准曲线斜率（S）计算如下：LOD = 3.3（SD / S）。
4. 统计
- 使用适当的统计分析软件执行所有统计分析。这里使用了 SigmaPlot v14.5。由于大多数参数的偏态分布，百分比和连续变量显示为四分位数间距的中位数。
- 使用 Wilcoxon 秩和检验比较 COVID-19 患者和健康对照组之间的血浆 MPO-DNA 和 NE-DNA 水平。使用相关分析来探索光密度与NET标准百分比之间的关系。
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Representative Results
该方法使用具有抗MPO、抗NE和抗DNA单克隆抗体的夹心ELISA来测量MPO相关和NE相关DNA（图1）。在该方法中，微量滴定板的孔涂有MPO特异性或NE特异性单克隆抗体，以捕获DNA相关的MPO和DNA相关的NE，以及非DNA相关的MPO和NE。为了计算测定内变异系数（CV），在同一板内对从COVID-19和健康对照患者收集的30个样本进行重复测量，并将%CV计算为重复测量的平均值;为了计算测定间CV（即板对板的一致性），在10个不同的平板上一式四份测量来自COVID-19患者和健康对照组的两种类型的样品;为了证明该测定的特异性，通过使用涂有同种对照抗体的板而不是针对MPO和NE的特异性单克隆抗体来测定各种浓度的MPO-DNA和NE-DNA复合物;为了计算测定的灵敏度和线性，测定了通过PMA和轻度DNase消化刺激分离的人中性粒细胞制成的连续稀释的NET标准品，并计算了相关系数和检测限（LOD）。
从连续稀释的NET标准品中提取的MPO-DNA和NE-DNA的校准曲线如图 2所示。当吸光度值分别不超过0.93和0.90的浓度时，可获得MPO-DNA和NE-DNA的可靠标准曲线（分别为R2 = 0.958和0.963）。根据SD和校准曲线斜率计算出的MPO-DNA和NE-DNA（%NET标准）的LOD值分别为0.132%和0.126%。
当应用0.6μg/mL DNase I时，获得最高的OD（图3）。因此，DNA消化仅限于在室温下加入DNase I的0.6μg/ mL反应混合物15分钟。当板涂有iso型对照抗体而不是针对MPO的特异性单克隆抗体时，在不同浓度的DNase I下检测到非常低的OD值（<0.09吸光度单位[AU]）。
为了计算MPO-DNA和NE-DNA的测定内变异系数（CV），在同一板中对来自COVID-19和健康对照患者的30个样品进行了重复测量;%CV 是使用重复平均值计算的。健康对照组MPO-DNA和NE-DNA的测定内CV分别为1.871和0.987，COVID-19患者的检测内CV分别为2.532和2.010（表1）。MPO-DNA和NE-DNA的平均测定内CV分别为2.202±0.467和1.497±0.723（平均±SD）（表1）。
为了计算MPO-DNA和NE-DNA的测定间CV，在10个不同的板上一式四份测量从COVID-19患者和健康对照者收集的两种类型的样品，以监测板与板的一致性。MPO-DNA和NE-DNA的平均测定间CV分别为6.524±2.672和4.389±0.923（平均±SD）（表2）。
为了评估捕获抗体对MPO-DNA和NE-DNA复合物的特异性，我们使用涂有同种对照抗体的板而不是针对MPO和NE的特异性单克隆抗体来测定不同浓度的MPO-DNA和NE-DNA复合物。 表3 显示，在各种浓度（0.035 AU至0.078 AU和-0.007 AU至0.096 AU， 分别）。
将脱氧核糖核酸酶消化的PMA刺激中性粒细胞上清液中的MPO-DNA和NE-DNA水平定义为100%NET标准，血浆样品数据表示为%NET标准。COVID-19患者血浆中的MPO-DNA（%NET标准）水平（n = 16;29.1% [IQR，25.8,41.5]）明显高于健康对照组血浆中的MPO-DNA（%净标准）水平（n = 10;13.4% [IQR，12.4,14.8]），NE-DNA（%净标准）水平（46.4%[IQR，32.7,53.7]和12.1%[IQR，9.9,14.7]）也分别高于 P < 0.01; 图4）。
图 1：用于测量样品中髓过氧化物酶-DNA 或中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA 的夹心酶联免疫吸附测定方法的基本阶段。 （A）孔涂有抗髓过氧化物酶（MPO）或抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）捕获抗体。（B）剩余的蛋白质结合位点被封闭剂阻断。（C）加入含有NE偶联和MPO偶联DNA的样品。（D）进行有限的DNase消化，并将样品在孔中孵育以与捕获抗体结合。（E）加入二级过氧化物酶标记的抗DNA抗体。（F）去除未结合的二级过氧化物酶标记的抗DNA抗体。（G）加入底物2,2'-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），监测显色。缩写：ABTS = 2,2'-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）;MPO = 髓过氧化物酶;NE = 中性粒细胞弹性蛋白酶 请点击此处查看此图的大图。
图2：强度值与中性粒细胞细胞外陷阱标准品的各种稀释度之间关系的线性。 将DNA酶消化的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸刺激的中性粒细胞的上清液连续稀释，测定髓过氧化物酶-DNA和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA的水平以产生校准曲线。从未稀释的中性粒细胞胞外陷阱标准品（NET标准品）获得的吸光度单位（AU）被分配为100%NET，并将405nm处的强度值与%NET标准品绘制成线性关系。缩写：MPO = 髓过氧化物酶;NE = 中性粒细胞弹性蛋白酶;NET = 中性粒细胞细胞外陷阱 请点击此处查看此图的大图。
图3：中性粒细胞胞外捕获DNA消化中DNase I的剂量反应。 将样品插入髓过氧化物酶包被的孔中。然后，加入脱氧核糖核酸酶I（0微克/毫升、0.3微克/毫升、0.6微克/毫升或0.9微克/毫升）。消化15分钟后，停止酶活性，并相应地进行夹心酶联免疫吸附测定的其余步骤。数据显示为标准偏差±平均值。 N = 12。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：COVID-19 患者骨髓过氧化物酶-DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶-DNA 复合物的血浆水平。 数据以中性粒细胞细胞外陷阱标准（NET标准）含量的百分比表示，并以中位数和四分位距表示。COVID-19患者，n = 16;健康对照，n = 10。** P < 0.01 与健康对照组相比。缩写：HC = 健康对照;NET = 中性粒细胞细胞外陷阱。 请点击此处查看此图的大图。
表1：测定内变异系数。 一式两份测量30个样品，以监测单个变异系数，从而确定测定内变异系数。缩写：AU = 吸光度单位;CV = 变异系数 请点击此处下载此表格。
表2：测定间变异系数。在10个不同的板上一式四份测量样品，以监测板间的变化，从而确定测定间变异系数。缩写：AU = 吸光度单位;CV = 变异系数。 请按此下载此表格。
表3：捕获抗体的特异性测试。在平板上涂有抗髓过氧化物酶（MPO）和抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）的同型对照抗体，以评估捕获抗体对MPO-DNA和NE-DNA复合物的特异性。缩写：AU = 吸光度单位;MPO = 髓过氧化物酶;NE = 中性粒细胞弹性蛋白酶 请点击此处下载此表。
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Discussion
我们已经描述了一种夹心ELISA方法，其中MPO或NE在含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样品的初始孵育期间与捕获抗体的一个位点结合。洗涤后，通过将样品与过氧化物酶相关的抗DNA单克隆抗体孵育来完成“三明治”。去除未结合的二抗后，通过添加显色ABTS过氧化物酶底物来检测结合的过氧化物酶偶联物，其产生可溶性终产物，可以在405nm处通过分光光度法读取。良好的线性、较高的测定间和测定内精密度表明本文和其他1,2中描述的ELISA测定在临床应用中是可靠可行的。此外，当DNase处理的PMA刺激的中性粒细胞的上清液被指定为NET标准品的最大信号时，该ELISA测定可用作半定量方法1,14,15。
NET的长染色质线装饰有MPO和NE蛋白。为了增加捕获抗体与MPO-DNA或NE-DNA复合物之间的结合，通过用酶DNA酶有限的DNA消化将线切成较短的片段;添加过高的DNA酶浓度可能导致DNA过度消化，从而降低吸光度。初步实验的结果表明（见 图3）表明，需要添加适量的DNase来松动来自NET的残留物。使用异型对照抗体而不是特异性捕获抗体的实验表明，该测定中使用的捕获抗体对MPO-DNA和NE-DNA复合物具有特异性。
NET形成的早期阶段的特征是脱聚染色质和质膜强度的保存9,16,17。具有浓缩核的中性粒细胞已被鉴定为正在经历NET形成的中性粒细胞，可以通过流式细胞术10进行定量。虽然流式细胞术可以在短时间内分析来自细胞的大量图像，但它不能用于评估细胞膜破裂和染色质挤出后NET形成的后期阶段。瓜氨酸组蛋白 H3 已知是 NET 特异性标志物，可通过蛋白质印迹18 和 ELISA19 检测;然而，这些方法仅特定于PAD4相关的NET形成，不能用于评估PAD4非依赖NETs20。
COVID-19 患者的血清 NET 残余水平高于健康对照组的发现与之前的报告一致21,22。这一发现表明，中性粒细胞活化（包括NET形成）可能在COVID-19的发病机制中起重要作用。
该测定具有局限性。最近的报告表明，分别编码MPO和NE的免疫相关基因，包括 MPO 和 ELANE，在不受控制的炎症条件下高度表达23 ，并与疾病严重程度和死亡率呈正相关24。由于MPO和NE参与NET的形成，独立于这些酶活性15，因此中性粒细胞中NE和MPO的蛋白质水平增加可能会影响该测定的结果。
我们得出结论，这种夹心ELISA方法直接测量颗粒蛋白的细胞外DNA，包括NE和MPO，它们对NET形成具有特异性。该检测测定法是研究人类样品和培养物上清液中NET特征的可靠、高灵敏度且有用的方法。
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Disclosures
本研究期间生成和/或分析的所有数据都包含在这篇已发表的文章中。提交人声明他们没有竞争利益。
Acknowledgments
作者感谢Huq Muhammad Aminul博士在审阅手稿时提供的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
References
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