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Immunology and Infection

Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Presentamos un protocolo para una técnica modificada de ensayo de inmunoadsorción enzimática sándwich para medir cuantitativamente dos componentes de los remanentes de trampas extracelulares de neutrófilos, los complejos de ADN conjugado con mieloperoxidasa y ADN conjugado con elastasa de neutrófilos, derivados de neutrófilos activados.

Abstract

Ciertos estímulos, como los microorganismos, hacen que los neutrófilos liberen trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son básicamente estructuras en forma de red compuestas de ADN con proteínas granulosas, como la mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos (NE), y proteínas citoplasmáticas y citoesqueléticas. Aunque el interés en los TNE ha aumentado recientemente, no se dispone de un método de ensayo sensible y fiable para medir los TNE en entornos clínicos. En este artículo se describe un ensayo de inmunoabsorción enzimática en sándwich modificado para medir cuantitativamente dos componentes de los TNE circulantes, los complejos MPO-ADN y NE-ADN, que son componentes específicos de los TNE y se liberan en el espacio extracelular como productos de degradación de los TNE. El ensayo utiliza anticuerpos monoclonales específicos para MPO o NE como anticuerpos de captura y un anticuerpo de detección específico de ADN. MPO o NE se une a un sitio del anticuerpo de captura durante la incubación inicial de muestras que contienen complejos MPO-DNA o NE-ADN. Este ensayo muestra una buena linealidad y una alta precisión entre ensayos e intraensayos. Lo utilizamos en 16 pacientes con COVID-19 con síndrome de dificultad respiratoria aguda acompañante y encontramos que las concentraciones plasmáticas de MPO-DNA y NE-DNA eran significativamente más altas que en el plasma obtenido de controles sanos. Este ensayo de detección es un método fiable, altamente sensible y útil para investigar las características de los NET en plasma humano y sobrenadantes de cultivo.

Introduction

Este artículo describe un método para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en fluidos biológicos mediante el uso de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas sándwich (ELISA) para detectar complejos de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) con ADN 1,2. Los TNE están compuestos por una columna vertebral de ADN decorada con proteasas antimicrobianas que se originan a partir de gránulos de neutrófilos 3,4. Tanto los complejos MPO-ADN como NE-ADN son componentes importantes y específicos de los TNE y se liberan en el espacio extracelular como productos de degradación de los TNE 3,4.

Además de su importante papel fisiológico en la defensa antimicrobiana3, los TNE también tienen varios efectos patológicos4,5, incluyendo la promoción de la trombogénesis6 y el empeoramiento de la sepsis7. En consecuencia, las NET han ido ganando atención recientemente. Sin embargo, la cuantificación in vivo de los NET ha demostrado ser un reto debido a la falta de un método de ensayo cuantitativo sensible y fiable.

Existen algunos métodos, incluida la medición directa de los NET mediante microscopía de fluorescencia8,9 y citometría de flujo 10 y la medición indirecta del ADN libre de células circulantes, los nucleosomas y la histona C3 citrulinada, pero cada método tiene sus propias ventajas y limitaciones11. Aunque el método microscópico de inmunofluorescencia es específico de los tumores neuroendocrinos y muestra claramente la localización y el grado de formación de los tumores neuroendocrinos, las muestras se limitan al tejido de la biopsia y a los materiales secretados. Además, este método debe ser realizado por investigadores calificados y requiere mucho tiempo para obtener resultados. La medición de los niveles circulantes de componentes relacionados con NET mediante citometría de flujo es fácil y proporciona resultados rápidamente; sin embargo, el método no es específico de las NET12.

Nosotros13 y otros1,2 hemos desarrollado un ensayo altamente sensible y confiable para medir los componentes circulantes de NET, ADN conjugado con MPO o conjugado con NE, en plasma humano con una técnica ELISA modificada que utiliza anticuerpos específicos para MPO o NE como anticuerpos de captura y un anticuerpo de detección específico de ADN. Este ensayo también se puede utilizar ex vivo para identificar los componentes de NET en los sobrenadantes de cultivo celular liberados por los neutrófilos activados en respuesta a la estimulación del forbol 12-miristato 13-acetato (PMA).

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Protocol

Este estudio se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad Médica de Aichi (2017-H341, 2019-H137). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante.

1. Preparación de reactivos

NOTA: Para realizar el ensayo ELISA sándwich, los reactivos se preparan como se describe a continuación.

  1. Tampón de recubrimiento:
    1. Para hacer un tampón de carbonato-bicarbonato de 0,1 mol/L, pesar 10,6 g de carbonato de sodio anhidro (peso molecular, 106 g/mol) y 8,4 g de bicarbonato de sodio (peso molecular, 84 g/mol).
    2. Añádalo a aproximadamente 900 ml de agua destilada en un vaso de precipitados.
    3. Ajuste el pH del tampón a 9,6 añadiendo la cantidad necesaria de ácido clorhídrico diluido o hidróxido de sodio.
    4. Compruebe el pH con un medidor de pH.
    5. Luego, agregue el volumen requerido de agua destilada para lograr un volumen total de 1,000 mL.
    6. Conservar este tampón carbonato-bicarbonato 0,1 mol/L en el frigorífico a 4 °C.
  2. Búfer de bloqueo:
    1. Añadir aproximadamente 250 μL de azida sódica al 20% y 1 g de albúmina sérica bovina (BSA) a 70 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) compuesta por 137 mmol/L de NaCl, 8,1 mmol/L deNa2HPO 4, 2,68 mmol/L de KCl y 1,47 mol/L de KH2PO 4 (pH 7,4), y mezclar suavemente.
    2. Agregue agua destilada para lograr un volumen total de 100 ml. Las concentraciones finales de albúmina sérica bovina y azida sódica son del 1% y 0,05%, respectivamente. Espere 10 minutos y luego la solución estará lista para usar.
  3. Solución de lavado: Preparar t-octilfenoxipolietoxietanol al 0,5%, éter de terc-octilfenilo de polietilenglicol (Triton X-100) en agua destilada.
    1. Diluya Triton X-100 al 100 % al 10 % con agua destilada y deje reposar la solución al 10 % durante 1 día antes de usarla.
    2. A continuación, vuelva a diluir la solución de Triton X-100 al 10% 20 veces con agua destilada para lograr una concentración del 0,5%.
  4. Dilución de anticuerpos:
    1. Diluir el anticuerpo de captura (anticuerpo anti-MPO [1 mg/ml] o anticuerpo anti-NE [1 mg/ml]) a 1:2.000 en el tampón de recubrimiento (pH 9,6) antes de su uso en el día 1 del ensayo (ver más abajo) y el anticuerpo de detección (anticuerpo anti-ADN conjugado con peroxidasa) a 1:40 con PBS antes de su uso en el día 3 del ensayo (ver más abajo).
      NOTA: Para el experimento preliminar, diluir los anticuerpos de tipo ISO (IgG de conejo [5 mg/mL] e IgG1 clon de ratón Ci4 [0,5 mg/mL]) a 1:10.000 y 1:1.000 en el tampón de recubrimiento (pH 9,6).
  5. Solución de sustrato ABTS: Dependiendo del número de muestras, disuelva una, dos o tres tabletas de 2,2'-azino-bis (3 ácido etilbenzotiazolina-6-sulfónico (ABTS) en 5 ml, 10 ml o 15 ml de tampón ABTS (que contiene perborato de sodio, ácido cítrico e hidrogenofosfato disódico); se necesitan 100 μL por muestra. Conservar la solución preparada a 2-8 °C protegida de la luz. La solución es estable hasta por 3 meses.

2. Recogida y almacenamiento de muestras

  1. Aislamiento de plasma:
    1. Recoger 4 ml de muestras de sangre periférica en un tubo de extracción de sangre de heparina de litio mediante venopunción con una jeringa de 22 g y centrifugar a 1.600 x g durante 10 min a 4 °C.
    2. Transfiera el sobrenadante a un tubo de muestra con cierre seguro de 2 ml.
    3. Vuelva a centrifugar el sobrenadante a 16.000 x g durante 10 minutos a 4 °C para eliminar las células residuales.
    4. Recoja el sobrenadante en un nuevo tubo de muestra con cierre seguro sin alterar el gránulo en la parte inferior del tubo.
    5. Almacenar el plasma obtenido a -80 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: Para obtener resultados de alto rendimiento con este ensayo, se requieren muestras de buena calidad. Si se utilizan muestras de plasma, realice una segunda centrifugación para eliminar las células residuales. Evite la descongelación repetida de las muestras. Use heparina como anticoagulante porque el EDTA afecta la actividad de la DNasa.
  2. Aislamiento de neutrófilos polimorfonucleares
    1. Recoger las muestras de sangre periférica en un tubo de extracción de sangre con heparina de litio mediante venopunción con una jeringa de 22 G.
    2. Coloque 6 ml de sangre en 6 ml de polimorfos de un solo paso y centrifugue los tubos a 1.000 x g durante 45 minutos a temperatura ambiente (RT).
    3. Coseche la tercera capa de capa leucocitaria que contiene neutrófilos y lávela tres veces en rojo de fenol RPMI-1640 a 400 x g durante 10 min a RT.
    4. Resuspender los neutrófilos en RPMI-1640 libre de rojo de fenol que contiene 2 mM de L-glutamina suplementada con suero fetal bovino inactivado por calor al 6%, y contar las células en el campo del microscopio con un hemocitómetro.
      NOTA: Este método produce una pureza del 96 % al 98 % con una viabilidad superior al 95 %, según lo evaluado mediante la exclusión del colorante azul de tripano.
  3. Activación de neutrófilos polimorfonucleares y NETosis in vitro
    1. Diluir neutrófilos polimorfonucleares recién aislados a 1 × 105 células/ml en RPMI-1640 libre de rojo de fenol que contenga 2 mM de L-glutamina suplementada con suero fetal bovino inactivado por calor al 6%, y sembrarlos en placas de cultivo de 35 mm.
    2. Para inducir NETs, estimular neutrófilos polimorfonucleares con PMA de 25 nM durante 4 h a 37 °C en aire con 5% de CO2/95%.
    3. Después de 4 h de incubación, digiera parcialmente los NETs añadiendo 0,6 μg/mL de DNasa I directamente a las placas de cultivo durante 15 min a RT, y detenga la actividad de la DNasa I añadiendo 5 mM de EDTA.
    4. Recoger el medio que contiene los NET sintetizados y centrifugar a 400 x g durante 10 min a 4 °C para eliminar los restos celulares.
    5. Obtener los sobrenadantes de cuatro controles sanos, mezclar y almacenar a -80 °C hasta su uso.
      NOTA: Los neutrófilos estimulados por PMA digeridos por DNasa obtenidos de cuatro controles sanos se utilizan como estándar NET 1,14,15. Genere una curva de calibración a partir de un patrón NET diluido en serie con PBS y asigne los valores de densidad óptica (OD) obtenidos de un patrón NET sin diluir como 100% NET.

3. Método de ensayo

NOTA: Los pasos para realizar el ensayo se describen en detalle a continuación.

  1. Día 1
    1. Aplique un total de 100 μL de anticuerpo anti-MPO o anti-NE diluido que contenga 0,05 μg de anticuerpo a cada pocillo de la placa, incluido el pocillo en blanco.
      NOTA: El tampón de recubrimiento no debe contener ningún tipo de detergente porque, de lo contrario, es posible que los anticuerpos no se unan de manera uniforme y suave a las paredes de cada pocillo. Para evitar el efecto gancho, la concentración de proteína de recubrimiento no debe ser superior a 20 μg/mL, ya que las concentraciones por encima de ese nivel saturarán la mayoría de los sitios disponibles en la placa de microtitulación. El rango de concentración típico de las soluciones de recubrimiento de proteínas es de 2-10 μg/mL. Para el experimento preliminar, se utilizó un anticuerpo de control de tipo IgG diluido para el recubrimiento en lugar de anticuerpos monoclonales específicos contra MPO. Utilice el anticuerpo de control de tipo IgG1 diluido en ratones para el recubrimiento en lugar de anticuerpos monoclonales específicos contra NE.
    2. Cubrir la placa con una cubierta adhesiva de plástico para evitar la evaporación de la muestra, e incubar durante la noche a 4 °C para permitir la unión de los anticuerpos de captura.
  2. Día 2
    1. Deseche la solución de anticuerpos diluida de los pocillos y, a continuación, pipetee 300 μL de solución de lavado por pocillo y repita este procedimiento de lavado de tres a cuatro veces.
    2. Retire el exceso de PBS golpeando el plato para secarlo con una toalla de papel.
    3. Bloquee cada pocillo de la placa ELISA con 200 μL del tampón de bloqueo.
    4. Cubra bien la placa con una cubierta de plástico adhesiva e incube durante 1,5-2 h a RT para obstruir los pocillos.
    5. Deseche completamente la solución de bloqueo de los pocillos y luego pipetee 300 μL de solución de lavado por pocillo y repita este procedimiento de lavado tres o cuatro veces.
    6. Retire el exceso de PBS golpeando el plato para secarlo con una toalla de papel.
    7. Aplique un total de 25 μL de plasma o medio a cada pocillo, excepto al pocillo en blanco, y agregue 75 μL de PBS como diluyente para que el volumen final sea de 100 μL; añadir 100 μL de PBS al pocillo en blanco.
    8. A continuación, mezcle las muestras a RT durante 10 s colocando la placa en un agitador a 250 rpm.
    9. Aplique 2 μL de DNasa I diluida 100 veces (0,03 mg/mL) a cada pocillo, incluido el pocillo en blanco (concentración final de DNasa I en la mezcla de reacción: 0,6 μg/mL).
    10. Selle la placa con una cubierta de plástico adhesiva y mezcle bien las muestras a RT durante 10 s colocando la placa en un agitador a 250 rpm.
      NOTA: Para evaluar las condiciones óptimas para la digestión del ADN, al desarrollar el ensayo, incubamos muestras que contenían ADN asociado a MPO de pacientes con COVID-19 con 0-0,9 μg/ml de DNasa I durante 15 min en RT y utilizamos placas recubiertas con un anticuerpo de captura específico para MPO o un anticuerpo de control de isotipo emparejado con la especie.
    11. Incubar las muestras durante 15 min en RT.
    12. Retire la cubierta de plástico adhesiva y aplique 1 μL de EDTA 0,5 M a cada pocillo para detener la reacción de la DNasa.
    13. Vuelva a sellar la placa con una cubierta de plástico adhesiva y agítela a RT durante 15 s colocándola en un agitador a 250 rpm.
    14. A continuación, incubar la placa durante la noche a 4 °C para permitir que los componentes proteicos de los NET se adhieran a los anticuerpos de captura.
  3. Día 3
    1. Retire la cubierta adhesiva de plástico y deseche la solución de los pocillos.
    2. Deseche completamente la solución de los pocillos y, a continuación, pipetee 300 μL de la solución de lavado por pocillo y repita este procedimiento de lavado tres o cuatro veces.
    3. Aplique un total de 100 μL del anticuerpo de detección de ADN conjugado con peroxidasa diluida a cada pocillo.
    4. Selle la placa herméticamente con una cubierta de plástico adhesiva e incube durante 1,5 h a RT.
    5. Deseche la solución completamente de los pocillos y, a continuación, pipetee 300 μL de solución de lavado por pocillo y repita este procedimiento de lavado tres o cuatro veces.
    6. Retire con cuidado la solución residual.
    7. Aplique un total de 100 μL de solución de sustrato ABTS a cada pocillo y cubra la placa con una cubierta de plástico adhesiva.
    8. Incubar la placa en la oscuridad a RT durante 20-30 min en una coctelera a 250 rpm.
      NOTA: Supervise la placa a intervalos de 5 minutos hasta que se obtengan las lecturas de OD deseadas.
    9. Añadir un total de 50 μL de ácido sulfúrico 2 M para detener la reacción.
    10. Mezcle el contenido líquido de los pocillos golpeando con cuidado el costado del plato.
    11. Encienda el lector de microplacas y conéctelo a la computadora.
    12. Abra la aplicación de software en la computadora.
    13. En la barra de estado, cree un nuevo experimento y asígnele un nombre.
    14. Configure todos los siguientes parámetros para la lectura de placas: Tipo de lectura, Absorbancia; Modo de lectura, Endpoint; Longitudes de onda, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Mezcla automática y supresión antes, desactivada; Placa de prelectura, apagado; Calibración automática, activada; Tiras, lea todo el plato; Prioridad de longitud de onda de columna, Prioridad de columna; Velocidad de carro, Normal; y Lectura automática, Desactivado.
    15. Luego, coloque la placa de 96 pocillos que contiene las muestras en el cajón y ciérrelo.
    16. Por último, seleccione el botón Leer para que la placa se lea inmediatamente.
    17. Lea la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 405 nm utilizando un lector de microplacas (en esta etapa, use una longitud de onda de 490 nm como referencia).
    18. Realice la sustracción automática del valor de absorbancia del medio de ensayo solo de todas las muestras desconocidas y guarde los datos.
      NOTA: Utilice una curva patrón obtenida a partir de un patrón NET diluido en serie para calcular la concentración relativa de NET en la muestra 1,14,15. Aquí, los resultados finales se presentan como "complejos de ADN MPO o NE (% del estándar NET)". El límite de detección (LOD) se calculó a partir de la desviación estándar (DE) y la pendiente de la curva de calibración (S) de la siguiente manera: LOD = 3,3(DE/S).

4. Estadísticas

  1. Realizar todos los análisis estadísticos utilizando un software de análisis estadístico adecuado. Aquí se utilizó SigmaPlot v14.5. Los porcentajes y las variables continuas se muestran como la mediana con el rango intercuartílico debido a la distribución sesgada de la mayoría de los parámetros.
  2. Compare los niveles plasmáticos de MPO-DNA y NE-DNA entre pacientes con COVID-19 y controles sanos mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon. Utilice el análisis de correlación para explorar la relación entre la densidad óptica y el porcentaje de NET-estándar.

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Representative Results

Este método utilizó un ELISA sándwich con anticuerpos monoclonales anti-MPO, anti-NE y anti-ADN para medir el ADN asociado a MPO y al NE (Figura 1). En este método, los pocillos de una placa de microtitulación se recubrieron con un anticuerpo monoclonal específico de MPO o NE específico para capturar MPO asociada al ADN y NE asociada al ADN, así como MPO y NE no asociadas al ADN. Para calcular el coeficiente de variabilidad (CV) intraensayo, se realizaron mediciones duplicadas dentro de la misma placa para 30 muestras recolectadas de pacientes con COVID-19 y controles sanos, y se calculó el %CV como la media de las mediciones duplicadas; para calcular el CV entre ensayos (es decir, la consistencia de placa a placa), se midieron dos tipos de muestras de pacientes con COVID-19 y controles sanos por cuadruplicado en 10 placas diferentes; para demostrar la especificidad de este ensayo, se analizaron varias concentraciones de complejos MPO-ADN y NE-ADN mediante el uso de placas recubiertas con anticuerpos de control de tipo ISO en lugar de anticuerpos monoclonales específicos contra MPO y NE; y para calcular la sensibilidad y linealidad del ensayo, se ensayó un patrón NET diluido en serie mediante la estimulación de neutrófilos humanos aislados con PMA y digestión de DNasa suave, y se calculó el coeficiente de correlación y el límite de detección (LOD).

En la Figura 2 se muestran las curvas de calibración para el ADN MPO y el ADN NE extraídas de un patrón NET diluido en serie. Se obtienen curvas estándar fiables para MPO-DNA y NE-DNA (R2 = 0,958 y 0,963, respectivamente) cuando los valores de absorbancia no superan las concentraciones de 0,93 y 0,90, respectivamente. Los valores de LOD calculados a partir de la DE y la pendiente de la curva de calibración fueron de 0,132% y 0,126% para MPO-DNA y NE-DNA (estándar %NETO), respectivamente.

La mayor DO se obtuvo cuando se aplicó 0,6 μg/mL de DNasa I (Figura 3). Por lo tanto, la digestión del ADN se limitó a añadir una mezcla de reacción de 0,6 μg/mL de DNasa I durante 15 min a temperatura ambiente. Cuando las placas se recubrieron con el anticuerpo de control de tipo ISO en lugar del anticuerpo monoclonal específico contra MPO, se detectaron valores muy bajos de OD (<0,09 unidades de absorbancia [AU]) a varias concentraciones de DNasa I.

Para calcular el coeficiente de variabilidad (CV) intraensayo para MPO-DNA y NE-DNA, se realizaron mediciones duplicadas en 30 muestras de pacientes con COVID-19 y controles sanos en la misma placa; el %CV se calculó utilizando la media duplicada. Los CV intraensayo para MPO-DNA y NE-DNA fueron de 1,871 y 0,987, respectivamente, en controles sanos y de 2,532 y 2,010, respectivamente, en pacientes con COVID-19 (Tabla 1). Los CV medios intraensayo de MPO-DNA y NE-DNA fueron de 2,202 ± 0,467 y 1,497 ± 0,723, respectivamente (media ± DE) (Tabla 1).

Para calcular el CV entre ensayos para MPO-DNA y NE-DNA, se midieron dos tipos de muestras recolectadas de pacientes con COVID-19 y controles sanos en cuadruplicado en 10 placas diferentes para monitorear la consistencia de placa a placa. La media de CV entre ensayos de MPO-DNA y NE-DNA fue de 6,524 ± 2,672 y 4,389 ± 0,923, respectivamente (media ± DE) (Tabla 2).

Para evaluar la especificidad de los anticuerpos de captura frente a los complejos MPO-ADN y NE-ADN, ensayamos varias concentraciones de los complejos MPO-ADN y NE-ADN mediante el uso de placas recubiertas con anticuerpos de control de isotipo en lugar de anticuerpos monoclonales específicos contra MPO y NE. La Tabla 3 muestra que los anticuerpos de control de tipo ISO reaccionaron poco con los complejos MPO-ADN y NE-ADN en las distintas concentraciones (0,035 UA a 0,078 UA y −0,007 UA a 0,096 UA, respectivamente).

Los niveles de MPO-DNA y NE-DNA en el sobrenadante de neutrófilos estimulados por PMA digeridos por DNasa se definieron como 100% NET-estándar, y los datos de la muestra de plasma se expresaron como %NET-estándar. Los niveles de MPO-DNA (%NET-estándar) fueron significativamente más altos en el plasma de pacientes con COVID-19 (n = 16; 29,1% [RIC, 25,8, 41,5]) que en el plasma de controles sanos (n = 10; 13,4% [RIC, 12,4, 14,8]), al igual que los niveles de NE-ADN (%NET-estándar) (46,4% [RIC, 32,7, 53,7] frente a 12,1% [RIC, 9,9, 14,7], respectivamente, P < 0,01; Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Etapas básicas de un método de ensayo de inmunoabsorción enzimática en sándwich para medir el ADN de la mieloperoxidasa o la elastasa de neutrófilos en el ADN en muestras. (A) Los pocillos están recubiertos con un anticuerpo de captura anti-mieloperoxidasa (MPO) o anti-elastasa de neutrófilos (NE). (B) Los sitios de unión a proteínas restantes son bloqueados por agentes bloqueantes. (C) Se añaden muestras que contienen ADN conjugado con NE y conjugado con MPO. (D) Se realiza una digestión limitada de la DNasa y la muestra se incuba en los pocillos para unirse al anticuerpo de captura. (E) Se agrega un anticuerpo anti-ADN secundario marcado con peroxidasa. (F) Se elimina el anticuerpo anti-ADN marcado con peroxidasa secundario no unido. (G) Se agrega el sustrato 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) y se monitorea el desarrollo del color. Abreviaturas: ABTS = ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico); MPO = mieloperoxidasa; NE = elastasa de neutrófilos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Linealidad de las relaciones entre los valores de intensidad y las diversas diluciones del patrón de trampa extracelular de neutrófilos. El sobrenadante de los neutrófilos estimulados por forbol 12-miristato 13-acetato de 13-ácido digeridos por DNasa se diluyó en serie, y se analizaron los niveles de mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN para generar una curva de calibración. Las unidades de absorbancia (UA) obtenidas a partir del patrón de trampa extracelular de neutrófilos sin diluir (estándar NET) se asignaron como 100% NET, y al trazar el valor de intensidad a 405 nm contra el estándar %NET se reveló una relación lineal. Abreviaturas: MPO = mieloperoxidasa; NE = elastasa de neutrófilos; NET = trampa extracelular de neutrófilos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Dosis-respuesta de la DNasa I en la digestión de ADN trampa extracelular de neutrófilos. La muestra se insertó en pocillos recubiertos de mieloperoxidasa. A continuación, se añadió DNasa I (0 μg/mL, 0,3 μg/mL, 0,6 μg/mL o 0,9 μg/mL). Después de 15 minutos de digestión, la actividad enzimática se detuvo y los pasos restantes del ensayo de inmunoabsorción enzimática sándwich se realizaron en consecuencia. Los datos se muestran como la media ± DE. N = 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Niveles plasmáticos de los complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN en pacientes con COVID-19. Los datos se expresan como porcentajes del contenido de trampas extracelulares de neutrófilos (estándar NET) y se presentan como medianas y rangos intercuartílicos. Pacientes con COVID-19, n = 16; controles sanos, n = 10. ** P < 0,01 en comparación con los controles sanos. Abreviaturas: HC = controles sanos; NET = trampa extracelular de neutrófilos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Coeficiente de variabilidad intraensayo. Se midieron treinta muestras por duplicado para monitorear los coeficientes de variabilidad individuales y, así, determinar el coeficiente de variabilidad intraensayo. Abreviaturas: AU = unidades de absorbancia; CV = coeficientes de variabilidad Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Coeficiente de variabilidad entre ensayos. Las muestras se midieron por cuadruplicado en 10 placas diferentes para monitorear la variación de placa a placa y, así, determinar el coeficiente de variabilidad entre ensayos. Abreviaturas: AU = unidades de absorbancia; CV = coeficiente de variabilidad. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 3: Test de especificidad para anticuerpos de captura. Las placas se recubrieron con anticuerpos de control de tipo ISO para la antimieloperoxidasa (MPO) y la antineutrófilos elastasa (NE) para evaluar la especificidad de los anticuerpos de captura para los complejos MPO-ADN y NE-ADN. Abreviaturas: AU = unidades de absorbancia; MPO = mieloperoxidasa; NE = elastasa de neutrófilos Haga clic aquí para descargar esta tabla.

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Discussion

Hemos descrito un método ELISA sándwich en el que MPO o NE se une a un sitio del anticuerpo de captura durante la incubación inicial de muestras que contienen complejos MPO-ADN o NE-ADN. Después del lavado, el "sándwich" se completa incubando las muestras con un anticuerpo monoclonal anti-ADN asociado a la peroxidasa. Después de la eliminación del anticuerpo secundario no unido, el conjugado de peroxidasa unido se detecta mediante la adición de un sustrato cromogénico de peroxidasa ABTS, que produce un producto final soluble que se puede leer espectrofotométricamente a 405 nm. La buena linealidad y la alta precisión entre ensayos e intraensayos indican que el ensayo ELISA descrito en este artículo y en otros 1,2 es fiable y factible para su aplicación clínica. Además, cuando el sobrenadante de los neutrófilos estimulados por PMA tratados con DNasa se asigna como señal máxima para el estándar NET, este ensayo ELISA se puede utilizar como método semicuantitativo 1,14,15.

Los largos hilos de cromatina de los NET están decorados con proteínas MPO y NE. Para aumentar la unión entre el anticuerpo de captura y los complejos MPO-ADN o NE-ADN, los hilos se cortan en trozos más cortos mediante una digestión limitada del ADN con la enzima DNasa; la adición de una concentración de DNasa demasiado alta podría conducir a una digestión excesiva del ADN y, por lo tanto, a una disminución de la absorbancia. Los resultados de un experimento preliminar (ver Figura 3) mostraron que es necesaria una cantidad adecuada de adición de DNasa para aflojar los restos derivados de los NET. Los experimentos que utilizaron anticuerpos de control de tipo ISO en lugar de anticuerpos de captura específicos mostraron que los anticuerpos de captura utilizados en este ensayo eran específicos para los complejos MPO-ADN y NE-ADN.

La etapa temprana de la formación de NET se caracteriza por la cromatina descondensada y la preservación de la intensidad de la membrana plasmática 9,16,17. Los neutrófilos con núcleo condensado han sido identificados como neutrófilos que están en formación de NET y pueden ser cuantificados por citometría de flujo10. Aunque la citometría de flujo puede analizar un gran número de imágenes de células en poco tiempo, no se puede utilizar para evaluar las etapas posteriores de la formación de NET después de la ruptura de la membrana celular y la extrusión de la cromatina. Las histonas H3 citrulinadas, que se sabe que son marcadores específicos de NET, se pueden detectar mediante Western blot18 y ELISA19; sin embargo, estos métodos solo son específicos para la formación de TNE relacionados con PAD4 y no pueden utilizarse para evaluar TNE independientes de PAD420.

El hallazgo de que los niveles séricos de remanentes de TNE fueron mayores en los pacientes con COVID-19 que en los controles sanos concuerda con informes previos21,22. Este hallazgo sugiere que la activación de los neutrófilos, incluida la formación de NET, puede desempeñar un papel importante en la patogénesis de la COVID-19.

Este ensayo tiene una limitación. Informes recientes han demostrado que los genes relacionados con el sistema inmunitario, incluidos MPO y ELANE, que codifican MPO y NE, respectivamente, se expresan en gran medida en condiciones inflamatorias no controladas23 y se correlacionan positivamente con la gravedad de la enfermedad y la mortalidad24. Dado que la MPO y la NE están implicadas en la formación de NETs independientemente de esas actividades enzimáticas15, el aumento de los niveles proteicos de NE y MPO en los neutrófilos puede afectar a los resultados de este ensayo.

Concluimos que este método ELISA sándwich mide directamente el ADN extracelular con proteínas granulosas, incluidas NE y MPO, que son específicas para la formación de NET. Este ensayo de detección es un método fiable, altamente sensible y útil para investigar las características de los NET en muestras humanas y sobrenadantes de cultivo.

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Disclosures

Todos los datos generados y/o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado. Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Los autores agradecen al Dr. Huq Muhammad Aminul por su ayuda en la revisión del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

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References

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Inmunología e Infección Número 195
Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado
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Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

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