Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

एक संशोधित सैंडविच एलिसा का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप से मायलोपेरोक्सीडेज-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस-डीएनए कॉम्प्लेक्स की मात्रा निर्धारित करना

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

हम एक संशोधित सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख तकनीक के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ताकि सक्रिय न्यूट्रोफिल से प्राप्त न्यूट्रोफिल बाह्य जाल अवशेषों, मायलोपेरोक्सीडेज संयुग्मित-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस संयुग्मित-डीएनए परिसरों के दो घटकों को मात्रात्मक रूप से मापा जा सके।

Abstract

सूक्ष्मजीवों जैसे कुछ उत्तेजनाएं, न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोफिल बाह्य जाल (एनईटी) जारी करने का कारण बनती हैं, जो मूल रूप से ग्रेन्युल प्रोटीन के साथ डीएनए से बनी वेब जैसी संरचनाएं हैं, जैसे मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ) और न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई), और साइटोप्लाज्मिक और साइटोस्केलेटल प्रोटीन। यद्यपि हाल ही में एनईटी में रुचि बढ़ी है, नैदानिक सेटिंग्स में एनईटी को मापने के लिए कोई संवेदनशील, विश्वसनीय परख विधि उपलब्ध नहीं है। यह लेख एनईटी, एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स के परिसंचारी दो घटकों को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक संशोधित सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख का वर्णन करता है, जो एनईटी के विशिष्ट घटक हैं और एनईटी के ब्रेकडाउन उत्पादों के रूप में बाह्य अंतरिक्ष में जारी किए जाते हैं। परख एमपीओ या एनई के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कैप्चर एंटीबॉडी और डीएनए-विशिष्ट पहचान एंटीबॉडी के रूप में करती है। एमपीओ या एनई एमपीओ-डीएनए या एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स वाले नमूनों के प्रारंभिक इनक्यूबेशन के दौरान कैप्चर एंटीबॉडी की एक साइट को बांधता है। यह परख अच्छी रैखिकता और उच्च अंतर-परख और इंट्रा-परख परिशुद्धता दिखाती है। हमने कोविड-19 के 16 रोगियों में इसका इस्तेमाल किया और पाया कि एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए की प्लाज्मा सांद्रता स्वस्थ नियंत्रण से प्राप्त प्लाज्मा की तुलना में काफी अधिक थी। यह पहचान परख मानव प्लाज्मा और संस्कृति सुपरनैटेंट में एनईटी की विशेषताओं की जांच के लिए एक विश्वसनीय, अत्यधिक संवेदनशील और उपयोगी विधि है।

Introduction

यह लेख डीएनए 1,2 के साथ मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ) और न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के परिसरों का पता लगाने के लिए सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) का उपयोग करके जैविक तरल पदार्थों में न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप (नेट) गठन की मात्रा निर्धारित करने की एक विधि को रेखांकित करता है। एनईटी एक डीएनए रीढ़ से बना होता है जिसे न्यूट्रोफिल ग्रैन्यूल 3,4 से उत्पन्न रोगाणुरोधी प्रोटीज से सजाया जाता है। एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स दोनों एनईटी के महत्वपूर्ण और विशिष्ट घटक हैं और एनईटी 3,4 के ब्रेकडाउन उत्पादों के रूप में बाह्य अंतरिक्ष में जारी किए जाते हैं।

रोगाणुरोधी रक्षा3 में उनकी महत्वपूर्ण शारीरिक भूमिका के अलावा, एनईटी में विभिन्न रोग प्रभाव4,5 भी हैं, जिनमें थ्रोम्बोजेनेसिस6 को बढ़ावा देना और सेप्सिस7 का बिगड़ना शामिल है। तदनुसार, एनईटी हाल ही में ध्यान आकर्षित कर रहे हैं। फिर भी, एक संवेदनशील, विश्वसनीय मात्रात्मक परख विधि की कमी के कारण एनईटी की विवो मात्रा का ठहराव चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है।

कुछ विधियां उपलब्ध हैं, जिनमें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी8,9 और फ्लो साइटोमेट्री10 द्वारा एनईटी का प्रत्यक्ष माप और परिसंचारी सेल-मुक्त डीएनए, न्यूक्लियोसोम और सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3 का अप्रत्यक्ष माप शामिल है, लेकिन प्रत्येक विधि के अपने फायदे और सीमाएंहैं। यद्यपि इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपिक विधि एनईटी के लिए विशिष्ट है और स्पष्ट रूप से स्थानीयकरण और नेट गठन की डिग्री दिखाती है, नमूने बायोप्सी ऊतक और स्रावित सामग्री तक सीमित हैं। इसके अलावा, इस विधि को कुशल शोधकर्ताओं द्वारा किया जाना चाहिए और परिणाम प्राप्त करने के लिए लंबे समय की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा नेट से संबंधित घटकों के परिसंचारी स्तर को मापना आसान है और जल्दी से परिणाम प्रदान करता है; हालाँकि, विधि एनईटी12 के लिए विशिष्ट नहीं है।

हम13 और अन्य 1,2 ने एक संशोधित एलिसा तकनीक के साथ मानव प्लाज्मा में परिसंचारी नेट घटकों, एमपीओ-संयुग्मित या एनई-संयुग्मित डीएनए को मापने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील और विश्वसनीय परख विकसित की है जो कैप्चर एंटीबॉडी और डीएनए-विशिष्ट पहचान एंटीबॉडी के रूप में एमपीओ या एनई के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करता है। इस परख का उपयोग फोरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट (पीएमए) उत्तेजना के जवाब में सक्रिय न्यूट्रोफिल द्वारा जारी सेल कल्चर सुपरनैटेंट में नेट घटकों की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यह अध्ययन हेलसिंकी की घोषणा के अनुरूप आयोजित किया गया था और आइची मेडिकल यूनिवर्सिटी (2017-एच 341, 2019-एच 137) के संस्थागत समीक्षा बोर्डों द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रत्येक प्रतिभागी से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. अभिकर्मक तैयारी

नोट: सैंडविच एलिसा परख करने के लिए, अभिकर्मकों को नीचे वर्णित के रूप में तैयार किया जाता है।

  1. कोटिंग बफर:
    1. 0.1 मोल / एल कार्बोनेट-बाइकार्बोनेट बफर बनाने के लिए, 10.6 ग्राम निर्जल सोडियम कार्बोनेट (आणविक भार, 106 ग्राम / मोल) और 8.4 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट (आणविक भार, 84 ग्राम /
    2. इसे एक बीकर में लगभग 900 एमएल आसुत जल में जोड़ें।
    3. पतला हाइड्रोक्लोरिक एसिड या सोडियम हाइड्रॉक्साइड की आवश्यक मात्रा जोड़कर बफर के पीएच को 9.6 तक समायोजित करें।
    4. पीएच मीटर के साथ पीएच की जांच करें।
    5. फिर, 1,000 एमएल की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए आसुत जल की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
    6. इस 0.1 मोल / एल कार्बोनेट-बाइकार्बोनेट बफर को रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. बफर ब्लॉक करना:
    1. 137 mmol/L NaCl, 8.1 mmol/L Na 2 HPO 4, 2.68 mmol /L KCl, और 1.47 mol/L KH2PO 4(pH7.4) से बना फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (PBS) के 70 मिलीलीटर में लगभग 250 μL 20% सोडियम एज़ाइड और 1 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) जोड़ें और धीरे से मिलाएं।
    2. 100 एमएल की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए आसुत जल जोड़ें। गोजातीय सीरम एल्बुमिन और सोडियम एज़ाइड की अंतिम सांद्रता क्रमशः 1% और 0.05% है। 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर समाधान उपयोग करने के लिए तैयार है।
  3. धोने का घोल: आसुत जल में 0.5% टी-ऑक्टिलफेनोक्सीपॉलीएथेनॉल, पॉलीथीन ग्लाइकॉल टर्ट-ऑक्टिलफेनिल ईथर (ट्राइटन एक्स -100) तैयार करें।
    1. आसुत जल के साथ 100% ट्राइटन एक्स -100 को 10% तक पतला करें, और उपयोग से पहले 10% समाधान को 1 दिन तक खड़े रहने दें।
    2. फिर, 0.5% की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए आसुत जल के साथ 10% ट्राइटन एक्स -100 समाधान को 20 गुना फिर से पतला करें।
  4. एंटीबॉडी कमजोर पड़ना:
    1. परख के पहले दिन (नीचे देखें) उपयोग करने से पहले कोटिंग बफर (पीएच 9.6) में कैप्चर एंटीबॉडी (एंटी-एमपीओ एंटीबॉडी [1 मिलीग्राम / एमएल] या एंटी-एनई एंटीबॉडी [1 मिलीग्राम / एमएल]) को 1: 2,000 तक पतला करें और परख के तीसरे दिन उपयोग से पहले पीबीएस के साथ डिटेक्शन एंटीबॉडी (पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटी-डीएनए एंटीबॉडी) को 1:40 तक पतला करें (नीचे देखें)।
      नोट: प्रारंभिक प्रयोग के लिए, आइसो-प्रकार के एंटीबॉडी (आईजीजी खरगोश [5 मिलीग्राम / एमएल] और आईजीजी 1 माउस क्लोन सीआई 4 [0.5 मिलीग्राम / एमएल]) को कोटिंग बफर (पीएच 9.6) में 1: 10,000 और 1: 1,000 तक पतला करें।
  5. एबीटीएस सब्सट्रेट समाधान: नमूनों की संख्या के आधार पर, एक, दो, या तीन 2,2'-एज़िनो-बिस (3 एथिलबेंजोथियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड (एबीटीएस) गोलियों को 5 एमएल, 10 एमएल, या 15 एमएल एबीटीएस बफर (सोडियम परबोरेट, साइट्रिक एसिड और डाइसोडियम हाइड्रोजन फॉस्फेट युक्त) में भंग करें; प्रति नमूना 100 μL की आवश्यकता है। तैयार घोल को प्रकाश से सुरक्षित 2-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। समाधान 3 महीने तक स्थिर है।

2. नमूना संग्रह और भंडारण

  1. प्लाज्मा अलगाव:
    1. 22 ग्राम सिरिंज के साथ वेनिपंक्चर द्वारा लिथियम हेपरिन रक्त संग्रह ट्यूब में 4 एमएल परिधीय रक्त के नमूने एकत्र करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,600 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. सुपरनैटेंट को 2 एमएल सेफ-लॉक नमूना ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. किसी भी अवशिष्ट कोशिकाओं को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 x g पर सतह पर तैरनेवाला को फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
    4. ट्यूब के निचले हिस्से में गोली को परेशान किए बिना सुपरनैटेंट को एक नए सुरक्षित-लॉक नमूना ट्यूब में इकट्ठा करें।
    5. प्राप्त प्लाज्मा को -80 डिग्री सेल्सियस पर आगे के उपयोग तक स्टोर करें।
      नोट: इस परख के साथ उच्च-थ्रूपुट परिणाम प्राप्त करने के लिए, अच्छी गुणवत्ता वाले नमूने आवश्यक हैं। यदि प्लाज्मा के नमूने का उपयोग किया जाता है, तो किसी भी अवशिष्ट कोशिकाओं को हटाने के लिए दूसरा सेंट्रीफ्यूजेशन करें। नमूनों को बार-बार पिघलाने से बचें। एंटीकोआगुलेंट के रूप में हेपरिन का उपयोग करें क्योंकि ईडीटीए डीनेस गतिविधि को प्रभावित करता है।
  2. पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल का अलगाव।
    1. परिधीय रक्त के नमूनों को 22 ग्राम सिरिंज के साथ वेनिपंक्चर द्वारा लिथियम हेपरिन रक्त संग्रह ट्यूब में एकत्र करें।
    2. एक-चरण बहुरूपता के 6 एमएल पर रक्त की 6 मिलीलीटर परत करें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 45 मिनट के लिए 1,000 x g पर ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. न्यूट्रोफिल युक्त तीसरी बफी कोट परत की कटाई करें, और इसे आरटी पर 10 मिनट के लिए 400 एक्स जी पर फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई -1640 में तीन बार धोएं।
    4. फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई -1640 में न्यूट्रोफिल को फिर से निलंबित करें जिसमें 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन होता है जो 6% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक होता है, और हेमोसाइटोमीटर के साथ माइक्रोस्कोप क्षेत्र में कोशिकाओं की गणना करता है।
      नोट: यह विधि 95% से अधिक व्यवहार्यता के साथ 96% से 98% शुद्धता उत्पन्न करती है, जैसा कि ट्राइपैन ब्लू डाई बहिष्करण द्वारा मूल्यांकन किया गया है।
  3. विट्रो में पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल और एनईटोसिस का सक्रियण
    1. फिनोल लाल-मुक्त आरपीएमआई -1640 में 1 × 105 कोशिकाओं / एमएल में ताजा पृथक पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल को पतला करें, जिसमें 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन 6% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक हो, और उन्हें 35 मिमी संस्कृति व्यंजनों में बीज दिया जाए।
    2. एनईटी को प्रेरित करने के लिए, 5% सीओ2/95% हवा में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए 25 एनएम पीएमए के साथ पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल को उत्तेजित करें।
    3. 4 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, आरटी पर 15 मिनट के लिए संस्कृति व्यंजनों में सीधे 0.6 μg / mL DNase I जोड़कर NETs को आंशिक रूप से पचाएं, और 5 mM EDTA जोड़कर DNase I गतिविधि को रोकें।
    4. संश्लेषित एनईटी युक्त माध्यम को इकट्ठा करें, और सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    5. चार स्वस्थ नियंत्रणों से सतह पर तैरनेवाला प्राप्त करें, मिश्रण करें, और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: चार स्वस्थ नियंत्रणों से प्राप्त डीएनएस-पचा पीएमए-उत्तेजित न्यूट्रोफिल का उपयोग नेट-मानक 1,14,15 के रूप में किया जाता है। पीबीएस के साथ एक क्रमिक रूप से पतला नेट-मानक से एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करें, और एक अपरिवर्तित नेट-मानक से प्राप्त ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) मानों को 100% नेट के रूप में असाइन करें।

3. परख विधि

नोट: परख करने के लिए चरण नीचे विस्तार से वर्णित हैं।

  1. दिन 1
    1. प्लेट के प्रत्येक कुएं पर 0.05 μg एंटीबॉडी वाले पतला एंटी-एमपीओ या एंटी-एनई एंटीबॉडी के कुल 100 μL लागू करें, जिसमें खाली कुएं भी शामिल हैं।
      नोट: कोटिंग बफर में किसी भी प्रकार का डिटर्जेंट नहीं होना चाहिए क्योंकि, अन्यथा, एंटीबॉडी प्रत्येक कुएं की दीवारों पर समान रूप से और सुचारू रूप से नहीं बंध सकते हैं। हुक प्रभाव को रोकने के लिए, कोटिंग प्रोटीन एकाग्रता 20 μg / mL से अधिक नहीं होनी चाहिए, क्योंकि उस स्तर से ऊपर की सांद्रता माइक्रोटिटर प्लेट पर अधिकांश उपलब्ध साइटों को संतृप्त करेगी। प्रोटीन कोटिंग समाधान की विशिष्ट एकाग्रता सीमा 2-10 μg / mL है। प्रारंभिक प्रयोग के लिए, एमपीओ के खिलाफ विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बजाय कोटिंग के लिए पतला आइसो-टाइप कंट्रोल एंटीबॉडी आईजीजी खरगोश का उपयोग करें। एनई के खिलाफ विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बजाय कोटिंग के लिए पतला आइसो-टाइप कंट्रोल एंटीबॉडी आईजीजी 1 माउस का उपयोग करें।
    2. नमूने के वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेट को चिपकने वाले प्लास्टिक कवर के साथ कवर करें, और कैप्चर एंटीबॉडी के बंधन की अनुमति देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. दिन 2
    1. कुओं से पतला एंटीबॉडी समाधान छोड़ दें, और फिर प्रति अच्छी तरह से धोने के घोल के 300 μL को पिपेट करें, और इस धोने की प्रक्रिया को तीन से चार बार दोहराएं।
    2. एक पेपर टॉवल पर प्लेट ड्राई टैप करके अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें।
    3. एलिसा प्लेट के प्रत्येक कुएं को ब्लॉकिंग बफर के 200 μL के साथ ब्लॉक करें।
    4. प्लेट को चिपकने वाले प्लास्टिक कवर के साथ बारीकी से कवर करें, और कुओं को बाधित करने के लिए आरटी पर 1.5-2 घंटे के लिए इसे इनक्यूबेट करें।
    5. कुओं से ब्लॉकिंग समाधान को पूरी तरह से हटा दें, और फिर प्रति अच्छी तरह से 300 μL धोने के घोल को पिपेट करें, और इस धोने की प्रक्रिया को तीन से चार बार दोहराएं।
    6. एक पेपर टॉवल पर प्लेट ड्राई टैप करके अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें।
    7. रिक्त कुएं को छोड़कर प्रत्येक कुएं पर कुल 25 μL प्लाज्मा या माध्यम लागू करें, और अंतिम मात्रा 100 μL बनाने के लिए एक डिल्यूनेट के रूप में पीबीएस के 75 μL जोड़ें; रिक्त कुएं में पीबीएस के 100 μL जोड़ें।
    8. फिर, 250 आरपीएम पर प्लेट को शेकर पर रखकर 10 सेकंड के लिए आरटी पर नमूने मिलाएं।
    9. प्रत्येक कुएं पर 100 गुना पतला DNase I (0.03 mg/mL) का 2 μL लागू करें, जिसमें रिक्त कुआं भी शामिल है (प्रतिक्रिया मिश्रण में DNase I की अंतिम सांद्रता: 0.6 μg/mL)।
    10. प्लेट को चिपकने वाला प्लास्टिक कवर के साथ सील करें, और प्लेट को 250 आरपीएम पर शेकर पर रखकर 10 सेकंड के लिए आरटी पर नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: डीएनए पाचन के लिए इष्टतम परिस्थितियों का आकलन करने के लिए, परख विकसित करते समय, हमने आरटी पर 15 मिनट के लिए 0-0.9 μg/mL DNase I के साथ सीओवीआईडी -19 के रोगियों से एमपीओ-संबद्ध डीएनए वाले नमूनों को इनक्यूबेट किया और एमपीओ या प्रजातियों से मेल खाने वाले आइसो-टाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित प्लेटों का उपयोग किया।
    11. आरटी पर 15 मिनट के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    12. चिपकने वाला प्लास्टिक कवर हटा दें, और DNase प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक कुएं पर 0.5 M EDTA के 1 μL लागू करें।
    13. प्लेट को चिपकने वाले प्लास्टिक कवर के साथ फिर से सील करें, और इसे 250 आरपीएम पर शेकर पर रखकर 15 सेकंड के लिए आरटी पर हिलाएं।
    14. फिर, प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें ताकि एनईटी के प्रोटीन घटकों को कैप्चर एंटीबॉडी से जुड़ने की अनुमति मिल सके।
  3. दिन 3
    1. चिपकने वाला प्लास्टिक कवर हटा दें, और कुओं से घोल को फेंक दें।
    2. कुओं से घोल को पूरी तरह से हटा दें, और फिर प्रति अच्छी तरह से धोने के घोल के 300 μL को पिपेट करें, और इस धोने की प्रक्रिया को तीन से चार बार दोहराएं।
    3. प्रत्येक कुएं पर पतला पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटी-डीएनए डिटेक्शन एंटीबॉडी के कुल 100 μL लागू करें।
    4. प्लेट को चिपकने वाले प्लास्टिक कवर के साथ बारीकी से सील करें, और इसे आरटी पर 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. कुओं से घोल को पूरी तरह से फेंक दें, और फिर प्रति अच्छी तरह से धोने के घोल के 300 μL को पिपेट करें, और इस धोने की प्रक्रिया को तीन से चार बार दोहराएं।
    6. अवशिष्ट घोल को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    7. प्रत्येक कुएं पर एबीटीएस सब्सट्रेट समाधान के कुल 100 μL लागू करें, और प्लेट को चिपकने वाला प्लास्टिक कवर के साथ कवर करें।
    8. 250 आरपीएम पर शेकर पर 20-30 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: वांछित ओडी रीडिंग प्राप्त होने तक 5 मिनट के अंतराल पर प्लेट की निगरानी करें।
    9. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 2 एम सल्फ्यूरिक एसिड के कुल 50 μL जोड़ें।
    10. प्लेट के किनारे को ध्यान से टैप करके कुओं की तरल सामग्री को मिलाएं।
    11. माइक्रोप्लेट रीडर पर स्विच करें, और इसे कंप्यूटर से कनेक्ट करें।
    12. कंप्यूटर पर सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोग खोलें।
    13. स्थिति पट्टी से, एक नया प्रयोग बनाएँ और उसे नाम दें.
    14. प्लेट रीडिंग के लिए निम्नलिखित सभी पैरामीटर सेट करें: पढ़ें प्रकार, अवशोषण; रीड मोड, एंडपॉइंट; तरंग दैर्ध्य, 2; एलएम -1, 405 एनएम; एलएम -2, 490 एनएम; ऑटो मिक्स और ब्लैंकिंग पहले, बंद; प्री-रीड प्लेट, ऑफ; ऑटो अंशांकन, ऑन; स्ट्रिप्स, पूरी प्लेट पढ़ें; कॉलम तरंग दैर्ध्य प्राथमिकता, कॉलम प्राथमिकता; गाड़ी की गति, सामान्य; और ऑटो पढ़ें, बंद।
    15. फिर, नमूने वाले 96-वेल प्लेट को दराज में रखें और इसे बंद कर दें।
    16. अंत में, पढ़ें बटन का चयन करें ताकि प्लेट तुरंत पढ़ ली जाए।
    17. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 405 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण को पढ़ें (इस स्तर पर, संदर्भ के रूप में 490 एनएम की तरंग दैर्ध्य का उपयोग करें)।
    18. सभी अज्ञात नमूनों से अकेले परख माध्यम के अवशोषण मूल्य का स्वचालित घटाव करें, और डेटा सहेजें।
      नोट: नमूना 1,14,15 में नेट की सापेक्ष एकाग्रता की गणना करने के लिए क्रमिक रूप से पतला नेट-मानक से प्राप्त मानक वक्र का उपयोग करें। यहां, अंतिम परिणाम "एमपीओ- या एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स (नेट-मानक का%) के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। पहचान की सीमा (एलओडी) की गणना मानक विचलन (एसडी) और अंशांकन वक्र (एस) की ढलान से निम्नानुसार की गई थी: एलओडी = 3.3 (एसडी / एस)।

4. सांख्यिकी

  1. उपयुक्त सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके सभी सांख्यिकीय विश्लेषण करें। यहां सिग्माप्लॉट वी 14.5 का उपयोग किया गया था। प्रतिशत और निरंतर चर को अधिकांश मापदंडों के विषम वितरण के कारण इंटरक्वार्टाइल रेंज के साथ औसत के रूप में दिखाया गया है।
  2. विलकॉक्सन रैंक सम टेस्ट का उपयोग करके कोविड-19 रोगियों और स्वस्थ नियंत्रणों के बीच प्लाज्मा एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए स्तरों की तुलना करें। ऑप्टिकल घनत्व और नेट-मानक के प्रतिशत के बीच संबंधों का पता लगाने के लिए सहसंबंध विश्लेषण का उपयोग करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस विधि ने एमपीओ से जुड़े और एनई से जुड़े डीएनए को मापने के लिए एंटी-एमपीओ, एंटी-एनई और एंटी-डीएनए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ एक सैंडविच एलिसा का उपयोग किया (चित्रा 1)। इस विधि में, एक माइक्रोटिटर प्लेट के कुओं को डीएनए से जुड़े एमपीओ और डीएनए-संबद्ध एनई के साथ-साथ गैर-डीएनए-संबद्ध एमपीओ और एनई को पकड़ने के लिए एमपीओ-विशिष्ट या एनई-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ लेपित किया गया था। परिवर्तनशीलता के अंतर-परख गुणांक (सीवी) की गणना करने के लिए, कोविड-19 और स्वस्थ नियंत्रण वाले रोगियों से एकत्र किए गए 30 नमूनों के लिए एक ही प्लेट के भीतर डुप्लिकेट माप किए गए थे, और % सीवी की गणना डुप्लिकेट माप के औसत के रूप में की गई थी; अंतर-परख सीवी (यानी, प्लेट-टू-प्लेट स्थिरता) की गणना करने के लिए, सीओवीआईडी -19 के रोगियों के दो प्रकार के नमूने और स्वस्थ नियंत्रण 10 अलग-अलग प्लेटों पर चतुष्कोणीय रूप से मापा गया; इस परख की विशिष्टता को प्रदर्शित करने के लिए, एमपीओ और एनई के खिलाफ विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बजाय आइसो-टाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ लेपित प्लेटों का उपयोग करके एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स की विभिन्न सांद्रता की परख की गई; और परख की संवेदनशीलता और रैखिकता की गणना करने के लिए, पीएमए और हल्के डीनेस पाचन के साथ पृथक मानव न्यूट्रोफिल को उत्तेजित करके बनाए गए एक क्रमिक रूप से पतला नेट-मानक की परख की गई थी, और सहसंबंध गुणांक और पहचान की सीमा (एलओडी) की गणना की गई थी।

क्रमिक रूप से पतला नेट-मानक से तैयार एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए के लिए अंशांकन वक्र चित्र 2 में दिखाए गए हैं। एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए (आर2 = 0.958 और 0.963, क्रमशः) के लिए विश्वसनीय मानक वक्र तब प्राप्त होते हैं जब अवशोषण मान क्रमशः 0.93 और 0.90 की सांद्रता से अधिक नहीं होते हैं। एसडी और अंशांकन वक्र के ढलान से गणना किए गए एलओडी मान एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए (% नेट मानक) के लिए क्रमशः 0.132% और 0.126% थे।

उच्चतम OD तब प्राप्त किया गया था जब 0.6 μg / mL DNase I लागू किया गया था (चित्रा 3)। इसलिए, डीएनए पाचन कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए DNase I के 0.6 μg / mL प्रतिक्रिया मिश्रण को जोड़ने तक सीमित था। जब प्लेटों को एमपीओ के खिलाफ विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बजाय आइसो-टाइप कंट्रोल एंटीबॉडी के साथ लेपित किया गया था, तो डीनेस आई की विभिन्न सांद्रता में बहुत कम ओडी मान (<0.09 अवशोषण इकाइयां [एयू]) का पता चला था।

एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए के लिए परिवर्तनशीलता के अंतर-परख गुणांक (सीवी) की गणना करने के लिए, कोविड-19 के रोगियों के 30 नमूनों में डुप्लिकेट माप और एक ही प्लेट में स्वस्थ नियंत्रण; %CV की गणना डुप्लिकेट माध्य का उपयोग करके की गई थी. एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए के लिए इंट्रा-परख सीवी स्वस्थ नियंत्रण में क्रमशः 1.871 और 0.987 और कोविड-19 रोगियों में क्रमशः 2.532 और 2.010 थे (तालिका 1)। एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए के औसत इंट्रा-परख सीवी क्रमशः 2.202 ± 0.467 और 1.497 ± 0.723 थे (औसत ± एसडी) (तालिका 1)।

एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए के लिए अंतर-परख सीवी की गणना करने के लिए, कोविड-19 के रोगियों से एकत्र किए गए दो प्रकार के नमूने और स्वस्थ नियंत्रण को प्लेट-टू-प्लेट स्थिरता की निगरानी के लिए 10 अलग-अलग प्लेटों पर चतुष्कोणीय रूप से मापा गया था। एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए के औसत अंतर-परख सीवी क्रमशः 6.524 ± 2.672 और 4.389 ± 0.923 थे (औसत ± एसडी) (तालिका 2)।

एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स के लिए कैप्चर एंटीबॉडी की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने एमपीओ और एनई के खिलाफ विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के बजाय आइसो-टाइप कंट्रोल एंटीबॉडी के साथ लेपित प्लेटों का उपयोग करके एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स की विभिन्न सांद्रता की परख की। तालिका 3 से पता चलता है कि आइसो-टाइप कंट्रोल एंटीबॉडी ने एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स के साथ विभिन्न सांद्रता (0.035 एयू से 0.078 एयू और -0.007 एयू से 0.096 एयू) पर बहुत कम प्रतिक्रिया की। क्रमशः)।

DNase-डाइजेस्टेड PMA-उत्तेजित न्यूट्रोफिल के सुपरनैटेंट में MPO-DNA और NE-DNA के स्तर को 100% NET-मानक के रूप में परिभाषित किया गया था, और प्लाज्मा नमूना डेटा को %NET-मानक के रूप में व्यक्त किया गया था। स्वस्थ नियंत्रण (एन = 10; 13.4% [आईक्यूआर, 12.4, 14.8]) के प्लाज्मा की तुलना में कोविड-19 (एन = 16; 29.1% [आईक्यूआर, 25.8, 41.5]) वाले रोगियों के प्लाज्मा में एमपीओ-डीएनए (% नेट<- मानक) का स्तर काफी अधिक था। चित्रा 4)।

Figure 1
चित्रा 1: नमूनों में मायलोपेरोक्सीडेज-डीएनए या न्यूट्रोफिल इलास्टेस-डीएनए को मापने के लिए सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख विधि के बुनियादी चरण। (ए) कुओं को एंटी-मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ) या एंटी-न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) कैप्चर एंटीबॉडी के साथ लेपित किया जाता है। (बी) शेष प्रोटीन बाइंडिंग साइटों को अवरुद्ध एजेंटों द्वारा अवरुद्ध किया जाता है। (ग) एनई-संयुग्मित और एमपीओ-संयुग्मित डीएनए युक्त नमूने जोड़े जाते हैं। (डी) सीमित डीनेस पाचन किया जाता है, और नमूने को कैप्चर एंटीबॉडी के साथ बांधने के लिए कुओं में इनक्यूबेट किया जाता है। (ई) एक द्वितीयक पेरोक्सीडेज-लेबल एंटी-डीएनए एंटीबॉडी जोड़ा जाता है। (एफ) अनबाउंड सेकेंडरी पेरोक्सीडेज-लेबल एंटी-डीएनए एंटीबॉडी को हटा दिया जाता है। (जी) सब्सट्रेट 2,2'-एज़िनो-बिस (3-एथिलबेंजोथियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड) जोड़ा जाता है, और रंग विकास की निगरानी की जाती है। संक्षेप: एबीटीएस = 2,2'-एज़िनो-बिस (3-एथिलबेंज़ोथियाज़ोलिन-6-सल्फोनिक एसिड); एमपीओ = मायलोपेरोक्सीडेज; एनई = न्यूट्रोफिल इलास्टेस कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: तीव्रता मूल्यों और न्यूट्रोफिल बाह्य जाल मानक के विभिन्न कमजोर पड़ने के बीच संबंधों की रैखिकता। डीनेस-डाइजेस्टेड फोरबोल 12-मायरिस्टेट 13-एसीटेट-उत्तेजित न्यूट्रोफिल के सुपरनैटेंट को क्रमिक रूप से पतला किया गया था, और मायलोपेरोक्सीडेज-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस-डीएनए के स्तर को अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए परख लिया गया था। अपरिवर्तित न्यूट्रोफिल बाह्य कोशिकीय जाल मानक (नेट-मानक) से प्राप्त अवशोषण इकाइयों (एयू) को 100% नेट के रूप में सौंपा गया था, और %NET-मानक के खिलाफ 405 एनएम पर तीव्रता मान को प्लॉट करने से एक रैखिक संबंध का पता चला। संक्षेप: एमपीओ = मायलोपेरोक्सीडेज; एनई = न्यूट्रोफिल इलास्टेस; NET = न्यूट्रोफिल बाह्य जाल कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: न्यूट्रोफिल बाह्य ट्रैप-डीएनए पाचन में डीएनएस आई की खुराक-प्रतिक्रिया। नमूना मायलोपेरोक्सीडेज-लेपित कुओं में डाला गया था। फिर, DNase I (0 μg/mL, 0.3 μg/mL, 0.6 μg/mL, या 0.9 μg/mL) जोड़ा गया। पाचन के 15 मिनट के बाद, एंजाइम गतिविधि को रोक दिया गया था, और सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख के शेष चरणों को तदनुसार किया गया था। डेटा को SD. N = 12 ± माध्य के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कोविड-19 के रोगियों में मायलोपेरोक्सीडेज-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस-डीएनए कॉम्प्लेक्स के प्लाज्मा स्तर। डेटा को न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप मानक (नेट-मानक) सामग्री के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है और माध्य और इंटरक्वार्टाइल रेंज के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। सीओवीआईडी -19 के रोगी, एन = 16; स्वस्थ नियंत्रण, एन = 10। ** पी < 0.01 बनाम स्वस्थ नियंत्रण। संक्षेप: एचसी = स्वस्थ नियंत्रण; नेट = न्यूट्रोफिल बाह्य जाल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: परिवर्तनशीलता का इंट्रा-परख गुणांक। परिवर्तनशीलता के व्यक्तिगत गुणांक की निगरानी के लिए तीस नमूने डुप्लिकेट में मापा गया था और इस प्रकार, परिवर्तनशीलता के इंट्रा-परख गुणांक को निर्धारित किया गया था। संक्षेप: एयू = अवशोषण इकाइयां; CV = परिवर्तनशीलता के गुणांक कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: परिवर्तनशीलता का अंतर-परख गुणांक। प्लेट-टू-प्लेट भिन्नता की निगरानी के लिए नमूनों को 10 अलग-अलग प्लेटों पर चतुष्कोणीय में मापा गया था और इस प्रकार, परिवर्तनशीलता के अंतर-परख गुणांक का निर्धारण किया गया था। संक्षेप: एयू = अवशोषण इकाइयां; CV = परिवर्तनशीलता का गुणांक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: एंटीबॉडी को पकड़ने के लिए विशिष्टता परीक्षण। एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स के लिए कैप्चर एंटीबॉडी की विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए प्लेटों को एंटी-मायलोपेरोक्सीडेज (एमपीओ) और एंटी-न्यूट्रोफिल इलास्टेस (एनई) के लिए आइसो-टाइप कंट्रोल एंटीबॉडी के साथ लेपित किया गया था। संक्षेप: एयू = अवशोषण इकाइयां; एमपीओ = मायलोपेरोक्सीडेज; एनई = न्यूट्रोफिल इलास्टेस कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

हमने एक सैंडविच एलिसा विधि का वर्णन किया है जिसमें एमपीओ-डीएनए या एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स वाले नमूनों के प्रारंभिक इनक्यूबेशन के दौरान एमपीओ या एनई कैप्चर एंटीबॉडी की एक साइट को बांधता है। धोने के बाद, "सैंडविच" को पेरोक्सीडेज से जुड़े एंटी-डीएनए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इंजेक्ट करके पूरा किया जाता है। अनबाउंड द्वितीयक एंटीबॉडी को हटाने के बाद, बाध्य पेरोक्सीडेज संयुग्म का पता क्रोमोजेनिक एबीटीएस पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट के अलावा लगाया जाता है, जो एक घुलनशील अंत-उत्पाद उत्पन्न करता है जिसे 405 एनएम पर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से पढ़ा जा सकता है। अच्छी रैखिकता और उच्च अंतर-परख और इंट्रा-परख परिशुद्धता से संकेत मिलता है कि इस पेपर और अन्य 1,2 में वर्णित एलिसा परख नैदानिक अनुप्रयोग के लिए विश्वसनीय और व्यवहार्य है। इसके अलावा, जब DNase-उपचारित PMA-उत्तेजित न्यूट्रोफिल के सुपरनैटेंट को NET-मानक के लिए अधिकतम संकेत के रूप में सौंपा जाता है, तो इस एलिसा परख का उपयोग अर्ध-मात्रात्मक विधि 1,14,15 के रूप में किया जा सकता है।

एनईटी के लंबे क्रोमैटिन धागे एमपीओ और एनई प्रोटीन से सजाए जाते हैं। कैप्चर एंटीबॉडी और एमपीओ-डीएनए या एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स के बीच बंधन बढ़ाने के लिए, धागे को एंजाइम डीनेस के साथ सीमित डीएनए पाचन द्वारा छोटे टुकड़ों में काट दिया जाता है; एक DNase एकाग्रता के अलावा जो बहुत अधिक है, डीएनए के अत्यधिक पाचन का कारण बन सकता है और इस प्रकार, अवशोषण में कमी हो सकती है। एक प्रारंभिक प्रयोग के परिणाम ( चित्रा 3 देखें) से पता चला है कि एनईटी से प्राप्त अवशेषों को ढीला करने के लिए डीनेस जोड़ की एक उचित मात्रा आवश्यक है। विशिष्ट कैप्चर एंटीबॉडी के बजाय आइसो-टाइप कंट्रोल एंटीबॉडी का उपयोग करने वाले प्रयोगों से पता चला कि इस परख में उपयोग किए गए कैप्चर एंटीबॉडी एमपीओ-डीएनए और एनई-डीएनए कॉम्प्लेक्स के लिए विशिष्ट थे।

नेट गठन के प्रारंभिक चरण को डीकन्डेन्स्ड क्रोमैटिन और प्लाज्मा झिल्ली की तीव्रता के संरक्षण 9,16,17 की विशेषता है। संघनित नाभिक के साथ न्यूट्रोफिल को न्यूट्रोफिल के रूप में पहचाना गया है जो नेट गठन से गुजर रहे हैं और प्रवाह साइटोमेट्री10 द्वारा निर्धारित किए जा सकते हैं। यद्यपि फ्लो साइटोमेट्री थोड़े समय में कोशिकाओं से बड़ी संख्या में छवियों का विश्लेषण कर सकती है, लेकिन इसका उपयोग कोशिका झिल्ली टूटने और क्रोमैटिन के एक्सट्रूज़न के बाद नेट गठन के बाद के चरणों का मूल्यांकन करने के लिए नहीं किया जा सकता है। सिट्रूलिनेटेड हिस्टोन एच 3, जिसे नेट-विशिष्ट मार्कर के रूप में जाना जाता है, को पश्चिमी सोख्ता18 और एलिसा19 द्वारा पता लगाया जा सकता है; हालाँकि, ये विधियाँ केवल पीएडी 4-संबंधित नेट गठन के लिए विशिष्ट हैं और इसका उपयोग पीएडी 4-स्वतंत्र एनईटी20 का आकलन करने के लिए नहीं किया जा सकता है।

यह निष्कर्ष कि स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में सीओवीआईडी -19 के रोगियों में सीरम नेट अवशेषों का स्तर अधिक था, पिछली रिपोर्ट21,22 से सहमत है। इस खोज से पता चलता है कि नेट गठन सहित न्यूट्रोफिल सक्रियण कोविड-19 के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।

इस परख की एक सीमा है। हाल की रिपोर्टों से पता चला है कि एमपीओ और ईएलएएन सहित प्रतिरक्षा से संबंधित जीन, जो क्रमशः एमपीओ और एनई को एन्कोड करते हैं, अनियंत्रित भड़काऊ स्थितियों23 के तहत अत्यधिक व्यक्त किए जाते हैं और रोग की गंभीरता और मृत्यु दर24 के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध होते हैं। चूंकि एमपीओ और एनई उन एंजाइमेटिकगतिविधियों से स्वतंत्र एनईटी के गठन में शामिल हैं, न्यूट्रोफिल में एनई और एमपीओ के प्रोटीन स्तर में वृद्धि इस परख के परिणामों को प्रभावित कर सकती है।

हम निष्कर्ष निकालते हैं कि यह सैंडविच एलिसा विधि सीधे एनई और एमपीओ सहित ग्रेन्युल प्रोटीन के साथ बाह्य डीएनए को मापती है, जो नेट गठन के लिए विशिष्ट हैं। यह पहचान परख मानव नमूनों और संस्कृति सुपरनैटेंट में एनईटी की विशेषताओं की जांच के लिए एक विश्वसनीय, अत्यधिक संवेदनशील और उपयोगी तरीका है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

इस अध्ययन के दौरान उत्पन्न और / या विश्लेषण किए गए सभी डेटा इस प्रकाशित लेख में शामिल हैं। लेखक ों ने घोषणा की कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि की समीक्षा में सहायता प्रदान करने के लिए डॉ हक मुहम्मद अमीनुल को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 195
एक संशोधित सैंडविच एलिसा का उपयोग करके न्यूट्रोफिल एक्स्ट्रासेल्युलर ट्रैप से मायलोपेरोक्सीडेज-डीएनए और न्यूट्रोफिल इलास्टेस-डीएनए कॉम्प्लेक्स की मात्रा निर्धारित करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter