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Immunology and Infection

Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Nous présentons un protocole pour une technique modifiée de dosage immuno-enzymatique sandwich permettant de mesurer quantitativement deux composants des restes de pièges extracellulaires neutrophiles, l’ADN conjugué myéloperoxydase et les complexes ADN conjugués à l’élastase neutrophile, dérivés de neutrophiles activés.

Abstract

Certains stimuli, tels que les micro-organismes, amènent les neutrophiles à libérer des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE), qui sont essentiellement des structures en forme de toile composées d’ADN avec des protéines granulaires, telles que la myéloperoxydase (MPO) et l’élastase neutrophile (NE), et des protéines cytoplasmiques et cytosquelettiques. Bien que l’intérêt pour les TNE ait augmenté récemment, il n’existe pas de méthode de dosage sensible et fiable pour mesurer les TNE en milieu clinique. Cet article décrit un test immuno-enzymatique sandwich modifié pour mesurer quantitativement deux composants des TNE circulantes, l’ADN-MPO et les complexes ADN-NE, qui sont des composants spécifiques des TNE et qui sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE. Le test utilise des anticorps monoclonaux spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique de l’ADN. MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Ce test montre une bonne linéarité et une grande précision inter-essais et intra-essais. Nous l’avons utilisé chez 16 patients atteints de COVID-19 avec le syndrome de détresse respiratoire aiguë qui l’accompagne et avons constaté que les concentrations plasmatiques de MPO-ADN et d’ADN-NE étaient significativement plus élevées que dans le plasma obtenu à partir de témoins sains. Ce test de détection est une méthode fiable, très sensible et utile pour étudier les caractéristiques des TNE dans le plasma humain et les surnageants en culture.

Introduction

Cet article décrit une méthode permettant de quantifier la formation de pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans les fluides biologiques en utilisant le test immuno-enzymatique sandwich (ELISA) pour détecter les complexes de myéloperoxydase (MPO) et d’élastase neutrophile (NE) avec l’ADN 1,2. Les TNE sont composées d’un squelette d’ADN décoré de protéases antimicrobiennes provenant de granules de neutrophiles 3,4. Les complexes MPO-ADN et ADN-E sont tous deux des composants importants et spécifiques des TNE et sont libérés dans l’espace extracellulaire en tant que produits de dégradation des TNE 3,4.

Outre leur rôle physiologique important dans la défense antimicrobienne3, les TNE ont également divers effets pathologiques4,5, notamment la promotion de la thrombogenèse6 et l’aggravation de la septicémie7. Par conséquent, les TNE ont récemment attiré l’attention. Néanmoins, la quantification in vivo des TNE s’est avérée difficile en raison de l’absence d’une méthode de dosage quantitative sensible et fiable.

Quelques méthodes sont disponibles, notamment la mesure directe des TNE par microscopie à fluorescence8,9 et cytométrie en flux 10 et la mesure indirecte de l’ADN acellulaire circulant, des nucléosomes et de l’histone H3 citrulliée, mais chaque méthode a ses propres avantages et limites11. Bien que la méthode microscopique d’immunofluorescence soit spécifique aux TNE et montre clairement la localisation et le degré de formation des TNE, les échantillons sont limités aux tissus de biopsie et aux matériaux sécrétés. De plus, cette méthode doit être réalisée par des chercheurs qualifiés et nécessite beaucoup de temps pour obtenir des résultats. La mesure des niveaux circulants de composants liés aux TNE par cytométrie en flux est facile et fournit des résultats rapidement ; cependant, la méthode n’est pas spécifique aux TNE12.

Nous13 et al. 1,2 avons mis au point un test très sensible et fiable pour mesurer les composants TNE circulants, l’ADN conjugué MPO ou l’ADN conjugué NE, dans le plasma humain avec une technique ELISA modifiée qui utilise des anticorps spécifiques pour MPO ou NE comme anticorps de capture et un anticorps de détection spécifique à l’ADN. Ce test peut également être utilisé ex vivo pour identifier les composants TNE dans les surnageants de culture cellulaire libérés par les neutrophiles activés en réponse à la stimulation du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA).

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Protocol

Cette étude a été menée conformément à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par les comités d’examen institutionnels de l’Université de médecine d’Aichi (2017-H341, 2019-H137). Le consentement éclairé écrit de chaque participant a été obtenu.

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : Pour effectuer le test ELISA sandwich, les réactifs sont préparés comme décrit ci-dessous.

  1. Tampon de revêtement :
    1. Pour obtenir un tampon carbonate-bicarbonate de 0,1 mol/L, peser 10,6 g de carbonate de sodium anhydre (poids moléculaire, 106 g/mol) et 8,4 g de bicarbonate de sodium (poids moléculaire, 84 g/mol).
    2. Ajoutez-le à environ 900 ml d’eau distillée dans un bécher.
    3. Ajustez le pH du tampon à 9,6 en ajoutant la quantité requise d’acide chlorhydrique dilué ou d’hydroxyde de sodium.
    4. Vérifiez le pH à l’aide d’un pH-mètre.
    5. Ensuite, ajoutez le volume requis d’eau distillée pour obtenir un volume total de 1 000 ml.
    6. Conservez ce tampon carbonate-bicarbonate de 0,1 mol/L au réfrigérateur à 4 °C.
  2. Tampon de blocage :
    1. Ajouter environ 250 μL d’azoture de sodium à 20 % et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 70 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) composée de 137 mmol/L de NaCl, 8,1 mmol/L de Na 2HPO 4, 2,68 mmol/L de KCl et 1,47 mol/L de KH2PO 4 (pH7,4), et mélanger délicatement.
    2. Ajouter de l’eau distillée pour obtenir un volume total de 100 ml. Les concentrations finales d’albumine sérique bovine et d’azoture de sodium sont respectivement de 1 % et 0,05 %. Attendez 10 minutes, puis la solution est prête à l’emploi.
  3. Solution de lavage : Préparer 0,5 % de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol, de polyéthylène glycol tert-octylphényléther (Triton X-100) dans de l’eau distillée.
    1. Diluer 100 % Triton X-100 à 10 % avec de l’eau distillée et laisser reposer la solution à 10 % pendant 1 jour avant utilisation.
    2. Ensuite, rediluez la solution de Triton X-100 à 10 % 20 fois avec de l’eau distillée pour obtenir une concentration de 0,5 %.
  4. Dilution des anticorps :
    1. Diluer l’anticorps de capture (anticorps anti-MPO [1 mg/mL] ou anticorps anti-NE [1 mg/mL]) à 1 :2 000 dans le tampon d’enrobage (pH 9,6) avant utilisation le jour 1 de l’essai (voir ci-dessous) et l’anticorps de détection (anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase) à 1 :40 avec PBS avant utilisation le jour 3 de l’essai (voir ci-dessous).
      REMARQUE : Pour l’expérience préliminaire, diluer les anticorps de type iso (IgG de lapin [5 mg/mL] et clone de souris IgG1 Ci4 [0,5 mg/mL]) à 1 :10 000 et 1 :1 000 dans le tampon d’enrobage (pH 9,6).
  5. Solution de substrat ABTS : Selon le nombre d’échantillons, dissoudre un, deux ou trois comprimés d’acide 2,2'-azino-bis(3 éthylbenzothiazoline-6-sulfonique (ABTS) dans 5 mL, 10 mL ou 15 mL de tampon ABTS (contenant du perborate de sodium, de l’acide citrique et de l’hydrogénophosphate disodique) ; 100 μL sont nécessaires par échantillon. Conservez la solution préparée à une température comprise entre 2 et 8 °C, à l’abri de la lumière. La solution est stable jusqu’à 3 mois.

2. Collecte et stockage des échantillons

  1. Isolement du plasma :
    1. Prélever 4 mL d’échantillons de sang périphérique dans un tube de prélèvement sanguin d’héparine de lithium par ponction veineuse avec une seringue de 22 G et centrifuger à 1 600 x g pendant 10 min à 4 °C.
    2. Transvaser le surnageant dans un tube d’échantillon de 2 mL à verrouillage sûr.
    3. Recentrer le surnageant à 16 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les cellules résiduelles.
    4. Recueillir le surnageant dans un nouveau tube d’échantillon à verrouillage sûr sans perturber la pastille au fond du tube.
    5. Conservez le plasma obtenu à −80 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.
      REMARQUE : Pour obtenir des résultats à haut débit avec ce test, des échantillons de bonne qualité sont nécessaires. Si des échantillons de plasma sont utilisés, effectuez une deuxième centrifugation pour éliminer les cellules résiduelles. Éviter les décongélations répétées des échantillons. Utilisez l’héparine comme anticoagulant car l’EDTA affecte l’activité de la DNase.
  2. Isolement des polynucléaires neutrophiles
    1. Prélever les échantillons de sang périphérique dans un tube de prélèvement sanguin d’héparine au lithium par ponction veineuse à l’aide d’une seringue de 22 G.
    2. Déposer 6 mL de sang sur 6 mL de polymorphes en une étape et centrifuger les tubes à 1 000 x g pendant 45 min à température ambiante (RT).
    3. Récoltez la troisième couche de couche leucocytaire contenant des neutrophiles et lavez-la trois fois dans du rouge de phénol RPMI-1640 à 400 x g pendant 10 min à RT.
    4. Remettre les neutrophiles en suspension dans du RPMI-1640 sans rouge de phénol contenant 2 mM de L-glutamine complété par 6 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et compter les cellules dans le champ du microscope à l’aide d’un hémocytomètre.
      REMARQUE : Cette méthode donne une pureté de 96% à 98% avec une viabilité supérieure à 95%, telle qu’évaluée par l’exclusion du colorant bleu trypan.
  3. Activation des polynucléologues, neutrophiles et NETosis in vitro
    1. Diluer les neutrophiles polymorphonucléaires fraîchement isolés à 1 × 105 cellules/mL dans du RPMI-1640 sans rouge de phénol contenant 2 mM de L-glutamine complété par 6 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, et les ensemencer dans des boîtes de culture de 35 mm.
    2. Pour induire des TNE, stimuler les polynucléaires neutrophiles avec 25 nM PMA pendant 4 h à 37 °C dans 5 % de CO2/95 % d’air.
    3. Après 4 h d’incubation, digérer partiellement les TNE en ajoutant 0,6 μg/mL de DNase I directement dans les boîtes de culture pendant 15 min à RT, et arrêter l’activité de la DNase I en ajoutant 5 mM d’EDTA.
    4. Prélever le milieu contenant les TNE synthétisées et centrifuger à 400 x g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.
    5. Obtenir les surnageants de quatre témoins sains, mélanger et conserver à −80 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE : Les neutrophiles stimulés par la PMA digérés par la DNase obtenus à partir de quatre témoins sains sont utilisés comme norme NET 1,14,15. Générez une courbe d’étalonnage à partir d’un étalon NET dilué en série avec PBS, et attribuez les valeurs de densité optique (OD) obtenues à partir d’un étalon NET non dilué comme 100 % NET.

3. Méthode d’analyse

REMARQUE : Les étapes pour effectuer le test sont décrites en détail ci-dessous.

  1. Jour 1
    1. Appliquer un total de 100 μL d’anticorps anti-MPO ou anti-NE dilué contenant 0,05 μg d’anticorps sur chaque puits de la plaque, y compris le puits vierge.
      REMARQUE : Le tampon de revêtement ne doit contenir aucun type de détergent car, sinon, les anticorps risquent de ne pas se lier uniformément et en douceur aux parois de chaque puits. Pour éviter l’effet d’hameçon, la concentration en protéines de l’enrobage ne doit pas dépasser 20 μg/mL, car des concentrations supérieures à ce niveau saturent la plupart des sites disponibles sur la plaque de microtitration. La plage de concentration typique des solutions d’enrobage protéique est de 2 à 10 μg/mL. Pour l’expérience préliminaire, utiliser des anticorps de contrôle de type iso dilués de lapin IgG pour l’enrobage au lieu d’anticorps monoclonaux spécifiques contre le MPO. Utiliser un anticorps témoin de type iso dilué de souris IgG1 pour l’enrobage au lieu d’anticorps monoclonaux spécifiques contre l’EN.
    2. Recouvrez la plaque d’un couvercle en plastique adhésif pour éviter l’évaporation de l’échantillon, et incubez une nuit à 4 °C pour permettre la liaison des anticorps de capture.
  2. Jour 2
    1. Jetez la solution d’anticorps diluée des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.
    2. Retirez l’excédent de PBS en tapotant l’assiette sur une serviette en papier.
    3. Bloquez chaque puits de la plaque ELISA avec 200 μL de tampon de blocage.
    4. Couvrez étroitement la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et incubez-la pendant 1,5 à 2 h à RT pour obstruer les puits.
    5. Éliminez complètement la solution de blocage des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.
    6. Retirez l’excédent de PBS en tapotant l’assiette sur une serviette en papier.
    7. Appliquer un total de 25 μL de plasma ou de milieu dans chaque puits, à l’exception du puits vide, et ajouter 75 μL de PBS comme diluant pour obtenir un volume final de 100 μL ; ajouter 100 μL de PBS dans le puits vierge.
    8. Ensuite, mixez les échantillons à RT pendant 10 s en plaçant la plaque sur un shaker à 250 tr/min.
    9. Appliquer 2 μL de DNase I diluée 100 fois (0,03 mg/mL) dans chaque puits, y compris le puits vierge (concentration finale de DNase I dans le mélange réactionnel : 0,6 μg/mL).
    10. Scellez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et mélangez soigneusement les échantillons à RT pendant 10 s en plaçant la plaque sur un agitateur à 250 tr/min.
      REMARQUE : Pour évaluer les conditions optimales de digestion de l’ADN, lors de la mise au point du test, nous avons incubé des échantillons contenant de l’ADN associé à la MPO provenant de patients atteints de COVID-19 avec 0-0,9 μg/mL DNase I pendant 15 minutes à RT et utilisé des plaques recouvertes d’un anticorps de capture spécifique pour la MPO ou d’un anticorps témoin de type iso apparié selon l’espèce.
    11. Incuber les échantillons pendant 15 min à RT.
    12. Retirez le couvercle en plastique adhésif et appliquez 1 μL d’EDTA 0,5 M sur chaque puits pour arrêter la réaction de la DNase.
    13. Refermez la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et secouez-la à RT pendant 15 s en la plaçant sur un shaker à 250 tr/min.
    14. Ensuite, incubez la plaque pendant la nuit à 4 °C pour permettre aux composants protéiques des TNE de se fixer aux anticorps de capture.
  3. Jour 3
    1. Retirez le couvercle en plastique adhésif et jetez la solution des puits.
    2. Éliminez complètement la solution des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.
    3. Appliquer un total de 100 μL d’anticorps anti-ADN conjugué à la peroxydase diluée dans chaque puits.
    4. Scellez hermétiquement la plaque avec un couvercle en plastique adhésif et incubez-la pendant 1,5 h à RT.
    5. Éliminez complètement la solution des puits, puis pipetez 300 μL de solution de lavage par puits, et répétez cette procédure de lavage trois à quatre fois.
    6. Retirez délicatement la solution résiduelle.
    7. Appliquez un total de 100 μL de solution de substrat ABTS sur chaque puits et recouvrez la plaque d’un couvercle en plastique adhésif.
    8. Incuber la plaque dans l’obscurité à RT pendant 20-30 min sur un shaker à 250 tr/min.
      REMARQUE : Surveillez la plaque à des intervalles de 5 minutes jusqu’à ce que les lectures de diamètre extérieur souhaitées soient obtenues.
    9. Ajouter un total de 50 μL d’acide sulfurique 2 M pour arrêter la réaction.
    10. Mélangez le contenu liquide des puits en tapotant soigneusement le côté de la plaque.
    11. Allumez le lecteur de microplaques et connectez-le à l’ordinateur.
    12. Ouvrez l’application logicielle sur l’ordinateur.
    13. Dans la barre d’état, créez un nouveau test et nommez-le.
    14. Réglez tous les paramètres suivants pour la lecture de la plaque : Type de lecture, Absorbance ; Mode de lecture, point de terminaison ; Longueurs d’onde, 2 ; Lm-1, 405 nm ; Lm-2, 490 nm ; Mélange automatique et suppression avant, Désactivé ; Plaque de pré-lecture, Éteint ; Calibrage automatique, activé ; Bandes, Lire toute la plaque ; Priorité à la longueur d’onde de la colonne, Priorité à la colonne ; Vitesse de chariot, Normal ; et Lecture automatique, Désactivé.
    15. Ensuite, placez la plaque à 96 puits contenant les échantillons dans le tiroir et fermez-la.
    16. Enfin, sélectionnez le bouton Lire pour que la plaque soit lue immédiatement.
    17. Lisez l’absorbance de chaque puits à une longueur d’onde de 405 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques (à ce stade, utilisez une longueur d’onde de 490 nm comme référence).
    18. Effectuez une soustraction automatique de la valeur d’absorbance du milieu d’essai seul à partir de tous les échantillons inconnus et enregistrez les données.
      NOTA : Utiliser une courbe étalon obtenue à partir d’un étalon NET dilué en série pour calculer la concentration relative de NET dans l’échantillon 1,14,15. Ici, les résultats finaux sont présentés sous la forme de « complexes d’ADN MPO ou NE (% de la norme NET) ». La limite de détection (LOD) a été calculée à partir de l’écart-type (ET) et de la pente de la courbe d’étalonnage (S) comme suit : LOD = 3,3 (SD/S).

4. Statistiques

  1. Effectuer toutes les analyses statistiques à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique approprié. Ici, SigmaPlot v14.5 a été utilisé. Les pourcentages et les variables continues sont représentés par la médiane de l’intervalle interquartile en raison de la distribution asymétrique de la plupart des paramètres.
  2. Comparez les taux plasmatiques d’ADN-MPO et d’ADN-E entre les patients atteints de COVID-19 et les témoins sains à l’aide du test de somme des rangs de Wilcoxon. Utilisez l’analyse de corrélation pour explorer la relation entre la densité optique et le pourcentage de norme NET.

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Representative Results

Cette méthode a utilisé un test ELISA sandwich avec des anticorps monoclonaux anti-MPO, anti-NE et anti-ADN pour mesurer l’ADN associé au MPO et l’ADN associé à l’EN (Figure 1). Dans cette méthode, les puits d’une plaque de microtitration ont été recouverts d’un anticorps monoclonal spécifique ou spécifique de l’ON pour capturer le MPO associé à l’ADN et l’ON associé à l’ADN, ainsi que le MPO et l’EN non associés à l’ADN. Pour calculer le coefficient de variabilité (CV) intra-essai, des mesures en double ont été effectuées dans la même plaque pour 30 échantillons prélevés chez des patients atteints de COVID-19 et des témoins sains, et le % CV a été calculé comme la moyenne des mesures en double ; pour calculer la CV inter-essais (c’est-à-dire la consistance d’une plaque à l’autre), deux types d’échantillons provenant de patients atteints de COVID-19 et de témoins sains ont été mesurés en quadruple sur 10 plaques différentes ; pour démontrer la spécificité de ce test, diverses concentrations de complexes MPO-ADN et NE-ADN ont été dosées en utilisant des plaques recouvertes d’anticorps témoins de type iso au lieu d’anticorps monoclonaux spécifiques contre MPO et NE ; et pour calculer la sensibilité et la linéarité de l’essai, un étalon TET dilué en série en stimulant des neutrophiles humains isolés avec de la PMA et une digestion légère de la DNase a été testé, et le coefficient de corrélation et la limite de détection (LOD) ont été calculés.

Les courbes d’étalonnage de l’ADN-MPO et de l’ADN-NE tirées d’un étalon TNE dilué en série sont illustrées à la figure 2. Des courbes standard fiables pour l’ADN-MPO et l’ADN-E (R2 = 0,958 et 0,963, respectivement) sont obtenues lorsque les valeurs d’absorbance ne dépassent pas des concentrations de 0,93 et 0,90, respectivement. Les valeurs de LOD calculées à partir de l’écart-type et de la pente de la courbe d’étalonnage étaient respectivement de 0,132 % et 0,126 % pour l’ADN-MPO et l’ADN-Ne (étalon %NET).

La DO la plus élevée a été obtenue lorsque 0,6 μg/mL de DNase I a été appliquée (figure 3). Par conséquent, la digestion de l’ADN s’est limitée à l’ajout d’un mélange réactionnel de 0,6 μg/mL de DNase I pendant 15 minutes à température ambiante. Lorsque les plaques ont été recouvertes de l’anticorps témoin de type iso au lieu de l’anticorps monoclonal spécifique contre la MPO, de très faibles valeurs de DO (<0,09 unités d’absorbance [UA]) ont été détectées à diverses concentrations de DNase I.

Pour calculer le coefficient de variabilité (CV) intra-essai pour l’ADN-MPO et l’ADN-NE, des mesures dupliquées ont été effectuées dans 30 échantillons de patients atteints de COVID-19 et de témoins sains dans la même plaque ; le %CV a été calculé à l’aide de la moyenne dupliquée. Les CV intra-test pour l’ADN-MPO et l’ADN-NE étaient respectivement de 1,871 et 0,987 chez les témoins sains et de 2,532 et 2,010, respectivement, chez les patients atteints de COVID-19 (tableau 1). Les CV intra-essais moyens de l’ADN-MPO et de l’ADN-NE étaient respectivement de 2,202 ± 0,467 et de 1,497 ± 0,723 (moyenne ± écart-type) (tableau 1).

Pour calculer le CV inter-essais pour l’ADN-MPO et l’ADN-NE, deux types d’échantillons prélevés sur des patients atteints de COVID-19 et des témoins sains ont été mesurés en quadruple sur 10 plaques différentes afin de surveiller la consistance d’une plaque à l’autre. Les CV inter-essais moyens de l’ADN-MPO et de l’ADN-Ne étaient respectivement de 6,524 ± 2,672 et de 4,389 ± 0,923 (moyenne ± écart-type) (tableau 2).

Afin d’évaluer la spécificité des anticorps de capture contre les complexes MPO-ADN et ADN-NE, nous avons dosé diverses concentrations de complexes MPO-ADN et EN-ADN en utilisant des plaques recouvertes d’anticorps témoins de type iso au lieu d’anticorps monoclonaux spécifiques contre MPO et NE. Le tableau 3 montre que les anticorps témoins de type iso ont peu réagi avec les complexes MPO-ADN et ADN-NE aux différentes concentrations (0,035 UA à 0,078 UA et −0,007 UA à 0,096 UA, respectivement).

Les niveaux d’ADN-MPO et d’ADN-NE dans le surnageant de neutrophiles stimulés par la PMA digérés par la DNase ont été définis comme étant 100 % de norme NET, et les données de l’échantillon de plasma ont été exprimées comme étant de la norme %NET. Les taux d’ADN MPO (%NET-standard) étaient significativement plus élevés dans le plasma de patients atteints de COVID-19 (n = 16 ; 29,1 % [IQR, 25,8, 41,5]) que dans le plasma de témoins sains (n = 10 ; 13,4 % [IQR, 12,4, 14,8]), tout comme les niveaux d’NE-DNA (%NET-standard) (46,4 % [IQR, 32,7, 53,7] contre 12,1 % [IQR, 9,9, 14,7], respectivement, P < 0,01 ; Graphique 4).

Figure 1
Figure 1 : Étapes de base d’une méthode de dosage immuno-enzymatique sandwich pour mesurer l’ADN myéloperoxydase ou l’ADN élastase neutrophile dans des échantillons. (A) Les puits sont recouverts d’un anticorps de capture anti-myéloperoxydase (MPO) ou anti-élastase neutrophile (NE). (B) Les autres sites de liaison aux protéines sont bloqués par des agents bloquants. (C) Des échantillons contenant de l’ADN conjugué à l’NE et de l’ADN conjugué au MPO sont ajoutés. (D) Une digestion limitée de la DNase est effectuée et l’échantillon est incubé dans les puits pour se lier à l’anticorps de capture. (E) Un anticorps anti-ADN secondaire marqué à la peroxydase est ajouté. (F) L’anticorps anti-ADN secondaire non lié marqué à la peroxydase est retiré. (G) Le substrat 2,2'-azino-bis (acide 3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) est ajouté et le développement de la couleur est surveillé. Abréviations : ABTS = acide 2,2'-azino-bis (3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonique) ; MPO = myéloperoxydase ; NE = élastase neutrophile Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Linéarité des relations entre les valeurs d’intensité et les différentes dilutions de l’étalon piège extracellulaire des neutrophiles. Le surnageant de neutrophiles stimulés par le phorbol 12-myristate 13-acétate de 13 digérés par la DNase a été dilué en série, et les niveaux d’ADN myéloperoxydase et d’ADN d’élastase neutrophile ont été dosés pour générer une courbe d’étalonnage. Les unités d’absorbance (UA) obtenues à partir de l’étalon de piège extracellulaire neutrophile non dilué (norme NET) ont été attribuées à 100 % NET, et le tracé de la valeur d’intensité à 405 nm par rapport à la norme % NET a révélé une relation linéaire. Abréviations : MPO = myéloperoxydase ; NE = élastase neutrophile ; NET = piège extracellulaire à neutrophiles Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Dose-réponse de la DNase I dans la digestion de l’ADN des neutrophiles extracellulaires. L’échantillon a été inséré dans des puits recouverts de myéloperoxydase. Ensuite, la DNase I (0 μg/mL, 0,3 μg/mL, 0,6 μg/mL ou 0,9 μg/mL) a été ajoutée. Après 15 minutes de digestion, l’activité enzymatique a été arrêtée et les étapes restantes du test immuno-enzymatique sandwich ont été effectuées en conséquence. Les données sont présentées sous la forme d’une moyenne ±écart-type. N = 12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Taux plasmatiques de complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN chez les patients atteints de COVID-19. Les données sont exprimées en pourcentages de la teneur en pièges extracellulaires neutrophiles (norme NET) et présentées sous forme de médianes et d’intervalles interquartiles. Patients atteints de la COVID-19, n = 16 ; témoins sains, n = 10. ** P < 0,01 par rapport aux témoins sains. Abréviations : HC = témoins sains ; NET = piège extracellulaire à neutrophiles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Coefficient de variabilité intra-essai. Trente échantillons ont été mesurés en double afin de surveiller les coefficients de variabilité individuels et, ainsi, de déterminer le coefficient de variabilité intra-essai. Abréviations : AU = unités d’absorbance ; CV = coefficients de variabilité Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Coefficient de variabilité inter-essais. Les échantillons ont été mesurés en quadruple sur 10 plaques différentes afin de surveiller la variation d’une plaque à l’autre et, ainsi, de déterminer le coefficient de variabilité inter-essais. Abréviations : AU = unités d’absorbance ; CV = coefficient de variabilité. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Test de spécificité pour les anticorps de capture. Les plaques ont été recouvertes d’anticorps témoins de type iso pour l’anti-myéloperoxydase (MPO) et l’élastase anti-neutrophile (NE) afin d’évaluer la spécificité des anticorps de capture pour les complexes MPO-ADN et NE-ADN. Abréviations : AU = unités d’absorbance ; MPO = myéloperoxydase ; NE = élastase neutrophile Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

Nous avons décrit une méthode ELISA sandwich dans laquelle MPO ou NE se lie à un site de l’anticorps de capture lors de l’incubation initiale d’échantillons contenant des complexes MPO-ADN ou NE-ADN. Après le lavage, le « sandwich » est complété par l’incubation des échantillons avec un anticorps monoclonal anti-ADN associé à la peroxydase. Après l’élimination de l’anticorps secondaire non lié, le conjugué peroxydase lié est détecté par l’ajout d’un substrat chromogène ABTS peroxydase, ce qui donne un produit final soluble qui peut être lu spectrophotométriquement à 405 nm. La bonne linéarité et la grande précision inter-essais et intra-essais indiquent que le test ELISA décrit dans cet article et d’autres 1,2 est fiable et réalisable pour une application clinique. De plus, lorsque le surnageant de neutrophiles stimulés par la PMA traités par la DNase est assigné comme signal maximal pour l’étalon NET, ce test ELISA peut être utilisé comme méthode semi-quantitative 1,14,15.

Les longs filaments de chromatine des TNE sont décorés de protéines MPO et NE. Pour augmenter la liaison entre l’anticorps de capture et les complexes MPO-ADN ou NE-ADN, les fils sont coupés en morceaux plus courts par digestion limitée de l’ADN avec l’enzyme DNase ; l’ajout d’une concentration de DNase trop élevée pourrait entraîner une digestion excessive de l’ADN et, par conséquent, une diminution de l’absorbance. Les résultats d’une expérience préliminaire (voir la figure 3) ont montré qu’une quantité appropriée d’ajout de DNase est nécessaire pour détacher les restes dérivés des TNE. Les expériences qui ont utilisé des anticorps témoins de type iso au lieu d’anticorps de capture spécifiques ont montré que les anticorps de capture utilisés dans ce test étaient spécifiques des complexes MPO-ADN et NE-ADN.

Le stade précoce de la formation des TNE est caractérisé par la décondensation de la chromatine et la préservation de l’intensité de la membrane plasmique 9,16,17. Les neutrophiles à noyau condensé ont été identifiés comme des neutrophiles en cours de formation de TNE et peuvent être quantifiés par cytométrie en flux10. Bien que la cytométrie en flux puisse analyser un grand nombre d’images de cellules en peu de temps, elle ne peut pas être utilisée pour évaluer les étapes ultérieures de la formation de TNE après la rupture de la membrane cellulaire et l’extrusion de la chromatine. Les histones citrullinées H3, qui sont connues pour être des marqueurs spécifiques de la TNE, peuvent être détectées par western blot18 et ELISA19 ; cependant, ces méthodes ne sont spécifiques qu’à la formation de TNE liées à la PAD4 et ne peuvent pas être utilisées pour évaluer les TNE indépendantes de la PAD420.

La constatation selon laquelle les taux sériques de restes de TNE étaient plus élevés chez les patients atteints de COVID-19 que chez les témoins sains concorde avec les rapports précédents21,22. Cette découverte suggère que l’activation des neutrophiles, y compris la formation de TNE, pourrait jouer un rôle important dans la pathogenèse de la COVID-19.

Ce test a une limite. Des rapports récents ont montré que les gènes liés au système immunitaire, y compris MPO et ELANE, qui codent respectivement pour MPO et NE, sont fortement exprimés dans des conditions inflammatoires non contrôlées23 et sont positivement corrélés à la gravité de la maladie et à la mortalité24. Étant donné que le MPO et le NE sont impliqués dans la formation des TNE indépendamment de ces activités enzymatiques15, l’augmentation des niveaux de protéines de NE et de MPO chez les neutrophiles peut affecter les résultats de ce test.

Nous concluons que cette méthode ELISA sandwich mesure directement l’ADN extracellulaire avec des protéines granulaires, y compris NE et MPO, qui sont spécifiques pour la formation de NET. Ce test de détection est une méthode fiable, très sensible et utile pour étudier les caractéristiques des TNE dans les échantillons humains et les surnageants de culture.

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Disclosures

Toutes les données générées et/ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié. Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le Dr Huq Muhammad Aminul pour leur aide dans la révision du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

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References

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Immunologie et infection numéro 195
Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié
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Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

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