Cuantificación de complejos mieloperoxidasa-ADN y neutrófilos elastasa-ADN a partir de trampas extracelulares de neutrófilos mediante el uso de un ELISA sándwich modificado

Resumen

Presentamos un protocolo para una técnica modificada de ensayo de inmunoadsorción enzimática sándwich para medir cuantitativamente dos componentes de los remanentes de trampas extracelulares de neutrófilos, los complejos de ADN conjugado con mieloperoxidasa y ADN conjugado con elastasa de neutrófilos, derivados de neutrófilos activados.

Resumen

Ciertos estímulos, como los microorganismos, hacen que los neutrófilos liberen trampas extracelulares de neutrófilos (NET), que son básicamente estructuras en forma de red compuestas de ADN con proteínas granulosas, como la mieloperoxidasa (MPO) y la elastasa de neutrófilos (NE), y proteínas citoplasmáticas y citoesqueléticas. Aunque el interés en los TNE ha aumentado recientemente, no se dispone de un método de ensayo sensible y fiable para medir los TNE en entornos clínicos. En este artículo se describe un ensayo de inmunoabsorción enzimática en sándwich modificado para medir cuantitativamente dos componentes de los TNE circulantes, los complejos MPO-ADN y NE-ADN, que son componentes específicos de los TNE y se liberan en el espacio extracelular como productos de degradación de los TNE. El ensayo utiliza anticuerpos monoclonales específicos para MPO o NE como anticuerpos de captura y un anticuerpo de detección específico de ADN. MPO o NE se une a un sitio del anticuerpo de captura durante la incubación inicial de muestras que contienen complejos MPO-DNA o NE-ADN. Este ensayo muestra una buena linealidad y una alta precisión entre ensayos e intraensayos. Lo utilizamos en 16 pacientes con COVID-19 con síndrome de dificultad respiratoria aguda acompañante y encontramos que las concentraciones plasmáticas de MPO-DNA y NE-DNA eran significativamente más altas que en el plasma obtenido de controles sanos. Este ensayo de detección es un método fiable, altamente sensible y útil para investigar las características de los NET en plasma humano y sobrenadantes de cultivo.

Introducción

Este artículo describe un método para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en fluidos biológicos mediante el uso de un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas sándwich (ELISA) para detectar complejos de mieloperoxidasa (MPO) y elastasa de neutrófilos (NE) con ADN ^1,2. Los TNE están compuestos por una columna vertebral de ADN decorada con proteasas antimicrobianas que se originan a partir de gránulos de neutrófilos ^3,4. Tanto los complejos MPO-ADN como NE-ADN son componentes importantes y específicos de los TNE y se....

Protocolo

Este estudio se llevó a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por las juntas de revisión institucional de la Universidad Médica de Aichi (2017-H341, 2019-H137). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante.

1. Preparación de reactivos

NOTA: Para realizar el ensayo ELISA sándwich, los reactivos se preparan como se describe a continuación.

1. Tampón de recubrimiento:
   1. Para hacer un tampón de carbonato-bicarbonato de 0,1 mol/L, pesar 10,6 g de carbonato de sodio anhidro (peso molecular, 106 g/mol) y 8,4 g de bicarbonato de sodio (pes....

Resultados

Este método utilizó un ELISA sándwich con anticuerpos monoclonales anti-MPO, anti-NE y anti-ADN para medir el ADN asociado a MPO y al NE (Figura 1). En este método, los pocillos de una placa de microtitulación se recubrieron con un anticuerpo monoclonal específico de MPO o NE específico para capturar MPO asociada al ADN y NE asociada al ADN, así como MPO y NE no asociadas al ADN. Para calcular el coeficiente de variabilidad (CV) intraensayo, se realizaron mediciones duplicadas dentro de la m.......

Discusión

Hemos descrito un método ELISA sándwich en el que MPO o NE se une a un sitio del anticuerpo de captura durante la incubación inicial de muestras que contienen complejos MPO-ADN o NE-ADN. Después del lavado, el "sándwich" se completa incubando las muestras con un anticuerpo monoclonal anti-ADN asociado a la peroxidasa. Después de la eliminación del anticuerpo secundario no unido, el conjugado de peroxidasa unido se detecta mediante la adición de un sustrato cromogénico de peroxidasa ABTS, que produce un producto final sol.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polimorfos de 1 paso	Precise Chemical and Scientific Corporation	AN221725	el aislamiento de PMN de sangre humana.
Placa de microtitulación de 96 pocillos	Thermo Fisher Scientific	467466
solución tampón ABTS	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contiene perborato de sodio, ácido cítrico y fosfato de hidrógeno disódico.
Comprimidos ABTS	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Cada comprimido contiene 5 mg de sustrato ABTS y 60 mg de sustancias vegetales.
Cubierta adhesiva de plástico, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anticuerpo anti-MPO	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Almacene a 2-8 °C. estable durante 1 año. La especie huésped es el conejo.
Anticuerpo anti-NE, clon AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Almacene a 2-8 °C. estable durante 1 año. La especie huésped es el ratón.
Albúmina sérica bovina	Ciencia Biomédica	BR-220700081	Albúmina de fracción bovina V. Tienda en 2– 8 °C. estable durante 2 años.
DNase I	New England BioLabs	M0303M Tienda	a -20 ° C
IgG, conejo, Control de isotipos	GENETEX, Inc.	GTX35035	Almacene como solución concentrada en 2– 8 °C.
IgG1, control de isotipo de ratón, clon Ci4	Merck	MABC002	Almacene como solución concentrada en 2– 8 °C.
Tubo de recolección de sangre de heparina de litio	Becton Dickinson and Company
Mezclador de microplacas	Como una corporación	NS-P
Lector de microplacas	Molecular Devices	SpectraMax 190	Cualquier lector de placas de microplacas capaz de leer longitudes de onda de 405 – 490 nm puede usar.
Aplicación de lector de microplacas	Molecular Devices	SoftMax pro
Anticuerpo anti-ADN conjugado con peroxidasa, Detección de muerte celular ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	Botella 2. Tienda en 2– 8 °C. estable durante 1 año.
Forbol 12-miristato 13-acetato	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activación de PMN's de sangre humana.
Solución tamponada de fosfato	Takara Bio	T9181	Conservar a temperatura ambiente. Estable durante 6 meses.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San José, CA, EE. UU
Azida de sodio	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Almacenar a temperatura ambiente.
t-octilfenoxipolietoxietanol, polietilenglicol terc-octilfenil éter	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Almacenar a temperatura ambiente.

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