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Immunology and Infection

Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

Presentiamo un protocollo per una tecnica di saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificata per misurare quantitativamente due componenti dei residui di trappole extracellulari dei neutrofili, i complessi di DNA coniugato a DNA coniugato con mieloperossidasi e DNA coniugato con elastasi neutrofila, derivati da neutrofili attivati.

Abstract

Alcuni stimoli, come i microrganismi, inducono i neutrofili a rilasciare trappole extracellulari per neutrofili (NET), che sono fondamentalmente strutture simili a ragnatele composte da DNA con proteine granulari, come la mieloperossidasi (MPO) e l'elastasi neutrofila (NE), e proteine citoplasmatiche e citoscheletriche. Sebbene l'interesse per i NET sia aumentato di recente, non è disponibile alcun metodo di analisi sensibile e affidabile per la misurazione dei NET in ambito clinico. Questo articolo descrive un saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificato per misurare quantitativamente due componenti dei NET circolanti, i complessi MPO-DNA e NE-DNA, che sono componenti specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET. Il test utilizza anticorpi monoclonali specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. MPO o NE si lega a un sito dell'anticorpo di cattura durante l'incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Questo test mostra una buona linearità e un'elevata precisione tra saggi e intrados. Lo abbiamo usato in 16 pazienti con COVID-19 con sindrome da distress respiratorio acuto e abbiamo scoperto che le concentrazioni plasmatiche di MPO-DNA e NE-DNA erano significativamente più alte rispetto al plasma ottenuto da controlli sani. Questo test di rilevamento è un metodo affidabile, altamente sensibile e utile per studiare le caratteristiche dei NET nel plasma umano e nei surnatanti di coltura.

Introduction

Questo articolo delinea un metodo per quantificare la formazione di trappole extracellulari neutrofile (NET) nei fluidi biologici utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich (ELISA) per rilevare complessi di mieloperossidasi (MPO) ed elastasi neutrofila (NE) con DNA 1,2. I NET sono composti da una spina dorsale di DNA decorata con proteasi antimicrobiche originate da granuli di neutrofili 3,4. Sia i complessi MPO-DNA che NE-DNA sono componenti importanti e specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET 3,4.

Oltre al loro importante ruolo fisiologico nella difesa antimicrobica3, i NET hanno anche vari effetti patologici4,5, tra cui la promozione della trombogenesi6 e il peggioramento della sepsi7. Di conseguenza, le NET hanno recentemente attirato l'attenzione. Ciononostante, la quantificazione in vivo dei NET si è dimostrata impegnativa a causa della mancanza di un metodo di analisi quantitativa sensibile e affidabile.

Sono disponibili alcuni metodi, tra cui la misurazione diretta dei NET mediante microscopia a fluorescenza8,9 e citometria a flusso 10 e la misurazione indiretta del DNA libero circolante, dei nucleosomi e dell'istone citrullinato H3, ma ogni metodo presenta i propri vantaggi e limiti11. Sebbene il metodo microscopico a immunofluorescenza sia specifico per i NET e mostri chiaramente la localizzazione e il grado di formazione dei NET, i campioni sono limitati al tessuto bioptico e ai materiali secreti. Inoltre, questo metodo deve essere eseguito da ricercatori qualificati e richiede molto tempo per ottenere risultati. Misurare i livelli circolanti di componenti correlati al NET mediante citometria a flusso è facile e fornisce risultati rapidi; tuttavia, il metodo non è specifico per NET12.

Noi13 e altri1,2 abbiamo sviluppato un test altamente sensibile e affidabile per misurare i componenti circolanti del NET, DNA coniugato con MPO o coniugato con NE, nel plasma umano con una tecnica ELISA modificata che utilizza anticorpi specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. Questo saggio può anche essere utilizzato ex vivo per identificare i componenti NET nei surnatanti delle colture cellulari rilasciati dai neutrofili attivati in risposta alla stimolazione del forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA).

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Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dai comitati di revisione istituzionali dell'Università di Medicina di Aichi (2017-H341, 2019-H137). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun partecipante.

1. Preparazione dei reagenti

NOTA: Per eseguire il test ELISA a sandwich, i reagenti vengono preparati come descritto di seguito.

  1. Tampone di rivestimento:
    1. Per produrre un tampone carbonato-bicarbonato da 0,1 mol/L, pesare 10,6 g di carbonato di sodio anidro (peso molecolare, 106 g/mol) e 8,4 g di bicarbonato di sodio (peso molecolare, 84 g/mol).
    2. Aggiungerlo a circa 900 ml di acqua distillata in un becher.
    3. Regolare il pH del tampone a 9,6 aggiungendo la quantità necessaria di acido cloridrico diluito o idrossido di sodio.
    4. Controllare il pH con un pHmetro.
    5. Quindi, aggiungere il volume richiesto di acqua distillata per ottenere un volume totale di 1.000 ml.
    6. Conservare questo tampone carbonato-bicarbonato da 0,1 mol/L in frigorifero a 4 °C.
  2. Buffer di blocco:
    1. Aggiungere circa 250 μL di sodio azide al 20% e 1 g di albumina sierica bovina (BSA) a 70 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) composta da 137 mmol/L NaCl, 8,1 mmol/L Na 2 HPO 4, 2,68 mmol/L KCl e 1,47 mol/L KH2PO 4 (pH7,4) e mescolare delicatamente.
    2. Aggiungere acqua distillata fino a ottenere un volume totale di 100 ml. Le concentrazioni finali di albumina sierica bovina e di sodio azide sono rispettivamente dell'1% e dello 0,05%. Attendere 10 minuti, quindi la soluzione è pronta per l'uso.
  3. Soluzione di lavaggio: Preparare lo 0,5% di t-ottilfenossipolietanolo, polietilenglicole terz-ottilfeniletere (Triton X-100) in acqua distillata.
    1. Diluire Triton X-100 al 10% con acqua distillata e lasciare riposare la soluzione al 10% per 1 giorno prima dell'uso.
    2. Quindi, diluire nuovamente la soluzione Triton X-100 al 10% 20 volte con acqua distillata per ottenere una concentrazione dello 0,5%.
  4. Diluizione dell'anticorpo:
    1. Diluire l'anticorpo di cattura (anticorpo anti-MPO [1 mg/mL] o anticorpo anti-NE [1 mg/mL]) a 1:2.000 nel tampone di rivestimento (pH 9,6) prima dell'uso il giorno 1 del test (vedere sotto) e l'anticorpo di rilevamento (anticorpo anti-DNA coniugato con perossidasi) a 1:40 con PBS prima dell'uso il giorno 3 del test (vedere sotto).
      NOTA: Per l'esperimento preliminare, diluire gli anticorpi isotipici (IgG di coniglio [5 mg/mL] e clone di topo IgG1 Ci4 [0,5 mg/mL]) a 1:10.000 e 1:1.000 nel tampone di rivestimento (pH 9,6).
  5. Soluzione di substrato ABTS: A seconda del numero di campioni, sciogliere una, due o tre compresse di acido 2,2'-azino-bis(3 etilbenzotiazolina-6-solfonico (ABTS) in 5 mL, 10 mL o 15 mL di tampone ABTS (contenente perborato di sodio, acido citrico e fosfato acido disodico); sono necessari 100 μL per campione. Conservare la soluzione preparata a 2-8 °C al riparo dalla luce. La soluzione è stabile fino a 3 mesi.

2. Raccolta e conservazione dei campioni

  1. Isolamento del plasma:
    1. Raccogliere 4 ml di campioni di sangue periferico in una provetta per la raccolta del sangue di litio eparina mediante venipuntura con una siringa da 22 G e centrifugare a 1.600 x g per 10 minuti a 4 °C.
    2. Trasferire il surnatante in una provetta da 2 mL con chiusura sicura.
    3. Centrifugare nuovamente il surnatante a 16.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali cellule residue.
    4. Raccogliere il surnatante in una nuova provetta di sicurezza senza disturbare il pellet sul fondo della provetta.
    5. Conservare il plasma ottenuto a −80 °C fino al successivo utilizzo.
      NOTA: Per ottenere risultati ad alta produttività con questo test, sono necessari campioni di buona qualità. Se si utilizzano campioni di plasma, eseguire una seconda centrifugazione per rimuovere eventuali cellule residue. Evitare lo scongelamento ripetuto dei campioni. Utilizzare l'eparina come anticoagulante perché l'EDTA influisce sull'attività della DNasi.
  2. Isolamento di neutrofili polimorfonucleati
    1. Raccogliere i campioni di sangue periferico in una provetta per la raccolta del sangue di litio eparina mediante venipuntura con una siringa da 22 G.
    2. Stratificare 6 mL di sangue su 6 mL di polimorfi one-step e centrifugare le provette a 1.000 x g per 45 minuti a temperatura ambiente (RT).
    3. Raccogliere il terzo strato di buffy coat contenente neutrofili e lavarlo tre volte in RPMI-1640 privo di rosso fenolo a 400 x g per 10 minuti a RT.
    4. Risospendere i neutrofili in RPMI-1640 privo di rosso fenolo contenente 2 mM di L-glutammina integrata con il 6% di siero fetale bovino inattivato dal calore e contare le cellule nel campo del microscopio con un emocitometro.
      NOTA: Questo metodo produce una purezza dal 96% al 98% con una vitalità superiore al 95%, come valutato dall'esclusione del colorante blu tripano.
  3. Attivazione di neutrofili polimorfonucleati e NETosi in vitro
    1. Diluire neutrofili polimorfonucleati appena isolati a 1 × 105 cellule/mL in RPMI-1640 privo di rosso fenolo contenente 2 mM di L-glutammina integrata con il 6% di siero fetale bovino inattivato dal calore e seminarli in piastre di coltura da 35 mm.
    2. Per indurre NET, stimolare neutrofili polimorfonucleati con PMA a 25 nM per 4 ore a 37 °C in aria al 5% di CO2/95%.
    3. Dopo 4 ore di incubazione, digerire parzialmente i NET aggiungendo 0,6 μg/mL di DNasi I direttamente alle piastre di coltura per 15 minuti a RT e interrompere l'attività della DNasi I aggiungendo 5 mM di EDTA.
    4. Raccogliere il terreno contenente i NET sintetizzati e centrifugare a 400 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere i detriti cellulari.
    5. Ottenere i surnatanti da quattro controlli sani, mescolare e conservare a -80 °C fino all'uso.
      NOTA: I neutrofili stimolati da PMA digeriti con DNasi ottenuti da quattro controlli sani sono utilizzati come standard NET 1,14,15. Generare una curva di calibrazione da uno standard NET diluito in serie con PBS e assegnare i valori di densità ottica (OD) ottenuti da uno standard NET non diluito come 100% NET.

3. Metodo di analisi

NOTA: I passaggi per l'esecuzione del test sono descritti in dettaglio di seguito.

  1. Giorno 1
    1. Applicare un totale di 100 μL di anticorpo diluito anti-MPO o anti-NE contenente 0,05 μg di anticorpo su ciascun pozzetto della piastra, compreso il pozzetto bianco.
      NOTA: Il tampone di rivestimento non deve contenere alcun tipo di detergente perché, in caso contrario, gli anticorpi potrebbero non legarsi in modo uniforme e senza intoppi alle pareti di ciascun pozzetto. Per evitare l'effetto gancio, la concentrazione della proteina di rivestimento non deve essere superiore a 20 μg/mL, perché concentrazioni superiori a tale livello satureranno la maggior parte dei siti disponibili sulla piastra per microtitolazione. L'intervallo di concentrazione tipico delle soluzioni di rivestimento proteico è compreso tra 2 e 10 μg/mL. Per l'esperimento preliminare, utilizzare l'anticorpo di controllo isotipo diluito IgG coniglio per il rivestimento invece di anticorpi monoclonali specifici contro MPO. Utilizzare l'anticorpo di controllo iso-tipo diluito IgG1 di topo per il rivestimento invece di anticorpi monoclonali specifici contro NE.
    2. Coprire la piastra con una copertura di plastica adesiva per evitare l'evaporazione del campione e incubare per una notte a 4 °C per consentire il legame degli anticorpi di cattura.
  2. Giorno 2
    1. Eliminare la soluzione anticorpale diluita dai pozzetti, quindi pipettare 300 μL di soluzione di lavaggio per pozzetto e ripetere questa procedura di lavaggio tre o quattro volte.
    2. Rimuovere il PBS in eccesso picchiettando la piastra su un tovagliolo di carta.
    3. Bloccare ogni pozzetto della piastra ELISA con 200 μL di tampone di blocco.
    4. Coprire strettamente la piastra con una copertura di plastica adesiva e incubarla per 1,5-2 ore a RT per ostruire i pozzetti.
    5. Eliminare completamente la soluzione bloccante dai pozzetti, quindi pipettare 300 μL di soluzione di lavaggio per pozzetto e ripetere questa procedura di lavaggio tre o quattro volte.
    6. Rimuovere il PBS in eccesso picchiettando la piastra su un tovagliolo di carta.
    7. Applicare un totale di 25 μL di plasma o terreno su ciascun pozzetto tranne il pozzetto bianco e aggiungere 75 μL di PBS come diluente per ottenere il volume finale di 100 μL; aggiungere 100 μL di PBS al pozzetto del bianco.
    8. Quindi, miscelare i campioni a RT per 10 s posizionando la piastra su uno shaker a 250 giri/min.
    9. Applicare 2 μL di DNasi I diluita 100 volte (0,03 mg/mL) su ciascun pozzetto, compreso il pozzetto bianco (concentrazione finale di DNasi I nella miscela di reazione: 0,6 μg/mL).
    10. Sigillare la piastra con un coperchio di plastica adesiva e miscelare accuratamente i campioni a RT per 10 s posizionando la piastra su uno shaker a 250 giri/min.
      NOTA: Per valutare le condizioni ottimali per la digestione del DNA, durante lo sviluppo del test, abbiamo incubato campioni contenenti DNA associato a MPO da pazienti con COVID-19 con 0-0,9 μg/mL DNasi I per 15 minuti a RT e abbiamo utilizzato piastre rivestite con anticorpo di cattura specifico per MPO o un anticorpo di controllo isotipo abbinato alla specie.
    11. Incubare i campioni per 15 minuti a RT.
    12. Rimuovere la copertura di plastica adesiva e applicare 1 μL di EDTA 0,5 M su ciascun pozzetto per arrestare la reazione DNasi.
    13. Richiudere la piastra con un coperchio di plastica adesiva e agitarla a RT per 15 s posizionandola su uno shaker a 250 giri/min.
    14. Quindi, incubare la piastra per una notte a 4 °C per consentire ai componenti proteici dei NET di attaccarsi agli anticorpi di cattura.
  3. Giorno 3
    1. Rimuovere il coperchio di plastica adesiva ed eliminare la soluzione dai pozzetti.
    2. Scartare completamente la soluzione dai pozzetti, quindi pipettare 300 μL di soluzione di lavaggio per pozzetto e ripetere questa procedura di lavaggio tre o quattro volte.
    3. Applicare un totale di 100 μL dell'anticorpo anti-DNA coniugato diluito con perossidasi su ciascun pozzetto.
    4. Sigillare bene la piastra con una copertura di plastica adesiva e incubarla per 1,5 ore a RT.
    5. Eliminare completamente la soluzione dai pozzetti, quindi pipettare 300 μL di soluzione di lavaggio per pozzetto e ripetere questa procedura di lavaggio tre o quattro volte.
    6. Rimuovere con cautela la soluzione residua.
    7. Applicare un totale di 100 μL di soluzione di substrato ABTS su ciascun pozzetto e coprire la piastra con una copertura di plastica adesiva.
    8. Incubare la piastra al buio a RT per 20-30 minuti su uno shaker a 250 giri/min.
      NOTA: Monitorare la piastra a intervalli di 5 minuti fino a ottenere le letture OD desiderate.
    9. Aggiungere un totale di 50 μL di acido solforico 2 M per arrestare la reazione.
    10. Mescolare il contenuto liquido dei pozzetti picchiettando con cura il lato della piastra.
    11. Accendere il lettore di micropiastre e collegarlo al computer.
    12. Aprire l'applicazione software sul computer.
    13. Dalla barra di stato, crea un nuovo esperimento e assegnagli un nome.
    14. Impostare tutti i seguenti parametri per la lettura della piastra: Tipo di lettura, Assorbanza; Modalità di lettura, Endpoint; Lunghezze d'onda, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Mix automatico e blanking prima, Off; Piastra preletta, spenta; Calibrazione automatica, On; Strisce, leggere l'intera piastra; Priorità lunghezza d'onda della colonna, Priorità della colonna; Velocità del carrello, Normale; e Lettura automatica, Disattivato.
    15. Quindi, mettere la piastra a 96 pozzetti contenente i campioni nel cassetto e chiuderlo.
    16. Infine, selezionare il pulsante Leggi in modo che la piastra venga letta immediatamente.
    17. Leggere l'assorbanza di ciascun pozzetto a una lunghezza d'onda di 405 nm utilizzando un lettore di micropiastre (in questa fase, utilizzare una lunghezza d'onda di 490 nm come riferimento).
    18. Eseguire la sottrazione automatica del valore di assorbanza del solo mezzo di saggio da tutti i campioni sconosciuti e salvare i dati.
      NOTA: Utilizzare una curva standard ottenuta dallo standard NET diluito in serie per calcolare la concentrazione relativa di NET nel campione 1,14,15. Qui, i risultati finali sono presentati come "complessi MPO- o NE-DNA (% dello standard NET)". Il limite di rilevamento (LOD) è stato calcolato dalla deviazione standard (SD) e dalla pendenza della curva di calibrazione (S) come segue: LOD = 3,3 (SD/S).

4. Statistiche

  1. Eseguire tutte le analisi statistiche utilizzando appositi software di analisi statistica. In questo caso è stato utilizzato SigmaPlot v14.5. Le percentuali e le variabili continue sono mostrate come mediana con l'intervallo interquartile a causa della distribuzione asimmetrica della maggior parte dei parametri.
  2. Confrontare i livelli plasmatici di MPO-DNA e NE-DNA tra pazienti COVID-19 e controlli sani utilizzando il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. Utilizzare l'analisi di correlazione per esplorare la relazione tra la densità ottica e la percentuale di standard NET.

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Representative Results

Questo metodo ha utilizzato un ELISA a sandwich con anticorpi monoclonali anti-MPO, anti-NE e anti-DNA per misurare il DNA associato a MPO e NE (Figura 1). In questo metodo, i pozzetti di una piastra per microtitolazione sono stati rivestiti con un anticorpo monoclonale specifico per MPO o NE specifico per catturare MPO associato al DNA e NE associato al DNA, nonché MPO e NE non associati al DNA. Per calcolare il coefficiente di variabilità (CV) intra-test, sono state eseguite misurazioni duplicate all'interno della stessa piastra per 30 campioni raccolti da pazienti con COVID-19 e controlli sani e la %CV è stata calcolata come media delle misurazioni duplicate; per calcolare il CV inter-test (cioè la consistenza da piastra a piastra), sono stati misurati in quadruplice su 10 piastre due tipi di campioni di pazienti con COVID-19 e controlli sani; per dimostrare la specificità di questo test, sono state analizzate varie concentrazioni di complessi MPO-DNA e NE-DNA utilizzando piastre rivestite con anticorpi di controllo iso-tipo invece di anticorpi monoclonali specifici contro MPO e NE; e per calcolare la sensibilità e la linearità del saggio, è stato analizzato uno standard NET diluito in serie ottenuto stimolando neutrofili umani isolati con PMA e digestione DNasi lieve e sono stati calcolati il coefficiente di correlazione e il limite di rilevazione (LOD).

Le curve di calibrazione per MPO-DNA e NE-DNA tratte da uno standard NET diluito in serie sono mostrate nella Figura 2. Curve standard affidabili per MPO-DNA e NE-DNA (R2 = 0,958 e 0,963, rispettivamente) si ottengono quando i valori di assorbanza non superano le concentrazioni di 0,93 e 0,90, rispettivamente. I valori LOD calcolati dalla SD e la pendenza della curva di calibrazione sono stati rispettivamente dello 0,132% e dello 0,126% per MPO-DNA e NE-DNA (standard %NET).

L'OD più alto è stato ottenuto quando è stata applicata la DNasi I 0,6 μg/mL (Figura 3). Pertanto, la digestione del DNA si è limitata all'aggiunta di una miscela di reazione 0,6 μg/mL di DNasi I per 15 minuti a temperatura ambiente. Quando le piastre sono state rivestite con l'anticorpo di controllo iso-tipo invece dell'anticorpo monoclonale specifico contro MPO, sono stati rilevati valori di OD molto bassi (<0,09 unità di assorbanza [AU]) a varie concentrazioni di DNasi I.

Per calcolare il coefficiente di variabilità (CV) intra-test per MPO-DNA e NE-DNA, sono state eseguite misurazioni duplicate in 30 campioni di pazienti con COVID-19 e controlli sani nella stessa piastra; il %CV è stato calcolato utilizzando la media duplicata. I CV intra-test per MPO-DNA e NE-DNA erano rispettivamente 1,871 e 0,987 nei controlli sani e 2,532 e 2,010, rispettivamente, nei pazienti COVID-19 (Tabella 1). I CV medi intra-test di MPO-DNA e NE-DNA sono stati rispettivamente di 2,202 ± 0,467 e 1,497 ± 0,723 (media ± DS) (Tabella 1).

Per calcolare il CV inter-test per MPO-DNA e NE-DNA, due tipi di campioni raccolti da pazienti con COVID-19 e controlli sani sono stati misurati in quadruplicato su 10 piastre diverse per monitorare la coerenza da piastra a piastra. I CV medi tra i test di MPO-DNA e NE-DNA sono stati rispettivamente 6,524 ± 2,672 e 4,389 ± 0,923 (media ± DS) (Tabella 2).

Per valutare la specificità degli anticorpi di cattura contro i complessi MPO-DNA e NE-DNA, abbiamo analizzato varie concentrazioni di complessi MPO-DNA e NE-DNA utilizzando piastre rivestite con anticorpi di controllo iso-tipo invece di anticorpi monoclonali specifici contro MPO e NE. La Tabella 3 mostra che gli anticorpi di controllo iso-tipo hanno reagito poco con i complessi MPO-DNA e NE-DNA alle varie concentrazioni (da 0,035 UA a 0,078 UA e da -0,007 UA a 0,096 UA, rispettivamente).

I livelli di MPO-DNA e NE-DNA nel surnatante dei neutrofili stimolati da PMA digeriti con DNasi sono stati definiti come standard NET al 100% e i dati del campione di plasma sono stati espressi come standard %NET. I livelli di MPO-DNA (%NET-standard) erano significativamente più alti nel plasma di pazienti con COVID-19 (n = 16; 29,1% [IQR, 25,8, 41,5]) rispetto al plasma di controlli sani (n = 10; 13,4% [IQR, 12,4, 14,8]), così come i livelli di NE-DNA (%NET-standard) (46,4% [IQR, 32,7, 53,7] vs. 12,1% [IQR, 9,9, 14,7], rispettivamente, P < 0,01; Figura 4).

Figure 1
Figura 1: Fasi di base di un metodo di saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich per la misurazione del mieloperossidasi-DNA o dell'elastasi neutrofila in campioni. (A) I pozzetti sono rivestiti con un anticorpo anti-mieloperossidasi (MPO) o anti-elastasi neutrofila (NE). (B) I restanti siti di legame proteico sono bloccati da agenti bloccanti. (C) Vengono aggiunti campioni contenenti DNA coniugato con NE e coniugato con MPO. (D) Viene eseguita una digestione limitata della DNasi e il campione viene incubato nei pozzetti per legarsi con l'anticorpo di cattura. (E) Viene aggiunto un anticorpo anti-DNA secondario marcato con perossidasi. (F) L'anticorpo anti-DNA marcato con perossidasi secondaria non legata viene rimosso. (G) Viene aggiunto il substrato 2,2'-azino-bis (acido 3-etilbenzotiazolina-6-solfonico) e viene monitorato lo sviluppo del colore. Abbreviazioni: ABTS = acido 2,2'-azino-bis(acido 3-etilbenzotiazolina-6-solfonico); MPO = mieloperossidasi; NE = elastasi neutrofila Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Linearità delle relazioni tra i valori di intensità e le varie diluizioni dello standard della trappola extracellulare dei neutrofili. Il surnatante dei neutrofili stimolati dal forbolo 12-miristato 13-acetato-stimolati da DNasi è stato diluito in serie e i livelli di mieloperossidasi-DNA e neutrofilo-elastasi-DNA sono stati analizzati per generare una curva di calibrazione. Le unità di assorbanza (AU) ottenute dallo standard di trappola extracellulare dei neutrofili non diluiti (standard NET) sono state assegnate come 100%NET e tracciando il valore di intensità a 405 nm rispetto allo standard %NET è emersa una relazione lineare. Abbreviazioni: MPO = mieloperossidasi; NE = elastasi neutrofila; NET = trappola extracellulare dei neutrofili Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Dose-risposta della DNasi I nella digestione del DNA trappola extracellulare dei neutrofili. Il campione è stato inserito in pozzetti rivestiti di mieloperossidasi. Quindi, è stata aggiunta DNasi I (0 μg/mL, 0,3 μg/mL, 0,6 μg/mL o 0,9 μg/mL). Dopo 15 minuti di digestione, l'attività enzimatica è stata interrotta e le fasi rimanenti del test di immunoassorbimento enzimatico a sandwich sono state eseguite di conseguenza. I dati sono mostrati come media ± DS. N = 12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Livelli plasmatici di mieloperossidasi-DNA e complessi elastasi-DNA neutrofili in pazienti con COVID-19. I dati sono espressi come percentuali del contenuto di neutrophil extracellular trap standard (NET-standard) e presentati come mediane e intervalli interquartili. Pazienti con COVID-19, n = 16; Controlli sani, n = 10. ** P < 0,01 rispetto ai controlli sani. Abbreviazioni: HC = controlli sani; NET = trappola extracellulare dei neutrofili. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Coefficiente di variabilità intra-saggio. Trenta campioni sono stati misurati in duplicato per monitorare i singoli coefficienti di variabilità e, quindi, determinare il coefficiente di variabilità intra-saggio. Abbreviazioni: AU = unità di assorbanza; CV = coefficienti di variabilità Clicca qui per scaricare questa Tabella.

Tabella 2: Coefficiente di variabilità tra i saggi. I campioni sono stati misurati in quadruplicato su 10 piastre diverse per monitorare la variazione da piastra a piastra e, quindi, determinare il coefficiente di variabilità tra i saggi. Abbreviazioni: AU = unità di assorbanza; CV = coefficiente di variabilità. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Test di specificità per gli anticorpi di cattura. Le piastre sono state rivestite con anticorpi di controllo iso-tipo per l'anti-mieloperossidasi (MPO) e l'elastasi anti-neutrofila (NE) per valutare la specificità degli anticorpi di cattura per i complessi MPO-DNA e NE-DNA. Abbreviazioni: AU = unità di assorbanza; MPO = mieloperossidasi; NE = elastasi neutrofila Fare clic qui per scaricare questa tabella.

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Discussion

Abbiamo descritto un metodo ELISA a sandwich in cui MPO o NE si legano a un sito dell'anticorpo di cattura durante l'incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Dopo il lavaggio, il "sandwich" viene completato incubando i campioni con un anticorpo monoclonale anti-DNA associato alla perossidasi. Dopo la rimozione dell'anticorpo secondario non legato, il coniugato della perossidasi legata viene rilevato mediante l'aggiunta di un substrato cromogenico di perossidasi ABTS, che produce un prodotto finale solubile che può essere letto spettrofotometricamente a 405 nm. La buona linearità e l'elevata precisione tra i saggi e tra i saggi indicano che il test ELISA descritto in questo articolo e in altri 1,2 è affidabile e fattibile per l'applicazione clinica. Inoltre, quando il surnatante di neutrofili stimolati da PMA trattati con DNasi viene assegnato come segnale massimale per lo standard NET, questo test ELISA può essere utilizzato come metodo semiquantitativo 1,14,15.

I lunghi fili di cromatina dei NET sono decorati con proteine MPO e NE. Per aumentare il legame tra l'anticorpo di cattura e i complessi MPO-DNA o NE-DNA, i fili vengono tagliati in pezzi più corti mediante digestione limitata del DNA con l'enzima DNasi; l'aggiunta di una concentrazione di DNasi troppo elevata potrebbe portare a un'eccessiva digestione del DNA e, quindi, a una diminuzione dell'assorbanza. I risultati di un esperimento preliminare (vedi Figura 3) hanno mostrato che è necessaria una quantità appropriata di aggiunta di DNasi per allentare i residui derivati dai NET. Gli esperimenti che hanno utilizzato anticorpi di controllo iso-tipo invece di anticorpi di cattura specifici hanno mostrato che gli anticorpi di cattura utilizzati in questo test erano specifici per i complessi MPO-DNA e NE-DNA.

La fase iniziale della formazione di NET è caratterizzata dalla cromatina decondensata e dalla conservazione dell'intensità della membrana plasmatica 9,16,17. I neutrofili con nucleo condensato sono stati identificati come neutrofili in fase di formazione di NET e possono essere quantificati mediante citometria a flusso10. Sebbene la citometria a flusso sia in grado di analizzare un gran numero di immagini provenienti dalle cellule in breve tempo, non può essere utilizzata per valutare le fasi successive della formazione di NET dopo la rottura della membrana cellulare e l'estrusione della cromatina. Gli istoni citrullinati H3, che sono noti per essere marcatori specifici di NET, possono essere rilevati mediante western blotting18 ed ELISA19; tuttavia, questi metodi sono specifici solo per la formazione di NET correlati a PAD4 e non possono essere utilizzati per valutare i NET indipendenti da PAD420.

La scoperta che i livelli di residui sierici NET erano più alti nei pazienti con COVID-19 rispetto ai controlli sani concorda con i rapporti precedenti21,22. Questa scoperta suggerisce che l'attivazione dei neutrofili, compresa la formazione di NET, può svolgere un ruolo importante nella patogenesi di COVID-19.

Questo test ha una limitazione. Recenti studi hanno dimostrato che i geni immuno-correlati, tra cui MPO ed ELANE, che codificano rispettivamente per MPO e NE, sono altamente espressi in condizioni infiammatorie non controllate23 e sono positivamente correlati con la gravità e la mortalitàdella malattia 24. Poiché MPO e NE sono coinvolti nella formazione di NET indipendentemente da tali attività enzimatiche15, l'aumento dei livelli proteici di NE e MPO nei neutrofili può influenzare i risultati di questo test.

Concludiamo che questo metodo ELISA a sandwich misura direttamente il DNA extracellulare con proteine granulari, tra cui NE e MPO, che sono specifiche per la formazione di NET. Questo test di rilevamento è un metodo affidabile, altamente sensibile e utile per studiare le caratteristiche dei NET in campioni umani e surnatanti di coltura.

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Disclosures

Tutti i dati generati e/o analizzati durante questo studio sono inclusi in questo articolo pubblicato. Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il Dr. Huq Muhammad Aminul per l'assistenza fornita nella revisione del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

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References

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Immunologia e infezione numero 195
Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato
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Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

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